Медицинский университет удк 579.842.16:579.252.55:615.33 носова елена станиславовна фенотипическая и молекулярно-генетическая характеристика вирулентности и резистентности к -лактамным антибиотикам кл
УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» УДК 579.842.16:579.252.55:615.33 НОСОВА Елена Станиславовна ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУЛЕНТНОСТИ И РЕЗИСТЕНТНОСТИ К -ЛАКТАМНЫМ АНТИБИОТИКАМ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ РОДА KLEBSIELLA Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.02.03 – микробиология Минск 2010 1 Работа выполнена в УО «Белорусский государственный медицин ский университет».Научный руководитель: Титов Леонид Петрович, доктор медицинских наук, профессор, член корреспондент НАН Беларуси, заведующий лабораторией клинической и эксперимен тальной микробиологии ГУ «Республикан ский научно-практический центр эпидемио логии и микробиологии» Официальные оппоненты: Близнюк Алина Михайловна, кандидат медицинских наук, доцент кафед ры эпидемиологии УО «Белорусский госу дарственный медицинский университет» Генералов Игорь Иванович, доктор медицинских наук, профессор, заве дующий кафедрой клинической микробио логии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» Оппонирующая организация: ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования» Защита диссертации состоится 16 июня 2010 года в 14.00 на заседа нии совета по защите диссертаций Д 03.18.04 при УО «Белорусский госу дарственный медицинский университет», по адресу: 220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, 83, тел. 272-55-98, e-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УО «Белорусский государственный медицинский университет».
Автореферат разослан «» _ 2010 г.
Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат медицинских наук, доцент А. М. Близнюк ВВЕДЕНИЕ Инфекции, вызываемые бактериями рода Klebsiella, являются актуаль ной проблемой медицинской науки и практического здравоохранения во всем мире, включая Республику Беларусь [Л.П. Титов и др., 2006;
R.S. Basri, 2008;
H. Sahly et al., 2008;
P.M. Hawkey, 2008;
F. Allerberger et al., 2008].
В структуре ВБИ Klebsiella занимают четвертое место, вызывая широкий спектр заболеваний [М.В. Эйдельштейн, 2001;
S. Nijssen et al., 2004;
J.R. Di Persio et al., 2005;
M. Tumbarello et al., 2006]. Медицинские проблемы клеб сиеллезной инфекции (КИ) неразрывно связаны с быстрым формированием лекарственной устойчивости, обусловленной продукцией -лактамаз расши ренного спектра действия (БЛРС). Частота распространения клебсиелл, про дуцирующих БЛРС, увеличивается с каждым годом и варьирует в зависимо сти от страны от 5% до 75%, что создает серьёзные трудности, связанные со снижением эффективности лечения, возникновением осложнений, увеличе нием сроков госпитализации [S. Cosgrove, 2003;
S. Nijssen, 2004;
R. Canton, 2008;
T.M Coque, 2008]. Одновременно с ростом уровня резистентности от мечается неуклонное расширение типов БЛРС среди штаммов клебсиелл, выделенных как от пациентов в стационарах и амбулаториях, так и из окру жающей среды [J. Pitout, 2005;
J. Empel, 2005;
G. L. Jacoby, 2005;
H. Sahly et al., 2008]. Проблемы молекулярной эпидемиологии штаммов-продуцентов БЛРС представляют высокую актуальность в мире [P.L. Winokur, 2001;
С.В. Сидоренко, 2003;
М.В. Эйдельштейн, 2005;
P.M. Hawkey, 2008;
R.
Canton, 2008]. Несмотря на наличие многочисленных данных и научных ра бот о генетических характеристиках -лактамаз [F. Cockerill, 1999;
G.A. Jacoby, 2005;
M. Pfaller, 2006;
H.J. Monstein, 2007;
Д.В. Иванов, 2008] их значение в клинических лабораториях недооценивается, а детекция штаммов-проду центов БЛРС часто несовершенна [S. Navon-Venezia et al., 2004;
M. Pfaller, 2006;
S. Grover et al., 2006]. Вопросы изучения распространенности -лактамаз и спектра мутаций, приводящих к развитию устойчивости к -лактамным препаратам, у клебсиелл, циркулирующих на территории Беларуси, остаются открытыми.
Ведущими резервуарами штаммов-продуцентов БЛРС могут являться биотопы желудочно-кишечного тракта, слизистой ротоглотки, ран [J.
Valverde et al., 2004;
N.-Y. Boo, V. Lim, 2005]. Молекулярно-генетические механизмы формирования резистентности клебсиелл к антибактериальным препаратам и их ассоциация с экспрессией факторов вирулентности недоста точно изучены. В связи с этим, исследование биологических свойств клебси елл, в частности факторов, влияющих на адгезивность и детерминирующих ее генов, позволит разработать более современные методы диагностики, а также профилактические меры, направленные на подавление ранних стадий инфекционного процесса.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Связь работы с крупными научными программами и темами.
Диссертационная работа была выполнена на кафедре микробиологии, виру сологии и иммунологии Белорусского государственного медицинского уни верситета. Отдельные этапы работы являлись частью научного исследования по теме «Идентифицировать гены вирулентности у микроорганизмов рода Klebsiella и получить мутантные авирулентные штаммы» (2003–2005 гг., № госрегистрации 200418) в рамках государственной программы «Генетиче ская инженерия» по разработке и использованию генно-инженерных био технологий в интересах сельского хозяйства и медицины.
Цель исследования: на основании молекулярно-генетической харак теристики факторов патогенности изучить генетическую вариабельность клинических изолятов клебсиелл, выявить мутации, связанные с формирова нием устойчивости к бета-лактамным антибиотикам.
Для достижения цели были поставлены следующие эксперименталь ные задачи:
1. Выявить резистентные штаммы Klebsiella spp., продуцирующие -лактамазы расширенного спектра действия молекулярного класса А, с использованием фенотипических и генотипических методов.
2. Изучить частоту и характер точечных замен нуклеотидов в генах -лактамаз SHV типа с помощью методов ПЦР-ПДРФ и секвенирования.
3. Определить в -лактамазах SHV типа характер замен аминокислот, ассоциированных с устойчивостью культур K. pneumoniae к -лактамным препаратам.
4. Исследовать частоту выявления основных генетических детерминант вирулентности, определяющих адгезивность клинических культур Klebsiella spp.
Объектом исследования явились 44 штамма и образца ДНК Klebsiella spp., выделенных из клинического материала больных. Культуры K.
pneumoniae составили 20 штаммов, K. oxytoca – 24.
