Новая технология культивирования высших базидиомицетов в искусственно замкнутой экосистеме
На правах рукописи
Калашников Андрей Анатольевич
НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЫСШИХ
БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ИСКУССТВЕННО ЗАМКНУТОЙ
ЭКОСИСТЕМЕ
03.01.06 – биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов - 2011
Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»
Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Миронов Александр Давыдович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Дыкман Лев Абрамович доктор биологических наук, профессор, Бушов Александр Владимирович
Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»
Защита состоится «17» февраля 2011 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г.
Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.
Автореферат диссертации разослан «13» января 2011 г. и размещен на сайте университета www.sgau.ru.
Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Карпунина Л.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Современное развитие грибоводства в России выявило потребность создания новых интенсивных технологий, удовлетворяющих современным требованиям: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, высокая продуктивность и товарные качества мицелия и плодовых тел.
Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ..., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской.
Общеизвестно, что непрерывное культивирование какого-либо сорта гриба в течение длительного времени неизбежно приводит к потере урожайности в результате генетического «старения». Поэтому, получение новых гибридов вешенки, обладающих повышенной урожайностью по сравнению с родительскими производственными штаммами, является наиболее актуальной задачей в области селекции грибов.
Не менее важной задачей является защита субстрата для получения плодовых тел от контаминации посторонней микрофлорой при помощи экологически чистых биопрепаратов, не способных оказывать негативное влияние на окружающую среду и здоровье потребителя. Современные способы выращивания мицелия и плодовых тел высших грибов-базидиомицетов основаны на интенсивной стерильной технологии в искусственно замкнутой экосистеме – специальных контейнерах с использованием растительных субстратов, следуя которой возможно получение быстрого и обильного урожая. Однако, применение этой технологии связано со значительными материальными и энергетическими затратами, включающими наличие специализированных бактериологических лабораторий и помещений для подготовки субстрата и выращивания мицелия и плодовых тел грибов небольшими грибоводческими фирмами.
В связи с этим, важной задачей современной грибной индустрии является создание новых технологий, позволяющих при незначительном повышении материальных затрат получить высокий урожай плодовых тел грибов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Eger, Wang, Anderson, 1972;
Eger, 1974;
Larraya, 2002).
Цель работы: разработка новой технологии культивирования мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus, позволяющей с минимальными затратами в относительно простых условиях получать качественный мицелий и высокий урожай плодовых тел гриба.
Задачи исследования:
1. Получить новые гибриды P. ostreatus путем скрещивания производственного и полученного из природных объектов штаммов вешенки.
2. Оценить влияние различных стимуляторов на интенсивность роста мицелия изучаемых штаммов гриба на плотных и жидких питательных средах.
3. Провести сравнительный анализ урожайности вешенки на растительных субстратах, обработанных перекисью водорода.
4. Изучить влияние бактерий Bacillus subtilis 26D – основного действующего вещества промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М» на характер взаимодействия P. ostreatus и естественного контаминанта - плесневого гриба р.
Trichoderma.
5. Оценить урожайность изучаемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом «Фитосприн-М».
6. Провести промышленные испытания разработанной технологии культивирования P. ostreatus.
Научная новизна. Получен новый гибридный штамм Pleurotus ostreatus Т5, при скрещивании P. оstreatus ВС (промышленный штамм) P. оstreatus L (дикий штамм).
Обоснована эффективность применения естественного стимулятора – экстракта дубовой коры для интенсификации роста мицелия при мелкотоварном и промышленном культивировании грибов рода P. ostreatus - Вешенка.
Впервые изучено биотическое влияние промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М», содержащего в качестве биологически активного агента клетки Bacillus subtilis 26Д, на жизнедеятельность P. ostreatus в частично замкнутой экосистеме.
Практическая значимость работы. Разработанная технология культивирования плодовых тел Pleurotus ostreatus в перспективе может быть использована грибоводческими хозяйствами России, как в мелкотоварных, так и промышленных объемах. Данная технология используется для выращивания грибов вешенки в ОАО «Совхоз-Весна» (г. Саратов), что подтверждается актом о внедрении от 21.04.2009.
Материалы диссертационной работы вошли в учебное пособие «Проблемы и перспективы биологического разнообразия» (в соавторстве с Мироновым А.Д., Бондаренко Г.В., Соболевой Л.В., Зиминым П.В., Калашниковым А.А., 2008) для студентов, специализирующихся в области биоэкологии, рекомендованное и одобренное Учебно-методическим советом биотехнологического факультета СГАУ им. Н.И. Вавилова. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и написании дипломных работ в СГАУ им. Н.И.
Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордиев при 22-25С 2. Экстракт дубовой коры стимулирует рост мицелия, что зафиксировано при выращивании клеток мицелия гибрида P. ostreatus Т5 на шуттель-апарате и лабораторном ферментере «Анкум-2M.
