Анна александровна молекулярно-генетическая характеристика мутаций гена trithorax-like и их влияние на оогенез drosophila melanogaster генетика –
На правах рукописи
УДК 575.224:577.21:591.3:595.773.4
ОГИЕНКО АННА АЛЕКСАНДРОВНА
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
МУТАЦИЙ ГЕНА TRITHORAX-LIKE И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ООГЕНЕЗ
DROSOPHILA MELANOGASTER
Генетика – 03.00.15
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2007
Работа выполнена в лаборатории эволюционной биологии клетки, Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.
Научный руководитель: кандидат биологических наук Баричева Элина Михайловна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Серов Олег Леонидович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск кандидат биологических наук, Гусаченко Анна Михайловна, Новосибирский государственный университет Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, г. Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится «3» октября 2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д – 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: [email protected] C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан «» августа 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.
Актуальность проблемы. Оогенез представляет собой сложный, контролируемый скоординированным действием большого числа генов, многоэтапный процесс, результатом которого является формирование зрелой яйцеклетки. Изучение оогенеза – одна из приоритетных задач современной биологии и медицины. Несмотря на то, что уже известны многие гены, контролирующие этот процесс, в настоящее время ведутся интенсивные поиски новых генов и особенно комплексов взаимодействующих генов, участвующих в его регуляции. Данная работа посвящена изучению роли гена Trithorax-like (Trl) в оогенезе Drosophila melanogaster. Ген Trl кодирует многофункциональный белок GAGA, одной из основных функций которого является регуляция экспрессии генов. Наиболее хорошо изучена роль этого белка в ходе эмбриогенеза. О функциональной значимости белка GAGA в ходе оогенеза дрозофилы ранее можно было судить только на основании косвенных данных.
Было известно, что продукты гена Trl, активно экспрессирующегося в яичниках взрослых мух, накапливаются в растущем ооците и необходимы для развивающегося эмбриона. Однако при анализе ранее известных Trl-мутантов и генетических мозаиков не было выявлено никаких морфологических нарушений в структуре яичников и яйцевых камер. Отсутствие прямых доказательств того, что ген Trl необходим для оогенеза дрозофилы, связано с тем, что в мировых коллекциях отсутствовали мутации, позволяющие проводить подобного рода исследования. В данной работе были получены и охарактеризованы новые гипоморфные мутации гена Trl, которые позволили провести всесторонний анализ влияния гена Trl на оогенез дрозофилы. Белок GAGA требуется для обеспечения экспрессии множества генов дрозофилы, поэтому полученные в работе данные позволяют выявить не только участие самого гена Trl в ходе оогенеза, но и ряд предполагаемых, ранее не описанных в литературе, генов мишеней белка GAGA, участвующих в контроле оогенеза. Результаты исследования оогенеза дрозофилы имеют фундаментальное значение для выяснения причин стерильности насекомых, а данные о формировании актиновых филаментов и миграции клеток могут быть использованы в исследованиях, проводимых на других модельных объектах.
Цели и задачи работы состояли в изучении роли гена Trl и кодируемого им белка GAGA в оогенезе D. melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Получить новые гипоморфные мутации гена Trl, влияющие на оогенез дрозофилы, и провести их картирование;
2. Провести анализ влияния вновь полученных мутаций на экспрессию гена Trl как на уровне мРНК, так и на уровне белка;
3. Исследовать влияние этих мутаций на оогенез дрозофилы;
4. Изучить изменение фертильности и морфологии яичников мутантов в зависимости от уровня экспрессии гена Trl.
Научная новизна работы.
Получены и охарактеризованы новые гипоморфные мутации гена Trl, в разной степени снижающие экспрессию гена. Полученные мутации явились уникальным инструментом, позволившим впервые провести детальное исследование влияния гена Trl на оогенез дрозофилы.
Впервые показано, что изменение экспрессии гена Trl приводит к изменению структуры яичников мух. Нарушения выявляются как в овариолах, так и в отдельных яйцевых камерах. Установлено, что Trl-мутации вызывают изменение числа половых клеток (питающих и ооцитов) в яйцевых камерах по сравнению с нормой. Впервые у Trl-утантов выявлены дефекты в формировании стадиоспецифических цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках на поздних стадиях развития яйцевой камеры. В работе впервые описано нарушение в функционировании соматических клеток у Trl мутантов. На поздних стадиях развития яйцевой камеры у мутантов нарушается миграция бордюрных и центрипетальных клеток. Дефекты в формировании цитоплазматических актиновых филаментов и в функционировании соматических клеток приводят к нарушению процесса переноса цитоплазмы питающих клеток в ооцит и, следовательно, к прекращению роста ооцита.
