Идентификация возбудителя гистоплазмоза на основе полимеразной цепной реакции
На правах рукописи
ВЬЮЧНОВА Надежда Васильевна
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА
НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Волгоград – 2013
Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении
здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Антонов Валерий Алексеевич
Официальные оппоненты:
Бойко Андрей Виталиевич, доктор медицинских наук, доцент, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики отдела диагностики инфекционных болезней Шелудько Андрей Вячеславович, доктор биологических наук, ФГБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов»
Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов
Ведущая организация: Научно-исследовательский центр Федерального государственного казенного учреждения «33 Центральный научно исследовательский испытательный институт» Министерства обороны Российской Федерации (войсковая часть 23527, г. Киров)
Защита состоится 15 мая 2013 г. в 1000 на заседании совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно исследовательский противочумный институт "Микроб"» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"».
Автореферат разослан «» 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Histoplasma capsulatum — диморфный микромицет, возбудитель тяжелого инфекционного заболевания гистоплазмоза. В настоящее время выделяют: H.capsulatum var. capsulatum – возбудитель классического (американского) гистоплазмоза, высокоэндемичные очаги которого расположены вдоль реки Миссисипи (США) и H.capsulatum var. duboisii - возбудитель африканского гистоплазмоза, распространенного в странах Центральной и Западной Африки. В последнее время гистоплазмоз зарегистрирован в ряде азиатских странах, таких как Индонезия, Тайланд, Индия [Manfredi R. et al., 1994;
Poonwan N. et al., 1998].
Еще один вариант H. capsulatum var. farciminosum – возбудитель эпизоотического лимфангоита у лошадей, ослов, мулов. Возбудитель широко распространен в Европе, Северной Африке, Индии и Южной Азии. В патологии людей какого-либо существенного значения не имеет [Kauffman C.A., 2007].
В настоящее время случаи заболевания гистоплазмозом зарегистрированы более чем в 60 странах мира. В России до сих пор не было достоверно подтверждено ни одного случая заболевания гистоплазмозом.
Можно предположить, что причина заключается в малой осведомленности работников здравоохранения в отношении этого микоза и отсутствии коммерческих препаратов для диагностики.
Разнообразие клинических проявлений наряду с отсутствием патогномоничных симптомов являются причинами трудностей диагностики гистоплазмоза. В настоящее время лабораторная диагностика основана на использовании культурального, биологического и иммунологического методов.
Традиционная схема лабораторного анализа с выделением культуры занимает до 30 суток. Общим для всех иммуносерологических методов, направленных на выявление антигенов гриба, является их невысокая чувствительность и недостаточная специфичность. В настоящее время интенсивно развиваются альтернативные методы диагностики, позволяющие решить данные проблемы. В первую очередь, это полимеразная цепная реакция, позволяющая выявлять данный патоген независимо от этапа культивирования гриба.
Цель работы заключалась в конструировании амплификационной тест-системы для выявления ДНК H.capsulatum методом полимеразной цепной реакции.
Задачи исследования:
Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных 1.
в различных генетических базах данных, с целью подбора праймеров для идентификации H.сapsulatum методом ПЦР.
Оптимизировать условия проведения ПЦР, оценить специфичность и 2.
чувствительность выбранных олигонуклеотидных затравок HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as, HcCBP1s-HcCBP2as на широком наборе гомологичных и гетерологичных штаммов и разработать амплификационную тест-систему для идентификации H. сapsulatum.
Определить оптимальные методы выделения и очистки ДНК 3.
возбудителя гистоплазмоза при анализе чистых культур микромицетов, объектов внешней среды и биологического материала, контаминированных клетками H. сapsulatum.
Оценить эффективность сконструированной амплификационой тест 4.
системы для диагностики экспериментального гистоплазмоза.
Научная новизна Впервые для выявления ДНК возбудителя гистоплазмоза в качестве ДНК мишеней для посадки праймеров использовали ген, кодирующий белок мицелиальной фазы MS8 и ген, опосредующий синтез кальций связывающего белка CBP в дрожжевой фазе.
На основании полученных результатов получено положительное решение о выдаче патента на изобретение №2011127594/10(040875) «Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum» (от 04.06.2012 г., приоритет от 05.07.2012 г.).
На основе гена ms8 впервые разработана отечественная амплификационная тест-система для идентификации возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР и показана ее эффективность при обнаружении ДНК гриба в объектах внешней среды, контаминированных клетками H.сapsulatum и биологическом материале, полученном от экспериментально зараженных животных.
В результате исследований предложен способ выделения ДНК возбудителя гистоплазмоза, позволяющий проводить эффективный лизис клеток и очистку ДНК патогенных грибов, обеспечивающий высокую чувствительность и специфичность реакции амплификации.
Впервые схема лабораторной диагностики гистоплазмоза дополнена этапами ПЦР с использованием разработанной тест-системы при идентификации чистых культур H. сapsulatum, а также обнаружении возбудителя в клиническом материале и пробах из объектов внешней среды.
