Салицилатгидроксилаза pseudomonas fluorescens 142nf(рnf142): свойства и роль в гидроксилировании феназинов
На правах рукописи
ВЛАСОВА ЕЛЕНА ПАВЛОВНА САЛИЦИЛАТГИДРОКСИЛАЗА PSEUDOMONAS FLUORESCENS 142NF(рNF142): СВОЙСТВА И РОЛЬ В ГИДРОКСИЛИРОВАНИИ ФЕНАЗИНОВ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва – 2011
Работа выполнена на кафедре химии естественнонаучного факультета ФГБОУ ВПО «Тульский государственный университет» и в лаборатории биологии плазмид УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.
Научные руководители: доктор химических наук Решетилов Анатолий Николаевич кандидат биологических наук Пунтус Ирина Филипповна Официальные доктор биологических наук, кандидат оппоненты: химических наук Зякун Анатолий Маркович кандидат химических наук Демидюк Илья Валерьевич Мордовский государственный
Ведущая организация:
университет им. Н.П.Огарева
Защита диссертации состоится «_» _ 2011 г. в _ ч на заседании Диссертационного Совета Д 212.102.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу:
119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mon.gov.ru Автореферат разослан « » _ 2011 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В настоящее время в природный круговорот углерода вовлекается значительное количество соединений, попадающих в биосферу в качестве химических средств защиты растений, в виде отходов промышленности, загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Многие из этих соединений, включая и полициклические углеводороды (ПАУ), являются токсичными и, следовательно, возможная аккумуляция их в биосфере представляет серьезную опасность для живых организмов. Основную роль в деградации подобных загрязнений играют микроорганизмы, так как микробная деградация ароматических соединений приводит к высвобождению углерода из ароматических структур и, таким образом, к вовлечению его в биологический круговорот. Для успешного использования микроорганизмов с целью очистки окружающей среды требуется детальное изучение их катаболических путей, а также ключевых ферментов, катализирующих деструкцию ароматических поллютантов.
В природе разрушение ароматических углеводородов в аэробных условиях происходит через расщепление ароматического кольца бактериальными диоксигеназами. Однако эти ферменты работают лишь в том случае, если в ароматическом кольце имеются две гидроксильные группы в орто- или пара положении по отношению друг к другу. Поэтому, один из первых шагов в биодеградации ароматических соединений – это введение одной или двух гидроксильных групп в ароматическое кольцо. Введение одной гидроксильной группы в ароматическое кольцо – моногидроксилирование – часто катализируется монооксигеназами, относящимися к подклассу флавинсодержащих монооксигеназ, которые также носят название гидроксилаз. Гидроксилазы ароматических соединений являются объектом биохимических и генетических исследований не только в силу их важной роли в процессах детоксикации, но также как превосходные системы для изучения механизмов ферментативного включения кислорода в молекулу субстрата.
Салицилатгидроксилаза (СГ) (КФ 1.14.13.1) является одним из ключевых ферментов деградации полициклических ароматических углеводородов, катализирует декарбоксилирование и одновременное гидроксилирование салицилата в присутствии НАДН, приводящее к образованию катехола.
Биохимические исследования салицилатгидроксилаз в последнее время были дополнены активными генетическими исследованиями. Использование современных молекулярно-генетических методов для изучения генов салицилатгидроксилаз показало большое их разнообразие. Но к настоящему времени большинство салицилатгидроксилаз не выделялось и свойства их не исследованы. Изучение разнообразия генов бактериальных салицилатгидроксилаз показало, что в природе наиболее часто встречаемый ген - ген nahG плазмиды pDTG1. Однако этот фермент к настоящему времени не был выделен и изучен.
Изучение свойств различных салицилатгидроксилаз важно для понимания фундаментальных механизмов адаптации микроорганизмов к новым условиям загрязнения. Помимо решения теоретических вопросов исследование салицилатгидроксилаз имеет и практический интерес. Ранее было показано, что феназин-модифицирующий ген phzS из штамма P. aeruginosa PAO1, кодирует белок подобный салицилатгидроксилазам из различных микроорганизмов, в том числе салицилатгидроксилазе NahW из P.stutzeri AN10 (Mavrodi et al, 2001).