Положения, выносимые на защиту.
В результате проведенного в данной работе исследования было установлено, что нарушение в экспрессии белка GAGA является причиной выявленных дефектов в ходе оогенеза мутантов. Установлено, что все анализируемые Trl мутанты характеризуются однотипными, но проявляющимися в разной степени нарушениями морфологии яичников. Степень проявления нарушений коррелирует с уровнем снижения транскрипции гена Trl в яичниках. Наиболее сильные нарушения зарегистрированы для мутантов Trl362, у которых значительно снижен уровень экспрессии гена Trl в яичниках. У мутантов Trl362(ex) и Trlen82, характеризующихся незначительными изменениями экспрессии гена, степень проявления дефектов значительно меньше. Введение трансгенных конструкций в геном мутантов, обеспечивающих дополнительную экспрессию кДНК гена Trl, приводит к восстановлению фертильности самок и морфологии их яичников, что свидетельствует о том, что именно изменение в экспрессии гена Trl является причиной выявленных нарушений в оогенезе мутантов.
Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о процессе оогенеза насекомых. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах печатного текста, содержит 7 таблиц и иллюстрирована 41 рисунком. В списке литературы приведен 201 источник.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Линии D. melanogaster описаны в справочнике (Lindsley, Zimm, 1992), базе данные FlyBase (www.Flybase.org), а также в статьях (Федорова и др., 2006;
Огиенко и др., 2006).
Морфологический анализ яичников проводили, как описано в статье (Огиенко и др., 2006).
Иммунохимическое окрашивание органов дрозофилы для детекции на флуоресцентном и лазерном сканирующем микроскопах проводилось согласно (Xue, Cooley, 1993), с некоторыми модификациями. Антитела против белка GAGA были любезно предоставлены профессором В. Пирротта (V. Pirrota) (Женевский Университет, Швейцария) (Poux et al., 2001).
Окрашивание яичников дрозофилы с помощью фаллоидина для детекции на флуоресцентном и лазерном сканирующем микроскопах проводили, как описано в статье (Guild et al., 1997).
Детекция апоптоза проводилась по методике, описанной в статье (Foley, Cooley, 1998).
Нозерн-блот гибридизация проводилась по методике Бурнета (Burnett, 1997).
В качестве зондов для гибридизации использовали (Р32) - меченые фрагменты кДНК гена Trl (экзоны 2, 3 и 4) и гена rpl19.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Новые гипоморфные мутации гена Trithorax-like.
В ходе работы был проведен анализ новых гипоморфных мутаций гена Trithorax-like (Trl) - Trl362, Trl362(ex) и Trlen82. Мутации Trl362, Trl362(ex) были получены автором, а мутация Trlen82 - выделена в Лаборатории молекулярной биологии Института фундаментальных исследований (г. Бомбей, Индия) М.В. Волошиной. Все три мутации затрагивают 5’-регуляторную область гена Trl (рис. 1). Мутация Trl362 связана с внедрением P(lacW)-транспозона в прямой ориентации в 5`- некодирующую область гена (в позицию 2979). Позиции здесь и далее указаны в соответствии с последовательностью GenBank #AJ (Катохин и др., 2001). К транспозону прилегает делеция размером 97 п.н. (2979 3076), удаляющая два первых сайта инициации транскрипции, используемых в яичниках (позиции 3009 и 3065 по Д.А. Карагодину). Мутация Trl362(ex) несет такую же делецию, как и аллель Trl362, однако Р-элемент отсутствует (рис. 1).
Проведенный в Лаборатории эволюционной биологии клетки молекулярный анализ мутации Trlen82 позволил сделать заключение, что мутация Trlen обусловлена внедрением Р-элемента размером 1,4 т.п.н. в 5’-некодирующую область гена Trl, в позицию 2997. В линии, несущей данную мутацию, не обнаружено никаких дополнительных изменений в гене Trl, т.е. в ней сохранены все пять сайтов инициации транскрипции (рис. 1).
Самки, несущие мутации Trl362 и Trl362(ex), стерильны как в гомозиготном состоянии, так и в сочетании с нуль-аллелем гена - мутацией TrlR85. У мутантных самок Trlen82 сильно снижается фертильность гомозиготном состоянии, а в сочетании с нуль-аллелем гена (TrlR85) они являются полностью стерильными.
