Структурное исследование над+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов
На правах рукописи
Шабалин Иван Григорьевич
СТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАД+-ЗАВИСИМЫХ
ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ
ОРГАНИЗМОВ
Специальность 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата химических наук
МОСКВА 2010
Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии
Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научные руководители: доктор химических наук, профессор В.О. Попов кандидат физико математических наук К.М. Поляков
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Д.И. Левицкий доктор химических наук, В.З. Плетнёв
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН
Защита состоится « 10 » июня 2010 г. в « 14 » часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.
Автореферат разослан _ мая 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы (ФДГ, КФ 1.2.1.2) окисляют ионы формиата при сопутствующем восстановлении кофермента НАД+ до НАДH:
НСОО- + НАД+ СО2 + НАДН ФДГ широко распространены в природе: они были найдены в бактериях, грибах и высших растениях. В метилотрофных микроорганизмах этот фермент играет важную роль в обеспечении их энергией, катализируя последний этап катаболизма метанола. В растениях ФДГ участвует в ответе на стрессовые воздействия: в стрессовых условиях содержание этого фермента в митохондриях достигает 9% от всех митохондриальных белков.
Особенностью молекулярного механизма действия ФДГ является прямой перенос гидрид-иона от субстрата на атом С4 никотинамидного кольца НАД+ без дополнительных стадий переноса протона, присутствующих в реакциях, катализируемых другими родственными НАД+-зависимыми дегидрогеназами. Поэтому реакция, катализируемая ФДГ, является удобной моделью для изучения механизма переноса гидрид-иона в каталитическом центре НАД+-зависимых дегидрогеназ методами квантовой механики и молекулярной динамики. ФДГ используется на практике для регенерации кофермента НАДH в ферментативных процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. Практическая необратимость формиатдегидрогеназной реакции и широкий рН-оптимум активности сделали этот фермент универсальным биокатализатором, способным эффективно работать при значениях рН, оптимальных для целевого процесса.
Ранее проведен большой объем исследований по кинетическим и физико-химическим свойствам ФДГ в растворе из ряда организмов. Решены пространственные структуры апо- и холо-форм ФДГ из метилотрофной бактерии Pseudomonas sp.101 (PseФДГ) с разрешением около 2 и структура апо-формы ФДГ из метилотрофных дрожжей Candida Boidinii (CboФДГ) с разрешением 1.7. Предложен молекулярный механизм действия фермента, многие детали которого подтверждены методом сайт направленного мутагенеза и методами молекулярного моделирования.
Однако, ряд важных вопросов, связанных с особенностями каталитического действия фермента, оставались невыясненными. В частности, оставался открытым вопрос о том, как устроены холо-формы эукариотических ФДГ, в том числе активный центр и сайт связывания кофермента. Неизвестно, какие структурные особенности определяют отличия эукариотических ФДГ от бактериальных по таким параметрам как кинетический механизм, активность и термостабильность. Кроме того, к моменту начала работы не было получено пространственных структур ФДГ с атомным разрешением, которые могли бы уточнить некоторые детали молекулярного механизма действия фермента и послужить надежной стартовой моделью для его исследования методами квантовой механики. Таким образом, изучение НАД+-зависимых структурно-функциональных особенностей формиатдегидрогеназ из различных организмов является актуальным как с фундаментальной (особенности структурной организации ФДГ из различных организмов и детали молекулярного механизма действия ФДГ и процессов переноса гидрид-иона в каталитических центрах НАД+-зависимых дегидрирогеназ в целом), так и с практической точки зрения (разработка рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).
Цель работы. Целью данной работы является структурное исследование ФДГ из различных организмов. Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:
НАД+-зависимой 1) Получение кристаллов апо- и холо-форм формиатдегидрогеназы из метилотрофной бактерии Moraxella sp. C- (MorФДГ) и высшего растения Arabidopsis thaliana (AraФДГ).
2) Решение пространственных структур апо- и холо-форм MorФДГ и AraФДГ методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.
3) Сравнительный анализ решенных структур с ранее известными структурами ФДГ.
Научная новизна. Впервые решены пространственные структуры апо- и холо-форм MorФДГ и AraФДГ. Структуры AraФДГ являются первыми структурами растительных ФДГ, причем структура холо-AraФДГ является первой структурой холо-формы эукариотической ФДГ. Проведен сравнительный анализ решенных структур с ранее исследованными структурами ФДГ, выявлены структурные отличия бактериальных и эукариотических ФДГ. Решена структура апо-формы MorФДГ в закрытой конформации, представляющая собой редкий пример структуры апо-формы НАД+-зависимой дегидрогеназы в закрытой конформации, характерной для холо-формы ферментов. Показана роль связывания кофермента, структурирования С-концевого фрагмента 375-399 и связывания субстрата/ингибитора в переходе бактериальных ФДГ к закрытой конформации. Впервые решена структура ФДГ с атомным разрешением (структура тройного комплекса MorФДГ-НАД+-азид с разрешением 1.1 ) и подтвержден ряд предположений о молекулярном механизме действия ФДГ.
Личный вклад автора. Поиск и оптимизация условий кристаллизации, участие в сборе дифракционных данных, обработка полученных данных.
Решение и уточнение пространственных структур. Анализ полученных атомных моделей. Большая часть работы выполнялась лично соискателем, за исключением работы по кристаллизации, решению, уточнению и анализу структур апо-MorФДГ (разрешение 2.3 ) и холо-MorФДГ (разрешение 1.95 ), которая проводилась совместно с Е.В. Филлиповой. Большая часть работы (более 85%) выполнялась соискателем.
Практическая значимость работы. Значительно расширена структурная основа для понимания механизма действия используемого в биотехнологии фермента. Полученная структурная информация может быть с успехом использована для дальнейшего дизайна рекомбинантного биокатализатора для систем регенерации никотинамидных коферментов в биотехнологии.
Предложен ряд перспективных мутаций для увеличения термостабильности AraФДГ и повышения сродства AraФДГ и CboФДГ к НАД+.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: международная конференция «Biocatalysis – 2007» (Москва, 2007), VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007) (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Recent Developments in Macromolecular Crystallography (India, Pune, 2008), международная конференция "Рентгеновское, Синхротронное излучения, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии" (Москва, 2009).
Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах (из них одна статья в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ), одна статья в сборнике и 6 тезисов конференций.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 ссылок. Работа изложена на страницах, содержит 46 рисунков и 6 таблиц.
ВВЕДЕНИЕ Обсуждена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Рассмотрена физиологическая роль ФДГ в различных организмах, проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей фермента. Проанализирована литература по кинетическим свойствам ФДГ в растворе, по пространственным структурам ФДГ и по исследованию механизма действия этого фермента.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Объекты исследования В качестве объекта исследования были выбраны НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы из метилотрофной бактерии Moraxella sp. C- (MorФДГ) и высшего растения Arabidopsis thaliana (AraФДГ). Белки были экспрессированы, выделены и очищены сотрудниками группы генетической инженерии и белкового дизайна кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ под руководством профессора В.И. Тишкова.
