Гидрозольные препараты – бесприборные иммунохимические экспресс – диагностикумы.
На правах рукописи
Куклина Светлана Анатольевна ГИДРОЗОЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ – БЕСПРИБОРНЫЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ЭКСПРЕСС – ДИАГНОСТИКУМЫ.
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2011
Работа выполнена на кафедре общей химии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кировской государственной медицинской академии Министерства Здравоохранения и Социального развития Российской Федерации.
Научный консультант:
доктор технических наук, Мешандин Алексей Гаврилович профессор
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, Птичкина Наталья Михайловна профессор кандидат химических наук, Сорокоумова Галина Моисеевна доцент государственное образовательное учреждение высшего
Ведущая организация:
профессионального образования Удмуртский государственный университет, г. Ижевск
Защита состоится “ 28 ” февраля 2011 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте МИТХТ им. М.В.
Ломоносова www.mitht.ru Автореферат разослан “ 27 ” января 2011 г
Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук Лютик А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Иммунохимические методы позволяют объективно и адекватно судить о правильности терапевтических либо иных методов лечения. В настоящее время существует более 200 различных диагностических методов и их модификаций, основанных на реакции антиген-антитело (Орлова О.Ю., 2005). К наиболее часто применяемым могут быть отнесены методы иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА). Для этих методов характерны высокая чувствительность и точность результатов, возможность их автоматизации. Вместе с тем, они отличаются значительной дороговизной, неэкспрессностью, использованием специальных и дорогих приборов, специальными условиями хранения иммунохимических диагностикумов.
Всё вышесказанное делает методы иммуноферментного анализа (ИФА) и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), радиоиммунного анализа (РИА) пригодными, прежде всего как верифицирующие тесты, но не как скриннинговые.
Для скриннинговых анализов необходимы препараты для экспресс – диагностики, которые должны иметь низкую себестоимость, стабильные и воспроизводимые иммунохимические свойства, время постановка реакции и считывания результатов не более 10 минут, не требовать использования дополнительных приборов. Кроме того, экспресс-диагностика должна давать возможность ставить реакции с малыми объемами препарата и биоматериала, взятого от пациента (10-20 мкл) (Мешандин А.Г.,1997).
В последнее время предложено решение данной задачи – использование в качестве диагностических препаратов гидрозолей. Гидрозольные препараты представляют собой водные коллоидные растворы ультрадисперсных частиц, на поверхности которых адсорбированы биоспецифические компоненты, в частности, антигены, либо комплементарные им антитела к различным нозологиям. Имеются данные о гидрозольных препаратах на основе неорганических объектов – это золь гексацианоферрата (II) железа (III), так называемая «берлинская лазурь» в качестве твёрдой фазы, предназначенного для определения туберкулёзных антител в сыворотке крови больных в постановке на стекле (Орлова О.Ю., 2005). Данные препараты могут служить основой для разработки большого количества бесприборных диагностических систем и могут использоваться там, где требуется выявить феномен взаимодействия антигена с антителом.
Однако ряд вопросов, связанных с оптимизацией свойств коллоидного раствора «берлинской лазури» таких, как содержание и тип модификатора, рН разводящего раствора, величина ионной силы разводящего раствора, оптимальный способ постановки и визуализации реакции гидрозольной агглютинации, остаются до конца нерешенным.
Так же возникают вопросы о возможности синтеза гидрозольных препаратов на основе других объектов: коллоидных растворов ультрадисперсных алмазов (УДА) детонационного синтеза (Долматов В.Ю., 2003), коллоидных растворов парафина, изучение их свойств.
Данная работа направлена на создание технологии получения устойчивых гидрозольных диагностических препаратов, основанных на реакции антиген-антитело, с последующей объективной визуализацией.
Техника постановки реакции гидрозольной агглютинации почти полностью совпадает с техникой постановки реакции пассивной гемагглютинации. В связи с этим стоимость анализов будет различаться лишь по стоимости применяемых диагностикумов.
Так стоимость эритроцитарного диагностикума, необходимого для постановки одного анализа в реакциях пассивной гемагглютинации (РПГА), составляет 20 рублей, стоимость одного анализа методом иммуноферментного анализа (ИФА) – 30 рублей, тогда как стоимость гидрозольного диагностикума – 5 рублей. Время постановки реакции гидрозольной агглютинации составляет 5-10 минут, тогда как время проведения одного анализа от 3 часов (иммуноферментный анализ) до 1 суток (полимеразная цепная реакция) Таким образом, основным предметом нашего исследования стали разработка и создание экспрессных иммунохимических коллоидных препаратов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы.
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре общей химии Кировской государственной медицинской академии Министерства Здравоохранения и Социального развития Российской Федерации.