Предметом исследования явились фенотипы резистентности к 14 анти биотикам;
гены -лактамаз молекулярного класса А трех типов – SHV, TEM и CTX;
замены в генах БЛРС SHV типа;
два гена, представляющие ко-регион острова патогенности;
адгезивная активность, проверенная на двух линиях клеток Hep-2 и KB;
четыре гена фимбриальных и нефибриальных адгезинов.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Расширение профиля фенотипической резистентности клинических штаммов Klebsiella spp. к пенициллинам, в том числе ингибиторозащищен ным, и цефалоспоринам обусловлено приобретением генов БЛРС молеку лярного класса А, а также гиперпродукцией конститутивных -лактамаз SHV-1 и K-1 типов. Ориентировочная информация о группах и типах -лактамаз, продуцируемых клиническими изолятами Klebsiella spp., полу чена на основании анализа профилей чувствительности к основным группам -лактамных антибиотиков.
2. Типирование SHV -лактамаз, наиболее часто выявляемых фермен тов молекулярного класса А у клинических культур K. pneumoniaе, методами ПЦР-ПДРФ и секвенирования позволяет установить их полиморфизм и идентифицировать мутации, приводящие к формированию устойчивости к -лактамным антибиотикам.
3. Бета-лактамазы у культур K. pneumoniaе SHV-1, SHV-2, SHV-5, SHV 11 и SHV-31 типов отличаются заменами одной или двух аминокислот и формируют различные уровни резистентности к -лактамным антибиоти кам. Увеличение резистентности к цефтазидиму, цефотаксиму и азтреонаму K. pneumoniae обусловлено присутствием генов SHV-2, SHV-5, SHV-31 типов и связано с заменами аминокислот в позициях 238 (Гли Сер) и 240 (Глу Лиз) фрагмента, кодирующего активный центр фермента.
4. Адгезивная способность клебсиелл является вариабельным призна ком вирулентности, обусловленным присутствием генов mrkD и cf29K, кодирующих адгезины, и ассоциирована с генотипом irp2+/fyuA+ острова патогенности.
Личный вклад соискателя. Соискателем совместно с научным руко водителем сформулированы цель и задачи исследования, определены мето ды и основные этапы выполнения работы. Диссертантом лично выполнены все экспериментальные исследования, проведен сравнительный анализ лите ратурных источников, опубликованных в отечественной и зарубежной печа ти, статистическая обработка полученных данных. Самостоятельно написа ны все разделы диссертации, совместно с научным руководителем выполнен анализ данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.
В публикациях [1–12] диссертанту принадлежит анализ данных литературы и собственных экспериментальных исследований, статистическая обработка данных.
Апробация результатов диссертации. Результаты научных исследо ваний были представлены: на научно-практической конференции «Актуаль ные вопросы клинической микробиологии» (г. Минск, 2006–2007 гг.), Рес публиканской научно-практической конференции «Профилактика и лечение госпитальных инфекций. Резистентность микроорганизмов к химиопрепара там» (г. Минск, 2006 г.);
международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (г. Минск, 2007 г.);
международной научно-практической конференции «Enteric bacteria and inflammatory bowel disease» (Республика Армения, г. Цахкадзор, 2008 г.), XI международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID по антимикробной тера пии (Россия, г. Москва, 2009), международном научно-практическом семи наре «Gut microbiota composition in Crohn’s disease patients» (Республика Армения, г. Агавнадзор, 2009 г.).
Опубликованность результатов диссертации. По теме диссертации опубликовано 12 научных печатных работ: 6 статей в рецензируемых науч ных журналах, 1 статья в электронном журнале СНГ;
1 статья в сборнике научных трудов;
4 тезиса в сборниках материалов международных научно практических конференций. Суммарный объем публикаций составляет 4 ав торских листа, в том числе статьи в рецензируемых журналах объемом в 3,2 авторских листа.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 111 страницах, включает 14 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, общей характери стики, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций по практическому использованию результатов, библиографи ческого списка, включающего список использованных источников (69 рус скоязычных и 195 иностранных) и список публикаций соискателя по теме диссертационной работы, приложений.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалом для исследования явились 44 клинических изолята бакте рий рода Klebsiella, выделенных из клинического материала больных.
Биоматериалом для микробиологического исследования служили образцы биологических сред (испражнения (n=40), отделяемое пупочной раны, зева, трахеостомы (n=4). Культуры K. pneumoniae составили 20 штаммов, K. oxytoca – 24.
Определение чувствительности культур Klebsiella spp. к антибио тикам. Определение чувствительности культур Klebsiella spp. к 14 антибио тикам осуществляли методом серийных двухкратных разведений препаратов в плотной питательной среде (Мюллер–Хинтон II). Определяли минималь ные ингибирующие концентрации (МИК) амоксициллина (АМХ), амокси циллин/клавулановой кислоты (AMC), ампициллин/сульбактама (SAM), цефтазидима (CAZ), цефотаксима (CTX), цефепима (CFM), азтреонама (AZT), имипенема (IMP), гентамицина, нетилмицина, амикацина, левомице тина, доксициклина, ципрофлоксацина. Подтверждение продукции -лакта маз проводили методом двойных дисков, в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам – CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institution, США). Контроль качества про водили тестированием контрольных штаммов E. coli АТСС25922, K.
pneumoniae ATCC700603.
Генотипирование -лактамаз молекулярного класса А Для амплификации фрагментов генов -лактамаз молекулярного класса А SHV, TEM и CTX типов использовали праймеры, предложенные T. Coque et al., 2002. Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы в ОДО «Праймтех» (г. Минск). Продукты амплификации генов SHV, TEM и CTX анализировали с помощью гель-электрофореза в 2%-ном геле.
ПЦР-ПДРФ анализ генов -лактамаз SHV типа. Исследование поли морфизма генов SHV проводили методом ПЦР-ПДРФ [A. Van der Zee et al., 2003]. Амплифицированные фрагменты гена SHV, подвергали обработке эндонуклеазами рестрикции NheI, DdeI, NruI («Fermentas», Литва).
Определение нуклеотидных последовательностей генов SHV. Реакци онную смесь после окончания ПЦР очищали от излишков праймеров, дНТФ и полимеразы при помощи наборов для выделения ДНК из амплификацион ной смеси («GeneElute PCR Clean-Up Kit», Sigma), в соответствии с инструк цией прилагаемой производителем, и использовали в качестве матрицы.
Секвенирование участков ДНК, электрофорез и анализ продуктов реакции проводили на автоматическом ДНК-анализаторе «ALFexpress II» c использо ванием коммерческих наборов и программных продуктов производства «Amersham Biosciences».
Методы оценки факторов вирулентности Для детекции ко-региона острова патогенности (ОП) амплифицирова ли фрагменты генов (irp2 и fyuА) сидерофорной системы с использованием праймеров, предложенных R. Koczura, A. Kaznowski, 2003. Ген irp2 кодирует белок, отвечающий за синтез сидерофора, fyuА – рецептор к бактериоцину.