Практическая ценность Материалы научных исследований использованы при разработке МУ 3.4.3008-12 «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней»
(утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 28.03.2012 г.), проекта Методических рекомендаций «Идентификация возбудителей особо опасных микозов по таксономическим признакам и эпидемиологической значимости» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека).
По результатам диссертационной работы составлены Методические указания «Лабораторная диагностика особо опасных микозов» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 3.04.2012 г.), методические рекомендации «Использование олигонуклеотидных праймеров для выявления возбудителей гистоплазмоза с помощью полимеразной цепной реакции» (утверждены директором института 30.06.2009 г.) и методические рекомендации «Подготовка проб контаминированных возбудителями гистоплазмоза для исследования методом ПЦР» (утверждены директором института 10.10.2011 г.).
Для государственной регистрации проведены внутриинститутские комиссионные испытания параметров качества сконструированной амплификационой тест-системы (чувствительность, специфичность) (акт испытаний от 30.06.2010 г.), разработана и утверждена нормативная документация, в том числе Пусковой регламент, Технические условия и Инструкция по применению к «Набору реагентов для выявления ДНК микромицетов вида Histoplasma методом полимеразной цепной реакции «Амплиген Гисто» (утверждены директором института 10.10.2011 г.).
Сконструированную амплификационную тест-систему и предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научно исследовательского противочумного института для анализа генетических особенностей музейных штаммов H. сapsulatum и испытательно лабораторном центре при исследовании поступающих проб на наличие возбудителей микромицетов II группы патогенности.
Материалы включены в лекционный материал программы повышения квалификации врачей по специальности «Лабораторная микология»
утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 21.04.2005 г.;
курсов повышения квалификации врачей бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24.09.2007 г.;
программы профессиональной переподготовки по специальности «Бактериология. Основы безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II группы»
утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 27.08.2010 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
Группоспецифические праймеры HcMs8s-Ms8as3 подобранные, на 1.
основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок мицелиальной фазы и праймеры Ms8 HcCBP1s-HcCBP2as сконструированные на основе гена кальций-связывающего белка CBP, обеспечивают амплификацию ДНК H. сapsulatum var. capsulatum, H.
сapsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum.
Амплификационная тест-система, сконструированная на основе 2.
праймеров HcMs8s-Ms8as3, позволяет детектировать H. сapsulatum var.
capsulatum, H. сapsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum в концентрации не ниже 1х104 кл/мл со 100 % специфичностью при анализе чистых культур и проб из объектов окружающей среды (почвы, воды), искусственно контаминированных возбудителями гистоплазмоза.
Метод ПЦР с разработанной тест-системой эффективен для 3.
диагностики гистоплазмоза при исследовании биологического материала от экспериментально зараженных животных.
Праймеры HcMs8s2-Ms8as, обеспечивают дифференциацию H.
4.
сapsulatum var. capsulatum и H. capsulatum var. farciminosum от H. сapsulatum var. duboisii методом ПЦР с чувствительностью 1х105 – 1х106 кл/мл.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва, Национальная Академия Микологии 2007 г.;
на III Международной (XII Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции Москва, 2008 г.;
научно-практической конференции по медицинской микологии «XI Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2008 г.;
на Междисциплинарных микологических форумах, Москва Национальная Академия Микологии 2009 и 2010 гг.;
на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире»
Оболенск, 2009 г.;
на Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» Новосибирск, Россия, 2009 г.;
научно практической конференции по медицинской микологии «XII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2009 г.;
на V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, 2010 г.;
на научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» Оболенск, 2010 г.;
на научно-практической конференции по медицинской микологии «XIII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, г.;
на VII Всероссийской научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010» Москва, г.;
на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности»
Оболенск, 2011 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 7 – в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6-ти глав собственных исследований, иллюстрированных 9 таблицами и 13 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего источников (27 отечественных и 132 иностранных авторов).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы В работе были использованы 18 штаммов H. capsulatum var. capsulatum, 4 штамма H. capsulatum var. duboisii, 1 штамм H. capsulatum var.
farciminosum, 11 штаммов Blastomyces dermatitidis, 5 штаммов Coccidioides immitis, по 3 штамма Paracoccidioides brasiliensis, Cryptococcus neoformans и по 1 штамму Candida albicans, Fusarium oxysporum, Fusarium avenarium.