Цель работы 1. Изучение особенностей синтеза и состава гидрозольных диагностикумов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы, на поверхность которых сорбированы специфические белки - антигены – маркеры определенных заболеваний.
2. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.
Задачи исследования 1. Выбор типа твердофазного носителя для реакции гидрозольной агглютинации.
2. Установление типа и дозировки модификатора при хемосорбции биолиганда на коллоидные частицы гексацианоферрата (II) железа (III) («берлинской лазури»).
3. Выбор типа разводящего раствора с учетом рН и ионной силы при постановке реакции иммунохимической гидрозольной агглютинации.
4. Исследование объективного способа постановки и фиксации результатов иммуноанализа.
5. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.
Научная новизна работы Впервые проведено комплексное исследование органического (парафин) и неорганического материала (ультрадисперсные алмазы) в качестве твердой фазы для последующего изготовления гидрозольных диагностических препаратов.
Установлено, что малодиссоциирующие соли d-переходных металлов являются лучшими модификаторами, обеспечивающими наиболее эффективное ковалентное связывание белка с неорганическим носителем – коллоидным раствором гексацианоферрата (II) железа (III) с целью создания стабильных конъюгатов с воспроизводимыми иммунохимическими свойствами.
Впервые оптимизирован состав разводящего раствора для реакции гидрозольной агглютинации для гидрозоля - гексацианоферрата (II) железа (III).
Впервые получены гидрозольные иммунохимические диагностикумы на выявление маркеров таких заболеваний, как сифилис и птичий грипп.
Научно-практическая значимость работы Ранее на кафедре была разработана методика для получения гидрозольных препаратов на основе гексацианоферрата (II) железа (III), так называемой «берлинской лазури». Однако данные препараты имели недостаток: при попытках пассивной адсорбции биолиганда на гидрозоль гексацианоферрата (II) железа (III) не наблюдали адсорбции белка на поверхность твердой фазы. Это выражалось в том, что агглютинационный анализ не происходил во всем диапазоне разведений «+» и «-» сывороток с антителами, комплементарными определенным антигенам. Поэтому необходимо было осуществить комплекс работ по «пришивке» специфических антигенов – белков через определенный модификатор.
В ходе работы была установлена связь между дозировками химических модификаторов на поверхности ультрадисперсных частиц и свойствами получающихся продуктов - иммунохимических гидрозолей, а также связь между pH и ионной силой разводящего раствора и агрегационной устойчивостью гидрозольных препаратов.
В данной работе были впервые исследованы другие носители (коллоидные растворы парафина и ультрадисперсных алмазов) в качестве твердой фазы для создания диагностических препаратов, производящих адсорбцию биолиганда без применения модификатора.
В ходе работы получены и в последующем апробированы в клинических условиях гидрозольные диагностикумы, предназначенные для выявления маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп. Получены акты испытаний данных диагностикумов в организациях: НИИ гриппа РАМН (г. Санкт – Петербург), клинической лаборатории ФГУ ЛИУ– 12 УФСИН России по Кировской обл., ОАО НПП «АВИВАК» (г. Санкт – Петербург).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Гидрозольные препараты могут быть получены не только на основе неорганических коллоидных растворов, но и коллоидных растворов ультрадисперсных алмазов (УДА), а также на основе органических веществ – коллоидного раствора парафина.
2. Для адсорбции биолигандов на поверхность золя гексацианоферрата (II) железа (III) необходим химический модификатор, оптимальными следует признать катионы тяжелых металлов: Hg2+, Pb2+ в виде малодиссоциирующих солей в водном растворе.
3. Разводящим раствором, обеспечивающим высокое значение константы аффинитета и авидности реагирующих между собой антигена и антитела следует признать 1% KCl;
0,9 – 1% KCl в растворе фосфатного буфера.
Апробация работы Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно – практических конференциях: VI Московском международном салоне инноваций (Москва, 2006);
II специализированной выставке «Наука. Инвестиции. Производство.
Вятский левша» (Киров,2006);
IV Всероссийской конференции «Бизнес - ангелов и инноваторов» (Саранск, 2006);
IV Республиканской научно-практической конференции «Перспективные направления и новые технологии в здравоохранении» (Йошкар - Ола, 2006);
Всероссийской научно – практической конференции с международным участием «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006) – Диплом V степени;
VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2007) – Приз Международной федерации изобретательских организаций и Золотая медаль Министерства образования и науки РФ;
Международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (Киров, 2007);
II Международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области» (Киров, 2008);
VIII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2008) - серебряная медаль Министерства образования и науки РФ;
работа доложена на расширенном заседании кафедры общей химии Кировской ГМА.