Все мутантные самки откладывают значительно меньшее, по сравнению с нормой, количество яиц. Яйца значительно меньше по размеру, чем в норме, и имеют укороченные дорзальные выросты хориона. Размер яиц составляет: 320 350 мкм у Trl362-мутантов, 320-400 мкм у Trlen82 и 350-420 мкм у Trl362(ex), что значительно меньше нормы, где размер яйца составляет 500 мкм.
Рис. 1. Мутации, затрагивающие 5’-область гена Trl. Положение мутаций показано относительно сайтов инициации транскрипции гена Trl в яичниках (по Д.А. Карагодину, неопубликованные данные). Треугольниками показаны места встройки Р-элементов, стрелка внутри треугольников указывает ориентацию транспозонов. Скобками указана делеция, пунктирными стрелками – удаляемые мутациями сайты инициации транскрипции.
Несмотря на то, что все мутанты в гомозиготном состоянии доживают до стадии имаго и при этом не имеют заметных фенотипических отклонений, они все же характеризуются пониженной жизнеспособностью. Жизнеспособность трансгетерозигот Trl362/TrlR85 снижается при 25°С на 18%, а при 29°С на 43% по сравнению с контролем TrlR85/Oregon R. Жизнеспособность особей Trl362(ex)/TrlR и Trlen82/TrlR85 снижается на 14% при 25°С и на 20% при 29°С.
2. Анализ экспрессии гена Trl у новых гипоморфных мутаций.
Для выяснения причин стерильности самок исследуемых Trl мутантов был проведен анализ транскрипции гена Trl в яичниках с помощью Нозерн-блот гибридизации. Как показано на рис. 2, в яичниках имаго дикого типа наблюдается высокий уровень транскрипции гена Trl. В РНК, выделенной из гонад взрослых самок дикого типа, выявляется один мажорный транскрипт размером 2.4 т.п.н. и три минорных транскрипта большего размера.
В РНК из яичников самок Trl362 выявляется только один транскрипт размером 3 т.п.н., а суммарное количество мРНК гена Trl снижено как минимум в 10 раз, по сравнению с диким типом (рис. 2). Транскрипция гена Trl в яичниках гомозиготных Trlen82 мутантных самок снижена на треть по сравнению с нормой (рис. 2), тогда как в яичниках Trl362(ex)-мутантов экспрессия гена практически не отличается от нормы. У мутантов Trlen82 и Trl362(ex) в РНК, выделенной из яичников, присутствуют все варианты транскриптов, обнаруживаемые в норме.
Рис. 2. Анализ транскрипции гена Trl у мутантов. Нозерн-блот, содержащий суммарную РНК, выделенную из яичников гомозигот Trlen82, Trl362(ex), Trl362, гетерозигот Trl362/TrlR85 и мух дикого типа (Oregon R). Стрелкой указан единственный транскрипт, выявляемый в яичниках мутантов Trl362. Внизу показана гибридизация этого же блота с зондом rpl19 в качестве контроля нанесения РНК.
У мутантов Trl362, для которых было продемонстрировано значительное снижение уровня транскрипции гена Trl в яичниках, были обнаружены значительные нарушения в распределении белка GAGA в гонадах самок на разных стадиях развития (личинки 3-го возраста, предкуколки и имаго). В норме, в яйцевых камерах, покидающих гермарий, белок GAGA выявляется во всех типах половых (питающие клетки и ооцит) и соматических клеток (фолликулярные, интерфолликулярные, клетки терминального филамента и туники) (рис. 3 А-В). С ростом яйцевой камеры заметного снижения количества белка GAGA ни в половых, ни в соматических клетках не наблюдалось. У Trl362 мутантов в ядрах питающих клеток и ооците белок GAGA или не выявляется вообще, или же выявляется в очень незначительных количествах (рис. 3 Г-Е), при этом данный белок отчетливо детектируется во всех типах соматических клеток (рис. 3 Д, Е). В яичниках гипоморфных мутантов Trl362(ex) и Trlen значительного снижения количества белка GAGA обнаружено не было (рис. 4).