2. Кристаллизация Кристаллизация проводилась методом диффузии в парах в висячих каплях при температуре 20С в термостатированной комнате. В случае кристаллизации холо-формы ФДГ к раствору белка добавляли кофермент НАД+ и азид натрия до концентрации каждого 5 мМ. Раствор белка с концентрацией от 6 до 14 мг/мл перед кристаллизацией центрифугировался.
Для приготовления каждой капли бралось 2 мкл белка и смешивалось с резервуарным раствором в соотношении 1:1. После нахождения первоначальных условий кристаллизации для улучшения качества и размеров кристаллов проводилась серия экспериментов по оптимизации состава противораствора и концентрации раствора белка.
Оптимизированные условия кристаллизации представлены в таблице 1.
Таблица 1. Условия кристаллизации MorФДГ и AraФДГ.
Разре Структура Состав раствора белка Состав противораствора шение, 8 мг/мл MorФДГ, 2.5 мМ АДФР, 5 мM Апо-MorФДГ 0.1 М ацетат аммония, 21% ПЭГ 2.3 формиат натрия, 0.1 М калий открытая 8000, 0.1 М Bis-Tris буфер рН 5. фосфатный буфер рН 7. Апо-MorФДГ 10.5 мг/мл MorФДГ, 0.1M калий- 0.1M HEPES pH 7.5, 2.2 M 1. закрытая фосфатный буфер pH 7.0 Сульфат аммония, 2% PEG 11 мг/мл MorФДГ, 5 мМ НАД+, 5 мM Холо- 0.1 М Bis-Tris буфере рН 6.5, 2. 1.95 азид натрия, 0.1M калий-фосфатный MorФДГ М сульфат аммония буфер pH 7. 10.5 мг/мл MorФДГ, 5 мМ НАД+, 5 мM Холо- 0.1 М Bis-Tris буфере рН 6.5, 2. 1.1 азид натрия, 0.1M калий-фосфатный MorФДГ М сульфат аммония буфер pH 7. 6 мг/мл AraФДГ, 10mM ЭДТА, 0.1 M 0.1 M Bis-Tris pH 6.0, 2.1 M 1. Апо-AraФДГ калий-фосфатный буфер pH 7.0 сульфат аммония 14 мг/мл AraФДГ, 5 мМ НАД+, 5 мM Холо- 0.1 M Bis-Tris pH 5.5, 2.1 M 2.0 азид натрия, 10mM ЭДТА, 0.1 M калий AraФДГ сульфат аммония фосфатный буфер pH 7. 3. Рентгеноструктурный эксперимент, решение и уточнение пространственных структур Дифракционные данные были получены: на станции К4. Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий (структуры апо-MorФДГ-закрытая и холо-AraФДГ), на источнике рентгеновского излучения ELLIOT GX-6 с вращающимся анодом в Институте Белка РАН, г. Пущино (структура холо-MorФДГ (1.95 )) и на станциях Х11 и Х13 синхротрона Гамбургского отделения EMBL (структуры апо-MorФДГ, холо-MorФДГ (1.1 ) и апо-AraФДГ). Статистические характеристики наборов дифракционных данных представлены в таблице 2.
Таблица 2. Статистические характеристики наборов дифракционных данных.
В скобках приведены данные для последнего слоя разрешения.
Апо- Апо Холо- Холо- Апо- Холо Набор данных MorФДГ MorФДГ MorФДГ MorФДГ AraФДГ AraФДГ открытая закрытая Институт EMBL- EMBL- EMBL КЦСИ белка РАН КЦСИ Станция Hamburg, Hamburg, Hamburg, К4.4 ELLIOTT К4. X13 X11 X GX- Температура, К 100 100 293 100 100 Длина волны, 0.80 1.05 1.54 0.82 0.81 0. 20-2.3 39.1-1.96 27.8-1.95 20-1.1 20-1.7 20-2. Разрешение, (2.33-2.3) (2.05-1.96) (2.0-1.95) (1.11-1.10) (1.8-1.7) (2.07-2.0) P21 C2 C2 C2 C P Группа симметрии и a=77.9, a=80.66, a=80.45, a=79.24, a=229.62, a=70. параметры b=123.5, b=66.09, b=66.50, b=66.24, b=217.68, b=106. кристаллической c=85.3;
c=75.55;
c=75.55;
c=74.20;
c=139.11;
c=106.50;
ячейки ( и град) ==90, ==90, ==90, ==90, ==90, = == =95 =104.13 =103.57 =103.40 = 92. Число измеренных 107292 88327 67848 586345 892591 рефлексов Число уникальных 68344 27648 27554 145564 84701 рефлексов Мозаичность, град 1.7 0.7 0.35 0.7 0.45 0. Полнота, % 96.1 (83.1) 99.5 (100) 97.1 (95.1) 96.5 (73.8) 95.9 (90.4) 93.6 (87.9) Rmerge, % 12.1 (15.5) 12.2 (47.6) 9.4 (35.7) 5.1 (52.9) 4.6 (32.3) 7.5 (32.8) I/ I 9.2 6.0 (2.1) 8.0 (3.0) 44 (1.9) 31.3 (5.4) 8.9 (2.6) Температурный фактор из графика 43 33.1 25.7 11.5 25.6 21. Вилсона, Дифракционные данные для структур апо-MorФДГ и холо-MorФДГ (1.1 ) были обработаны программами DENZO и SCALEPACK. Данные для структуры апо-MorФДГ-закрытая обрабатывались программой AUTOMAR.
Дифракционные данные для всех остальных структур были обработаны программой XDS. Пространственные структуры были решены методом молекулярного замещения по программе MOLREP. В качестве стартовой модели для решения структур апо- и холо-MorФДГ использовались структуры одной субъединицы апо- и холо-PseФДГ, соответственно. Для решения структур апо- и холо-AraФДГ использовалась структура кофермент-связывающего домена холо-MorФДГ, каталитические домены были достроены в процессе уточнения вручную. Кристаллографическое уточнение структур проводили по программе REFMAC. Для всех неводородных атомов структуры холо-MorФДГ (1.1 ) температурные факторы уточнялись в анизотропном приближении, все остальные структуры уточнялись в изотропном приближении. При уточнении структуры холо MorФДГ (1.1 ) и структуры апо-AraФДГ (1.7 ) учитывался вклад атомов водорода в рассеивание. Для визуального контроля за ходом уточнения, внесения существенных изменений в атомную модель структуры и локализации молекул воды использовали графическую программу COOT.
Статистические характеристики уточнения структур и атомных моделей приведены в таблице 3.
Таблица 3. Статистические характеристики уточнения структур и атомных моделей.