3. Штамм Bacillus subtilis 26Д, выделенный из препарата «Фитоспорин-М», с мицелиальной культурой P. ostreatus Т5 и спорами чистой культуры Trichoderma spp.
на среде МС ингибировал развитие микромицета Trichoderma spp.
4. Наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома;
обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и повышает общую урожайность.
5. При культивировании штамма P. ostreatus Т5 на субстрате, обработанном препаратом «Фитоспорин-М», происходит уменьшение времени появления примордий и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения.
Работа выполнена на кафедре экологии, биологии, физиологии и фармакологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.
Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологических свойств высших грибов-базидиомицетов».
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на:
- Всероссийской конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции», (Саратов, 2008);
- Всероссийской научно-практическая конференция. «Актуальные проблемы ветеринарной патологии сельскохозяйственных животных и птиц», (Саратов, 2008);
- Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию госагроуниверситета. «Вавиловские чтения-2008», (Саратов, 2008).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 4 работы, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей в себя материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, предложений производству, списка используемых литературных источников, включающего 116 источников, в том числе 68 зарубежных авторов и приложений. Работа изложена на 144 страницах и иллюстрирована 22 рисунками, таблицами.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты, материалы и методы исследований В работе использованы два штамма Pleurotus ostreatus БС и P. оstreatus L, полученные из коллекции грибов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук. Исследование проводили по следующей схеме (рис. 1).
Вегетативный мицелий данных штаммов культивировали на модифицированной среде Семерджиевой с добавлением экстракта дубовой коры.
Гибридизацию исходных штаммов проводили по методу Г. Фритше (1969), используя для этих целей моноспоровую селекцию.
Глубинное культивирование мицелия проводили в ферментере "Анкум-2М" в 6 л вышеуказанной жидкой среды, а также на шуттель-аппарате оригинальной конструкции.
Субстрат для посевного мицелия готовили из зерна пшеницы по традиционной методике (Бисько, 1983;
1987;
Бухало, 1988;
Методы приготовления…, 1982).
Для изучения оптимального состава субстрата для получения плодовых тел готовили следующие материалы: древесные опилки хвойных и лиственных пород деревьев, пшеничная солома.
Производственные испытания проводили на базе грибоводческого хозяйства комплекса ОАО «Совхоз-Весна», расположенного в г. Саратов. В качестве контрольного штамма в производственных экспериментах использовали штамм P.
ostreatus HK-35 Duna, полученным из коллекции данного хозяйства.
Для создания дополнительной степени стерильности, при необходимости (рекомендуется для мелкотоварного производства), в субстрат при запаривании добавляли 6% перекись водорода (150 мл/л).
Фунгицидное воздействие препарата "Фитоспорин-М" изучали в процессе подготовки субстрата, культивирования и образования плодовых тел. Раствор препарата (1,5:1000) добавляли непосредственно в воду после запаривания субстрата и достижения температуры воды от 38-42С. Через 12 часов выдержки субстрата в воде с биофунгицидом, затем воду сливали, а субстрат использовали непосредственно для экспериментов.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «STATISTICA 6.0» MS Office.
Рис. 1. Схема проведения эксперимента РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Подбор совместимых монокарионов и отбор фертильных дикарионов вешенки обыкновенной В результате проведенных экспериментов по скрещиванию исходных штаммов было получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордий при 22-25С, обозначенные, соответственно, Т1- Т5 (табл. 1).
Таблица 1 – Динамика образования примордиев Штамм Т, (сут) L T2 T BС T5 T1 T n,(шт) 1,2±0,2 4,3±0,2 3,2±0,2 2,7±0,2 3,7±0, 7 0,0 3,0+0, 4,1±0,2 6,7±0,2 5,0±0,3 5,7±0,3 4,2±0,2 5,0±0, 14 2,3±0, 3,5±0,2 5,3±0,6 9,2±0,2 8,0±0,3 7,5±0,2 6,0±0, 16 7,5±0, 4,0±0,3 8,0±0,7 12,5±0,2 9,2±0,5 9,7±0,6 8,7±0,3 9,0±0, 5,3±0,2 9,5±0,5 20,7±0,2 12,0±0,5 13,5±0,2 14,2±0,6 13,0±0, Всего 15,1±0,3 28,1±1,4 53,8±0,4 36,3±1,1 40,2±0,9 37,5±0,2 36,8±1, Предварительные эксперименты показали, что наиболее активным ростом мицелия на плотных питательных средах, а также более ранними сроками появления примордий обладает штамм Т5, что и позволило отобрать его для дальнейших исследований.
Полученный штамм способен так же, как и родительские, образовывать кластеры (сростки плодовых тел) от 2-4 до 20-30 шт. Шляпка 1-8 см в диаметре, в молодом возрасте выпуклая, светло-коричневая, затем – плоская, тарелкоподобная, более темная. Пластинки сероватые, ножка, как правило, центральная или слегка эксцентрическая, 4-6х0,5-1,6 см, серовато-белая. Мякоть плотная, сероватая (рис. 2).