Адгезивную активность изучали на культурах эпителиальных клеток Hep-2 и KB согласно методике, описанной N. Maroncle, C. Rich, C. Forestier, 2006. Клетки Hep-2 и KB культивировали на среде Игла (EMEM) с добавле нием 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% L-глютамина, 1% незаме нимых аминокислот, 10000 ед/мл пенициллина, 10 мг/мл стрептомицина и 25 мг/мл амфотерицина В. В лунки планшета с монослоем отмытых клеток Hep-2 (KB) вносили 1 мл среды EMEM с добавлением D-маннозы (для по давления неспеспецифической адгезии, обусловленной фимбриями 1-го ти па) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В каждую лунку планшета добавляли 25 мкл суспензии клеток клебсиелл (в концентрации 107/мл), полученной из 18-часовой ночной культуры, выросшей на LB-бульоне.
Для каждого штамма рассчитывали коэффициент адгезии (КА).
Определение генов 3-го типа фимбрий (mrkA и mrkD), cf29k, ompA.
Амплифицировали фрагменты генов 3-го типа фимбрий (mrkA, кодирует главную субъединицу и mrkD, отвечает за рецепторсвязующую специфич ность штаммов), нефимбриального адгезина – cf29K и порина наружной мембраны – ompА. В работе использовали праймеры, предложенные O.
Fumagalli et al., 1997. Поиск оптимальных условий проведения ПЦР прово дили для каждой пары праймеров.
Биоинформационный поиск. Поиск гомологичных нуклеотидных по следовательностей генов -лактамаз молекулярного класса А SHV типа осу ществляли с использованием сервиса BLAST в базе данных NCBI (Karlin S., 1993). Результаты секвенирования SHV генов сравнивали с данными биоин формационного анализа последовательностей, представленных в базе дан ных аминокислотных замен БЛРС на вебсайте http://www.lahey.org/studies/.
Множественное выравнивание, сравнительный анализ и определение пара метров схожести и различий нуклеотидных и аминокислотных последова тельностей осуществляли с использованием компьютерных программ MEGA 4 и BioEdit 7.0.1.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработ ку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 8, Microsoft Оffice Excel. При статистических расчетах использовали медиану (М). При сравнении независимых групп с ненормальным распределением значений одного или двух количественных признаков использовали непара метрический метод с помощью U-критерия Манна–Уитни. Сравнение групп по качественным признакам проводили с использованием критерия Хи квадрат Пирсона. В качестве критерия достоверности различий показателей принимали уровень значимости Р 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика антибиотикорезистентности и определение про дукции -лактамаз молекулярного класса А у клебсиелл с использова нием фенотипических и генотипических методов При суммировании данных антибиотикограмм культуры K. рneumoniae и K. oxytoca к большинству исследованных антибиотиков показали сходные фенотипы резистентности, однако, установлены некоторые различия в пока зателях устойчивости к различным классам препаратов. Высокую актив ность в отношении клинических штаммов Klebsiella spp. из тестируемых -лактамных антибиотиков проявил имипенем в диапазоне концентраций МИК 0,25–2 мг/л. Для K. pneumoniae цефтазидим и цефотаксим проявили меньшую эффективность (частота резистентных форм к ним составила 20±9,1% и 15±8,2%) по сравнению с препаратом 4-го поколения цефепимом (0%). Цефотаксим (частота резистентных форм 42±10,3%), цефепим (16,6±7,8%) и азтреонам (37±10,1%) проявили меньшую активность в отно шении K. oxytoca. Среди защищенных препаратов комбинация ампицил лин/сульбактам оказалась более эффективной по сравнению с амоксицил лин/клавулановой кислотой, частота выделения чувствительных штаммов K. рneumoniae к ним составила соответственно 100% и 70±10,5%, K. oxytoca – 70,8±9,4% и 16,6±7,7%. Этот феномен может быть связан с количеством продуцируемого фермента и/или дифференциальной активностью клавула ната и сульбактама в отношении различных -лактамных препаратов. При определении чувствительности необходимо тестировать оба препарата или тот, который предполагается использовать для терапии. Аминогликозид 3-го поколения амикацин проявил более низкую активность в отношении K. pneumoniae по сравнению с K. oxytoca (частота выделения резистентных вариантов составила 20±9,1% и 8,3±5,7%, соответственно).
Первичная информация о характере -лактамаз, присутствующих в клинических штаммах Klebsiella spp., была получена на основании анализа профилей чувствительности. Тест двойных дисков для подтверждения про дукции БЛРС был поставлен для культур Klebsiella spp., у которых МИК цефтазидима, цефотаксима, цефепима и азтреонама составляли более 1 мг/л (диапазон МИК 2 – 32 мг/л) и позволил выявить у 20,5±6,1% штаммов K. рneumoniae и 42±10,3% K. oxytoca продукцию ферментов -лактамаз мо лекулярного класса А. При оценке результатов МИК классическим методом разведения из них были признаны резистентными и умеренно резистентны ми только 7 штаммов K. рneumoniae (диапазон концентраций цефтазидима, цефотаксима 16 – 64 мг/л), а 2 штамма были идентифицированы как чувст вительные (МИК 8 мг/л). На основании определения чувствительности культур к антибиотикам двумя методами отмечено, что если при интерпре тации результатов использовать классические критерии оценки резистентно сти (повышение МИК цефтазидима, цефотаксима или азтреоанама 32 мг/л), то 22% изолятов, потенциальных продуцентов БЛРС, может остаться неуч тенным.
Характеристика фенотипов резистентности штаммов K. рneumoniae с гиперпродукцией SHV-1 и K. оxytoca с гиперпродукцией K- Анализируя антибиотикограммы установлено, что 27,3±6,7% штаммов K. рneumoniae и K. оxytoca продуцировали конститутивные цефалоспорина зы (SHV-1 и K-1) в количествах, обеспечивающих высокий уровень рези стентности к амоксициллину (32–64 мг/л), к ингибиторзащищенным пени циллинам и цефалоспоринам чувствительность сохранялась (диапазон МИК составлял 0,25–1 мг/л). Такой фенотипический профиль свидетельствовал об умеренном уровне продукции ранних -лактамаз SHV-1 и K-1 (дикий тип).
Различия фенотипов резистентности штаммов K. рneumoniae и K. оxytoca с продукцией конститутивных ферментов суммированы в таблице 1.