Феназиновые антибиотики, продуцируемые PGPR-бактериями, подавляют рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов в ризосфере растений. Исследование роли салицилатгидроксилазы в процессе гидроксилирования феназинов позволит улучшить имеющиеся биопрепараты, используемые в сельском хозяйстве для защиты культур от фитопатогенных микроорганизмов. Салицилатгидроксилаза также может быть использована в качестве рецепторного элемента в биосенсорных системах для детекции широкого спектра органических соединений при мониторинге объектов окружающей среды и биотехнологических процессах.
Работа поддержана грантами ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» мероприятие 1.3.2. Проведение научных исследований целевыми аспирантами (ГК №П1705), мероприятие 1.1 (ГК № 02.740.11.0296), грантом РФФИ 11-04-97562-р_центр_а.
Цель работы:
выделение салицилатгидроксилазы микроорганизма – эффективного нефтедеструктора Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), изучение ее свойств и определение роли в гидроксилировании феназиновых антибиотиков.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Определить видовую принадлежность Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) 2. Определить тип и локализацию гена салицилатгидроксилазы 3. Подобрать среды и условия культивирования микроорганизма для наработки наибольшего количества белка с максимальной активностью салицилатгидроксилазы 4. Выделить и изучить биохимические и каталитические характеристики салицилатгидроксилазы 5. Выявить основные закономерности зависимости активности салицилатгидроксилазы от строения субстрата 6. Определить роль салицилатгидроксилазы в гидроксилировании феназиновых антибиотиков, играющих важную роль в защите растений от фитопатогенов Научная новизна Установлено, что штамм-нефтедеструктор, входящий в биопрепарат «МикроБак», Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) содержит ген салицилатгидроксилазы nahG, отнесенный к типу pDTG1. Показано, что ген nahG локализован на плазмиде.
Впервые выделена салицилатгидроксилаза, ген которой относится к типу pDTG1, и изучены ее свойства. Установлено, что салицилатгидроксилаза P. fluorescens 142NF(pNF142) состоит из одной субъединицы 46 кДа;
является ФАД-содержащим белком;
оптимальные условия функционирования: рН 7,5;
температура 35°С;
константы Михаэлиса по салицилату и НАДН 1,3 мкМ, и 9, мкМ, соответственно.
Впервые выявлена зависимость между величиной зарядов на функциональных группах субстрата, рассчитанных с помощью квантовомеханических методов, и активностью салицилатгидроксилазы. Показано, что активность салицилатгидроксилазы зависит от положения и типа заместителей в молекуле салицилата, влияющих на заряды функциональных групп -СООН и ОН, необходимых для протекания ферментативной реакции. Изменение знака рассчитанного суммарного заряда на группе ОН в молекулах с различными заместителями с отрицательного на положительный приводит к снижению активности фермента. Понижение суммарного заряда на группе СООН приводит к увеличению активности фермента в ряду субстратов, замещенных в одном положении.
Впервые показано, что салицилатгидроксилаза Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) участвует в трансформации феназиновых соединений, обладающих выраженной антибиотической активностью в отношении фитопатогенов.
Научно-практическая значимость Для увеличения выхода салицилатгидроксилазы предложено культивирование микроорганизмов в ферментере на богатой среде с индукцией салицилатом оперонов биодеградации нафталина в середине экспоненциальной фазы роста культуры, что позволяет получить биомассу штамма P. fluorescens 142NF(pNF142) с высоким содержанием салицилатгидроксилазы (210 Ед/л) с высокой удельной активностью (0,065 Ед/мг). Поскольку штамм Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) входит в состав биопрепарата «МикроБак», предназначенного для очистки нефтезагязненных территорий, получение биомассы с высокой активностью салицилатгидроксилазы, обладающей широкой субстратной специфичностью, повышает эффективность этого биопрепарата.
Схема очистки салицилатгидроксилазы, включающая ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и гель-фильтрацию, позволила получить гомогенный препарат фермента с выходом 25% и активностью 7,5 Ед/мг белка, который может быть использован как биокатализатор для создания биосенсора для определения салицилата в биологических жидкостях при лечении салицилатами (например, аспирином), а также в составе многоферментных биосенсоров для определения широкого круга веществ.