Рис. 2. Морфология гибрида Т Культивирование штаммов P. ostreatus на различных питательных средах В соответствии с поставленной целью по разработке технологии культивирования мицелия и плодовых тел P. ostreatus, были изучены показатели роста клеток штамма P. ostreatus Т5 на плотных питательных средах.
В качестве субстратов были выбраны модифицированная среда Семерджиевой МС и минеральная синтетическая среда, обычно применяемая для выращивания мицелия. Подбор питательной среды для проведения дальнейших экспериментов проводили при помощи сравнения коэффициентов роста мицелия на среде МС и минеральной синтетической среде (табл. 2).
В последующих экспериментах изучено влияние состава питательной среды на рост мицелия изучаемых штаммов.
Таблица 2 – Зависимость интенсивности роста мицелия изучаемых штаммов от состава среды Ростовой коэффициент Штамм источники углерода в минеральной среде среда МС мальтоза лактоза глюкоза Т3 21,00±0,50 42,00±0,30 80,00±0,07 90,00±0, Т4 27,00±0,16 40,00±0,40 72,00±0,10 92,00±0, Т5 32,00±0,05 43,00±0,08 75,00±0,04 87,00±0, БС 18,00±0,08 38,00±0,15 52,00±0,08 70,00±0, L 22,00±0,05 43,00±0,16 57,00±0,30 64,00±0, Примечание. Ростовой коэффициент (Рк) - модифицированный ростовой коэффициент, который рассчитывали по формуле: Pk=Dhg/t;
где D - диаметр колонии, в мм, g - плотность колонии, в баллах по 3-х балльной шкале, h - высота колонии, в мм, t - возраст колонии (сут).
Для исследования интенсивности роста мицелия в жидкой среде, оценивали степень влияния различных стимуляторов роста. Были использованы следующие добавки:
подсолнечное масло, углекислый кальций, агар-агар, дубовый экстракт.
Установлено, что мицелий P. ostreatus наиболее интенсивно растет на средах с добавлением экстракта дубовой коры. Интенсификация роста происходит в результате стимулирования активности грибных фенолоксидаз, что подтверждается проведенными исследованиями при определении ростового коэффициента (Рк) (табл.
3).
Таблица 3 – Коэффициент зависимости роста мицелия (Рк) штаммов изучаемых грибов от различных стимуляторов Штамм Стимулятор роста Т5 БС Т3 Т L подсолнечное масло 14,00±0,07 7,00±0,04 11,0±0,3 9,00±0,70 9,50±0, дубовый экстракт 18,00±0,15 5,00±0,30 13,0±0,1 6,90±0,030 14,00±0, СаСО3 10,00±0,16 6,00±0,10 9,0±0,7 8,00±0,20 9,00±0, агар 9,00±0,30 8,00±0,04 7,0±0,3 5,00±0,06 7,00±0, без добавок 11,20±0,00 6,70±0,70 7,4±0,5 8,10±0,04 10,00±0, При выращивании клеток мицелия наиболее перспективного гибрида Т5 на лабораторном ферментере «Анкум-2M» также установлено, что добавка экстракта дубовой коры и скорость перемешивания существенно влияют на динамику нарастания клеток мицелия (рис. 3).
Рис. 3. Динамика роста мицелия штамма Т5 на ферментере «Анкум-2М»
Примечание: а– с добавлением или отсутствием ДЭ: 1 – с ДЭ, 250 об/мин;
2 – без ДЭ, 250 об/мин;
3 – с ДЭ, дробное перемешивание.
б – при разной скорости мешалки ферментера:
1 – 250 об/мин, 2 – 500 об/мин, 3 – без механического перемешивания (барботирование воздухом).
Зависимость роста мицелия от рН среды Анализ полученных данных о росте мицелия в жидкой среде с аэрацией на шуттель-аппарате и ферментере «Анкум-2» при различных показателях рН, позволил установить, что наиболее оптимальное значение рН для выхода биомассы равно 5, (рис.4).
Исследованный штамм P.ostreatus Т5 отличался по скорости обрастания субстрата мицелием и времени появления плодовых тел от родительских штаммов.
Наиболее быстро плодовые тела появлялись у штамма Т5. Известно, что распределение урожайности между волнами плодоношения является индивидуальной характеристикой штамма (табл. 4).
Из таблицы 4 видно, что гибрид Т5 по сравнению с другими гибридами и родительскими штаммами БС и L наиболее быстро колонизирует субстрат, а также дает максимальный выход плодовых тел, т.е. характеризуется повышенной урожайностью.