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение исследований), выводов, списка литературы (102 источников) и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Работа изложена на 109 страницах, содержит 13 рисунков, 14 таблиц, диаграмм. Список литературы включает 102 источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили гидрозольные препараты. В качестве объектов для гидрозолей использовали:
1. раствор гексацианоферрата (II) железа (III), представляет собой гидрозоль с отрицательно заряженными гранулами, если потенциалобразующие ионы - [Fe(CN)6]4-;
2. раствор ультрадисперсных алмазов (УДА), СКТБ «Технолог» (г. С. Петербург), представляет собой дисперсию ультрадисперсных алмазов в воде;
3. раствор парафина, синтезированный проф. Мешандиным А.Г. – дисперсия парафина в воде, полученная методом замены растворителя.
В качестве специфических биолигандов использовали:
1) комплексный туберкулезный антиген – диагностикум ППД производства С Петербургского НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова. В состав комплексного антигена Ю.Я. Кассича входит полисахаридный комплекс, метиленовый экстракт туберкулезных микобактерий и водный экстракт легочной ткани здорового крупного рогатого скота.
2) генно-инженерный антиген №17 (Военно-медицинская академия г. Санкт – Петербург). В состав входит белок, полученный из генно-инженерных модификаций плазмидами Treponema Pallidium штамма G. Coli.
3) антигены вирусов гриппа, в том числе H5N1 (вируса птичьего гриппа), производства НИИ гриппа РАМН г. С.- Петербурга.
В качестве биологического материала – сыворотки от лиц с верифицированным диагнозом «туберкулез» и сыворотки от доноров, сыворотки от лиц с диагнозом «сифилис» и здоровых доноров, сыворотки от объектов, больных «птичьим гриппом» и здоровых доноров. С последними объектами осуществляли работу в НИИ гриппа РАМН.
В работе использовали стандартные методы химического анализа: рН – метрия;
агглютинационный анализ и статистические методы обработки результатов (для выявления вида зависимости титра от концентрации применялся регрессионный анализ;
при помощи метода распределения 2 (хи-квадрат) определили теоретическую частоту положительных результатов эксперимента при равномерном распределении).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Выбор типа твердофазного носителя для реакции гидрозольной агглютинации.
В ходе данного исследования были оптимизированы свойства гидрозольных препаратов на основе ультрадисперсных частиц органической и неорганической природы для проведения реакции гидрозольной агглютинации.
Согласно литературным источникам носители для иммунохимических тестов должны соответствовать определенным требованиям:
контрастируемая окраска;
большая адсорбционная способность;
доступность;
большая удельная поверхность;
нанометрические размеры;
способность образовывать устойчивые коньюгаты с белками - биолигандами;
время постановки реакции агглютинации должно быть наиболее минимальным.
Исходя из требований, предъявляемых к носителям для иммунохимических тестов, определяли, какая твердая фаза является лучшей в реакции гидрозольной агглютинации.
Для исследования были взяты коллоидные растворы гексацианоферрата (II) железа (III), ультрадисперсных алмазов (УДА), парафина. Они отличались друг от друга размером частиц, плотностью, удельной поверхностью и различной окраской. Изучаемые нами носители представлены в таблице 1.
Табл. 1. Твердофазные носители в качестве основы для гидрозольных диагностикумов.
Тип носителя, Размеры Агрегатив - Время Предель- Цвет формула частиц, ная постанов- ный титр нм устойчи - ки вость «Берлинская лазурь», 80 - 200 устойчив 3–5 1:320 Синий Fe4[Fe(CN)6]3 мин.
Ультрадисперсные 4 - 10 неустойчив 10 – 12 1:64 Серый алмазы (УДА), Сх час.
Парафин, 200- 600 устойчив 25 – 30 1 Бесцвет СН3 - (СН2)х – СН3 мин. ный Для выбора оптимального соотношения биолиганда и гидрозолей ультрадисперсных алмазов, парафина, «берлинской лазури» брали 50, 100, 150 мкл антигена. Далее производилась адсорбция биолиганда на твердой фазе данных носителей. Постановка реакции гидрозольной агглютинации производилась на U – образном планшете.
Раститровывалась сыворотка «+» и «-» в соотношение 1:20, 1:40, 1:64, 1, 1:160, 1: разводящим раствором. В работе использовали в качестве антигена – комплексный туберкулезный антиген ППД, в качестве биологического материала – сыворотки от лиц с верифицированным диагнозом «туберкулез» и здоровых доноров. Экспериментальные данные представлены на рисунках 1 и 2.