Известно, что ризосферные микроорганизмы способны защищать растения, синтезируя феназиновые антибиотики. Поскольку салицилатгидроксилаза нефтедеструктора P. fluorescens 142NF(pNF142) участвует в трансформации 2 гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты, а ген салицилатгидроксилазы расположен на плазмиде, то за счет конъюгационного переноса плазмиды в ризосферные бактерии можно усилить свойства биопрепаратов, используемых в сельском хозяйстве для защиты культур от фитопатогенных микроорганизмов, и в биотехнологиях очистки окружающей среды.
Апробация работы Материалы работы были представлены на IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес» (Пущино, 2007);
VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008);
III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008);
XII International congress of bacteriology and applied microbiology (Istanbul, 2008);
Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008);
3rd Congress of European microbiologists «Microbes and Man – Interdependence and Future Challenges» (Gothenburg, 2009);
Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010);
VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011);
Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» (Пущино, 2011).
Публикации Опубликовано 17 работ, в том числе 6 статей, 11 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.
Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 49 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 115 источников, из них зарубежных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цели и задачи исследования.
Глава 1. В первой главе дается анализ научно-технической литературы, посвященной бактериальным салицилатгидроксилазам, способам их получения, очистки, свойствам, применению. Дано описание роли салицилатгидроксилазы в биодеградации ПАУ, генетического контроля синтеза этого фермента. Часть главы посвящена феназиновым соединениям.
Глава 2. Во второй главе дано описание материалов и методов исследования.
В качестве объекта изучения был выбран штамм Pseudomonas sp.
142NF(pNF142), поскольку известно, что ген салицилатгидроксилазы nahG, как правило, располагается на плазмиде, а данный штамм является эффективным деструктором ПАУ и нефтепродуктов и содержит плазмиду биодеградации.
Для определения видовой принадлежности исследуемого штамма, типа гена салицилатгидроксилазы и его локализации дополнительно использовали Pseudomonas putida BS3701 (pBS1141)(pBS1142), Pseudomonas putida KT2442, Pseudomonas putida G7 (NAH7), Pseudomonas fluorescens B-894, Pseudomonas putida NSIB 9816-4 (pDTG1). Идентификацию исследуемого штамма до вида производили в соответствии с 9-м изданием определителя Берге (Balleroni,1984).
Получение биомассы микроорганизмов осуществляли путём периодического культивирования на минимальной среде Эванса с салицилатом или нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии, а также глубинного периодического культивирования в ферментёре АНКУМ-2М объёмом 10 л с коэффициентом заполнения 0,6 на среде Ф1, содержащей кислотный гидролизат казеина 10 г/л, дрожжевой автолизат 70 г/л, глюкозу 20 г/л, набор минеральных солей ((NH4)2SO4 – 6 г/л;
K2HPO4 – 12 г/л;
MgSO4 – 0,3 г/л;
MnSO4 – 0,05 г/л);
пеногаситель 0,8 мл/л;
воды до 6 л. Разовые добавки салицилата натрия 0,2 г/л или дизельного топлива 0,4 мл/л Тотальную ДНК бактерий выделяли согласно (Ausubel et al., 1999).
Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Маниатис и др.,1984) c некоторыми модификациями.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли с праймерами shc1_up shc1_lo (Измалкова с соавт., 2005). Эндонуклеазы рестрикции в работе использовали фирмы “Amersham” (Англия) Электрофорез ДНК проводили в горизонтальном 0,8-1% агарозном геле.
Бактериальные клетки разрушали ультразвуком (23 кГц), активность салицилатгидроксилазы измеряли спектрофотометрически по потреблению НАДН при 30°С в реакционной смеси, содержащей 100 мкМ НАДН, 100 мкМ салицилата, 10 мкМ ФАД, бесклеточный экстракт и 0,05М фосфатный буфер рН7,5.
Концентрацию белка определяли методом Бредфорд.