Рис. 4. Зависимость выхода биомассы от значения рН Таблица 4 – Показатели урожайности исследуемых штаммов Время после инокуляции (сут.) Урожайность Общая Штамм до полного до первой до второй урожайнос первая волна вторая волна обрастания волны волны ть г/100 г плодоношения, плодоношения, субстрата плодоноше плодоноше субстрата %/г %/г мицелием ния ния Т3 16,00±0,20 36,0±0,4 86,0±0,5 27,00±0,01 55,00±0,010/14,85 45,00±0,01/12, Т4 14,00±0,10 30,0±0,1 67,0±0,3 32,00±0,03 65,00±0,020/28,70 35,00±0,02/3, Т5 10,00±0,30 27,0±0,2 53,0±0,1 41,00±0,01 71,00±0,010/29,11 29,00±0,01/11, БС 28,00±0,10 39,0±0,5 92,0±0,3 25,00±0,03 60,00±0,012/15,00 40,00±0,02/10, L 25,00±0,20 37,0±0,1 89,0±0,4 26,00±0,02 61,00±0,020/15,86 39,00±0,01/10, Новый гибрид Т5 способен к образованию единичных и срощенных плодовых тел при выращивании на опилочном и соломенном субстратах. Всего было получено до плодовых тел за 1,5 месяца инкубации (с одного контейнера). Из них на субстрате с соломой - 92 плодовых тела, общим весом 80 гр., с опилками - 95 плодовых тел, общим весом 91 гр. Эти данные позволяют констатировать, что гибрид Т5 значительно превышает активность плодообразования родительских штаммов, а также штаммов Т3 и Т4. Для сравнения, штаммы Т3 и Т4 образовывали не более 65 базидиом на обоих субстратах (за тоже время выращивания) общим весом 69-72 г.
Следовательно, полученный гибрид Т5 по своим показателям превосходит исходные штаммы, что позволяет также рекомендовать его для дальнейшего внедрения в промышленное культивирование.
Обнаружено, что образование плодовых тел товарного вида гибридом Т5 может происходить при недостаточной аэрации, т.е., со сменой свежего воздуха менее, чем 8-10 объемов/г субстрата в час, тогда как известно, что превышение концентрации СО2 в окружающей среде приводит к аномальному развитию плодовых тел (рис. 5).
Рис. 5. Морфология плодовых тел штаммов P. ostreatus, выращенных в условиях ограниченной аэрации Проведен сравнительный анализ урожайности P. ostreatus на субстратах, состоящих из пшеничной соломы и опилок смешанных пород деревьев, обработанных в процессе запаривания перекисью водорода. Результаты показали, что наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома, а обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и несколько повышает общую урожайность (табл. 5, 6).
Полученные данные можно объяснить тем, что перекись водорода, как активный окислитель, в процессе запаривания вызывает частичный гидролиз лигно целлюлозного комплекса субстрата с высвобождением определенного количества полисахаридов, служащих дополнительным источником питания для развивающегося мицелия.
Проведена оценка промышленных, экологически безопасных биофунгицидов на процесс культивирования и образования плодовых тел полученным гибридом вешенки путем изучения биотического воздействия штамма B. subtilis 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М" на характер взаимоотношений Р.
ostreatus и Trichoderma spp.
Таблица 5 - Урожайность штаммов вешенки на соломенном субстрате, обработанном перекисью водорода Время после инокуляции (сут.) Урожайность Общая до полного Субстрат урожай до первой до второй Штамм обраста- первая волна вторая волна ность волны волны ния плодоношения, плодоношения, в г/100 г плодоно- плодоно субстрата %/г %/г субстрата шения шения мицелием Без 18,0±0,4 31,00±0,20 46,00±0,06 45,00±0,14 65,00±0,01/29,25 35,00±0,9/15, обр.
Т Обр.
14,0±0,3 26,00±0,50 40,00±0,20 65,00±0,30 70,00±0,04/45,50 30,00±0,20/19, Н2О Без 25,0±0,5 34,00±0,07 48,00±0,06 31,00±0,07 51,00±0,01/15,81 49,00±0,03/15, обр.
Т Обр.
17,0±0,3 29,00±0,40 42,00±0,20 37,00±0,30 72,00±0,04/26,64 28,00±20/10, Н2О Без 26,0±0,5 36,00±0,50 35,00±0,06 27,00±0,07 55,00±0,01/14,85 45,00±0,03/12, обр.
Т Обр.
17,0±0,3 27,00±0,30 30,00±0,20 35,00±0,30 72,00±0,04/25,20 28,00±0,20/9, Н2О Без 24,0±0,5 37,00±0,50 65,00±0,06 24,00±0,07 65,00±0,01/15,60 35,00±0,03/8, обр.
БС Обр.
17,0±0,3 24,00±0,30 50,00±0,20 30,00±0,30 70,00±0,04/21,00 30,00±0,20/7, Н2О Без 25,0±0,5 32,00±0,50 60,00±0,06 35,00±0,07 60,00±0,01/21,00 40,00±0,03/14, обр.