Все исследования на штаммах микромицетов проводились в соответствии с требованиями Санитарных правил 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)» и Санитарных правил 1.3.2322–08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Штаммы возбудителей особо опасных микозов в мицелиальной фазе роста культивировали на агаре Сабуро («Himedia», Индия) с дрожжевым экстрактом («Difco», США) при температуре (28±1) 0С в течение 30 сут. Для получения дрожжевой фазы H. сapsulatum, B. dermatitidis и P. brasiliensis культуры в мицелиальной фазе суспендировали в 0,15 М растворе хлорида натрия, рН (7,1±0,1) и по 0,2 мл высевали в пробирки с агаром Френсиса, модифицированном добавлением до конечных концентраций цельной крови 8 %, глюкозы - 1 % и L-цистеина - 0,1 %. Пробирки инкубировали при температуре (37±1) 0С от 6 до 14 сут, в зависимости от штамма.
Взвеси обеззараживали добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1 мг/мл (1:1000) с последующим прогреванием на водяной бане 40 мин при температуре (56±1) 0С и инкубацией при комнатной температуре в течение 24 ч, после чего проводили высев на стерильность.
Приготовление проб ДНК проводили согласно методическим указаниям 1.3.2569-09. «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» (Москва, 2009).
Для выделения ДНК в работе использовали методы высокотемпературного лизиса, нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата модифицированный [Boom R. et al., 1990;
Ткаченко Г.А.
с соавт, 2007] и гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [Sandhu G.S. et al., 1995;
Ткаченко Г.А. с соавт, 2007].
В качестве лизирующих ферментов использовали пищеварительный сок улитки (ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Волгоград), «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum» («Sigma-ALDRICH», Германия) и «Chitinase from Trichoderma viride» («Sigma-ALDRICH», Германия).
Концентрацию полученного раствора ДНК определяли с помощью спектрофотометра «GeneQuant» («Amersham», США) Анализ молекулярной структуры праймеров проводили с использованием компьютерных программ Gene Runner 3.0 и Oligo 6.71.
Олигонуклеотидные праймеры синтезированы фирмами ЗАО «НПФ ДНК технология» (г. Москва) и ЗАО «Синтол» (г. Москва). Амплификацию с использованием «горячего старта» проводили в объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках на мультициклере «Терцик» (НПФ «ДНК технология», Москва). Электрофорез ампликонов проводили в 1,5% и 3% агарозном геле при градиенте напряжения 5 В/см в течение 30 мин [Маниатис Т. с соавт, 1984]. Результаты электрофореза регистрировали с помощью документирующей системы GelDoc XP и прилагаемым к ней программным обеспечением "Quantity One". Секвенирование продуктов амплификации производили с использованием набора Applied Biosystems BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, накопление продуктов циклического секвенирования производили на амлификаторе Applied Biosystems 2720, для очистки продуктов использовали набор Applied Biosystems BigDye XTerminator Purification Kit. Учет результатов провели на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130.
Моделирование экспериментальной инфекции осуществляли путем внутрибрюшинного введения беспородным белым мышам массой 18 - 20 г 1,0 мл суспензии клеток культуры штамма H.capsulatum var. capsulatum B 580 в мицелиальной и дрожжевой фазах. Заражающая доза составляла 1х кл/мл. Экспериментальных животных вскрывали на 6, 13, 17 и 27 сут после заражения. Части внутренних органов (лёгких, печени, селезёнки) и кровь исследовали методом ПЦР. Одновременно делали высев на агар Сабуро.
Идентификацию выделенной культуры возбудителя гистоплазмоза проводили по общепринятым схемам [Онищенко Г.Г. с соавт, 2009].
Для проведения статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc.,США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Подбор праймеров и параметров реакции амплификации для генной диагностики возбудителя гистоплазмоза Первым этапом исследования стал анализ имеющихся последовательностей генов H.capsulatum, представленных в генетической базе данных GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Для конструирования диагностических тест-систем был проведен поиск специфических последовательностей ДНК среди генов, определяющих синтез факторов вирулентности.
В качестве мишени для специфического отжига праймеров был выбран фрагмент гена кальций-связывающего белка - calcium-binding protein CBP (GenBank NCBI, AF006209).
Другой мишенью для подбора праймеров послужил участок гена ms (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031). На основе данного гена нами сконструированы две пары праймеров.
Таким образом, на основе генов ms8 и cbp1 «in silico» выбраны олигонуклеотидные последовательности праймеров, которые по результатам компьютерного анализа способны специфически детектировать возбудителей гистоплазмоза.
Нуклеотидные последовательности выбранных праймеров представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Последовательности выбранных олигонуклеотидных праймеров и размер специфических ампликонов Название Нуклеотидные последовательности Размер праймера Праймеров ампликона на основе гена cbp 5’-GGАATGGATGTCTTACCCTCAAC-3’ HcCBP1s 280 п.н.
5’-TGCGTGAATAСCCTGACAGC-3’ HcCBP2as на основе гена ms 5’-CCCACATAGAAAGCCTCGTTCC -3’ HcMs8s 361 п.н.
5’-TAGCCCTGCTGTTCGTTGC-3’ Ms8as 5’-GATCATCCGCTGGTAATCG -3’ HcMs8s 362 п.н.