Апо- Апо Холо- Холо- Апо- Холо Структура MorФДГ MorФДГ MorФДГ MorФДГ AraФДГ AraФДГ открытая закрытая Разрешение, 2.3 1.96 1.95 1.1 1.7 2. R-фактор/ Rfree, % 23.1/З2.7 18.7/24.0 14.2/18.4 13.4/15.9 16.8/19.7 18.9/23. Число рефлексов:
в уточнении 64841 26255 26730 138020 83414 в расчете Rfree 3451 1382 1407 7275 4170 RMSD длин валентных 0.019 0.020 0.018 0.015 0.017 0. связей, RMSD валентных углов, град 1.9 1.8 1.6 1.7 1.6 1. Средневзвешенная ошибка координат атомов (DPI), 0.321 0.175 0.165 0.028 0.093 0. Число неводородных атомов в модели:
белок 12101 3005 3097 3106 5442 вода 480 97 181 437 559 лиганды 3 12 47 84 30 Средний темп-ный фактор, 2:
атомов белка 37.1 32.4 18.6 19.1 30.7 23. молекул воды 34.2 33.1 27.4 31.8 40.2 32. атомов лигандов 26.5 30.1 12.6 24.9 39.8 23. Доля остатков на графике Рамачандрана в областях, %:
наиболее благоприятных 83.7 86.4 89.4 90.0 89.8 88. разрешенных 16.0 13.3 10.3 9.7 10.2 11. запрещенных 0.3 0.3 0.3 0.3 0 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Структуры холо- и апо-форм MorФДГ Холо-форма MorФДГ Пространственная структура холо-MorФДГ содержит в независимой части элементарной ячейки одну молекулу белка в закрытой конформации в комплексе с НАД+ и ионом азида, аналогом субстрата в переходном состоянии ферментативной реакции. Молекулу димера MorФДГ образуют субъединицы, связанные кристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка (Рис. 1). На С-конце полипептидной цепи структуры холо-MorФДГ были обнаружены 8 дополнительных аминокислотных остатков (392-399), которые не удавалось локализовать по картам электронной плотности в структуре холо-PseФДГ. Часть дополнительных остатков образуют -спираль 20 и способствуют более прочному междоменному взаимодействию в результате образования двух водородных связей (Asn317-Glu397) и гидрофобного кластера (Trp99, Pro314, Tyr396 и Trp177 соседней субъединицы димера). Два С-концевых остатка 400-401 не локализованы.
Полипептидная цепь субъединицы MorФДГ организована в глобулярную двухдоменную структуру, подобную структуре PseФДГ:
кофермент-связывающий домен образован аминокислотными остатками 147-333, а каталитический сформирован остатками 1-147 и 333-401 (Рис. 1).
Холо-MorФДГ и холо-PseФДГ имеют практически одинаковый ход полипептидной цепи: при суперпозиции отдельных субъединиц этих структур RMSD С атомов равно 0.42. Отклонения, превышающие 1, были обнаружены только в каталитическом домене. Вторичные структуры холо MorФДГ и холо-PseФДГ практически одинаковы (Рис. 2). Однако MorФДГ и PseФДГ отличаются организацией димерного контакта: при практически одинаковой площади (3953 и 3799 2, соответственно), димерный контакт в холо-MorФДГ содержит 54 водородных связей, а в холо-PseФДГ – водородных связей. При этом все водородные связи между субъединицами в димере холо-PseФДГ сохраняются и в холо-MorФДГ.
Рис. 1. Ход полипептидной цепи димерной молекулы MorФДГ в холо- (слева) и апо- (справа) форме. Левая субъединица димера окрашена в голубой цвет, кофермент-связывающий домен правой субъединицы – в фиолетовый, каталитический домен правой субъединицы – в розовый. В структуре холо-MorФДГ остатки 375-391, не структурированные в апо-MorФДГ, показаны моделью красного цвета, дополнительные остатки 392-399 (относительно структуры холо-PseФДГ) – темно-красного цвета, молекула НАД+ – зеленого цвета, ион азида – красного цвета. Ось второго порядка, связывающая субъединицы димера, направлена перпендикулярно плоскости рисунка.
Кофермент связывается в междоменной щели и взаимодействует в основном с остатками кофермент-связывающего домена (Рис. 3). В связывании кофермента в структурах холо-MorФДГ и холо-PseФДГ участвуют одинаковые остатки и молекулы воды, единственным отличием является отсутствие молекулы воды у атома N1A кофермента в MorФДГ.
Каталитические центры холо-PseФДГ и холо-MorФДГ устроены практически одинаково (Рис. 4). Единственным отличием является наличие водородной связи между ионом азида и остатком His332 в структуре холо-MorФДГ (расстояние равно 3.2, в холо-PseФДГ – 3.6 ). Наличие этой связи подтверждает высказанную ранее на основе теоретических расчетов и данных сайт-направленного мутагенеза гипотезу о том, что остаток His может образовывать водородную связь с субстратом как в комплексе Михаэлиса, так и в переходном состоянии ферментативной реакции.
1 0 1 PseФДГ 1 --------AKVLCVLYDDPVDGYPKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTPKAIDFTPGQLLGSVSGELGLRKYLE MorФДГ 1 --------AKVVCVLYDDPINGYPTSYARDDLPRIDKYPDGQTLPTPKAIDFTPGALLGSVSGELGLRKYLE AraФДГ 21 FNASSGDSKKIVGVFYK------ANEYATKNP-----------------------NFLGCVENALGIRDWLE CboФДГ 1 ---------KIVLVLYD------AGKHAADEE-----------------------KLYGCTENKLGIANWLK 2 3 3 4 4 PseФДГ 65 SNGHTLVVTSDKDGPDSVFERELVDADVVISQPFWPAYLTPERIAKAKNLKLALTAGIGSDHVDLQ--SAID MorФДГ 65 SQGHELVVTSSKDGPDSELEKHLHDAEVIISQPFWPAYLTAERIAKAPKLKLALTAGIGSDHVDLQ--AAID AraФДГ 65 SQGHQYIVTDDKEGPDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAYVTAERIKKAKNLKLLLTAGIGSDHIDLQ--AAAA CboФДГ 35 DQGHELITTSDKEGGNSVLDQHIPDADIIITTPFHPAYITKERIDKAKKLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTG ** * 5 6 7 8 6 PseФДГ 135 RNVTVAEVTYCNSISVAEHVVMMILSLVRNYLPSHEWARKGGWNIADCVSHAYDLEAMHVGTVAAGRIGLAV MorФДГ 135 NNITVAEVTYCNSNSVAEHVVMMVLGLVRNYIPSHDWARNGGWNIADCVARSYDVEGMHVGTVAAGRIGLRV AraФДГ 135 AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILMRNFVPGYNQVVKGEWNVAGIAYRAYDLEGKTIGTVGAGRIGKLL CboФДГ 107 KKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRV * * * *** 9 7 10 8 11 9 PseФДГ 207 LRRLAPFDV-HLHYTDRHRLPESVEKELNLTWHATREDMYPVCDVVTLNCPLHPETEHMINDETLKLFKRGA MorФДГ 207 LRLLAPFDM-HLHYTDRHRLPEAVEKELNLTWHATREDMYGACDVVTLNCPLHPETEHMINDETLKLFKRGA AraФДГ 135 LQRLKPFGC-NLLYHDRLQMAPELEKETGAKFVEDLNEMLPKCDVIVINMPLTEKTRGMFNKELIGKLKKGV CboФДГ 179 LERLVPFNPKELLYYDYQALPKDAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGA * 10 13 14 11 15 Cbo 16 PseФДГ 278 YIVNTARGKLCDRDAVARALESGRLAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRTMPY-----NGMTPHISGTTLTAQARY MorФДГ 278 YLVNTARGKLCDRDAIVRALESGRLAGYAGDVWFPQPAPNDHPWRTMPH-----NGMTPHISGTSLSAQTRY AraФДГ 135 LIVNNARGAIMERQAVVDAVESGHIGGYSGDVWDPQPAPKDHPWRYMPN-----QAMTPHTSGTTIDAQLRY CboФДГ 251 WLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRY ** * * * ** 17 18 12 13 19 PseФДГ 345 AAGTREILECFFEGR-PIRDEYLIVQGGALAGTGAHSYSKGNATGGSEEAAKFKKAV- MorФДГ 345 AAGTREILECYFEGR-PIRDEYLIVQGGGLAGVGAHSYSKGNATGGSEEAAKYEKLDA AraФДГ 135 AAGTKDMLERYFKGE-DFPTENYIVKDGELA----PQYR------------------- CboФДГ 323 AQGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYV---TKAYGKHDKK-------------- Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей всех ФДГ, для которых решены пространственные структуры.