Таблица 1 – Профиль резистентности культур K. рneumoniae и K. оxytoca с нормальной и гиперпродукцией ферментов SHV-1 и K- Диапазоны МИК (мг/л) Антибио- K. рneumoniae K. оxytoca K. оxytoca K- K. рneumoniae тики гиперпродукция гиперпродукция SHV-1 (n = 3) (n = 9) SHV-1 (n = 5) K-1 (n = 5) AMX 32–64 16–32 64 AMC 0,5–1 8–64 0,25 8– SAM 0,5–1 0,5–2,0 0,25 8– CAZ 0,5 0,5–16 0,25 0,25–0, AZT 0,5 0,25–0,5 0,5 8– CFM 0,25 0,25–0,5 0,25 CTX 0,5 0,25–1,0 0,5 1– IMP 0,25 0,125–0,25 0,25 0, Вариабельность МИК -лактамных антибиотиков, наблюдаемая у кли нических штаммов Klebsiella была связана с различным уровнем продукции ферментов SHV-1 или K-1. Увеличение профиля резистентности к пеницил линам, в том числе ингибиторозащищенным, и цефалоспоринам, может воз никать при гиперпродукции конститутивных ферментов SHV-1 или K- [D. Hammond et al., 2003;
C. Fevre et al., 2005]. Фенотип таких штаммов ока зывается схожим со штаммами-продуцентами БЛРС. Из данных таблицы видно, что штаммы K. рneumoniae с гиперпродукцией хромосомного фер мента SHV-1 обладали умеренной резистентностью к цефтазидиму (диапазон МИК 0,5–16 мг/л), резистентностью к ингибиторозащищенным препаратам (8–64 мг/л), но проявили чувствительность к цефотаксиму. 37,5±10,1% штаммов K. oxytoca были резистентны к амоксициллину (МИК 64 мг/л), азтреонаму (МИК 8–32 мг/л), проявили сниженную чувствительность к це фотаксиму (МИК 1–2 мг/л), сохраняли чувствительность к цефтазидиму (МИК 0,25–0,5 мг/л). Такая антибиотикограмма свидетельствует о наличии у штаммов гиперпродукции хромосомной -лактамазы K-1, но не о продук ции БЛРС. Штаммы K. рneumoniae и K. oxytoca с гиперпродукцией консти тутивных ферментов SHV-1 и K-1 составили 22,7±6,3% и показали высокие уровни МИК к пенициллинам и цефалоспоринам 3-го поколения, т. е. про филь сходный с продуцентами БЛРС.
Частота выявления генов, кодирующих -лактамазы молекулярного класса А SHV, TEM и CTX типов у штаммов Klebsiella spp.
Для анализа генетических детерминант устойчивости к -лактамным препаратам были амплифицированы участки генов, кодирующие ферменты молекулярного класса А SHV, CTX, TEM типов. Гены -лактамаз были выяв лены у 68,2±7,0% штаммов клебсиелл отдельно либо в сочетаниях. Гены SHV с большей частотой встречались у культур K. рneumoniae по сравнению с K. оxytoca (100% против 41,7±10,3%). Выявлено, что спектр фенотипиче ской резистентности штаммов Klebsiella spp. был ассоциирован с присутст вием генов -лактамаз молекулярного класса А различных типов. Штаммы, у которых присутствовала комбинация двух генов SHV и CTX, отличались высокими показателями резистентности к цефотаксиму, цефепиму и азтрео наму по сравнению со штаммами, несущими только один ген SHV. Высокие уровни резистентности к тестируемым -лактамным препаратам проявили штаммы, несущие гены трех -лактамаз SHV, CTX и TEM типов (таблица 2).
В таблице приведены диапазоны МИК50–МИК90.
Таблица 2 – Спектр резистентности культур Klebsiella spp. с продукцией -лактамаз молекулярного класса А различных типов Антибиотики, МИК (мг/л) Гены -лактамаз CTX CAZ CFM AZT SHV тип (n = 20) 1–16 4–32 0,5–1 0,5– CTX тип – самостоятельно или в комбинации с SHV 32–64 4–16 4–16 32– (n = 6) Комбинация SHV, CTX, 64 8–64 32–64 16– TEM типов (n = 4) Анализ мутаций в генах -лактамаз SHV типа у клинических изолятов K. pneumoniae Дальнейшие исследования были основаны на анализе генов -лактамаз SHV типа. Для молекулярной характеристики SHV генов были отобраны 20 культур K. pneumoniae с фенотипическим проявлением продукции БЛРС, показавшие повышенный уровень резистентности к пенициллинам, цефа лоспоринам 3-го поколения и азтреонаму (диапазон МИК 2–64 мг/л), у кото рых был выявлен один ген SHV. Известно, что БЛРС SHV типа (SHV-2 – SHV-88) отличаются от своего предшественника SHV-1 заменами аминокис лот в нескольких сайтах (1–7) [D.M. Livermore, 1995;
F. Perez et al., 2007].
Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов позволил иден тифицировать гены SHV с заменами нуклеотидов, которые отличают ранний фермент SHV-1 от его многочисленных производных. При проведении ПЦР ПДРФ с использованием эндонуклеаз DdeI, NheI и NruI у 60±11,2% культур K. pneumoniae в генах SHV были обнаружены нуклеотидные точечные заме ны. Эндонуклеазу NheI использовали для обнаружения замены G A (GGC AGC, G697A) в позиции 697, при наличии которой наблюдалось формирование новых продуктов (770 п.о. и 160 п.о.) у 5 (25±9,9%) культур (рисунок).
Линии 1 – SHV-2;
2 и 3 – SHV-1;
4 и 5 – SHV- Рисунок – Результаты ПЦР-ПДРФ анализа SHV гена эндонуклеазой рестрикции NheI штаммов K. рneumoniae Сайт для фермента NruI в гене SHV был определен у 4 (20±9,2%) куль тур, выявивший замену в позиции 680 (CAG AAG, G680/A). При помощи эндонуклеазы рестрикции DdeI у 7 (35±10,9%) культур были идентифициро ваны мутации в позиции 35.
В результате проведения следующего этапа при секвенировании были определены точечные замены аминокислот и окончательно установлены SHV типы -лактамаз, продуцируемые штаммами K. pneumoniae. В генах SHV у 60±11,2% культур K. pneumoniae были обнаружены одна или две зна чимые точечные замены нуклеотидов, повлекшие за собой замены амино кислот лейцина на глутамин в положени 35, глицина на серин в положении 238, глутаминовой кислоты на лизин в положении 240.
Изучение таблиц замен аминокислот (http://www.lahey.org/studies) по зволило определить пять типов SHV ферментов, присутствующих в изучае мых штаммах. Одиночные замены аминокислот локализовались в позициях 35 и 238 и выявлены у 25±9,9% культур. Сравнительный компьютерный анализ позволил выявить у культур K. pneumoniae ферменты SHV-1 (n = 8), SHV-2 (n = 2), SHV-5 (n = 3), SHV-11 (n = 3), SHV-31 (n = 4). Из них выявлено присутствие генов БЛРС (SHV-2, SHV-5 и SHV-31) у 9-ти (45±11,4%) штам мов K. pneumoniae, ферментов SHV не БЛРС (SHV-1 и SHV-11) у 11-ти (55±11,4%). Позиции замен аминокислот в последовательности различных вариантов -лактамаз SHV типа, обнаруженные у штаммов клебсиелл, отра жены в таблице 3.