УДА парафин «берлинская лазурь» Рис. 1. Зависимость обратного титра от Рис. 2. Зависимость обратного титра от соотношения биолиганда и коллоидных соотношения биолиганда и коллоидного растворов УДА и парафина раствора «берлинской лазури» Исходя из анализа экспериментальных данных, представленных в таблице 1 и рисунках 1 и 2, и требований, предъявляемых к носителям иммунохимических тестов, нами было сделано ряд выводов:
1. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза могут использоваться в реакциях типа пассивной гемагглютинации без модификатора, однако по скорости прохождения реакции они уступают коллоидному раствору гексацианоферрата (II) железа (III).
2. Коллоидный раствор парафина возможен к рассмотрению в последующем в качестве твердофазного носителя, так как соответствует требованиям и может применяться без модификатора. Но при этом уступает коллоидному раствору гексацианоферрата (II) железа (III) по следующим характеристикам: незначительно по скорости проведения реакции гидрозольной агглютинации, по окраске твердой фазы (парафин бесцветный). Окраска носителя необходима для визуализации результатов агглютинации.
3. По совокупности требований, предъявляемых экспрессным, бесприборным иммунохимическим диагностикумам был сделан выбор в пользу гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III). Приблизительная схема строения мицеллы гексацианоферрата (II) железа (III):
при избытке K4[Fe(CN)6] m[Fe4[Fe(CN)6]3]n[Fe(CN)6]4- 4(n -x)K+ 4x-4xK+ zH2O Так как мицелла имеет отрицательный заряд, то невозможно было осуществить адсорбцию белка на поверхность твердой фазы. Это выражалось в том, что агглютинационный анализ не происходил во всем диапазоне разведений «+» и «-» сывороток с антителами, комплементарными определенным антигенам. Поэтому необходимо было осуществить адсорбцию биолиганда и твердой фазы через определенный модификатор, т.е. вещество, обеспечивающее заданные свойства гидрозолей.
II. Выбор типа и дозировки модификатора при хемосорбции биолиганда на основе гексацианоферрата (II) железа (III).
Так как для гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) необходим модификатор для связывания твердой фазы и биолиганда в устойчивый конъюгат, то следующим этапом исследований было выявление типа и природы модификатора. Модификатор обеспечивал бы наиболее эффективное ковалентное связывание белка с неорганическим носителем – коллоидным раствором гексацианоферрата (II) железа (III) с целью создания стабильных конъюгатов с воспроизводимыми иммунохимическими свойствами.
Растворы модификаторов для иммунохимической реакции должны соответствовать определенным требованиям:
растворимые в воде;
не подвергаться гидролизу;
маленькое значение произведения растворимости соединений с атомом серы;
возможность вступать в реакции нуклеофильного замещения или присоединения;
доступность;
образовывать с биолигандом и твердой фазой устойчивые конъюгаты.
В результате реакции нуклеофильного замещения молекул модификатора происходит присоединение биолиганда (белка) по NH2–группе (преимущественно по лизину) и по SH– группе (по цистеину) с неорганической твёрдой фазой, то есть проявляется эффект «якоря». В качестве модификатора ранее использовали раствор хлорида свинца (II) PbCl2, который соответствовал большинства требованиям, но обеспечивал устойчивость диагностикума в течение суток. То есть данный диагностикум приемлем в использовании «ex tempore», но невозможен для длительного хранения препаратов. Для улучшения стабильности диагностического препарата на основе гексацианоферрата (II) железа (III) необходимы были новые модификаторы. В качестве модификаторов, осуществляющих хемосорбцию белка, использовали препараты с концентрацией 1%, представленные в таблице 2.
Эксперименты проводили с коллоидным раствором гексацианоферрата (II) железа (III), с туберкулезным антигеном с сыворотками от лиц с верифицированным диагнозом «туберкулез» и от здоровых доноров. Реакцию гидрозольной агглютинации осуществляли в U – образном планшете. Во вспомогательном планшете осуществляли разведение «положительной» и «отрицательной» сывороток в разводящем растворе в титрах 1:10.
Растворы модификаторов и раствора гексацианоферрата (II) железа (III) брали в соотношениях 1:10, 1: 100, 1:1000. Далее сыворотки помещали в полистирольный планшет, после чего вносили равные аликвоты гидрозольного препарата с различным соотношением модификатора.