Остатки, участвующие в димерном контакте, выделены зеленым фоном. Остатки, не локализованные ни в одной из пространственных структур каждого фермента, выделены красным цветом. Каталитически важные остатки отмечены звездочками. Остатки, участвующие в димерном контакте и элементы вторичной структуры приведены для холо-форм ферментов, за исключением CboФДГ.
Рис. 3. Схема связывания НАД+ и иона азида в структурах холо-MorФДГ (слева) и холо-AraФДГ (справа). Водородные связи показаны пунктиром. Остатки, отличающиеся характером боковой цепи в этих структурах, выделены синим цветом.
Остатки и молекулы воды, не участвующие в связывании кофермента в одной из структур, выделены красным цветом.
Остатки каталитического домена обведены рамкой. Молекулы воды, сохранившиеся и в структуре апо-MorФДГ-закрытая, выделены синим фоном на схеме для холо-MorФДГ.
Рис. 4. Каталитический центр холо-MorФДГ (слева) и холо-AraФДГ (справа).
Водородные связи изображены в виде красных пунктирных линий. Структура холо PseФДГ приведена моделью черного цвета.
Апо-форма MorФДГ В независимой части элементарной ячейки структуры апо-MorФДГ содержится два димера фермента в открытой конформации, образованные субъединицами (A)(B) и (C)(D). Субъединицы в димере связаны некристаллографическими поворотными осями второго порядка (Рис. 1). Все субъединицы в структуре апо-формы MorФДГ очень похожи: RMSD С атомов при попарном наложении субъединиц равно 0.35-0.46. В субъединицах (А) и (D) были локализованы по 374 аминокислотных остатка, а в субъединицах (В) и (С) по 369. Таким образом, как и в апо-PseФДГ, большой C-концевой фрагмент (остатки 375-401) структуры апо-MorФДГ не локализован. Апо-MorФДГ имеет более открытую (на 2-5 при сравнении разных субъединиц) конформацию по сравнению с апо-PseФДГ.
Как и в апо-PseФДГ, боковая цепь остатка каталитического центра Arg284 имеет разные конформации в различных субъединицах, что свидетельствует о его конформационной подвижности в апо-форме.
Конформация петли каталитического центра 122-125 различна в субъединицах структуры апо-MorФДГ, что подтверждает высказанное ранее предположение о её гибкости в апо-форме ФДГ. Боковые цепи остатков Arg222, His223, His258 и Glu260 аденин-связывающего сайта имеют различные конформации во всех субъединицах (как и в апо-PseФДГ), что позволяет сделать вывод о лабильности аденин-связывающего сайта ФДГ в открытой конформации в отсутствие кофермента.
Как следует из сравнения структур апо- и холо-форм MorФДГ, при связывании НАД+ и иона азида молекула MorФДГ приобретает закрытую конформацию, как это было описано ранее для PseФДГ. Каталитический домен смещается как единое целое в сторону кофермент-связывающего на угол ~12 (на 2-4 больше, чем для PseФДГ), что приводит к компактизации каталитического центра. При этом структурируются остатки каталитического центра 123-124 и Arg284 и остатки аденин-связывающего сайта Arg222, His223, His258 и Glu260. Кроме того, структурируются С-концевые остатки 375-399 с образованием -спиралей 19 и 20 (Рис. 1, Рис. 2). Небольшие отличия в организации доменов в апо- и холо-MorФДГ (отклонения С атомов на 1.0-2.4 относительно домена, к которому они относятся) вызваны связыванием кофермента (остатки 223-224, 257-262), структурированием С-концевых остатков (130-136, 223-224, 257-262, 316 317), структурированием каталитического центра (123-124) и подстройкой остатков, участвующих в междоменных взаимодействиях (17-29).
2. Структура апо-формы MorФДГ в закрытой конформации Пространственная структура апо-формы MorФДГ в закрытой конформации представляет собой редкий пример структуры апо-формы НАД+-зависимой дегидрогеназы с закрытой междоменной щелью. Кристаллы апо-MorФДГ в закрытой конформации изоморфны кристаллам холо-MorФДГ.
Ход полипептидной цепи этих структур практически одинаков: RMSD С атомов при суперпозиции по 399 остаткам составляет 0.31. При этом различия более 1 в положениях C атомов наблюдаются только в области связывания адениновой части кофермента (остатки 222-224). Как и в холо MorФДГ, в структуре апо-MorФДГ-закрытая структурированы С-концевые остатки 375-399 (Рис. 1). Таким образом, переход фермента к закрытой конформации сопровождается структурированием С-концевого фрагмента 375-399 даже без связывания кофермента.