В Рис. 3. Локализация белка GAGA в яичниках имаго дикого типа и мутантов Trl362, выявленная иммунохимическим окрашиванием с применением антител против белка GAGA. A, Б, В - распределение белка GAGA в яичниках мух дикого типа. Г, Д, Е распределение белка GAGA в яичниках мутантных мух. A - локализация белка GAGA в овариоле, состоящей из гермария (гер) и ряда фолликулов. Б - белок GAGA локализуется в питающих клетках (пк) и в клетках фолликулярного эпителия (фк). В локализация белка GAGA в интерфолликулярных клетках (ифк) и в клетках туники (кт). Д, Е - белок GAGA не выявляется в питающих клетках при этом выявляется в клетках фолликулярного эпителия, интерфолликулярных клетках и в клетках туники.
Увеличение х20 (А, Б, Г, Д), х100 (В, Е).
Рис. 4. Распределение GAGA белка у гипоморфных мутантов Trl362(ex) и Trlen82.
А - Trl362(ex), Б - Trlen82. Масштаб – 100 мкм.
3. Влияние мутаций гена Trl на оогенез дрозофилы.
В результате проведенного анализа мутантов было установлено, что самки, несущие различные мутации Trl, характеризуются однотипными, но проявляющимися в разной степени нарушениями морфологии яичников. У них нарушена структура как овариол в целом, так и отдельных яйцевых камер расположенных внутри овариолы. При этом степень проявления нарушений коррелирует с уровнем снижения транскрипции гена Trl в яичниках. Наиболее сильные нарушения зарегистрированы для мутантов Trl362. У мутантов Trl362(ex) и Trlen82, для которых сильного снижения экспрессии показано не было, дефекты в ходе оогенеза выявляются, однако степень их проявления значительно меньше.
3.1. Мутации гена Trl приводят к нарушению структуры овариол.
По числу овариол яичники всех анализируемых мутантных самок не отличаются от яичников самок дикого типа, однако морфология значительной части овариол у мутантов изменена. В яичниках мух дикого типа каждый фолликул отделен от двух соседних интерфолликулярными клетками (рис. 5 А).
Большинство овариол у мутантов Trl362 характеризуются слитными фолликулами, между которыми невозможно выявить интерфолликулярные клетки (рис. 5 Б, В). У Trl362(ex) и Trlen82 количество слитных фолликулов несколько ниже, чем у мутантов Trl362.
Рис. 5. Морфология овариол яичников самок дикого типа и мутантов Trl362. A овариола яичников дикого типа. Стрелками указаны интерфолликулярные клетки. Б, В - овариолы яичников Trl362/TrlR85. Фолликулы неправильно расположены внутри овариолы. Увеличение х40 для (А) и х20 для (Б, В).
Причинами наблюдаемого фенотипа могут быть как дефекты в структуре и формировании интерфолликулярных клеток, как это было показано для Notch- и Delta-мутантов (Grammont, Irvine, 2002), так и нарушения в функционировании туники, которая в норме предохраняет фолликулы от слипания и, благодаря перистальтическим движениям, способствует продвижению растущих яйцевых камер внутри овариолы (Middleton et al., 2006).
3.2. Мутации гена Trl приводят к нарушению числа половых клеток в яйцевых камерах.
В норме одна яйцевая камера содержит 1 ооцит и 15 питающих клеток (рис.
6 А). У Trl мутантов наблюдаются многочисленные яйцевые камеры с отличным от нормы числом питающих клеток (рис. 6 Б, В) и/или ооцитов, в некоторых случаях ооцит характеризуется неправильной локализацией внутри камеры.
Частота яйцевых камер с ненормальным числом ооцитов у мутантов Trl составляет около 2%, в то время как биполярные ооциты встречаются гораздо реже (~0.1%). Каждый из ооцитов в камерах, содержащих больше одного ооцита, обладает четырьмя каналами и кариосомой. В яичниках мух дикого типа не было зафиксировано камер с числом ооцитов больше одного, а также камер с биполярными ооцитами.
В яичниках мутантов Trl362 и Trl362(ex) повышено число камер с отличным от нормы числом питающих клеток. У мутантов Trl362 37% яйцевых камер имеют отличное от 15 число питающих клеток, а у мутантов Trl362(ex) число таких камер составляет 20%. Причем в большинстве случаев камеры с неправильным числом питающих клеток располагаются последовательно друг за другом. У мутантов Trlen82 и Trl13С число питающих клеток практически не отличается от нормы.