Табл. 2. Модификаторы для гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) Константа Наименование Формула Предположительный механизм действия диссоц - ии Хлорид ртути HgCl 2,6* 10-15 Prot – SH + Hg2+ (II) Prot – S – Hg – S – Prot Нитрат ртути Hg (NO3) Prot – SH + Hg2+ Хорошо Prot – S – Hg – S – Prot (II) растворим СuSO4 Prot – SH + Сu2+ Хорошо Prot – S – Сu – S – Prot Сульфат меди растворим (СН3СОО) Prot – SH + Сu2+ Хорошо Prot – S – Сu – S – Prot Ацетат меди (II) 2Сu растворим Хлорид хрома Хорошо CrCl3 Prot – SH + Cr3+ Prot – S – Cr+1 – S – Prot (III) растворим Нитрат серебра Хорошо AgNO3 Prot – SH + Ag1+ Prot – S – Ag (I) растворим O O H2N-Prot-COOH + C CH2 C HOC- - H2O H H (CH2)3 Глутардиаль дегид COH O ------------ HOOC-Prot-N C CH2 C H H Хлорид свинца PbCl 1,6* 10-5 Prot – SH + Pb2+ Prot – S – Pb – S – Prot (II) Нитрат свинца Хорошо Pb(NO3)2 юProt – SH + Pb2+ Prot – S – Pb – S – (II) растворим Prot Данные модификаторы обеспечивали следующие иммунохимические свойства полученных гидрозолей:
Рис. 3. Сравнение гидрозольных диагностикумов для детекции антител к возбудителю туберкулез с различными модификаторами.
1. С растворами хлорида хрома (III) и нитрата серебра (I) получали гидрозоли, нормально дифференцирующие «+» и «-» сыворотки. Коэффициент детерминации близок к 1, составляет 0,94 для нитрата серебра (I) и 0,98 для хлорида хрома (III). Согласно шкале Чеддока это соответствует весьма высокой степени достоверности. Однако при хранении эти препараты теряли агрегативную устойчивость в течение суток. Следовательно, эти препараты приемлемы в использовании «ex tempore», но невозможны для длительного хранения препаратов (рис. 3,4).
2. С растворами хлорида свинца, хлорида ртути (II) получали гидрозоли, нормально дифференцирующие «+» и «-» сыворотки. Коэффициент детерминации близок к 1, составляет 0,94 для хлорида свинца и 0,99 для хлорида ртути (II). Согласно шкале Чеддока это соответствует весьма высокой степени достоверности (рис. 5,6).
3. С растворами нитрата ртути, нитрата свинца, сульфата меди и ацетата меди получали гидрозоли, которые дифференцировали «+» и «-» сыворотки, но быстро коагулировали, и их невозможно было использовать для реакции агглютинации. Согласно шкале Чеддока это означает, что на долю вариации факторных признаков приходится меньшая часть по сравнению с остальными неучтенными в модели факторами, влияющими на изменение результативного показателя. Построенные при таких условиях регрессионные модели имеют низкое практическое значение.
4. С раствором глутардиальдегида получали гидрозоль, которые дифференцировал «+» и «-» сыворотки. Однако устойчив коллоидный раствор с данным модификатором был в течение 48 часов.
Исходя из анализа экспериментальных данных, коллоидные растворы гексацианоферрата (II) железа (III), модифицированные катионом Hg2+ в виде хлорида ртути, либо Pb2+ в виде хлорида свинца являются лучшим вариантом, проявляющим свойства гидрозольных препаратов. Причем эти соли в водном растворе являются малодиссоциирующими соединениями.
Используя в качестве модификаторов соли тяжёлых металлов, механизм хемосорбции может быть объяснён следующим образом: катионы тяжелого металла входят в состав мицеллы, не нарушая гидратной оболочки и диффузного слоя мицеллы.
Соль тяжёлого металла должна быть малодиссоциирующей, чтобы не происходило гидролиза. Это можно представить в виде схемы:
ионы Hg2+ отрицательно заряженная гранула положительно заряженная гранула Далее определяли оптимальную концентрацию модификатора. Объектом оптимизации являлся наиболее эффективный модификатор - раствор хлорида ртути (II) (HgCl2) с туберкулезным антигеном. Были взяты следующие концентрации модификатора – 1,0%;
1,25%;
1,33%;
1,5%;
2,0%, 2,5%. В последнем случае наблюдали необратимую спонтанную коагуляцию исходного гидрозоля. Данные представлены на рисунке 4.
Рис. 4. Зависимость влияния концентрации модификатора HgCl2 на иммунохимическую активность гидрозольного препарата для детекции антител к возбудителю туберкулез.
Из рисунка видно, что с ростом концентрации увеличивается обратный титр, но выше концентрации 2,0% происходило резкое ухудшение иммунохимических свойств препарата. Это можно объяснить денатурирующим действием на белок избытка ионов Hg2+, не связанных с поверхностью в мономолекулярный слой.
Наибольшая частота положительных результатов эксперимента получена при концентрации модификатора 2,00% и при обратном титре 1:320.