В междоменной полости структуры апо-MorФДГ-закрытая локализованы молекула воды и ион сульфата на месте связывания пирофосфатной части НАД+, а также молекула глицерина с половинной заселенностью и молекула воды на месте связывания никотинамидной части НАД+ и субстрата (т.е. в каталитическом центре). Других молекул, связанных на месте НАД+, обнаружено не было. В структуре апо-MorФДГ-закрытая шесть из девяти молекул воды, участвующих в связывании НАД+ в структуре холо-MorФДГ, имеют те же позиции и вовлечены в такую же сетку водородных связей, что и в холо-MorФДГ (Рис. 3). Возможными причинами кристаллизации апо-MorФДГ в закрытой конформации являются наличие дополнительных С-концевых остатков 392-399 и связывание иона сульфата на месте пирофосфатной части НАД+, поскольку эти факторы способствуют междоменным взаимодействиям. Кроме того, нельзя исключать возможное влияние межмолекулярных контактов в кристалле на конформацию фермента. Молекула глицерина в каталитическом центре не могла способствовать кристаллизации фермента в закрытой конформации, поскольку глицерин содержался только в растворе криопротектанта, в который кристаллы помещались непосредственно перед сбором данных.
Остатки каталитического центра структуры апо-MorФДГ-закрытая находятся практически в тех же конформациях, что и в холо-MorФДГ (отклонения в позициях атомов не превышают 0.6 ), т.е. находятся в каталитически-активной конформации. Этот факт является значительным отличием структуры апо-MorФДГ-закрытая от структур апо-PseФДГ и апо MorФДГ, в которых остатки каталитического центра, относящиеся к разным доменам, пространственно удалены друг от друга из-за открытой конформации фермента, петля 122-125 имеет две конформации основной цепи, а остаток Arg284 имеет несколько конформаций боковой цепи. Таким образом, можно сделать вывод, что переход фермента к закрытой конформации приводит к фиксации остатков каталитического центра в каталитически-активной конформации даже без связывания кофермента.
Сравнение структур апо-MorФДГ-закрытая и холо-MorФДГ показало, что связывание кофермента вызывает конформационные изменения фермента, которые не происходят при переходе фермента в закрытую конформацию без связывания кофермента. В сайте связывания адениновой части НАД+ позиции C атомов в этих структурах различаются более чем на 0.5 для остатков 221-226, 259-260 и 379-383 (Рис. 5). В структуре апо MorФДГ-закрытая эти три фрагмента не связаны между собой водородными связями, а боковые цепи четырех остатков (Arg222, Glu260, His379 и Ser382) разупорядочены и не локализованы по картам электронной плотности.
Кроме того, в сайте связывания адениновой части НАД+ не обнаружены дополнительные молекулы, что указывает на заполнение этого сайта неупорядоченным растворителем в отсутствие кофермента. Таким образом, независимо от конформации фермента, ряд остатков аденин-связывающего сайта разупорядочен в апо-форме MorФДГ.
Рис. 5. Аденин-связывающий сайт в Рис. 6. Различие конформаций петли структурах апо-MorФДГ-закрытая 221-226 в апо-MorФДГ-закрытая (зеленая) и холо-MorФДГ (малиновая). (серая), апо-MorФДГ (фиолетовая), Водородные связи изображены в виде апо-PseФДГ (зеленая), холо-MorФДГ красных пунктирных линий. Боковые цепи (красная) и холо-PseФДГ (желтая).
остатков Arg222, Glu260, His 379 и Ser382 Структуры совмещены по всем C в структуре апо-MorФДГ-закрытая не атомам кофермент-связывающего локализованы по картам электронной домена.
плотности.
В холо-форме MorФДГ кофермент образует пять водородных связей с остатками на участках 221-226, 259-260 и 379-383: с остатками Asp221 (две связи), Glu260, His379 (через молекулы воды) и Ser380 (Рис. 5, Рис. 3).
По-видимому, взаимодействие с коферментом вызывает смещение этих трех участков друг навстречу другу, что приводит к образованию пяти прямых водородных связей между ними. В результате, область связывания адениновой части НАД+ структурируется и компактизируется (Рис. 5).
Максимальный сдвиг C атомов происходит на участке 221-226 кофермент связывающего домена и составляет 2.3 (остаток His223). Конформация этой петли одинакова в структурах апо-MorФДГ, апо-MorФДГ-закрытая и апо PseФДГ, несмотря на то, что в случае апо-MorФДГ-закрытая фермент имеет закрытую конформацию. Конформация петли 221-226 в холо-формах MorФДГ и PseФДГ также совпадает и отличается от её конформации в апо формах (Рис. 6). Таким образом, можно сделать вывод, что изменение конформации петли 221-226 вызвано только связыванием кофермента, и не связано с переходом фермента в закрытую конформацию.
Решение уникальной структуры апо-формы MorФДГ в закрытой конформации позволило более полно охарактеризовать роль С-концевого фрагмента 375-399 и кофермента в стабилизации закрытой конформации бактериальных ФДГ. Остатки каталитического домена 375- структурируются при переходе фермента к закрытой конформации и способствуют её стабилизации, поскольку в результате этого между каталитическим и кофермент-связывающим доменами образуется 7 дополнительных водородных связей посредством этих остатков.
Дополнительные остатки MorФДГ 392-399 также участвуют в междоменных взаимодействиях, образуя две водородные связи (Asn317-Glu397) и гидрофобный кластер (Trp99, Pro314, Tyr396 и Trp177 соседней субъединицы димера).
Кофермент связывается в основном с кофермент-связывающим доменом, но также образует 9 водородных связей (6 из них через молекулы воды) с каталитическим доменом (Рис. 3). Таким образом, кофермент значительно стабилизирует закрытую конформацию фермента, поскольку он связывает домены между собой. Однако, кофермент также способствует структурированию С-концевого фрагмента 375-399, поскольку образует водородные связи с остатками His379 (через молекулу воды W21), Tyr (через молекулы воды W27 и W84) и Ser380 (Рис. 5). Кроме того, связывание кофермента вызывает изменение конформации петли 221-226 (Рис. 6), приводя к образованию пяти водородных связей между этой петлей и С концевыми остатками 379-382 (Рис. 5), что также способствует структурированию С-концевого фрагмента 375-391 и является междоменными взаимодействиями.
Данные малоуглового рентгеновского рассеивания свидетельствуют о том, что одного кофермента недостаточно для перехода ФДГ в закрытую конформацию, также необходимо связывание субстрата (иона формиата) или ингибитора (иона азида). Анализ структур ФДГ показал, что это происходит по двум причинам. Во-первых, субстрат/ингибитор связывается с остатками из обоих доменов, связывая их между собой. Во-вторых, отрицательный заряд субстрата/ингибитора способствует уменьшению электростатического отталкивания между положительно заряженными остатком каталитического центра Arg284 и никотинамидной частью НАД+.
3. Структуры холо- и апо-форм AraФДГ Холо-форма AraФДГ При анализе пространственных структур AraФДГ выяснилось, что ход полипептидной цепи AraФДГ и PseФДГ на участке 48-374 (нумерация по PseФДГ) практически одинаков. Поэтому, для удобства сравнительного анализа, остатки структур AraФДГ были пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью 48-374 PseФДГ (Рис. 2).