Следует отметить, что мутанты Trl362 и Trl362(ex) характеризуются отсутствием двух первых сайтов инициации транскрипции (рис. 1), используемых в яичниках, тогда как у мутантов Trlen82 и Trl13С все пять сайтов присутствуют в неизмененном виде. Два первых сайта инициации транскрипции, по-видимому, являются важными для формирования яйцевых камер с нормальным числом половых клеток.
Рис. 6. Морфология яичников мутантов Trl362. A - яйцевые камеры яичников дикого типа. Каждая яйцевая камера содержит 15 питающих клеток и 1 ооцит. Б, В - яйцевые камеры мутантов Trl362/TrlR85. Б - число питающих клеток меньше 15 и они сильно варьируют по размеру (стрелки). В - увеличено число питающих клеток в яйцевой камере. Увеличение х40.
Нарушение числа питающих клеток в яйцевой камере может быть следствием нарушения числа делений цистобласта в гермарии, в этом случае число питающих клеток в яйцевой камере должно составлять 2n-1 (1, 3, 7, 31…), где n – число делений цистобласта. Однако у Trl-мутантов яйцевые камеры с таким числом питающих клеток не встречаются, следовательно, цистобласт претерпевает четыре цикла деления, как это и должно быть в норме. Тот факт, что в камерах с нарушенным числом питающих клеток ооцит содержит четыре кольцевых канальца, также свидетельствует о том, что яйцевая камера прошла четыре раунда деления. Поэтому предполагается, что причиной нарушения числа питающих клеток у Trl-мутантов является неправильное обволакивание 16-клеточной цисты фолликулярными клетками в гермарии. Это подтверждается тем, что у Trl-мутантов камеры с нарушенным числом питающих клеток часто располагаются друг за другом и сумма питающих клеток в двух соседних яйцевых камерах с нарушенным числом трофоцитов кратна 15.
3.3. Мутации Trl приводят к увеличению числа камер с конденсированным хроматином в ядрах питающих клеток.
Было установлено, что яйцевые камеры с конденсированными ядрами трофоцитов встречаются у Trl362 мутантов значительно чаще (18%), чем в норме (3,8%), у более слабых гипоморфных мутантов такие камеры встречаются несколько реже (Trlen82 - 13.11%;
Trl362(ex) - 5%). В яичниках всех проанализированных мутантов деградирующие камеры, в которых наблюдается конденсация хроматина питающих клеток, выявляются на стадиях 9-11 (рис.
7 Б), тогда как в норме деградация яйцевых камер происходит на более ранней восьмой стадии развития яйцевой камеры (рис. 7 А) (King, 1956). У мутантов Trl аномальная конденсация хроматина часто охватывает сразу несколько соседних яйцевых камер (рис. 7 В). Поскольку конденсация хроматина характерна для апоптирующих клеток, было проведено специфическое окрашивание яйцевых камер мутантов акридином оранжевым. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что камеры с аномальной конденсацией хроматина действительно подвергаются апоптозу.
3.4. Мутации по гену Trl влияют на формирование цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках яичников на поздних стадиях развития яйцевой камеры.
Известно, что маленький размер яиц дрозофилы зачастую является следствием нарушения актин-зависимой фазы быстрого транспорта на последних стадиях развития яйцевой камеры. Поскольку для Тrl-мутантов характерно уменьшение размера яиц, то был проведен анализ структуры актиновых филаментов в яйцевых камерах Trl мутантов, используя Alexa конъюгированный фаллоидин.
Было установлено, что до 10-й стадии развития яйцевой камеры актиновые филаменты у всех Тrl-мутантов не отличаются от таковых у дикого типа, однако значительные изменения были выявлены в структуре цитоплазматических Рис. 7. Аномальная конденсация хроматина у Trl-мутантов. А - овариола яичников дикого типа, конденсация хроматина наблюдается в камере на стадии 8 (указана стрелкой). Б - овариола Trl362-мутанта, конденсация хроматина в яйцевой камере, находящейся на 10-11 стадии развития (указана стрелкой). В - аномальная конденсация хроматина в нескольких соседних камерах у Trl мутанта. Масштаб – 100 мкм.
актиновых филаментов, формирующихся на 10-й стадии. Этот тип актиновых филаментов формируется непосредственно перед фазой быстрого транспорта, их функция заключается в удержании ядер питающих клеток вдали от кольцевых канальцев во время фазы быстрого транспорта (рис. 8 В).