5’-TGCTGTGGATAACCTTGCTGGT-3’ Ms8as В серии экспериментов с ДНК исследуемых микроорганизмов определены оптимальные концентрации ингредиентов и режимы реакции амплификации.
В результате исследований установлено, что для проведения ПЦР с праймерами HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as реакционная смесь в 25 мкл должна содержать: 10 мкл ПЦР-смеси-2-blue - коммерческого препарата фирмы «ЦНИИ Эпидемиологии» (Россия), 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов;
специфические прямые и обратные праймеры по 12 пМ и 10 мкл исследуемой пробы ДНК.
Реакционная смесь для проведения ПЦР с праймерами HcCBP1s HcCBP2as содержала в 25 мкл: десятикратный буфер для ПЦР ((NH4)2SO4 – 170 мM, BSA – 2мг/мл, DTT- 10 мM, Трис – 670 мM, pH 8,8±0,1);
MgCl2 - 2, мМ;
200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов;
специфические олигонуклеотидные праймеры по 12 пМ;
1 ед. фермента Тaq полимеразы коммерческого препарата фирмы НПФ «ДНК-технология»
(Россия) и 10 мкл исследуемой пробы ДНК.
Отработанные программы термоциклирования реакционной смеси представлены в таблицах 2-3.
Таблица 2 - Режим ПЦР для праймеров HcMs8s-Ms8as и HcMs8s2- Ms8as Номер Задаваемая температура Время Количество реакционной смеси, 0С этапа экспозиции циклов Пауза 95. 5 мин 1 95.0 10 с 2 94. 10 с 62.0 10 с 72. 1 мин 3 72.0 Режим хранения 4 10. Таблица 3 - Режим ПЦР для праймеров HcCBP1s-HcCBP2as Номер Задаваемая температура Время Количество реакционной смеси, 0С этапа экспозиции циклов Пауза 95. 5 мин 1 95.0 10 с 2 94. 10 с 58.0 10 с 72. 1 мин 3 72.0 Режим хранения 4 10. В результате исследований на чистых культурах установлено, что с одной из пар праймеров, сконструированной на основе гена ms8 (HcMs8s Ms8as3) и праймерами на основе фрагмента гена cbp1 (HcCBP1s-HcCBP2as), в реакции амплификации синтезировались ампликоны ДНК всех трех вариантов штаммов возбудителя. Другая пара праймеров, комплементарная последовательностям гена ms8 (HcMs8s2-Ms8as), детектировала штаммы H.
capsulatum var. capsulatum и H.capsulatum var. farciminosum, не выявляя ДНК H.capsulatum var.duboisii (рис. 1).
Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов ПЦР при определении специфичности сконструированных праймеров для выявления возбудителей гистоплазмоза А – праймеры HcMs8s-Ms8as3;
В – праймеры HcMs8s2- Ms8as С – праймеры HcCBP1s-HcCBP2as 7 - C. рosadasii 36 Silveira 1 - H. capsulatum var. capsulatum 8 – C. neoformans 9/ 2 - H. capsulatum var. duboisii 3 -H. capsulatum var. farciminosum 12-89 9 – C. albicans 4 – B. dermatitidis 6064 10 – F. oxysporum F- 5 – P. brasiliensis В-851 11 – F. avenarium 6 – C. immitis 158 К+-положительный контрольный образец Оценка специфичности сконструированных праймеров проведена на широком наборе штаммов гетерологичных микроорганизмов. При этом, во всех случаях, получены отрицательные результаты, т.е. специфические фрагменты амплификации отсутствовали при исследовании, как ДНК близкородственных грибов, так и других гетерологичных микроорганизмов, используемых в работе.
Для проверки специфичности продуктов ПЦР проведено их выборочное секвенирование. После амплификации и очистки ампликонов у штаммов H. capsulatum (H. capsulatum var. capsulatum 6650, H. capsulatum var. duboisii 630 и H. capsulatum var. farciminosum 12-89) были секвенированы два перекрывающихся фрагмента гена ms8, а так же фрагмент гена cbp1.
Секвенирование производили как с прямыми, так и с обратным праймерами HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as и HcCBP1s- HcCBP2as.
Выравнивание секвенированных последовательностей штаммов H.
capsulatum проводили при помощи алгоритма Clustal W. В качестве референсной последовательности использовали штамм H. capsulatum (GenBank ID AY049031.1), представленный в генетической базе данных GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information).
В результате сравнения данных секвенирования амплифицированных фрагментов генов ms8 и cbp1 с помощью праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as и HcCBP1s-HcCBP2as, относительно референсной последовательности, были выявлены единичные замены и делеции нуклеотидов, не препятствующих отжигу праймеров при проведении реакции амплификации.
Оптимизация метода выделения ДНК возбудителя гистоплазмоза 2.
В ходе работы определены оптимальные методы выделения ДНК H.capsulatum из проб чистых культур, биологического материала и окружающей среды (вода, почва).