Очистку фермента, включающую ионообменную, гидрофобную хроматографию и гель-фильтрацию, производили при 6°С. Гомогенность полученного препарата определяли методом денатурирующего вертикального электрофореза в 12% полиакриламидном геле.
Молекулярный вес белка определяли по скорости миграции в SDS полиакриламидном геле относительно белков с известным молекулярным весом, и гель-фильтрацией на колонке HILOAD Superdex 200 (60см х 16см), откалиброванную с помощью белков с известным молекулярным весом: амилазы (200 кДа), алкогольдегидрогеназы (150 кДа) бычьего сывороточного альбумина ( кДа), карбоангидразы (29 кДа), и цитохрома C (13 кДа).
Феназиновые антибиотики выделяли из культуральной жидкости Pseudomonas aureofaciens BS1393, экстрагируя их хлороформом (1:1). Разделение феназиновых соединений осуществляли методом препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле.
Регистрацию масс-спектров в положительных ионах выполняли на тандемном масс-спектрометре LCQ ADVANTAGE MAX (Финниган, Германия) используя источник химической ионизации при атмосферном давлении (APCI).
ВЭЖХ-анализ продуктов трансформации салицилата проводили на HPLC хроматографе LKB-2150 (Pharmacia LKD Biotechnology, Швеция), используя колонку Pharmacia LKB Biotechnology Column;
носитель – Spherisorb ODS2, 5мкм, 4 мм x 250 мм;
скорость потока – 0,7 мл/мин;
элюент: метанол/вода/уксусная кислота в соотношении 30/70/1;
пики регистрировали при 254 нм. Идентификацию продуктов производили, сравнивая со стандартами, по времени удержания.
ВЭЖХ-анализ продуктов трансформации 2-гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты проводили на HPLC-хроматографе Agilent 1100/1200 (Agilent Technologies, Germany), используя колонку Symmetry C18, 5 мкм, 4,6 x 250 мм с предколонкой Symmetry C18, 5 мкм, 3,9 x 20 мм (Waters, Ireland) термостатированные при 30°С;
мобильная фаза: 52% ацетонитрил в воде, 0,01% уксусная кислота, скорость протока 1 мл/мин;
для детектирования соединений использовались следующие длины волн: 255 нм (основная), 205, 313 и 370 нм (дополнительные). Пробы перед анализом разводились равным объёмом ацетонитрила. Идентификацию продуктов производили, сравнивая со стандартами, по времени удержания.
Квантовохимические расчеты проводились в программе HyperChem 8.08.
Оптимизация молекул велась полуэмпирическим методом РМ3.
Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.
Определение видовой принадлежности исследуемого штамма На основании морфологических и биохимических данных штамм-деструктор нафталина Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) был идентифицирован как Pseudomonas fluorescens.
Определение типа гена салицилатгидроксилазы (nahG) штамма Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) и его локализации Для определения типа гена салицилатгидроксилазы проводили ПЦР с использованием праймеров shc1_up и shc1_lo, разработанных в лаборатории биологии плазмид для идентификации гена СГ nahG (Измалкова с соавт., 2005) и ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) – анализ (рис. 1).
Показано наличие в исследуемом штамме гена салицилатгидроксилазы nahG, относящегося к наиболее распространенному типу pDTG1.
А Б В Рис.1. А) Электрофореграмма продуктов амплификации гена nahG размером ок. 900 п.н.: М 1Kb DNA Ladder (Gibco BRL);
1 - NAH7;
2 – pDTG1;
3 –NF142 Б). Электрофореграмма рестрикции ПЦР-продукта амплификации гена nahG эндонуклеазой RsaI: M -Hyper Ladder l00bp (Bioline);
1 -NAH7;
2 - pDTG1;
3- NF142. В). Электрофореграмма рестрикции ампликонов гена nahG эндонуклеазой MspI.: М -Hyper Ladder l00bp (Bioline);
1 - NAH7;
2 pDTG1;
3- NF142.
Для установления локализации этого гена плазмиду pNF142 с помощью конъюгационного переноса переносили в реципиентный бесплазмидный штамм P.
putida КТ2442, который после этого приобретал способность к росту на минимальной среде с салицилатом. Из трансконъюгантных штаммов выделяли плазмидную ДНК, размер которой соответствовал размеру плазмиды pNF142 ( т.п.н.).