L Обр.
15,0±0,3 27,00±0,30 45,00±0,20 40,00±0,30 71,00±0,04/28,40 29,00±0,20/11, Н2О Таблица 6 – Урожайность штаммов вешенки на опилочном субстрате, обработанном перекисью водорода Время после инокуляции (сут.) Урожайность Общая Субстрат Урожай до полного до первой до второй Штамм первая волна вторая волна ность обрастания волны волны плодоношения, плодоношения, в г/100 г субстрата плодоноше плодоноше %/г %/г субстрата мицелием ния ния Без обр.
21,0±0,3 27,00±0,10 80,00±0,60 40,00±0,12 60,00±0,03/24,00 40,00±0,04/16, Обр Т.
16,0±0,1 20,00±0,01 45,00±0,10 55,00±0,40 70,00±0,06/38,50 30,00±0,50/16, Н2О Без обр.
27,0±0,5 35,00±0,07 49,00±0,06 30,00±0,03 51,00±0,01/15,30 49,00±0,03/14, Обр Т.
19,0±0,3 30,00±0,40 43,00±0,20 37,00±0,30 72,00±0,04/26,64 28,00±0,20/10, Н2О Без обр.
29,0±0,5 36,00±0,50 35,00±0,06 27,00±0,07 55,00±0,01/14,85 45,00±0,03/12, Обр Т.
19,0±0,3 27,00±0,30 30,00±0,20 35,00±0,30 72,00±0,04/25,20 28,00±0,20/9, Н2О Без обр.
28,0±0,5 37,0±0,5 65,00±0,06 24,00±0,07 65,00±0,01/15,60 35,00±0,03/8, Обр БС.
21,0±0,3 24,0±0,3 50,00±0,20 30,00±0,30 70,00±0,04/21,00 30,00±0,20/9, Н2О Без обр.
26,0±0,5 35,0±0,5 60,00±0,06 35,00±0,07 60,00±0,01/21,00 40,00±0,03/14, Обр L.
17,0±0,3 29,0±0,3 45,00±0,20 40,00±0,30 71,00±0,04/28,40 29,00±0,20/11, Н2О Биотический эффект рассчитывали согласно (Brodziak, 1980) по ширине зоны развития макроколонии Р. ostreatus Т5. В процессе экспериментов наблюдали образование зон ингибирования роста микромицета и снижение индивидуального биотического воздействия последнего на мицелий вешенки с -8 до -3 (табл. 7) в присутствии В. subtilis.
Характер взаимоотношений штамма B. subtilis 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М" с мицелиальной культурой Р. ostreatus Т5 и спорами культуры Trichoderma spp. изучали при совместном культивировании на среде МС.
Таблица 7 – Влияние B.subtilis на развитие Trichodеrma spp.
Степень биотического воздействия Объект 1 2 3 В. subtilis 4 0 4 Т. spp. -4 0 -4 - Т. spp. + В subtilis -2 0 -1 - Примечание: 1 — согласно оценке взаимного влияния обоих видов, 2 — согласно оценке ширины зоны ингибирования, 3 — согласно оценке развития вешенки, 4 — биотический индивидуальный эффект.
Инокулюм Р. ostreatus, помещенный в центре чашки Петри, инкубировали в течение 4 сут, затем подсевали суточную культуру бактерий B. subtilis 26Д в чистом виде и виде смеси со спорами Trichoderma spp. штрихом. Биотический эффект рассчитывали согласно (Brodziak, 1980) по ширине зоны развития макроколонии Р.
ostreatus Т5, применяя критерии метода биотических рядов. При этом коэффициенты корреляции рассчитывали методом линейной регрессии по формуле (с использованием программного пакета MS Office Exel):
Исследование влияния добавления клеток суспензии штамма B. subtilis 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М", к пшеничной соломе («вакцинация»), которая изначально может содержать определенное количество спор Trichoderma spр., на урожайность плодовых тел Р. ostreatus показало, что такая обработка субстрата значительно (в 3 раза) снижает плотность популяций этих микромицетов и приводит к увеличению количества термофильных бактерий рода B. subtilis.
Изучение урожайности исследуемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом "Фитоспорин-М", показало, что на этом субстрате происходит как уменьшение времени появления примордий, так и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения (табл. 8).
Таблица 8 – Показатели урожайности штаммов P. ostreatus на соломенном субстрате, обработанном препаратом "Фитоспорин-М" Время после инокуляции (сут.) Урожайность Общая Субстрат Штамм до полного до первой до второй урожайность первая волна вторая волна волны волны обрастания в г/100 г плодоношения, плодоношения, субстрата плодоно плодоно субстрата %/г %/г мицелием шения шения 15,0±0,1 34,0±0,5 70,0±0,1 37,00±0,02 72,00±0,10/26,64 28,0±0,2/10, Без обраб.