Наиболее сильные изменения, по сравнению с нормой (рис. 8 Б), наблюдались у Тrl362-мутантов, у которых значительно уменьшено число цитоплазматических актиновых филаментов, они неравномерно формируются в клетке и образуют пучки, которые выглядят изломанными по сравнению с нормой. В сочетании с Тrl362 приводит нуль-аллелем мутация к полному исчезновению цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках (рис. 8 Д). В результате этого, во время фазы быстрого транспорта большие полиплоидные ядра питающих клеток не удерживаются в центре клеток, как это наблюдается в норме (рис. 8 В), а под давлением, вызванным сокращением кортикального актинового слоя, попадают в кольцевые каналы и блокируют дальнейший ток цитоплазмы из питающих клеток в ооцит (рис. 8 Г, Е). Это приводит к тому, что содержимое питающих клеток не может быть вовремя и полностью перенесено в растущий ооцит, и в результате он имеет сильно уменьшенный, по сравнению с нормой, размер.
У более слабых гипоморфных мутантов Trlen82 и Тrl362(ex), у которых не наблюдается сильного снижения количества белка GAGA в питающих клетках, Рис. 8. Нарушение формирования цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках яичников мутантов Trl362 на поздних стадиях развития яйцевой камеры. А, Б, В - часть яйцевой камеры самок дикого типа;
Г, Д, Е -часть яйцевой камеры самок Trl362/TrlR85. А -ядра питающих клеток. Б - внутри питающих клеток хорошо видны сформированные актиновые филаменты. В - сумма А и Б. Г - ядра питающих клеток, измененной формы. Д - цитоплазматические актиновые филаменты полностью отсутствуют в питающих клетках. Е - сумма Г и Д. Ядра питающих клеток проникают в кольцевые канальцы. Масштаб - 25 мкм. Кольцевые канальцы указаны стрелками.
нарушение структуры цитоплазматических актиновых филаментов выражено значительно менее явно. В большинстве питающих клеток актиновые филаменты формируются, однако выглядят они несколько более тонкими, менее организованными и неравномерно распределенными внутри яйцевой камеры по сравнению с диким типом. В отдельных яйцевых камерах слабых гипоморфных мутантов все же наблюдаются случаи полного отсутствия цитоплазматических актиновых филаментов, что также сопровождается блокированием кольцевых канальцев ядрами питающих клеток.
У мутантов Trl13С были выявлены такие же нарушения в структуре и формировании цитоплазматических актиновых филаментов, как и у полученных нами Тrl-мутантов. Наличие сходного фенотипа у независимо полученных мутантов является одним из доказательств того, что нарушение экспрессии именно гена Trl приводит к дефектам в структуре цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках яичников.
У мутантов Тrl362 полное отсутствие цитоплазматических актиновых филаментов встречается почти в 90% камер, находящихся на 10-11 стадии развития, что приблизительно в 10 раз чаще, чем у мутантов Тrl362(ex), Тrlen82 и Trl13C.
Электронно-микроскопический анализ гомозигот Тrl362, также как и исследование на уровне светового микроскопа, выявили нарушения в структурной организации актинового цитоскелета. Кроме нормальных актиновых пучков, состоящих из параллельно ориентированных актиновых филаментов, в цитоплазме питающих клеток гомозигот Тrl362 часто встречаются увеличенные в диаметре пучки, так же как и пучки, в которых актиновые филаменты расположены под разными углами.
3.5. Мутации по гену Trl влияют на функционирование соматических клеток.
Наряду с нарушениями в числе и структуре половых клеток у Trl-мутантов были выявлены нарушения и в функционировании соматических клеток.
В норме до 6 стадии развития яйцевой камеры фолликулярные клетки (ФК), окружающие цисту со всех сторон, достаточно однородны по размеру и форме, однако впоследствии они претерпевают значительные морфологические изменения в зависимости от их дальнейшей судьбы. Во время 7-8 стадии большинство ФК начинают мигрировать назад в сторону растущего ооцита, они приобретают цилиндрическую форму, тогда как 50 ФК, покрывающие питающие клетки, уплощаются и формируют тонкий однослойный эпителий (Spradling, 1993;
Horne-Badovinac, Bilder, 2005). В течение 9 стадии развития яйцевой камеры 6-8 ФК (2 полярные и прилежащие к ним ФК) отсоединяются от клеток однослойного эпителия в передней части камеры и начинают мигрировать между питающими клетками по направлению к ооциту. Эти клетки получили название бордюрных клеток. В норме к 10-й стадии бордюрные клетки достигают переднего края ооцита и в дальнейшем продолжают свое движение дорзально, уже по его поверхности (рис. 9 А) (Montell et al., 1992;
Montell, 2003).