Культивирование штамма Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) для наработки салицилатгидроксилазы Поскольку количество салицилатгидроксилазы в культуре невелико, как правило, 0,1-2% от общего количества белка, для успешного выделения фермента необходимо было получить биомассу клеток с максимальным содержанием салицилатгидроксилазы с высокой активностью. В литературе описаны различные режимы культивирования микроорганизмов для наработки биомассы с целью выделения салицилатгидроксилазы – периодическое и непрерывное культивирование на различных средах. Ramsay с соавт. выращивали микроорганизмы на богатой среде, содержащей 0,2% салицилата. В результате многоступенчатой ферментации была получена культура с активностью салицилатгидроксилазы 400 Ед/л и 0,27 Ед/мг белка (Ramsay, 1992). При культивировании P. cepacia на минимальной среде с салицилатом активность салицилатгидроксилазы составила 55 Ед/л (White-Stevens, 1972). Berg (Berg, 1989), используя непрерывное культивирование, получил культуру микроорганизма с активностью салицилатгидроксилазы 108 Ед/л. Banat с соавт., используя непрерывное культивирование в минеральной среде с концентрацией салицилата г/л, получили высокие активности салицилатгидроксилазы 222-236 Ед/л (Banat, 1994).
В работе для выбора способа наработки биомассы мы культивировали P.
fluorescens 142NF(pNF142) на минеральной среде с салицилатом или нафталином, а также на богатой среде Ф1, предложенной нами после изучения литературы по культивированию псевдомонад: среда Ф1 по составу дешевле предложенной ранее Ramsay (Ramsay, 1992). При выращивании P. fluorescens 142NF(pNF142) на минимальной среде выход биомассы был невелик – 1,3 г/л при культивировании на нафталине и 5,5 г/л на салицилате. При выращивании на богатой среде выход биомассы клеток был значительно выше – 23 г/л с добавкой дизельного топлива и 26 г/л при добавлении салицилата. Известно, что салицилат является индуктором синтеза ферментов биодеградации нафталина, в том числе салицилатгидроксилазы, поэтому к богатой среде добавляли низкие количества салицилата (0,2 г/л) в середине экспоненциальной фазы роста. Это позволило получить высокое содержание салицилатгидроксилазы и сократить время ферментации.
Было показано, что удельная активность салицилата наиболее высока при культивировании на богатой среде Ф1 с добавлением салицилата, несколько ниже при культивировании на минимальной среде Эванса с нафталином или салицилатом (рис. 2).
Уденьная активность, Ед/мг 0, 0, 0, 0, белка 0, 0, 0, Минимальная Минимальная Богатая среда с Богатая среда с среда с среда с салицилатом диз. топливом нафталином салицилатом Условия культивирования микроорганизмов Рис. 2. Сравнение удельной активности салицилатгидроксилазы при различных режимах периодического культивирования Поскольку штамм Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) является активным деструктором нефтепродуктов, при культивировании добавляли дизельное топливо, чтобы стимулировать синтез биосурфактантов, но оно не индуцировало синтез ферментов биодеградации нафталина и удельная активность салицилатгидроксилазы в данном случае была самая низкая (0,02 Ед/мг). Известно, что добавление в среду роста салицилата (или нафталина, который медленно метаболизируется в салицилат за счет низкого уровня конститутивной экспрессии генов nah1-оперона) приводит к активации транскрипции nah-оперонов, опосредованной предсинтезированным NahR-белком. Белок NahR предположительно связывается с салицилатом и, согласно представлениям в рамках модели позитивной регуляции оперонов, переходит в активную форму активатора транскрипции nah-оперонов (Yen, 1988). Разница между удельными активностями при культивировании в ферментере на богатой среде с салицилатом и в ферментере с дизельным топливом объясняется эффектом низких концентраций салицилата на регуляторный ген nahR.