В работе использовали основные методы выделения ДНК, применяемые в практике. При исследовании чистых культур возбудителя гистоплазмоза использовали: высокотемпературный лизис, метод нуклеосорбции с разрушением клеточной стенки гуанидинтиоцианатом модифицированный [Boom R. et al., 1990;
Ткаченко Г.А. с соавт, 2007] и метод гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [Sandhu G.S. et al., 1995;
Ткаченко Г.А. с соавт, 2007].
Результаты опыта представлены на рисунке 2.
Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов ПЦР при различных способах экстракции ДНК H.сapsulatum 6652 с праймерами HcMs8s-Ms8as А – высокотемпературный лизис В - нуклеосорбция в присутствии гуанидинтиоционата С – гуанидин-фенольная экстракция с переосаждением ДНК изопропанолом В результате серии экспериментов установлено, что высокотемпературный лизис, оказался мало эффективным для выделения ДНК H.сapsulatum, вероятно, в связи с недостаточным разрушением клеточной стенки грибов. Использование в работе методики нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата натрия позволило повысить чувствительность ПЦР до 1х10 кл/мл.
Из всех апробированных методов наиболее эффективным для выделения ДНК из клеток H.сapsulatum при исследовании проб чистых культур оказался метод гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом. Чувствительность реакции амплификации с используемыми праймерами составила 1х104 - 1х105 кл/мл.
Основная проблема на этапе выделения ДНК из грибов заключается в трудности разрушения их клеточной стенки, которая существенно отличается от клеточной стенки бактерий и содержит глюканы, хитин, белки, обуславливающие устойчивость к действию большинства лизирующих агентов.
Для лизиса клеточной стенки и более полного экстрагирования ДНК из клеток гриба использовали литические препараты, разрушающие компоненты клеточной стенки микромицетов [Данилевич В.Н., Гришин Е.В., 2002;
Кабелина Т.С., Кулаев И.С., 2001;
Salazar O. et al., 2007].
В качестве источника литических ферментов первоначально использовали пищеварительный сок улитки (ПСУ) (ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Волгоград), ранее предложенный для применения в этом качестве [Шелохович А.И. с соавт, 1984].
В дальнейшем для расщепления клеточной стенки микромицетов использовали коммерческий препарат «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum» («Sigma-ALDRICH», Германия), обладающий целлюлазной, протеазной и хитиназной активностью и коммерческий препарат хитиназы «Chitinase from Trichoderma viride» в различных концентрациях и интервалах времени воздействия.
На основании проведенных экспериментов установлено, что применение лизирующих ферментов из T.harzianum в оптимальной концентрации 2 мг/мл с инкубированием смеси 1 ч при температуре (37±1) 0С позволило повысить эффективность экстракции ДНК из клеток H.capsulatum. В этом случае чувствительность ПЦР при исследовании проб чистых культур составила 3 1x10 – 1x10 кл/мл. Аналогичные показатели были получены при предварительном воздействии фермента хитиназы в концентрации 0,2 мг/мл с инкубированием смеси 1 ч при температуре (37±) 0С (рис.3).
Рисунок 3 - Электрофореграмма продуктов реакции амплификации ДНК H.сapsulatum 6652 из чистой культуры с использованием литических ферментов, праймеры HcMs8s-Ms8as А – гуанидин-фенольная экстракция с добавлением ПСУ (пищеварительный сок улитки) В – гуанидин-фенольная экстракция с добавлением препарата «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum»
С – гуанидин-фенольная экстракция с добавлением препарата «Chitinase from Trichoderma viride»
3. Оценка эффективности выбранных олигонуклеотидных праймеров при анализе гомологичных и гетерологичных штаммов микромицетов, а также экспериментальном гистоплазмозе После подбора метода выделения и оптимальных концентраций литических ферментов в реакции ПЦР были исследованы все штаммы Н.capsulatum, находящиеся в Коллекционном центре ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. В результате полученных данных были выявлены различия показателей аналитической чувствительности сконструированных праймеров.
Наибольшей чувствительностью обладали праймеры HcMs8s-Ms8as3.
Продукт амплификации синтезировался со всеми исследуемыми штаммами гриба с чувствительностью реакции 1х102 - 1х104 кл/мл в зависимости от штамма.
С праймерами на основе фрагмента гена cbp1 в концентрации 1х кл/мл в реакции ПЦР ДНК Н.capsulatum детектировали в 78% случаев, а ДНК H.capsulatum var. duboisii в этих же концентрациях в 100%.
У праймеров HcMs8s2-Ms8as чувствительность была ниже, чем у других взятых в работу праймеров - при концентрации 1х104 кл/мл детектировались 58 % проб. При этом, праймеры не детектировали ДНК H.capsulatum var.
duboisii, что позволяет с помощью ПЦР дифференцировать между собой клинически значимые варианты H.capsulatum var. capsulatum и H.capsulatum var. duboisii.