Т 9,0±0,5 20,0±0,3 40,0±0,2 55,00±0,01 80,00±0,10/44,00 20,0±0,3/11, Обр."Фит.
18,0±0,1 41,0±0,7 75,0±0,4 29,00±0,23 66,00±0,12/19,14 34,0±0,2/9, Без обраб.
Т 11,0±0,6 26,0±0,2 43,0±0,3 44,00±0,16 76,00±0,14/33,44 24,0±0,3/10, Обр."Фит".
21,0±0,1 44,0±0,6 80,0±0,4 26,00±0,42 81,00±0,15/21,06 19,0±0,1/4, Без обраб.
Т 15,0±0,6 29,0±0,3 55,0±0,3 42,00±0,21 72,00±0,17/30,24 28,0±0,2/11, Обр."Фит".
24,0±0,2 47,0±0,3 82,0±0,1 23,00±0,32 78,00±0,12/15,56 22,0±0,3/7, Без обраб.
БС 18,0±0,7 28,0±0,2 57,0±0,3 40,00±0,35 60,00±0,18/24,00 40,0±0,2/16, Обр."Фит".
23,0±0,6 40,0±0,3 75,0±0,2 27,00±0,22 68,00±0,15/18,36 32,0±0,4/8, Без обраб.
L 17,0±0,6 26,0±0,2 67,0±0,4 42,00±0,37 81,00±0,30/34,02 19,0±0,2/5, Обр."Фит".
Таким образом, спорообразующие бактерии B. subtilis 26Д при культивировании полученного гибрида являются не только активным биофунгицидом, но и стимулятором роста и плодообразования.
На основании анализа литературных и полученных нами данных можно заключить, что В. subtilis и Р. ostreatus в частично замкнутой искусственной экосистеме связаны по типу прямых и косвенных топических и трофических связей;
в создании элективного для Р. ostreatus субстрата при культивировании в частично искусственной экосистеме важна роль популяции штамма B. subtilis 26Д.
Органолептическая оценка плодовых тел вешенки Для оценки потребительских свойств полученного гибрида P. ostreatus T5 мы использовали рекомендации по органолептической оценке плодовых тел вешенки, изложенных в работах С.В. Копыльцова (2009), а также основные показатели качества, приводимые в международных стандартах ЕЭК ООН FFV-54, CODEX STAN 38-1981 и в отечественной нормативной документации на культивируемые грибы.
Съедобность грибов определяется их физиологической и эстетической привлекательностью, приятным вкусом, кулинарными достоинствами (Бухало, 1988).
Кроме урожайности, существенным показателем уровня промышленного грибоводства является качество получаемых плодовых тел или их товарные качества, необходимые потребителю. Основными критериями, отражающими потребительские свойства плодового тела, являются: вкус, аромат, сочность, нежность, прозрачность бульона и его цвет (Шепелев, 2004).
Вкус плодовых тел складывается из комплекса химических компонентов и может зависеть от компонентов субстрата, на котором проводили культивирование гриба. В наших экспериментах при культивировании плодовых тел на соломенном субстрате не было выявлено посторонних, не характерных для грибов вешенка, привкусов. Вешенка относится к группе грибов, не накапливающих алкалоидов, поэтому даже без предварительной тепловой обработки не является токсичной (СП 2.3.4.009-93). В то же время, проведенная кулинарная обработка способствует формированию лучших вкусовых качеств.
Известно, что при повышении общей урожайности возможно снижение качественных показателей грибной продукции. В соответствии с этим, мы провели сравнительную органолептическую оценку качества плодовых промышленно культивируемых, родительских и полученных нами гибридных штаммов.
Результаты оценки выражали в баллах условной шкалы (1-6) с возрастающей последовательностью числа, каждое из которых соответствует определенному уровню того или иного показателя качества. Балловый метод позволяет установить уровень частичного и общего (по комплексу показателей) качества изучаемого продукта (Копыльцов, 2009). Как известно, при использовании научно обоснованной балловой системы и соблюдении предусмотренных требований метод балловой оценки позволяет получать объективные, хорошо воспроизводимые результаты.
Одним из требований, предъявляемых к грибам как сырью для кулинарной обработки и выработки консервированной продукции по ГОСТ 28649-90 «Грибы маринованные» и ГОСТ 28649-90 «Грибы отварные», является качество грибного бульона. Конечный бульон должен быть прозрачным с соломенно-желтой окраской.
Результаты органолептического анализа грибного бульона, представлены в таблице 9.
Для оценки согласованности мнений дегустаторов вычисляли коэффициент конкордации Кендалла с помощью программы «STATISTICA 6.0».
В роли экспертов выступали люди со специальной подготовкой, потенциальные потребители и изготовители грибной продукции (грибоводы хозяйства «Весна»).
Различают также индивидуальное и коллективное мнение экспертов, последнее считают более точным, а главное, согласованным.