III. Выбор разводящего раствора для реакции гидрозольной агглютинации.
Для раститровки сывороток использовали разводящий раствор. При постановке реакции агглютинации исключительно важно обеспечить высокое значение константы аффинитета и авидности реагирующих между собой антигена и антитела. В свою очередь аффинитет и авидность напрямую зависят от типа фазы, в которой происходит иммунохимическая реакция, то есть разводящего раствора. Следовательно, задача оптимизации разводящего раствора – определение его природы, значения рН, величины ионной силы, является необходимым элементом в создании иммунохимического препарата. Поэтому для улучшения иммунохимических свойств диагностикумов был осуществлен выбор и оптимизация состава разводящего с учетом его рН и ионной силы.
Для оценки эффективности была проведена реакция гидрозольной агглютинации на основе гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) с модификатором HgCl2, генно инженерным антигеном №17 и сывороток от лиц с диагнозом «сифилис» и здоровых доноров, туберкулезным антигеном – диагностикум ППД и сывороток от лиц с диагнозом «туберкулез» и здоровых доноров. Были опробованы разводящие растворы в количестве объектов, влияющими на иммунохимические свойства диагностикумов. Были взяты растворы NaCl и KCl с целью выяснения влияния ионной силы на свойства диагностикумов. С целью выяснения влияния значения рН использовали фосфатный буферный раствор (табл. 3).
Табл. 3. Разводящие растворы для иммунохимической реакции гидрозольной агглютинации.
№ Тип раствора Добавка Иммунохимические Примечание качества 1 NaCl, раствор не показал четкой коагуляция ------------------- дифференцировки «+» и гидрозолей в «-» сывороток системах с туберкулезным и сифилисным антигеном 2 NaCl, раствор не показал четкой происходила Фосфатный дифференцировки «+» и коагуляция буфер «-» сывороток гидрозолей в выше указанных системах 3 KCl, обеспечивал в системе с раствор ------------------- дифференцировку «+» и туберкулезным -- «-» сывороток антигеном 4 KCl, обеспечивал наилучшую в системе с раствор Фосфатный дифференцировку «+» и туберкулезным буфер «-» сывороток антигеном 1. Раствор KCl без добавок обеспечивал дифференцировку «+» и «-» сывороток.
2. Раствор NaCl без добавок не показал четкой дифференцировки «+» и «-» сывороток (происходила коагуляция всех растворов) во всех вышеуказанных системах.
3. Раствор KCl с добавлением 0,05 М фосфатного буферного раствора обеспечивал наилучшую дифференцировку «+» и «-» сывороток.
4. Раствор NaCl с добавлением 0,05 М фосфатного буферного раствора не показал четкой дифференцировки «+» и «-» сывороток (происходила коагуляция всех растворов) во всех вышеуказанных системах.
Было рассмотрено влияние ионной силы Na+ и К+ на иммунохимические свойства диагностикумов. Катион калия обладает слабо выраженными гидратационными свойствами и высокой проникающей способностью в водных системах, поэтому по результатам экспериментальных данных это во многом определяет специфику биологического действия катиона калия. При большем или меньшем значении ионной силы наблюдается тенденция к диссоциации иммунохимического комплекса и, следовательно, к уменьшению чувствительности и специфичности иммунохимического анализа. Добавление фосфатного буферного раствора (раствор, содержащий буферную систему из моно и дифосфатных анионов) соответствует физиологическому значению рН в плазме крови человека и теплокровных существ (рН = 7,36).
Величина концентрации разводящего раствора KCl с добавлением фосфатного буфера была изучена на 5 экспериментальных точках: 0,5%;
0,9%;
1,0%;
1,2%;
1,3% (рис.
5 и 6).
Рис. 5. Зависимость обратного титра от Рис. 6. Зависимость обратного титра от концентрации хлорида калия для детекции концентрации хлорида калия для детекции антител к сифилису антител к туберкулезу Таким образом, наибольшая частота положительных результатов эксперимента получена при концентрации раствора хлорида калия 1,00% и при обратном титре 1:400 и 1:320. Эффективным вариантом разводящего раствора является раствор KCl, приготовленный на фосфатном буфере (фосфатно – солевой буфер) с концентрацией 0,9% и 1,0%, что наглядно отображено на рисунках 5 и 6. При введении фосфатного буфера в качестве компонента разводящего раствора отмечается существенное увеличение чувствительности иммунохимической реакции, выраженное в увеличении обратного титра положительных сывороток. Данная тенденция однозначно прослеживается как на выявлении антител к Treponema Pallidum, так и антител к M.
Tuberculosis. Данные результаты позволяют говорить о фосфатно – солевом буфере как об эффективном разводящем растворе иммунохимических реакций гидрозольной агглютинации. При этом необходимо отметить, что отрицательные сыворотки, изучаемые в настоящей работе, по обеим нозологиям не проявляли каких-либо тенденций агглютинации с изучаемыми гидрозольными препаратами.