Для сравнения информативности результатов ПЦР с разработанными нами праймерами использовали затравки, комплементарные последовательностям гена 18S рРНК (GenBank NCBI X58572) [Bialek R., Fischer J.R. et al., 2001] и гена, кодирующего структуру специфического белка Н.capsulatum, имеющего молекулярную массу 100 кДа (GenBank NCBI AJ005963) [Bialek R., Ernst F. et al., 2002;
Bialek R., Feucht A. et al., 2002].
Реакцию амплификации с праймерами Hc100 PCR, детектирующими ген, кодирующий 100 кДа белок, и с праймерами Fungus, детектирующими ген 18S рРНК, проводили согласно протоколам, представленным зарубежными авторами [Bialek R., Fischer J.R. et al., 2001;
Bialek R., Ernst F. et al., 2002;
Bialek R., Feucht A. et al., 2002] (рис.4).
Рисунок 4 - Электрофореграмма специфичности праймеров зарубежных авторов А- праймеры Hc100 PCR [Bialek R., Ernst F. et al., 2002;
Bialek R., Feucht A. et al., 2002] В- праймеры Fungus [Bialek R., Fischer J.R. et al., 2001] 7 - C. рosadasii 36 Silveira 1 - H. capsulatum var. capsulatum 2 - H. capsulatum var. duboisii 630 8 - C. neoformans 9/ 3 - H. capsulatum var. farciminosum 12-89 9 - C. albicans 4 - B. dermatitidis 6064 10 - F. oxysporum F- 5 - P. brasiliensis В-851 11 - F. avenarium К+-положительный контрольный 6 - C. immitis образец При постановке реакции амплификации с праймерами Fungus специфические продукты ПЦР обнаружены у всех штаммов Н.capsulatum, находящихся в музее живых культур института. Но, в то же время, при использовании данных праймеров были получены ложноположительные результаты в пробах содержащих ДНК P. brasiliensis, B. dermatitidis и C.
albicans.
С помощью олигонуклеотидных затравок на основе гена, кодирующего 100 кДа белок Н.capsulatum (Hc100 PCR), в ПЦР синтезировались ампликоны всех трех вариантов H.capsulatum с чувствительностью 1х104 кл/мл.
Перекрестных реакций с используемыми в работе микромицетами не обнаружено. Однако, реакция амплификации с праймерами Hc100 PCR проводится в два раунда, что в свою очередь увеличивает риск контаминации, временные и материальные затраты на получение результатов ПЦР.
На основании сравнения результатов аналитической чувствительности разработанных праймеров в дальнейшей работе с пробами окружающей среды и биологического материала использовали праймеры HcMs8s-Ms8as3.
При исследовании проб окружающей среды (почва, вода), искусственно контаминированных клетками H.capsulatum, наибольшей чувствительности реакции амплификации удалось достигнуть, используя тот же метод, что и при работе с чистыми культурами. Чувствительность реакции ПЦР составила 1х104 кл/мл.
Так же были апробированы различные методы выделения ДНК из проб биологического материала, искусственно контаминированного клетками H.capsulatum. При сравнении используемых в работе методов более эффективным оказался метод гуанидин-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой нуклеосорбцией на SiO2. Метод обеспечивал визуализацию результатов реакции амплификации при концентрации микромицетов в пробе не ниже 1x10 кл/мл.
Для повышения чувствительности ПЦР при выделении ДНК из проб крови мы дополнительно использовали буфер, лизирующий эритроциты, следующего состава: 10 мM Трис, pH 7,6;
5 мM MgCl2;
10 мM NaCl [Loffler J.
et al., 1997]. В ходе работы было установлено, что предварительная обработка проб крови буфером, лизирующим эритроциты, и воздействие фермента хитиназы повышает чувствительность ПЦР до 1х103 - 1x10 кл/мл.
В процессе выделения ДНК из биологического материала основная задача – хорошо диспергировать ткань, чтобы разрушить клетки, а затем отделить ДНК от сопутствующих ей белков и посторонних примесей для постановки ПЦР. Так как в макроорганизме H.capsulatum располагается преимущественно внутриклеточно, в случае выделения ДНК из биологического материала, к исследуемому образцу, для лизиса тканей органа добавляли 50 мM NaOH. Установлено, что щелочной лизис и ферментативное воздействие хитиназы при выделении ДНК H.capsulatum из биологического материала позволяет повысить чувствительность ПЦР до 1х104 клеток в пробе.
Диагностическая информативность ПЦР с праймерами HcMs8s-Ms8as была изучена при работе с материалом, полученным от лабораторных животных, экспериментально зараженных возбудителем гистоплазмоза в различные сроки инфекционного процесса. Параллельно анализируемые пробы исследовали микологическим методом. Использование праймеров HcMs8s-Ms8as3 при анализе органов животных методом ПЦР позволило выявить исследуемые микроорганизмы в 19 (14,8 %) из 128 проб.