Таблица 3 – Спектр замен нуклеотидов в генах -лактамаз SHV типа Нуклеотидный триплет/аминокислоты SHV тип ПЦР-ПДРФ в позициях* -лактамаз 35 238 SHV-1** – СТА/Лей GGC/Гли GAA/Глу SHV-1 – СТА/Лей GGC/Гли GAA/Глу SHV-2 238 (NheI) СТА/Лей АGC/Сер GAA/Глу SHV-5 238 (NheI), 240 (NruI) СТА/Лей АGC/Сер АAG (ААА)/Лиз SHV-11 35 (DdeI) CАA/Глн GGC/Гли GAA (GAG)/Глу SHV-31 35 (DdeI), 240 (NruI) CАA/Глн GGC/Гли АAG/Лиз Примечание – * – нумерация сайтов замен в соответствии с номенклатурой R.P. Ambler, 1991;
** – SHV-1, GenBank X98098.
Ассоциация мутаций в генах -лактамаз SHV-2, SHV-5, SHV-11, SHV-31 типов с профилем фенотипической резистентности изолятов K. рneumoniae Мутации в позициях 238 и 240 приводят к пространственному измене нию конфигурации и свойств активного центра фермента, предохраняют -лактамазы группы SHV от действия пенициллинов и цефалоспоринов [P. Bradford, 2001;
A.A. Shah et al., 2004;
G.A. Jacoby, 2005;
T.-H. Liao et al., 2006]. В связи с этим спектр резистентности K. pneumoniae на основании тестирования 8 -лактамных антибиотиков был охарактеризован в зависимо сти от типа продуцируемого SHV фермента и локализации замены амино кислоты. Мутации в позициях 238 и 240 гена SHV в фрагменте, кодирующем участок активного центра, присутствовали у 9 исследованных культур K. рneumoniae (SHV-2, SHV-5, SHV-31) и были связаны с расширением спек тра резистентности. Установлено, что наличие генов -лактамаз SHV типа в штамме не обеспечивает приобретение резистентности ко всем -лактамам широкого спектра действия in vitro. Замены аминокислот в двух позициях способствует лучшему взаимодействию c карбоксильными группами цефта зидима и азтреонама [G. Jacoby, 2005;
G. Jacoby 2006]. Мутация только в по зиции 238 Гли Сер, выявленная у фермента SHV-2, приводила к умерен ному уровню резистентности азтреонама и цефтазидима (МИК 0,25–2 мг/л и МИК 1–32 мг/л, соответственно). Мутации в двух позициях 238 и 240, которые наблюдались у фермента SHV-5, резко увеличивали резистентность штаммов. Штаммы с продукцией фермента SHV-5 (238 Гли Сер, 240 Глу Лиз), демонстрировали более высокий уровень резистентности, чем с продук цией SHV-2. У штаммов с присутствием фермента SHV-5 диапазон МИК це фотаксима составил 4–8 мг/л, цефтазидима – 16–64 мг/л, азтреонама – 8 мг/л.
Отмечено, что штаммы K. pneumoniaе с продукцией ферментов БЛРС (SHV-2, SHV-5 и SHV-31), у которых регистрировались замены аминокислот в позициях 238 (Гли Сер) и 240 (Глу Лиз), проявили более высокий уровень резистентности к цефотаксиму, цефтазидиму и азтреонаму по срав нению с культурами, продуцирующими SHV-1 и SHV-11, и не имеющими мутаций в отмеченных выше позициях, Р 0,01 (таблица 4).
Таблица 4 – Антимикробная чувствительность штаммов K. рneumoniae в зависимости от геногруппы -лактамаз SHV типа K. рneumoniae продуцирующие K. рneumoniae продуцирующие ферменты не БЛРС (n = 11)1 ферменты БЛРС (n = 9) Антибиотики МИК мг/л МИК мг/л Медиана МИК50 МИК90 Медиана МИК50 МИК AMX 32 32 64 64 64 AMC 4 4 32 4 4 SAM 1 1 4 1 1 CTX 0,5 0,5 1 8* 8 CAZ 2 2 16 16* 16 CFM 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 AZT 0,25 0,25 0,5 2* 2 IMP 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 Примечание – 1 – ферменты не БЛРС – SHV-1 и SHV-11, 2 – ферменты БЛРС – SHV-2, SHV-5, SHV-31;
* – достоверные различия по сравнению с ферментами не БЛРС, Р 0,01.
Показано, что эффект замен аминокислот, локализующихся вне актив ного центра фермента SHV был намного меньшим. Фермент SHV-11 не имел замены в позиции 238, но отличался от SHV-1 заменой в позиции 35 (Лей Глн), которая не затрагивает участок, кодирующий активный центр фермен та. Цефалоспорины 3-го поколения и азтреонам проявляли активность в отношении штаммов с наличием SHV-11 в диапазоне концентраций 0,125– 2 мг/л. Фермент SHV-11 не проявлял выраженной повышенной гидролитиче ской активности в отношении -лактамных препаратов и, в связи с этим, был отнесен к категории штаммов не БЛРС.
Выявлено, что штаммы с продукцией БЛРС SHV-2, SHV-5, SHV-31 ти пов были резистентны к аминопенициллинам и цефалоспоринам in vitro и проявили 100%-ную чувствительность к цефепиму и имипенему. Следует отметить, что повышенные уровни резистентности к цефтазидиму и цефо таксиму не всегда ассоциированы с ферментами БЛРС. У 5-ти (25±9,9%) культур клебсиелл не было обнаружено сайтов ни для одной из исследован ных эндонуклеаз рестрикции, аминокислотных мутаций не было выявлено.
Такой фенотип резистентности проявляли ферменты SHV-1 при гиперпро дукции (таблица 1).
Молекулярно-генетическая характеристика острова патогенности и адгезинов Klebsiella spp.
Наличие в геноме микроорганизмов островов патогенности является главным признаком, отличающим патогенных бактерий от непатогенных [S. Bach, 2000;
А.Р. Мавзютов, 2002;
J. Gartner, 2004]. Частота обнаружения у Klebsiella spp. генов ко-региона ОП (irp2 и fyuA), вовлеченных в синтез, регуляцию и транспорт сидерофоров, представляющих систему ассимиляции железа и играющих важную роль в патогенезе, составила 63,6±7,3% для irp гена, 52,3±7,5% – для fyuA. При изучении результатов ПЦР была отмечена неоднородность амплифицируемого фрагмента гена fyuA, у 25±9,9% штам мов K. pneumoniae регистрировался укороченный фрагмент гена. Таким об разом, при сравнительном анализе распределения генов ОП было выявлено, что генотип irp2+/fyuA+ формировали 52,3±7,5% штаммов клебсиелл, irp2+/fyuA- – 25,0±6,5%, irp2-/fyuA- – 22,7±6,3%.