В независимой части элементарной ячейки структуры холо-AraФДГ содержится 6 молекул (т.е. 12 субъединиц) AraФДГ в закрытой конформации в комплексе с НАД+ и ионом азида. В ходе сравнительного анализа выяснилось, что в структуре присутствуют два сорта этих молекул: две молекулы (A)(B) и (C)(D), в которых субъединицы похожи друг на друга, и остальные четыре молекулы, в которых субъединицы одной молекулы несколько отличаются. Субъединицы холо-AraФДГ отличаются относительным расположением каталитических доменов относительно соответствующих кофермент-связывающих (разница 0.7-2.7) и конформацией остатков 39-48 (максимальное различие в позициях С атомов 4.8 ). На Рис. 7 представлена суперпозиция по С атомам кофермент-связывающих доменов максимально различающихся субъединиц в структуре – (А) и (I) (RMSD C атомов составляет 0.53 ).
Рис. 7. Суперпозиция по кофермент связывающим доменам субъединиц (А) (синяя) и (I) (зеленая) структуры НАД+ холо-AraФДГ. Молекула показана фиолетовым цветом, ион азида - красным цветом.
Полипептидная цепь субъединицы AraФДГ организована в глобулярную двухдоменную структуру, подобную структуре бактериальных ФДГ (Рис. 8): кофермент-связывающий домен AraФДГ образован аминокислотными остатками 147-333, а каталитический домен сформирован остатками 28-146 и 334-378. Во всех субъединицах структуры холо-AraФДГ не локализованы по кар е ртам эллектронно плот ой тности шшесть N-концевы N ых ос статков (Рис. 2) С дру ). угой стороны, в отличие от структур холо-фор х рм ба актериал льных ФД в стр ДГ, руктуре х холо-AraФ ФДГ лока ализован все С-концевы ны С ые ам минокисллотные о остатки полипептидной цепи. От ц тчасти, э связа это ано с те ем, чт в AraФ С-конец коро на 22 остатка чем в P то ФДГ оче 2 а, PseФДГ.
Ри 8. Ход полипеп ис. д птидной ц цепи диме ерной мо олекулы A AraФДГ в холо- (сл лева) и ап по (справа) ф форме. О Окраска пприведен в соо на ответствии с элемментами вторичной ст труктуры. Некристаллографическа ая ось второго поряд о дка, свя язывающщая су убъединицы димер напра ра, авлена пе ерпендик кулярно п плоскости рисунка Молеку и а. ула + НА показ АД зана моде елью маллинового цвета, ио азида – красног он го.
Кофеермент-с связываю ющие домены MorФД ДГ и AraФДГ имею ют пр рактичес ски одиннаковый ход по олипептидной це епи (Рис 9) и основны с. ые эл лементы вторичнной струуктуры (Рис. 2). Значение RMSD С ат томов при су уперпози иции осттатков 147-333 ххоло-форм MorФ ФДГ и AAraФДГ составил ло 0.96, различия в поз зициях С С атом мов сраавниваем мых осттатков не пр ревышаю 2.3.
ют Ри 9. Сра ис. авнение кофермен к нт связывающщих домен нов субъединиц (А) холо-фор ц рм ArraФДГ (ссиняя) и MorФД ДГ (те емно-крас сная) при суперпозицции по остатка ам НА + 47-333. Молекул ла АД по оказана ф фиолетовы цвето ым ом, ио азида – красным цветом.
он м Сраввнение каталитиических доменов структ в тур холоо-AraФДГ и хол Г ло MorФДГ при суперрпозиции по оста и аткам 0-38 (1-9 в MorФ 9 ФДГ), 49- 146 и 34 36 приве 69 едено на Рис. 10 N-конц а 0. цевые осстатки 9-48 и С-концевы остат ые тки 70-378 ст труктуры холо-AraФДГ в сравнен не уч ы нии частвова али, поск кольку хо од по олипептиидной це епи фермментов н этих участках значительно от на х тличаетсся.
Зн начение RMSD С атомо при т С ов такой супперпозицции сост тавило 0.58, при эт том различия в п позициях С атом срав х мов вниваемы остатков не превышаю ых ют 1.3. На участк а ках 30-38 (1-9 в MorФД 8 ДГ), 49-146 и 34-369 основныые эл лементы вторич чной стр руктуры каталиттических домено струк ов ктур хол ло Ar raФДГ и холо-MoorФДГ пр рактически одина аковы, за исключ а чением небольших н от тличий в их длине (Рис. 2).
Ри 10. Ср ис. равнение каталити е ических ддоменов холо-фор AraФД (синяя) и MorФД рм ДГ ДГ (те емно-красная), пр суперпо ри озиции по остатка 30-38 ( о ам (1-9 в MorФДГ), 9-146 и 34 36 Отлич 69. чающиеся остатки MorФДГ 10-48 и 370-399 показан красны цвето я и Г 9 ны ым ом.
Молекула Н + пок НАД казана фи иолетовым цветом ион ази – крас м, ида сным цвеетом.
Осно овные отличия простран нственно струк ой ктуры ArraФДГ от структ т тур ба актериалльных ФД заклю ДГ ючаются в замене длинно N-концевой пе е ой етли 10- ко оротким уучастком 39-48 и в отсут м тствии С-концевы остатков 375-378 и ых 83 40 (Рис. 10). Ос 01 статки 400-46 обр разуют дополнит д тельную, по отнношению к ю ст труктурам бактериальны ФДГ, -спира м ых аль 0 ((Рис. 2). Из-за отличия в ор рганизац N-кон площ ции нца щадь диммерного контакта в AraФД меньш на а ДГ ше 4% в сравнении с Mor rФДГ и с составляет 3023. При этом в ддимерном контак м кте Ar raФДГ у участвует всего 32 вод т дородных связи, что го х ораздо меньше в ср равнении с 42 у P и PseФДГ и 54 у MoorФДГ.
Анал струк лиз ктуры хо оло-AraФ ФДГ, явля яющейся первой структу я й урой хол ло формы э эукариот тической ФДГ, показал что катали л, итические центр е ры эу укариотических и прокариотическ устро ких оены практическ одина ки аково (Риис.
4) Катал ). литически цент AraФ ий тр ФДГ отл личается только одной заменой о й Th hr282Asn среди остатков имеющ водо n в, щих ородные связи с субстра атом и/ил ли ко офермен нтом. Одднако эта замена не при а а иводит к измене ению колличества и ха арактера водоро а одных сввязей, по оскольку 282-й о у остаток в этих структурах с вз заимодей йствует с коферрментом посредством ат тома кисслорода основной це епи.