Применение культурального метода позволило обнаружить возбудителя в 21,1 % (т.е. в 27 из 128 проб).
В реакции амплификации ДНК возбудителя гистоплазмоза детектировали во всех исследуемых органах экспериментально зараженных животных. Процент положительных проб варьировал от сроков наблюдения и исследуемых тканей.
Наибольшее количество положительных проб ПЦР в 13 из 19 проб на всех сроках наблюдения было выявлено из органов брюшной полости (печень, селезенка). При внутрибрюшинном заражении поражение возникает в месте введения гриба, в печени, селезенке и поджелудочной железе, и лишь затем с током крови клетки H.сapsulatum распространяются в другие органы макроорганизма.
Возможность получения результатов ПЦР в более ранние сроки является одним из главных преимуществ метода и помогает в решении основной проблемы микологического метода - длительности (до 3 недель) исследования. Полученные результаты могут служить основанием для рекомендации использования разработанных праймеров, комплементарных фрагменту гена ms8, при исследовании проб биологического материала на наличие возбудителя гистоплазмоза.
4. Конструирование амплификационной тест-системы для выявления микромицетов вида Histoplasma Используя подобранные нами ранее олигонуклеотидные праймеры HcMs8s-Ms8as3 на основе нуклеотидной последовательности гена ms8, разработана тест-система «Амплиген Гисто» для выявления ДНК возбудителя гистоплазмоза методом полимеразой цепной реакции в пробах чистых культур и биологического материала.
С целью определения диагностической ценности (специфической активности, специфичности) «Набора реагентов для выявления ДНК микромицетов вида Histoplasma методом полимеразной цепной реакции «Амплиген Гисто» была разработана программа и проведено контрольное лабораторное испытание препарата. Материалом для исследования служили чистые культуры возбудителей гистоплазмоза и искусственно контаминированная кровь.
Специфическую активность препарата определяли анализом лизатов десятикратных разведений суспензии агаровых культур H. capsulatum. За специфическую активность принимали минимальную концентрацию микробных клеток, находящихся в 1 мл исследуемой пробы. Было установлено, что нижний предел чувствительности тест-системы «Амплиген Гисто» в реакции амплификации, при исследовании проб содержащих H.
capsulatum, составил 1х102 кл/мл (45% случаев). При наличии в пробе H.
capsulatum в концентрации 1х103 кл/мл процент положительных результатов реакции амплификации увеличился с 45 до 75%. В 100% случаев ДНК возбудителя гистоплазмоза определяли при концентрации микромицета 1х104 и выше кл/мл. При исследовании проб биологического материала методом ПЦР препарат «Амплиген Гисто» детектирует ДНК возбудителя гистоплазмоза в концентрациях 1х104 кл/мл. Ложноположительных результатов ПЦР при исследовании проб не содержащих ДНК возбудителя гистоплазмоза не зафиксировано.
Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать заключение об эффективности ПЦР-анализа в выявлении ДНК возбудителя гистоплазмоза. Сконструированный нами «Набор реагентов для выявления ДНК микромицетов вида Histoplasma методом полимеразной цепной реакции «Амплиген Гисто», предназначенный для идентификации H.capsulatum var.
capsulatum, H.capsulatum var. duboisii и H.capsulatum var. farciminosum, удовлетворяет всем предъявляемым к современным диагностическим системам требованиям по специфической активности и специфичности, а следовательно, может эффективно применяться для идентификации ДНК Н.capsulatum.
ВЫВОДЫ:
Выявлено, что группоспецифические праймеры HcMs8s-Ms8as3, 1.
комплементарные фрагменту гена, кодирующего белок мицелиальной фазы Ms8 и праймеры HcCBP1s-HcCBP2as – на основе гена кальций связывающего белка CBP, позволяют детектировать H. сapsulatum var.
capsulatum, H. сapsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum.
Показано, что с помощью праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcCBP1s 2.
HcCBP2as и HcMs8s2-Ms8as, возможна дифференциация клинически значимых вариантов возбудителя гистоплазмоза - H. сapsulatum var.
capsulatum и H. сapsulatum var. duboisii.
На основе нуклеотидной последовательности гена, детерминирующего 3.
белок мицелиальной фазы Ms8 определены олигонуклеотидные затравки, подобраны оптимальные условия, определены параметры проведения ПЦР и сконструирована амплификационная тест-система для идентификации возбудителя гистооплазмоза, позволяющая выявлять H. сapsulatum в концентрации 1х10 кл/мл.
Продемонстрирована возможность применения амплификационной 4.
тест-системы, разработанной на основе олигонуклеотидных затравок HcMs8s-Ms8as3 для специфической детекции H.capsulatum при исследовании объектов внешней среды (почвы, воды), искусственно контаминированных возбудителем гистоплазмоза и моделировании инфекционного процесса.