Анализ адгезивной активности клебсиелл с использованием культур клеток Hep-2 и KB Определение адгезивной способности клебсиелл на культурах клеток Нер-2 и КВ выявило, что все исследованные штаммы экспрессировали 3-й тип маннозо-резистентных фимбрий и демонстрировали в связи с этим адге зивную активность. По степени адгезивности были выделены группы с вы соким уровнем адгезии, у которых КА составлял 2,5 и выше, средним – 1,0– 2,4 и низким – 0,047–0,9. Выявленные различия адгезивной активности к культурам клеток Нер-2 и КВ могли быть обусловлены рецепторной спе цифичностью и позволили предположить неодинаковое распределение генов, формирующих индивидуальные механизмы адгезии исследуемых культур Klebsiella spp. Изучение генетических детерминант, отвечающих за продук цию 3-го типа маннозорезистентных фимбрий, позволило определить у всех исследованных штаммов клебсиелл ген mrkА. Отмечалось, что ген mrkD, от вечающий за рецепторсвязанную специфичность Klebsiella, с большей час тотой встречался среди штаммов K. oxytoca по сравнению с K. рneumoniae (71,4±8,7% против 28,6±8,7%). Комбинация двух генов mrkD и mrkA была обнаружена у 63,6±7,25% культур. Функции 3-го типа фимбрий заключают ся в лиганд-рецепторном взаимодействии и формировании биопленки на эпителии слизистых, а так же поверхности имплантов и катетеров, что явля ется решающим фактором для выживаемости клебсиелл [J. Langstraat, 2001;
P. Di Martino, 2003;
B.J. Chang et al., 2006]. Адгезивная активность штаммов была обусловлена присутствием нескольких генов адгезии. Ген нефимбри ального адгезина cf29K, принадлежащий к семейству адгезинов K88, был оп ределен у 56,8±7,5% клинических штаммов клебсиелл. Анализ результатов ПЦР и показателей адгезии показал, что штаммы клебсиелл с наличием ге нов mrkD и cf29K отличались высокой и средней адгезивной активностью, КА составлял 1,4–2,5. Присутствие в геноме клебсиелл кластера генов ОП irp2-fyuA облегчает колонизацию и способствует усилению вирулентных свойств изолятов [R. Koczura, A. Kaznowski, 2003]. При сопоставлении ре зультатов присутствия генов ОП с показателем адгезивной активности было отмечено, что у культур с генотипом irp2-/fyuA- адгезивная способность была снижена, коэффициент адгезии находился в пределах 0,047–0,9. Установлено статистически значимая ассоциация между присутствием у штаммов клебси елл кластера генов ОП fyuA-irp2 и повышенной адгезивной способностью.
Группа культур клебсиелл с присутствием двух генов ОП (патогенотипом irp2+/fyuA+), характеризовалась достоверно повышенной адгезивной способ ностью (КА 1,0–5,3), по сравнению с группой штаммов irp2-/fyuA- (Р 0,05).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные научные результаты диссертации 1. Устойчивость Klebsiella spp. к -лактамным препаратам обусловлена продукцией -лактамаз молекулярного класса А (SHV, TEM и CTX типов), которые обнаруживаются у 68,2±7,0% клинических изолятов. Установлено, что изоляты Klebsiella spp. проявляют резистентность к трем и более -лак тамным антибиотикам. Штаммы, в геноме которых присутствует комбина ция двух генов -лактамаз SHV и CTX типов, отличаются высокими показа телями резистентности к цефотаксиму, цефепиму и азтреонаму от штаммов, у которых выявляется только один ген SHV [1, 2, 10].
2. Результаты антибиотикограмм позволяют дифференцировать штам мы K. pneumoniae и K. oxytoca, продуцирующие БЛРС и конститутивные ферменты SHV-1 и K-1, а также оценить их уровень продукции. Гиперпро дукция конститутивных ферментов SHV-1 и K-1 может проявляться сходны ми профилями антибиотикорезистентности со штаммами-продуцентами БЛРС. Штаммы K. рneumoniae с гиперпродукцией конститутивного фермен та SHV-1 проявляют резистентность к пенициллинам, ингибиторозащищен ным пенициллинам, умеренную резистентность к цефтазидиму, чувстви тельность к цефотаксиму. Штаммы K. oxytoca с гиперпродукцией K-1 прояв ляют характерный фенотип – резистентность к пенициллинам, цефалоспо ринам (цефотаксиму), азтреонаму, однако сохраняют чувствительность к цефтазидиму [5, 7, 9].
3. Культуры K. рneumoniae характеризуются высокой частотой (100%) выявления генов, кодирующих -лактамазы молекулярного класса А SHV типа. Впервые методом ПЦР-ПДРФ с использованием эндонуклеаз рестрик ции NheI, DdeI и NruI и на основании изучения нуклеотидных последова тельностей установлен полиморфизм генов SHV у культур K. pneumoniae.
Определены точечные замены нуклеотидов в положениях G697A у 25% культур K. рneumoniae, G680/A – 20% [1, 2, 6, 9].
4. Выявлено присутствие генов БЛРС (SHV-2, SHV-5, SHV-31 типов) у 45% штаммов K. рneumoniae, антибиотиконеинактивирующих ферментов (SHV-1 и SHV-11) – у 55% штаммов. Компьютерный анализ аминокислотных замен в -лактамазах SHV типа выявил наиболее частые замены в положени ях 35 (Лей Глн), 238 (Гли Сер) и 240 (Глу Лиз) [5, 6, 11, 12].
5. Фенотипы резистентности штаммов K. pneumoniae к -лактамным антибиотикам обусловлены типом продуцируемых SHV ферментов и ассо циированы с локализацией замен аминокислот. На основании спектра выяв ленных мутаций в генах SHV показано, что у штаммов K. pneumoniae увели чение уровня МИК к цефалоспоринам 3-го поколения (цефтазидиму и цефо таксиму) и азтреонаму связано с присутствием БЛРС типов SHV-2 (238 Гли Сер), SHV-5 (238 Гли Сер, 240 Глу Лиз), SHV-31 (35 Лей Глн, 240 Глу Лиз), у которых регистрировались замены аминокислот в актив ном центре фермента. Замены аминокислот в позиции фрагмента вне актив ного центра у -лактамаз SHV-11 (35 Лей Глн) существенно не приводят к увеличению резистентности K. рneumoniaе [5, 6, 11, 12].
6. У культур Klebsiella spp. выявлены генотипы острова патогенности irp2 /fyuA+ (52,3±7,5%), irp2+/fyuA- (25±6,5%), irp2-/fyuA- (22,7±6,3%).