Связ зывание коферм мента в структурах холо-AraФД и хол ДГ ло-MorФДДГ зн начителььно отлиичается (Рис. 3 Водо 3). ородные связи между молекуло м ой ко офермен и остатками S нта Ser147, S Ser380, His258 и Glu260, присутст H твующие в е ст труктуре холо-MoorФДГ, в структур холо-A ре AraФДГ оотсутств вуют или замененны на водородные с а связи чеерез моолекулы воды. Причем дополн нительны ых, от тносителльно ст труктуры холо- -MorФДГ, прямых вод, дородных связей х кофермента с белком в структуре холо-AraФДГ нет. В результате, адениновая часть кофермента, имеющая две прямые водородные связи с белком в структуре холо-MorФДГ (с остатками His258 и Glu260), в структуре холо-AraФДГ имеет только опосредованные молекулами воды водородные связи с белком. Пирофосфатная часть кофермента также образует на две водородные связи меньше: в структуре AraФДГ остаток Ser147 заменен на валин, а остаток Ser380 заменен на Gln376 (пространственное расположение остатка Gln376 в структуре холо-AraФДГ эквивалентно расположению остатка Ser380 в структуре холо-MorФДГ). При этом в структуре холо-AraФДГ больше на три водородных связей кофермента с молекулами воды, связанными с ферментом. Гидрофобный аденинин связывающий карман кофермент-связывающего домена в AraФДГ и MorФДГ устроен практически одинаково. На основе проведенного анализа пространственных структур для улучшения связывания кофермента предложены мутации Val147Ser, Thr258His, Lys260Glu и Gln376Ser для AraФДГ и мутации Val119Ser, Gly233Glu и Ala356Ser для CboФДГ.
Апо-форма AraФДГ В независимой части элементарной ячейки структуры апо-AraФДГ находится одна молекула фермента в открытой конформации, т.е. две субъединицы, связанные некристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка (Рис. 8). Субъединицы в структуре апо-формы AraФДГ очень похожи: RMSD С атомов при попарной суперпозиции субъединиц равно 0.05. В апо-AraФДГ, как и в холо-AraФДГ, не локализованы по картам электронной плотности шесть N-концевых остатков (Рис. 2). В отличие от структур апо-форм бактериальных ФДГ, в структуре AraФДГ локализованы все С-концевые аминокислотные остатки полипептидной цепи, также как и в холо-форме.
Апо-форма AraФДГ имеет гораздо более открытую конформацию, в сравнении с бактериальными ФДГ, что может быть объяснено заменой длинной жесткой петли 10-48 на короткий и гибкий участок 39-48 в пространственной структуре AraФДГ (Рис. 7, Рис. 10). Как и в апо-формах других ФДГ, остатки каталитического центра в апо-AraФДГ, относящиеся к разным доменам (Ile122 и Asn146 каталитического домена и Arg284 и His кофермент-связывающего домена), пространственно разнесены друг от друга из-за расхождения доменов в открытой конформации фермента.
Остаток Arg284 имеет одну конформацию, однако атомы боковой цепи этого остатка имеют относительно высокие температурные факторы, что свидетельствует о его высокой конформационной подвижности. Петля каталитического центра 122-125 имеет такую же конформацию, как в холо AraФДГ.
Как следует из сравнения структур апо- и холо-форм AraФДГ, при связывании НАД+ и иона азида молекула AraФДГ приобретает закрытую конформацию, как и в бактериальных ФДГ. Каталитический домен см мещается как еддиное цеелое в строну коферме ент-связыывающег на уго го ол ~ 22, что на 10-14 больше, чем для бактериа б альных ФДГ, из з-за более от ткрытой конформации а апо-AraФ ФДГ. Небольшие отличи в ор е ия рганизации до оменов в апо- и холо о-AraФДГ (откло Г онения С атом С мов на 1.0-3. от тносител льно доммена, к котором они относятс му о ся) вызвваны свяязываниеем ко оферменнта и о образоваанием в водороднных свя язей с приблиз зившимися ос статками С-конц и цевого ффрагмента 369- -378 к коферме ент-связы ывающем му до омену (о остатки 222-223 и 257-2661), подс стройкой остатко катали ов итическо ого це ентра (оостатки 123 и 125) и подстр ройкой оостатков участв в, вующих в ме еждомен нных вза аимодейсствиях (о остатки 39-48, 3 74-177, 184-185, 313, 3116, 34-336, 369-3788). Сбл лижение доменов при иводит к комп пактизации ка аталитического ц центра. З Значителльным оттличием AraФДГ от бакте ериальныых ФДДГ явля яется о отсутстви ие длин нного С-концево С ого фра агмента, которы, ый ст труктурир руется п при перееходе к закрыто конфо ой ормации: вместо этого С о ко онцевые остатки 369-378 меняют свою ко онформацию со с сдвигом С атомов не более чем на 1.1-2.9. Кр е а 9 роме тог го, в сл лучае AraФДГ нет тако н ого зн начитель ьного из зменения конфо я ормации петли 221- и 26 (макссимальное см мещение С атомов сост е тавляет 1.3 в сравненнии с 2.3 в Mo 3 orФДГ) при св вязывани кофер ии рмента, ч може быть связано с отличиями в ор что ет с рганизации ад денин-св вязывающщего сай (Рис. 3).
йта 4. Струк. ктура х холо-ф формы M MorФДГ с ато Г омным разреш шением м Знач чительны ым пре еимущест твом атомного разре а ешения являет тся бо ольшое количес ство дифракцио онных данных относите д ельно количества к ут точняемы парам ых метров, что позволяет уточнять темпер у ь ратурные фактор е ры не еводород дных аттомов в анизотр ропном приближ жении. П Путем увеличения вр ремени к кристаллизации у удалось вырастить криста холо алл о-MorФДГ (тройной + ко омплекс MorФДГ--НАД -аз зид), при игодный для сбор дифра д ра акционны данны ых ых с атомным разреш м шением.
Рис 11. С Структура каталит а тического центра холо х Рис. 12. Переход д MorФДГ с разрешшением 1.1. Карт электро та онной никотинамидной группы НАД+ в б плотност с коэф ти ффициентами 2|F0| – |Fc| пок казана биполярную для НАД+ и азида с уровне срезки 1.0.
Д а ем и форму.
Кристалл оказался изоморфным кристаллам, использованным для решения структуры холо-MorФДГ с разрешением 1.95. Эти структуры практически идентичны: RMSD С атомов равно 0.30, при этом максимальное отклонение С атомов составляет 1.1 (остаток Ser18).
Координаты атомов боковых цепей 18 остатков, локализованных на поверхности белковой глобулы, отличаются более чем на 1, причем максимальное отличие составляет 9 (остаток Arg26).
Структура с атомным разрешением позволила гораздо более полно и достоверно определить структуру растворителя и более точно идентифицировать альтернативные конформации остатков. На основании анализа значений температурных факторов и пиков электронной плотности удалось различить большинство атомов азота, кислорода и углерода, что дало возможность однозначно установить поворотные изомеры боковых цепей остатков гистидина и большинства остатков аспарагина и глютамина.
Данные структуры с атомным разрешением подтвердили, что в каталитическом центре MorФДГ карбоксамидная группа кофермента зафиксирована водородными связями с остатками каталитического центра в транс-конформации (Рис. 11, атом О7 направлен в сторону атома С4), которая, согласно квантово-механическим расчетам для газовой фазы, на 2 ккал/моль менее выгодна чем цис-конформация. Кроме того, подтверждено наличие водородной связи между ионом азида и остатком His332 в структуре холо-MorФДГ (расстояние равно 3.2 ).