Подобраны оптимальные способы экстракции и очистки ДНК 5.
возбудителя гистоплазмоза из контаминированных проб различных объектов внешней среды и биологического материала, позволяющие выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1х104 кл/мл.
Установлено, что использование литических ферментов «Lysing 6.
Enzymes from Trichoderma harzianum» или «Chitinase from Trichoderma viride» на стадии пробоподготовки повышает концентрацию и чистоту препарата выделяемой ДНК, и, как следствие, чувствительность реакции амплификации на один-два порядка.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Фролов Д.М., Ткаченко Г.А., Вьючнова Н.В., Антонов В.А.
1.
Оптимизация метода выделения ДНК из клеток Histoplasma capsulatum // Вестник РГМУ. Материалы III Международной (XII Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции. - Москва. 2008. - №2(61). - С.342 - 343.
Ткаченко Г.А., Вьючнова Н.В., Гришина М.А., Антонов В.А., 2.
Савченко С.С., Лесовой В.С., Замараев В.С., Липницкий А.В.
Использование ПЦР для идентификации Histoplasma capsulatum // Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т.10, №2. - С.84 - 85.
Ткаченко Г.А., Вьючнова Н.В., Гришина М.А., Антонов В.А., 3.
Лесовой В.С., Липницкий А.В. Использование ферментов для выделения ДНК из клеток Histoplasma capsulatum // Иммунопатология, аллергология, инфектология – 2009. - №1.- С.12-13.
Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Антонов В.А., 4.
Савченко С.С., Липницкий А.В. Обнаружение возбудителей гистоплазмоза методом полимеразной цепной реакции / Биологическая безопасность в современном мире. Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора.- Оболенск. – 2009. - С.108-111.
Липницкий А.В., Алексеев В.В., Гришина М.А., Ткаченко Г.А., 5.
Антонов В.А., Савченко С.С., Вьючнова Н.В. Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики глубоких микозов // Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней.
Международная научно-практическая конференция. - Новосибирск. – 2009. С.119-122.
Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко 6.
С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В. Сравнительный анализ методов выделения ДНК из клеток Histoplasma capsulatum Darling // Проблемы медицинской микологии. – 2009. - Т.-11, №3. - С. 38-42.
Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., 7.
Антонов В.А. Сравнительный анализ различных праймеров для идентификации ДНК Histoplasma capsulatum // Вестник РГМУ. Материалы V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции. – Москва. – 2010. - №2. - С. 472.
Кочубеева Е.Н., Гришина М.А., Вьючнова Н.В., Липницкий 8.
А.В. К характеристике вирулентности Histoplasma capsulatum // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2010. - №1. - С.157.
Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко 9.
С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В. Использование ПЦР для подтверждения принадлежности грибов к виду Histoplasma // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2010. - №1. - С.151 152.
10. Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В. Применение ПЦР для детекции ДНК Histoplasma capsulatum при анализе образцов крови // Современные технологии обеспечения биологической безопасности. Материалы научно практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно исследовательских учреждений Роспотребнадзора. – Оболенск. – 2010. С.154-157.
11. Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В. Обнаружение ДНК Histoplasma capsulatum в биологическом материале методом ПЦР // Проблемы медицинской микологии. – 2010. - Т.-12, №2. - С. 74.
12. Ткаченко Г.А., Вьючнова Н.В., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В. Оценка эффективности различных праймеров для идентификации возбудителей особо опасных микозов // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010», сборник трудов. – 2010. - Т.1. С.434-437.
13. Шпак И.М., Савченко С.С., Антонов В.А., Гришина М.А., Ткаченко Г.А., Вьючнова Н.В. Типирование штаммов Histoplasma capsulatum на основе амплификации с произвольными праймерами // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010», сборник трудов. - 2010. - Т.1. - С.456-457.
14. Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А. Индикация возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР // Современные технологии обеспечения биологической безопасности.
Материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора. – Оболенск. – 2011. - С.166-169.
15. Шпак И.М., Ткаченко Г.А., Вьючнова Н.В., Леденева М.А., Гришина М.А., Антонов В.А. Внутривидовое типирование микромицетов Histoplasma capsulatum с использованием секвенирования // Современные технологии обеспечения биологической безопасности. Материалы III научно практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно исследовательских учреждений Роспотребнадзора. – Оболенск. – 2011. С.148-150.
Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко 16.
С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В. Конструирование олигонуклеотидных праймеров для выявления ДНК возбудителя гистоплазмоза // Проблемы медицинской микологии. – 2012. - Т.-14, №2. С. 58-63.
Гришина М.А., Кочубеева Е.Н., Липницкий А.В., Вьючнова 17.
Н.В., Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Антонов В.А. Разработка препаратов для диагностики особо опасных микозов / Инфекция и иммунитет // Материалы Х съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля, 2012, Т.2.-№1-2.-С.254.