Согласованность мнения экспертов оценивали по величине коэффициента конкордации:
где S - сумма квадратов отклонений всех оценок рангов каждого объекта экспертизы от среднего значения;
n - число экспертов;
m - число объектов экспертизы.
Коэффициент конкордации изменяется в диапазоне 0W1, причем 0 - полная несогласованность, 1 - полное единодушие.
Таблица 9 – Органолептическая оценка качества грибного бульона вешенки (в баллах) Прозрачность Образец Аромат Вкус Сумма баллов и цвет БС 10,6±0, 3,2 4,0 3, 12,4±0, L 4,4 4,2 3, Т3 10,6±0, 3,0 3,9 3, Т4 14,8±0, 4,6 4,9 5, Т5 17,0±0, 5,7 5,4 5, НК35 12,4±0, 4,6 3,5 4, Коэффициент 0,82 0,6 0, конкордации Как видно из таблицы 9, ни одному из образцов не было выставлено максимальное количество баллов. По сумме баллов гибридные штаммы в основном не имели достоверных различий в сравнении с промышленным и родительскими, лишь штамм Т3 несколько уступал остальным образцам. По отдельным критериям, например, «прозрачность и цвет бульона» образцы Т5, Т4, L были оценены как лучшие. После отваривания был получен прозрачный бульон соломенно-желтого цвета без взвеси с ярко выраженным грибным вкусом и ароматом. Коэффициенты конкордации свидетельствуют о значительной согласованности (Олефирова, 2005) мнений дегустаторов в отношении «аромата» и средней – в отношение «вкуса» и «прозрачности» бульона. Органолептическая характеристика свежих и отварных плодовых тел исследуемых штаммов вешенки представлена в таблице 10.
Таблица 10 – Органолептическая оценка качества отварных плодовых тел вешенки (в баллах) Аромат плодового тела Сумма Образец Вкус Нежность Сочность баллов Сырого Вареного Т5 24,0±0, 4,5 4,8 4,6 5,2 4, Т3 21,8±0, 3,5 4,6 4,3 4,8 4, Т4 19,2±0, 3,7 4,3 3,9 3,7 3, БС 20,3±0, 2,9 4,0 4,6 3,9 4, НК35 19,6±0, 2,7 3,8 3,7 4,5 4, 18,1±0, L 3,9 3,8 3,2 3,3 3, Коэффициент 0,95 0,87 0,89 0,75 0, конкордации Как видно из данных, представленных в таблице 10, по сумме баллов, выставленных экспертами за органолептические показатели, гибридные штаммы несколько отличались в сравнении с коммерческими и родительскими и лишь некоторые незначительно уступали последним. Оценка дегустаторами, указанных показателей является также высокой по «аромату» сырого плодового тела и значительной по другим показателям.
Таким образом, результаты товароведной экспертизы, представленные в таблицах, демонстрируют, что по суммарной органолептической оценке гибридный штамм Т5, отобранный как высокопродуктивный, превосходит остальные штаммы.
Производственные испытания Разработанная технология была проверена нами в промышленных условиях в грибоводческом хозяйстве ОАО «Совхоз-Весна».
Процедура получения плодовых тел грибов проводилась по следующей схеме:
Субстрат для культивирования – солома пшеницы твердых сортов обрабатывалась перегретым паром в течение 1 часа с добавлением 6% раствора перекиси водорода. После остывания до температуры 45-50°С субстрат обрабатывали раствором «Фитоспорина-М» (10 л/100 кг субстрата). Через 12 часов после обработки субстрат засевали непосредственно в субстратной машине зерновым мицелием штамма P. ostreatus T5 в количестве 3% по объему. Предварительное лабораторное выращивание жидкого мицелия проводили на мучной среде с добавлением экстракта дубовой коры (ФГУП «Курская биофабрика»). После перемешивания смеси из нее формировали субстратные блоки весом 12 кг в полипропиленовых контейнерах.
Блоки инкубировали в темноте при температуре 26 °С до полной колонизации субстрата и затем переносили в отделение для получения плодовых тел с температурой 16-18°С (рис. 9).
В качестве контроля по рекомендации руководства грибоводческого хозяйства ОАО «Совхоз-Весна» использовали наиболее часто культивируемый штамм вешенки НК-35 Duna. Процедуру подготовки субстрата и получение плодовых тел проводили по вышеуказанной технологии.
В результате проведенных испытаний установлено, что:
полная колонизация субстрата мицелием гибрида Т5 происходит быстрее, чем у штамма НК-35, в среднем на 5 суток.
урожайность штамма Т5 в первую и вторую волну культивирования существенно выше, чем штамма НК-35 Duna (табл. 11. и 12).