IV. Выбор носителя для визуализации результатов реакции гидрозольной агглютинации.
Регистрацию результатов осуществляли на пористых носителях:
хроматографических колонках и фильтровальной бумаге, а также на стеклянной пластине.
Оценка результатов реакции агглютинации на основе гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) с модификатором HgCl2, туберкулезным антигеном и сывороток от лиц с диагнозом «туберкулез» и здоровых доноров.
Постановка реакции гидрозольной агглютинации на стекле предусматривает внесение образцов раститрованной сыворотки и гидрозоля на стекло и размазывание препарата тонким слоем. За счёт естественного испарения происходит концентрирование раствора, что неизбежно приводит к потере коллоидным раствором агрегативной устойчивости. При этом в «положительных» и «отрицательных» реакциях характер этой потери будет различным – внешний вид реакций в “плюсе”- точка в центре капли, в “минусе”- равномерное распределение раствора, как показано на рисунке 7.
А Б Рис. 7. Реакция гидрозольной агглютинации на стекле: А - положительная сыворотка, Б - отрицательная сыворотка Постановка реакции гидрозольной агглютинации в планшете предусматривает внесение образцов раститрованной сыворотки и гидрозоля в ячейки. Причем в лунках с «-» сывороткой не происходит агглютинации, а в лунках с «+» сывороткой наблюдается осадок – крупные агломераты. Данные представлены на рисунке 8.
А Б Рис. 8. Реакция гидрозольной агглютинации в планшете: А - отрицательная сыворотка, Б - положительная сыворотка Интерпретация на пористых носителях: при наличии достаточно высокого титра антител в сыворотке больного наблюдалась задержка в пропитывании гидрозолем порошка, заполняющего хроматографическую колонку, в виде короткого столбика синего цвета. При отсутствии антител — гидрозоль впитывается, что дает длинный синий столбик — отрицательный результат, как показано на рисунке 9.
А Б Рис. 9. Реакция гидрозольной агглютинации в хроматографической колонке: А отрицательная сыворотка, Б - положительная сыворотка Результаты на фильтровальной бумаге: при положительной реакции — плотный, компактный комплекс с четкой границей, диаметром 2 — 4 мм;
отрицательная реакция — распределение частиц реагирующих веществ без четкой границы в виде пятна синего цвета, как показано на рисунке 10.
Рис. 10. Визуализация результатов на фильтровальной бумаге: А - отрицательная сыворотка, Б - положительная сыворотка Таким образом, из представленных результатов можно сформулировать вывод – для постановки реакции наиболее удобен вариант реакции на стекле и в планшете. Наиболее оптимальный способ визуализации реакции гидрозольной агглютинации на фильтровальной бумаге. Именно визуализация результатов на фильтровальной бумаге показывает четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток, а также дает возможность длительного хранения результатов.
Получив экспериментальные данные, нами было принято решение об апробации результатов данных исследований в клинических условиях: в лаборатории Биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН г. Санкт – Петербург;
клинической лаборатории больницы ФГУ ЛИУ– 12 УФСИН России по Кировской обл.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ ГИДРОЗОЛЕЙ В КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ На сегодняшний день гидрозольные препараты апробированы в диагностике самых разнообразных нозологий – сифилиса, туберкулеза, птичьего гриппа. Имеются положительные заключения организаций: НИИ гриппа РАМН (г. Санкт – Петербург), клинической лаборатории ФГУ ЛИУ– 12 УФСИН России по Кировской обл. Данные представлены в таблице 4.
Табл. 4. Результаты испытаний гидрозолей в клинических условиях.
Тип гидрозоля, Fe4[Fe(CN)6] 3 ;
(HgCl2) Fe4[Fe(CN)6] 3 ;
(HgCl2) модификатора Тип антигена H5N1 ПДД (туберкулезный (вирус птичьего гриппа) антиген) База испытаний НИИ гриппа РАМН Клиническая лаборатория больницы ФГУ ЛИУ – Обратный титр 1 – 1:640 1:50 – 1: Количество пациентов n=6 n = Чувствительность 100% 87,5% Специфичность n = 2 - 100% n = 10 - 100% Время постановки 1 – 5 мин 3 – 5 мин Результаты опытов свидетельствуют об «узнавании» гидрозолем с антигеном M.
Tuberculosis и H5N1 положительных сывороток в титрах 1:50-1:2000. Следовательно, по представленным данным мы вправе в первом приближении говорить о чувствительности метода, сопоставимой с ИФА, и о его достаточной специфичности. По результатам испытания можно говорить о 100% специфичности метода и 90% чувствительности.