Следует отметить, что движение немногочисленных бордюрных клеток контролируется продуктами многих генов.
На 10В стадии центрипетальные клетки (клетки цилиндрического эпителия, расположенные на границе между ооцитом и питающими клетками) уплощаются и начинают мигрировать внутрь яйцевой камеры, продвигаясь между питающими клетками и ооцитом (рис. 10 А, Г, Ж). Миграция центрипетальных клеток заканчивается, когда они достигают бордюрных клеток, в результате, передняя часть ооцита также полностью покрывается фолликулярным эпителием (Horne-Badovinac, Bilder, 2005).
У всех анализируемых Trl-мутантов выявлено нарушение миграции бордюрных клеток. Бордюрные клетки у мутантов к 10-й стадии не достигают передней поверхности ооцита, а задерживаются в передней части камеры, между питающими клетками (рис. 9 В, Г).
Рис. 9. Нарушение миграции бордюрных клеток у Trl-мутантов на поздних стадиях развития яйцевой камеры. А - cхематическое изображение овариолы, показана миграция бордюрных клеток в норме (с модификациями из Montell, 2003). Б - яйцевая камера 10-й стадии (норма). Бордюрные клетки лежат на поверхности ооцита (стрелка).
В, Г - яйцевые камеры Trl-мутантов на 11-й стадии развития. Миграция бордюрных клеток нарушена, они не достигли поверхности ооцита и располагаются между питающими клетками (стрелки). Б-Г - яйцевые камеры, окрашенные с помощью X-Gal.
Масштаб 100 мкм.
У всех изученных Trl-мутантов было обнаружено нарушение в движении ценрипетальных клеток (рис. 10), которые в норме формируют границу между ооцитом и питающими клетками. В результате, ФК располагаются зачастую только на заднем конце камеры, не покрывая передней поверхности ооцита (рис.
10). Это приводит к тому, что ооцит внедряется в область, занимаемую питающими клетками, и принимает неправильную форму (рис. 10 Д, Е).
Таким образом, у Trl-мутантов в яйцевых камерах, находящихся на поздних стадиях развития, были выявлены дефекты в движении соматических клеток.
Как отмечалось ранее, изменение числа питающих клеток в пределах одной камеры, вероятно, обусловлено нарушением функционирования ФК в гермарии, т.е. функционирование ФК нарушено также и на более ранних стадиях развития яйцевых камер мутантов.
4. Восстановление фертильности у Тrl-мутантных самок при экспрессии дополнительных копий кДНК гена Trl.
Предполагается, что причиной всех вышеперечисленных дефектов в оогенезе у Trl-мутантов является нарушение в экспрессии гена Trl. Для подтверждения этого предположения были проведены эксперименты по спасению фенотипа мутантных самок. С помощью скрещиваний в геном анализируемых мутантов были введены транспозоны hsp83:GAGA-519 и hsp83:GAGA-581, позволяющие увеличить у мутантов количество различных изоформ белка GAGA (GAGA- и GAGA-581). Линии, несущие транспозоны, были любезно предоставлены профессором П. Шедлом (Greenberg, Sсhedl, 2001).
Рис. 10. Нарушение миграции фолликулярных клеток у мутантов Trlen82 и Trl362(ex) на поздних стадиях развития яйцевой камеры. А, Г, Ж - яйцевая камера дикого типа на стадии 10;
Б, Д, З - яйцевая камера мутанта Trlen82/TrlR85;
В, Е, И – яйцевая камера мутанта Trl362(ex)/TrlR85. Г, Д, Е - яйцевые камеры, окрашенные Alexa-конъюгированным фаллоидином (О – ооцит). Г – в норме ценрипетальные клетки (указаны стрелками) глубоко проникают внутрь камеры между ооцитом и питающими клетками. Д, Е – у мутантов нарушена миграция центрипетальных клеток. Е - ооцит (выделен пунктиром) внедряется в область питающих клеток. Ж, З, И – яйцевые камеры, окрашенные DAPI.
З, И - фолликулярные клетки не покрывают поверхности всего ооцита. Треугольниками указана граница, где кончается миграция фолликулярных клеток. Масштаб 100 мкм.