+ У культур клебсиелл с повышенной адгезивной способностью чаще выяв ляются гены острова патогенности (irp2+/fyuA+) и адгезинов (mrkD и cf29K) (Р 0,03) [3, 4, 8].
Рекомендации по практическому использованию результатов При определении чувствительности клинических штаммов K.
pneumoniae и K. oxytoca фенотипическими тестами рекомендуется использо вать подтверждающий тест (комбинацию дисков цефтазидим и цефтази дим/кла-вуланат) для выявления штаммов-продуцентов -лактамаз расши ренного спектра действия молекулярного класса А.
В качестве чувствительного (маркерного) антибиотика для скрининга БЛРС SHV типа у клинических изолятов K. pneumoniae предпочтительно использовать цефтазидим.
Метод ПЦР-ПДРФ с использованием рестрикционных эндонуклеаз NheI, DdeI и NruI рекомендуется для определения в генах БЛРС SHV типа точечных мутаций, приводящих к устойчивости культур к -лактамным пре паратам.
Показатели адгезии, присутствие генов адгезинов mrkD и cf29K могут рассматриваться в качестве критерия при оценке вирулентности штаммов Klebsiella spp., выделенных из патологического материала. Данные о выяв лении генетических маркеров вирулентности, информативны для эпидемио логического анализа при оценке этиологической значимости Klebsiella spp.
Основные результаты, изложенные в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии БГМУ (акт внедрения от 24.04.09);
фенотипический тест с использованием комбинации дисков цефтазидим и цефтазидим/клавулановая кислота, метод ПЦР-ПДРФ с использованием рестрикционных эндонуклеаз NheI, DdeI и NruI для опре деления точечных мутаций, приводящих к развитию устойчивости к -лак тамным препаратам, внедрен в работу вирусобактериологической лаборато рии УЗ «Детская городская инфекционная клиническая больница» (акты внедрения от 29.05.09).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ Статьи в научных журналах 1. Носова, Е.С. Бета-лактамазы широкого спектра действия бактерий рода Klebsiella при кишечном дисбактериозе / Е.С. Носова, Л.П. Титов // Здравоохранение. – 2005. – № 11. – С. 35–38.
2. Носова, Е. С. Частота выявления генов бета-лактамаз расширенного спектра действия у клинических изолятов Klebsiella pneumoniae и Klebsiella oxytoca и их связь с проявлением фенотипической резистентности к анти биотикам / Е.С. Носова, О.В. Дьяконова, Л.П. Титов // Медицинские ново сти. – 2006. – № 10. – С. 115–118.
3. Носова, Е.С. Адгезивная способность и распределение генов, коди рующих адгезины у энтеропатогенных Klebsiella spp / Е.С. Носова, Л.П. Ти тов // Доклады Национальной академии наук Беларуси. – 2008. – Т. 52, № 4. – С. 78–82.
4. Носова, Е.С. Частота выявления генов вирулентности иерсиний у клебсиелл, выделенных от больных кишечным дисбактериозом / Е.С. Но сова, Л.П. Титов // Здравоохранение. – 2008. – № 11. – С. 39–41.
5. Nosava, E.S. Biological properties and genetic analysis of the virulence factors Klebsiella spp. strains isolated from patients with enteric dysbacteriosis symptom complex / E.S. Nosava, L.P. Titov // New electronic journal of natural sciences. – 2009. – Vol. 1, № 12. – Р. 30–35.
6. Носова, Е.С. Молекулярно-генетический анализ генов бета-лактамаз SHV типа у энтеропатогенных штаммов Klebsiella spp. / Е.С. Носова, Л.П. Титов // Доклады Национальной академии наук Беларуси. – 2009. – Т. 53, № 2. – С. 85–90.
7. Носова, Е.С. Выявление -лактамаз расширенного спектра действия у клинических штаммов Klebsiella spp. с использованием методов серийных разведений антибиотиков и двойных дисков / Е.С. Носова, Л.П. Титов // Ме дицинские новости. – 2009. – № 12. – С. 66–68.
Статьи в сборниках научных трудов 8. Носова, Е.С. Факторы патогенности бактерий рода клебсиелла / Е.С. Носова, Л.П. Титов // Проблемы бактериологии и иммунологии: мате риалы юбил. науч. конф. (К 80-летию каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии БГМУ). – Минск, 2005. – С. 49–60.
Материалы конференций 9. Носова, Е.С. Генотипическая характеристика бета-лактамного про филя и ассоциированной резистентности клинических штаммов клебсиелл / Материалы Республиканской научно-практической конференции «Профи лактика и лечение госпитальных инфекций, резистентность микроорганиз мов к химиопрепаратам». – Минск, 2006. – С. 45.
10. Носова, Е.С. Идентификация генов бета-лактамаз расширенного спектра действия у клинических изолятов клебсиелла и их связь с проявле нием фенотипической резистентности к антибиотикам / Е.С. Носова, Л.П. Титов // Материалы международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», 17–18 мая 2007. – Минск, 2007. – С. 125–126.
11. Носова, Е.С. Определение мутаций в генах, кодирующих бета лактамазы широкого спектра действия SHV-типа методами ПЦР-ПДРФ и секвенированием у клинических изолятов Klebsiella spp. / Е.С. Носова, Л.П. Титов // Материалы XI Международного конгресса МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии, Москва, 27–29 мая. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2009. – Т. 11, № 2, Приложение 1. – С. 28.
12. Nosava, E.S. Discrimination of SHV -lactamase genes by RFLP and sequencing in Klebsiella spp. isolates / E.S. Nosava, L.P. Titov // ISTC seminar
Abstract
book «Gut microbiota composition in Crohn’s disease patients», 24– November 2009. – Agavnadzor, Armenia, 2009. – Р. 47.
РЭЗЮМЭ Носава Алена Станіславаўна Фенатыпічная і малекулярна-генетычная характарыстыка вірулентнасці і рэзістэнтнасці да -лактамных антыбіётыкаў клінічных штамаў роду Klebsiella Ключавыя словы: Klebsiella spp., -лактамазы малекулярнага класа А, мутацыі ў генах SHV, гены вострава патагеннасці і адгезінаў.
Аб’ект даследавання: штамы і ўзоры ДНК Klebsiella spp., вылучаныя з клінічнага матэрыялу хворых.
Прадмет даследавання: фенатыпы рэзістэнтнасці Klebsiella spp., гены -лактамаз малекулярнага класа А, замены у генах БЛПС SHV тыпу, гены вострава патагеннасці і адгезінаў, адгезіўная актыўнасць.
Мэта працы: на падставе малекулярна-генетычнай характарыстыкі фактараў патагеннасці вывучыць генетычную варыябельнасць клінічных ізалятаў клебсіел, выявіць мутацыі, злучаныя з фармаваннем устойлівасці да -лактамных антыбіётыкаў.