ВЫВОДЫ 1. В работе изучены диагностические препараты на основе гидрозольных растворов гексацианоферрата (III) железа, ультрадисперсных алмазов, парафина. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза могут использоваться в реакциях типа пассивной гемагглютинации в качестве твердой фазы, однако по скорости прохождения реакции они уступают коллоидному раствору гексацианоферрата (II) железа (III). Коллоидный раствор парафина возможен к рассмотрению в последующем в качестве твердофазного носителя.
Наиболее лучшим вариантом является диагностикум на основе коллоидного раствора гексацианоферрата (II) железа (III).
2. Исследован состав компонентов гидрозольных диагностикумов. Доказано:
наиболее лучшим модификатором является катион Hg2+ в виде малодиссоциирующей соли HgCl2 в водном растворе. Оптимальным вариантом концентрации модификатора при проведении реакции гидрозольной агглютинации оказалась – 2,0% на 1 мл. гидрозоля, обеспечивающая четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток.
3. Определен состав разводящего раствора - раствор KCl с добавлением фосфатного буфера, обеспечивающий наилучшую дифференцировку «+» и «-» сывороток.
Оптимальным вариантом при проведении иммунохимического анализа оказались концентрации 0,9% и 1,0% фосфатно-солевого буфера.
4. Более объективный способ постановки реакции гидрозольной агглютинации на стеклянной пластине и в планшете. Лучший способ визуализации реакции гидрозольной агглютинации на фильтровальной бумаге. Именно визуализация результатов на фильтровальной бумаге показывает четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток, а также дает возможность длительного хранения результатов.
5. Благодаря оптимизации свойств компонентов гидрозольного препарата появляются такие необходимые качества, как высокая (более 90%) специфичность, длительность сроков хранения готовых гидрозольных препаратов, простота считывания результатов, возможность проведения реакции с малыми объемами биоматериала (сыворотка крови, слюна и т.д.), собственно препарата требуется для единичного анализа 25-50 мкл, биоматериала – еще меньше – 1-5 мкл.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Куклина С.А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты для экспресс диагностики биомаркеров // Вестник новых медицинских технологий (периодический теоретический и научно-практический журнал, рекомендованный ВАК). Тула. – 2007. №2. - т. XIV. - с. 135 – 136.
2. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Мальщукова А.А. Гидрозольные препараты, изготовленные по принципам нанотехнологии в качестве экспрессных бесприборных тестов для бесприборной диагностики инфекционных и соматических патологий // Вестник Российской военно-медицинской академии (научно – практическое издание, рекомендованное ВАК). С.- Петербург. – 2008, Т.23, №3, с. 488-490.
3. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Попова С.В. Применение метода гидрозольной агглютинации в диагностике туберкулёзной инфекции // Российский Биомедицинский журнал (периодический теоретический и научно-практический журнал, рекомендованный ВАК) С.- Петербург. - 2009, Т. 10, с.478-491.
4. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Мальщукова А.А. Способ диагностики инфекционных заболеваний // Информационный листок № 24-025-06. – Киров. – ЦНТИ. 2006. - с. 1-2.
5. Куклина С.А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты как экспрессные бесприборные диагностикумы в медицине, ветеринарии и биотехнологии // Тезисы 2-й пром. выставки «Науки. Инвестиции. Производство. Вятский Левша». – Киров. - 2006. – с.
36 – 37.
6. Куклина С.А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты для экспресс диагностики биомаркеров // Материалы IV Республиканской научно-практической конференции «Перспективные направления и новые технологии в здравоохранении». Йошкар – Ола. - 2006. - с. 68 – 69.
7. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Мальщукова А.А. Оптимизация компонентов гидрозольных препаратов для экспрессной диагностики // Вятский медицинский вестник.
Киров. - № 2. - 2006. – с.48 – 49.
8. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Шугалей И.В., Тофтунова В.В.
Ультрадисперсные алмазы в качестве гидрозолей для экспрессной иммунодиагностики // IX Вишняковские чтения «Вузовская наука - образованию и промышленности» материалы международной научной конференции / под ред. проф. В.Н.Скворцова. – Бокситогорск. 2006. - с. 201- 202.
9. Куклина С.А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты как иммунохимические диагностикумы для определения качества воды // Материалы I Всероссийской молодежной научной конференции « Молодежь и наука Севера». – Сыктывкар.- 2008. – с.
204 – 205.
10.Куклина С.А., Мешандин А.Г., Орлова О.Ю. Гидрозольные диагностикумы для определения качества воды // Теоретическая и прикладная экология. Общественно – научный журнал. Киров. – 2009. - №2. - с. 21-24.