Приготовление исходного мицелия на жидкой среде с экстрактом дубовой коры (в ферментере «Анкум-2» при t=26°С, Vп= оборотов/мин) Приготовление посевного мицелия на зерне пшеницы (промытое и просушенное зерно отваривали 40 мин с добавлением 3% Н2О2) Запаривание и обработка соломенного субстрата 6% Н2О2 (150мл/л) (на 4 часа, при t=95°С) Вакцинация» субстрата биофунгицидом «Фитоспорин-М» (1,5:1000) (добавили в воду и выдерживали 12 ч, при t=40°С) Инокуляция субстрата зерновым мицелием (5% мицелия, p= 0,4-0,5кг/л) Культивирование контейнеров с инокулированным субстратом и получение урожая плодовых тел (первая волна через 20 суток, вторая волна через суток) Рис. 9. Блок-схема разработанной технологии культивирования вешенки Таблица 11 – Сравнительная урожайность штаммов Т5 и НК-35 Duna, выращенных по традиционной технологии Время после инокуляции (сут.) Урожайность Общая Штамм до полного урожайность до первой до второй первая волна вторая волна обрастания в г/100 г волны волны плодоношения, плодоношения, субстрата субстрата плодоношения плодоношения %/г %/г мицелием НК- 27,00±0,42 52,0±0,2 85,00±0,70 14,00±0,40 67,00±0,04/9,38 23,00±0,05/4, Т5 19,00±0,15 34,0±0,5 45,00±0,20 27,00±0,45 65,00±0,07/17,55 35,00±0,20/9, Таблица 12 – Сравнительная урожайность штаммов Т5 и НК-35 Duna, выращенных по новой технологии Время после инокуляции (сут.) Урожайность Общая Штамм до полного урожайность до первой до второй первая волна вторая волна обрастания в г/100 г волны волны плодоношения, плодоношения, субстрата субстрата плодоношения плодоношения %/г %/г мицелием НК- 19,0±0,3 40,00±0,10 80,0±0,6 30,0±0,1 60,00±0,03/18,00 20,00±0,04/12, Т5 12,0±0,1 18,00±0,01 45,0±0,1 43,0±0,4 70,00±0,06/30,10 18,00±0,50/12, Таким образом, использование новой технологии подготовки субстрата и использование полученного гибрида Т5 существенно ускоряет время колонизации субстрата и повышает общую урожайность.
Выводы 1. Получены новые высокоурожайные гибриды P. ostreatus Т3, Т4 и Т5, отличающиеся от родительских штаммов скоростью колонизации мицелия и повышенной урожайностью.
2. Показано, что применение экстракта дубовой коры в качестве стимулятора роста мицелия вешенки на жидкой питательной среде положительно влияет на выход биомассы.
3. Установлено, что обработка субстратов биофунгицидом «Фитоспорин-М»
позволяет защитить субстрат от контаминирующего воздействия посторонней микрофлоры (грибков рода Trichoderma), а также повысить общую урожайность.
4. Обнаружено, что применение перекиси водорода для обработки субстрата служит дополнительным стерилизующим агентом и в разы повышает общую урожайность.
5. Промышленные испытания в искусственно замкнутой экосистеме показали, что культивирование гибрида Т5 и производственного штамма HK-35 Duna, взятого в качестве контрольного, по предлагаемой технологии позволяет сократить время колонизации субстрата, а также значительно повысить общую урожайность.
Предложения производству В условиях промышленного производства грибоводческим хозяйствам рекомендуется использовать предлагаемую технологию получения мицелия и плодовых тел P. ostreatus, включающую использование высокоурожайных гибридов вешенки применяя в качестве стимулятора роста мицелия экстракт дубовой коры на жидкой питательной среде и получение плодовых тел на субстрате, обработанном биофунгицидом «Фитоспорин М».
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Калашников, А.А. Влияние стимуляторов роста на биологические свойства высших базидиомицетов / А.А. Калашников, А.Д. Миронов, Г.В. Бондаренко // Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных.
Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции: сб. науч. трудов.
– Саратов, 2008. – С. 95-97.
2. Бондаренко, Г.В. Биотехнология получения и исследование культурально морфологических свойств новых гибридов грибов рода P. оstreatus / Г.В. Бондаренко, А.Д.
Миронов, А.А. Калашников // Вавиловские чтения – 2008 : Материалы Межд. науч.-практ.
конф. 26-27 ноября 2008. – Саратов, 2008. – С. 258-259.
3. Миронов, А.Д. Влияние биотических факторов на жизнедеятельность гибрида P.
ostreatus T5 в частично замкнутой искусственной экосистеме / А.Д. Миронов, А.А.
Калашников // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2009.
– №8. – С.35-38.
4. Миронов, А.Д. Влияние биофунгицида «Фитоспорин-М» на рост и развитие мицелия и плодовых тел грибов вешенка. / А.Д. Миронов, А.А. Калашников // Вавиловские чтения – 2010 : Материалы Межд. науч.-практ. конф. 25-27 ноября 2010. – Саратов, 2010. – С. 234 236.