Метады: бактэрыялагічныя, малекулярна-генетычныя, культуральныя, статыстычныя.
Атрыманыя вынікі i iх навiзна: выяўлены механізм фармавання ўстойлівасці да цэфаласпарынаў 3-га пакалення і азтрэанаму абумоўлены прадукцыяй -лактамаз малекулярнага класа А (SHV, TEM і CTX тыпаў).
Праведзена тыпаванне SHV -лактамаз з выкарыстаннем малекулярных метадаў ПЦР-ПДРФ і секвеніравання;
выяўлены палімарфізм генаў SHV.
Упершыню спектр рэзістэнтнасці K. pneumoniae на падставе тэставання -лактамных антыбіётыкаў ахарактарызаваны ў залежнасці ад тыпу прадуцыруемага SHV ферменту і лакалізацыі замены амінакіслаты. Паказана, што штамы K. pneumoniaе з прадукцыяй ферментаў БЛПС SHV-2, SHV- і SHV-31, у якіх рэгістраваліся замены ў пазіцыях 238 (Глі Сер) і 240 (Глу Ліз), выявілі высокі ўзровень рэзістэнтнасці да цэфатаксіму, цэфтазідзіму і азтрэанаму ў параўнанні з культурамі, якія прадуцыруюць SHV-1 і SHV- і не маюць мутацый у адзначаных вышэй пазіцыях. Выяўлены залежнасці паміж адгезіўнай здольнасцю, прысутнасцю генаў mrkD і cf29K і генатыпам вострава патагеннасці irp2+/fyuA+ у штамаў клебсіел.
Рэкамендацыi па выкарыстанні вынікаў: для малекулярна генетычнага маніторынгу ізалятаў Klebsiella spp., якія прадуцыруюць -лактамазы пашыранага спектра дзеяння.
Вобласць прымянення: клінічная бактэрыялогія, малекулярная эпідэміялогія, інфекцыйныя хваробы.
РЕЗЮМЕ Носова Елена Станиславовна Фенотипическая и молекулярно-генетическая характеристика виру лентности и резистентности к -лактамным антибиотикам клинических штаммов рода Klebsiella Ключевые слова: Klebsiella spp., -лактамазы молекулярного класса А, мутации в генах SHV, гены острова патогенности и адгезинов.
Объект исследования: штаммы и образцы ДНК Klebsiella spp., выде ленные из клинического материала больных.
Предмет исследования: фенотипы резистентности Klebsiella spp., гены -лактамаз молекулярного класса А, замены в генах БЛРС SHV типа, гены острова патогенности и адгезинов, адгезивная активность.
Цель работы: на основании молекулярно-генетической характеристики факторов патогенности изучить генетическую вариабельность клинических изолятов клебсиелл, выявить мутации, связанные с формированием устой чивости к -лактамным антибиотикам.
Методы: бактериологические, молекулярно-генетические, культураль ные, статистические.
Полученные результаты и их новизна: выявлен механизм формиро вания устойчивости к цефалоспоринам 3-го поколения и азтреонаму обу словленный продукцией -лактамаз молекулярного класса А (SHV, TEM и CTX типов). Проведено типирование SHV -лактамаз с использованием молекулярных методов ПЦР-ПДРФ и секвенирования;
выявлен полимор физм генов SHV. Впервые спектр резистентности K. pneumoniae на основании тестирования -лактамных антибиотиков охарактеризован в зависимости от типа продуцируемого SHV фермента и локализации замены аминокислоты.
Показано, что штаммы K. pneumoniaе с продукцией ферментов БЛРС SHV-2, SHV-5 и SHV-31, у которых регистрировались замены в позициях 238 (Гли Сер) и 240 (Глу Лиз), проявили высокий уровень резистентности к цефо таксиму, цефтазидиму и азтреонаму по сравнению с культурами, продуци рующими SHV-1 и SHV-11, не имеющих мутаций в отмеченных выше пози циях. Выявлены зависимости между адгезивной способностью, присутстви ем генов mrkD и cf29K и генотипом острова патогенности irp2+/fyuA+ у штаммов клебсиелл.
Рекомендации по использованию результатов: для молекулярно генетического мониторинга изолятов Klebsiella spp., продуцирующих -лак тамазы расширенного спектра действия.
Область применения: клиническая бактериология, молекулярная эпи демиология, инфекционные болезни.
SUMMARY Nosava Alena Stanislavauna The phenotypic and molecular-genetic characteristic of virulence and resistance to -lactam antibiotics in Klebsiella clinical strains Key words: Klebsiella spp., -lactamases molecular classes A, mutation in genes SHV, high-pathogenicity island and adhesins genes.
Object of research: strains and DNA samples Klebsiella spp. recovered from patient’s clinical material.
Subject of research: Klebsiella spp. resistance phenotype, -lactamases molecular class A genes, nucleotide replacements in SHV genes, high pathogenicity island and adhesins, adhesion activity.
Aim of research: on the basis of molecular-genetic characteristics of pathogenicity factors to study clinical Klebsiella spp. isolates genetic variability, to reveal the mutations associated with resistance to -lactam antibiotics formation.
Methods: bacteriological, molecular biological, cell culture, statistical.
Obtained results and their novelty: the resistance mechanism to 3rd generation cephalosporins and aztreonam caused by -lactamase molecular class A (SHV, TEM and CTX types) production has been revealed. Molecular typing with PCR-RFLP and sequence techniques revealed SHV -lactamase gene polymorphism. K. pneumoniae resistance profile on the basis of testing -lactame antibiotics was characterized depending on SHV enzyme type produced and amino acid replacement localization. K. pneumoniaе strains harbored ESBL SHV-2, SHV-5 and SHV-31 enzymes with replacements in 238 (Gly Ser) and 240 (Glu Lys) positions have shown high resistance level to cefotaxim, ceftazidim and aztreonam in comparison with the cultures producing SHV-1 and SHV-11 without mutation in positions noted above. Dependences between adhesion ability, presence of mrkD and cf29K genes and pathogenicity islands genotype irp2+/fyuA+ were shown.
Recommendations for application: for genetic monitoring Klebsiella spp.
strains with ESBL production.
Fields of application: clinical bacteriology, molecular epidemiology, infectious diseases.
Подписано в печать 30.04.10. Формат 6084/16. Бумага писчая «КюмЛюкс».
Печать офсетная. Гарнитура «Times».
Усл. печ. л. 1,16. Уч.-изд. л. 1,21. Тираж 60 экз. Заказ 250.
Издатель и полиграфическое исполнение:
учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет».
ЛИ № 02330/0494330 от 16.03.2009.
ЛП № 02330/0150484 от 25.02.2009.
Ул. Ленинградская, 6, 220006, Минск.