Согласно литературным данным, тройной комплекс ФДГ-НАД+-азид является стабильным аналогом переходного состояния ферментативной реакции. Ранее на основании исследования кинетических изотопных эффектов, а также расчетными теоретическими методами, было показано, что в переходном состоянии катализируемой ФДГ реакции молекула кофермента, находящаяся в энергетически-возбужденной транс конформации, может приобретать т.н. биполярную форму (Рис. 12). При этом должно наблюдаться возрастание отрицательного заряда на атоме O карбоксамидной группы, а также уменьшение длины связи С3-С7 и увеличение длины связи С7-О7 по сравнению с молекулой кофермента в свободном состоянии. Данные изменения способствуют увеличению частичного положительного заряда на атоме С4 кофермента, повышая его электрофильность и тем самым благоприятствуя скорость-лимитирующему переносу гидрид-иона и протеканию ферментативной реакции.
В результате отдельного цикла уточнения программой REFMAC с ослабленными ограничениями на длины связей никотинамидной группы длина связи С7-О7 составила 1.29, что на 0.06 длиннее стандартного значения, а длина связи С3-С7 составила 1.43, что на 0.07 короче стандартного значения. Эти различия всего в 1.3 раза больше, чем ошибка в определении длин связей, оцененная как сумма двух средневзвешенных ошибок координат атомов (таблица 3). Тем не менее, наши экспериментальные данные отражают тенденцию к изменению длин ковалентных связей, соответствующую приобретению никотинамидной группой кофермента биполярной формы в переходном состоянии ферментативной реакции, постулированной ранее.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Решены пространственные структуры ФДГ из бактерии Moraxella sp. C- (MorФДГ) в апо- и холо-формах с разрешением 2.3 и 1.95, соответственно. Показано, что MorФДГ имеет одинаковые с ранее исследованной ФДГ из бактерии Pseudomonas sp. 101 (PseФДГ) пространственную укладку полипептидной цепи, каталитический центр и сайт связывания кофермента. При этом MorФДГ отличается организацией димерного контакта в молекуле и наличием восьми дополнительных С-концевых остатков в структуре холо-формы.
2. Решена пространственная структура апо-формы MorФДГ в закрытой конформации с разрешением 1.96. Переход фермента к закрытой конформации сопровождается фиксацией остатков каталитического центра в каталитически-активной конформации и упорядочиванием С-концевого фрагмента 375-399 даже без связывания кофермента.
С другой стороны, изменение конформации петли 221-226 в аденин связывающем сайте происходит только при связывании кофермента.
Показана роль С-концевого фрагмента 375-399, кофермента и субстрата/ингибитора в стабилизации закрытой конформации бактериальных ФДГ.
3. Решены пространственные структуры ФДГ из высшего растения Arabidopsis thaliana (AraФДГ) в апо- и холо-формах с разрешением 1.7 и 2.0, соответственно. Показано, что AraФДГ и бактериальные ФДГ имеют похожие ход полипептидной цепи, вторичную структуру и устройство каталитического центра. AraФДГ отличается заменой длинной N-концевой петли 10-48 (нумерация по PseФДГ) на короткий участок 39-48, укороченным на 22 остатка С-концом, более открытой конформацией апо формы и меньшим количеством водородных связей между НАД+ и ферментом.
4. Впервые для ФДГ решена с атомным разрешением пространственная структура тройного комплекса MorФДГ-НАД+-азид, имитирующего переходное состояние ферментативной реакции. Подтверждено, что карбоксамидная группа кофермента имеет транс-конформацию, а остаток каталитического центра His332 может образовывать водородную связь с субстратом в переходном состоянии реакции. В структуре обнаружена тенденция к изменению длин ковалентных связей никотинамидной группы кофермента в сторону образования биполярной формы, существование которой в переходном состоянии ферментативной реакции было постулировано ранее.
Список работ по теме диссертации Shabalin, I. G., Filippova, E. V., Polyakov, K. M., Sadykhov, E. G., Safonova, T. N., Tikhonova, T. V., Tishkov, V. I., Popov, V. O. Structures of the apo and holo forms of formate dehydrogenase from the bacterium Moraxella sp. C-1:
towards understanding the mechanism of the closure of the interdomain cleft.
Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2009, V. 65, № 12, Р. 1315-1325.
Шабалин И. Г., Поляков К. М., Тишков В. И., Попов В. О. Пространственная НАД+-зависимой структура формиатдегидрогеназы из бактерий Moraxella sp. C-1 при атомном разрешении. Acta Naturae, 2009, №. 3, С. 98-102.
Shabalin, I.G., Tikhonova, T.V., Polyakov, K.M., Skirgello, O.E, Tishkov, V.I., Dorovatovskiy, P.V., Popov, V.O. Crystal structures of novel NAD+-dependent formate dehydrogenases from bacterium Moraxella sp. C-1 and higher-plant Arabidopsis thaliana. EMBL Annual Reports, 2007, V. 2, Р. 109-110.
Polyakov K.M., Shabalin I.G., Tikhonova T.V., Skirgello O.E., Serov A.E., Dorovatovskiy P.V., Tishkov V.I. and Popov V.O. The Structure of NAD+ dependent formate dehydrogenase from plant Arabidopsis Thaliana at resolution. International conference "Biocatalysis – 2007. Structure, functions, applications", Moscow, St.-Petersburg, 2007, Р. 117-118.
Шабалин И.Г., Поляков К.М., Скиргелло О.Е., Дороватовский П.В., Тихонова Т.В., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственные структуры формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp.C-1 и из растения Arabidopsis thaliana. VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007), Москва, 2007, С. 69.
Шабалин И.Г., Поляков К.М., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственные структуры комплексов формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. C- с окисленным и восстановленным коферментом. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, С. 35.
Shabalin I.G., Tikhonova T.V., Polyakov K.M., Skirgello O.E., Dorovatovskiy P.V., Tishkov V.I., Popov V.O. Apo- and holo-forms of NAD+-dependent formate dehydrogenases from a bacterium Moraxella sp. C-1 and the higher-plant Arabidopsis thaliana. Recent Developments in Macromolecular Crystallography, India, Pune, 2008, Р. 34.
Шабалин И.Г., Поляков К.М., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственная НАД+-зависимой структура формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. C-1 при атомном разрешении. Рентгеновское, Синхротронное излучения, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии, Москва, 2009, C. 111.
Дороватовский П.В., Шабалин И.Г., Поляков К.М., Садыхов Э.Г., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственная структура апо-формы формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. C-1 в закрытой конформации. Рентгеновское, Синхротронное излучения, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо Когнитивные технологии, Москва, 2009, C. 72.