Было установлено, что добавление одной копии трансгена hsp83:GAGA-519 в геном гомозиготных Тrl362 мух приводит к частичному восстановлению фертильности, в цитоплазме питающих клеток формируются актиновые филаменты, снижается число яйцевых камер с нарушениями. Добавление двух копий трансгена hsp83:GAGA-519 приводит к полному восстановлению фертильности самок Тrl362. При добавлении же двух копий другого трансгена hsp83:GAGA-581 восстановления фертильности не происходло. Полученные в работе данные согласуются с данными Гринберга и Шедла о том, что трансген hsp83:GAGA-519 является более эффективным для спасения фенотипа Trl13С мутантов, чем hsp83:GAGA-581-трансген (Greenberg and Sсhedl, 2001).
Фертильность самок Trlen82 и Trl362(ex) восстанавливается при добавлении одной копии каждого из трансгенов. Восстановление фертильности самок в результате увеличения количества белка GAGA свидетельствует о том, что стерильность была обусловлена недостатком именно этого белка.
ВЫВОДЫ.
1. Получены новые гипоморфные мутации гена Trl, затрагивающие 5’-область, проведено их картирование. Мутация Trl362 обусловлена встройкой Р элемента в 5`-некодирующую область гена (в позицию 2979) и прилегающую к нему делецию размером 97 п.н. (2979-3076). Делеция удаляет два первых сайта инициации транскрипции, используемых в яичниках. Мутация Trl362(ex) содержит такую же делецию в 5’-некодирующей области гена, как и мутация Trl362, но не содержит Р-элемент.
2. Показано, что мутации Trl362, Trl362(ex) и Trlen82 приводят к снижению жизнеспособности и стерильности самок в гомозиготном состоянии и в компаунде с нуль-аллелем.
3. Установлено, что в яичниках самок Trl362 транскрипция гена Trl снижена как минимум в 10 раз, что сопровождается значительным уменьшением количества белка GAGA в половых клетках. Транскрипция гена Trl в яичниках гомозиготных Trlen82-мутантных самок снижена приблизительно на треть, тогда как в яичниках Trl362(ex)-мутантов экспрессия гена практически не отличается от нормы.
4. Выявлено, что у всех анализируемых Trl мутантов в той или иной степени нарушена морфология овариол и яйцевых камер. Яйцевые камеры мутантов характеризуются отличным от нормы числом половых клеток. На поздних стадиях развития яйцевой камеры у мутантов выявлены нарушения в функционировании соматических клеток, а также в формировании стадиоспецифических цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках.
5. Введение трансгенных конструкций в геном мутантов, обеспечивающих дополнительную экспрессию кДНК гена Trl, приводит к восстановлению фертильности мутантных самок и морфологии их яичников. Это свидетельствует о том, что именно изменение в экспрессии гена Trl является причиной выявленных нарушений в оогенезе мутантов.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Е.В. Федорова, А.А. Огиенко, Д.А. Карагодин и др. Получение и анализ новых мутаций по гену Trithorax-like Drosophila melanogaster // Генетика.
2006. Т. 42. N. 2. С. 149-158.
2. А.А. Огиенко, Д.А. Карагодин, С.А. Федорова и др. Анализ новой гипомофной мутации гена Trithorax-like, влияющей на оогенез Drosophila melanogaster // Онтогенез. 2006. Т. 37. N. 3. С. 157–166.
3. А.А. Огиенко. Получение и анализ перестроек во втором интроне гена Trithorax-like Drosophila melanogaster // Материалы XLI Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". 2003. С. 29.
4. А.А. Огиенко, Д.А. Карагодин, С.А. Федорова и др. GAGA фактор, кодируемый геном Trithorax-like, требуется для оогенеза дрозофилы // Тезисы докладов XIV Школы по биологии развития «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии». Онтогенез. 2005. Т. 36. N. 5. С. 388.
5. А.А. Огиенко, Д.А. Карагодин, С.А. Федорова и др. Анализ механизмов влияния гена Trithorax-like на формирование актиновых филаментов в питающих клетках яичников Drosophila melanogaster // Материалы 10-ой Пущинской Школы-конференции молодых ученых. 2006. С. 37-38.
6. А.А. Огиенко, Д.А. Карагодин, С.А. Федорова и др. Анализ механизмов влияния гена Trithorax-like на нарушение процесса быстрого транспорта в оогенезе Drosophila melanogaster // Материалы Международной конференции “Генетика в России и мире”. 2006. С. 144.