Активность СГ, Ед/л 2, 0, Минимальная Минимальная Богатая среда с Богатая среда с среда с среда с салицилатом диз. топливом нафталином салицилатом Условия культивирования микроорганизмов Рис. 3. Влияние условий культивирования микроорганизмов на активность салицилатгидроксилазы Концентрация белка, мг/г клеток 160 20 Минимальная Минимальная Богатая среда с Богатая среда с среда с среда с салицилатом диз. топливом нафталином салицилатом Условия культивирования микроорганизмов Рис. 4. Влияние условий культивирования микроорганизмов на количество белка в клетках Использование в работе среды Ф1 с индукцией салицилатом оперонов биодеградации нафталина позволило увеличить выход единиц активности салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) на литр среды в 100 раз и в 10 раз увеличить выход количества белка на г клеток по сравнению с культивированием на минимальной среде (рис 3,4).
После перехода культуры в стационарную фазу роста активность салицилатгидроксилазы снижается до нуля, поэтому культуру клеток следует собирать в конце экспоненциальной фазе роста или в фазе замедления роста.
Таким образом, подобранные условия культивирования штамма и состав питательной среды позволили получить биомассу с активностью салицилатгидроксилазы 210 Ед/л и содержанием белка 140 мг/г клеток, что соответствует результатам, полученным ранее (Ramsay, 1992), однако время культивирования в нашей работе было значительно меньше.
Очистка салицилатгидроксилазы На основании литературных данных в работе первой стадией очистки была выбрана ионообменная хроматография на анионообменном носителе DEAE Toyopearl, поскольку фермент хорошо сорбировался на этом носителе. Диапазон концентраций фосфатного буфера для создания градиента был выбран от 20мМ до 400мМ, чтобы, с одной стороны, при нанесении на колонку белок достаточно прочно сорбировался, и, с другой стороны, чтобы обеспечить достаточно узкий пик на выходе из колонки. На этом этапе фермент был очищен в 3,5 раза с выходом 80% (рис 5). Салицилатгидроксилаза элюировалась c носителя при концентрации фосфатного буфера от 100 до 150 мМ.
Для следующего этапа очистки выбрали гидрофобную хроматографию.
Ramsay с соавт. предложил использовать в качестве гидрофобного носителя фенилсефарозу. Для элюирования белка уменьшали концентрацию хлорида калия с 1М до 0, увеличивали содержание этиленгликоля с 0 до 10% (об.) и меняли буферный раствор с 200 мМ фосфатного на 10мМ Трис/НСl (Ramsay, 1992).
Подобную схему мы использовали в своей работе (рис. 6). Из представленных данных видно, что фермент элюируется с носителя конечным буфером только после полного выхода градиента.
0,45 1,8 Концентрация фосфатного буфера, мМ 1, 0, Активность фермента, Ед/мл 1, Оптическая плотность 0, 1, 0,30 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,10 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 V, мл Оптическая плотность (280 нм) Активность, Ед/мл Градиент фосфатного буфера рН 7,5, мМ Рис. 5. Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl 650-М.
4 1, Концентрация фосфатного буфера, мМ Концентрация Трис/HCl, мМ Активность фермента, Ед/мл 0, А (280 нм) 0, 0, 0, 0 0, 0 20 40 60 80 V, мл А (280 нм) Активность фермента, Ед/мл Градиент фосфатного буфера рН 7,5, мМ Градиент Трис/HCl рН 9,0, мМ Градиент KCl, от 1М до Градиент этиленгликоля от 0 до 10% Рис. 6. Гидрофобная хроматография на Phenyl-Sepharose CL-6B (схема 1).
Для оптимизации данной стадии очистки создавали градиент, совмещающий три описанные выше: градиент буфера от 200 мМ фосфатного буфера рН 7,5 с 1М KCl до 10 мМ буфера Трис/HCl рН 9,0 с 10% этиленгликоля. После окончания градиента продолжали элюирование 25 мл 10 мМ буфера Трис/HCl рН 9,0 с 10% этиленгликоля (рис 7).
1,8 1, 1, Градиент фосфатного буфера, мМ 0, 1, Градиент Трис/HCl, мМ Оптическая плотность Активность, Ед/мл 1, 0, 1, 100 0, 0, 0, 0, 50 0,4 0, 0, 0, 0 10 20 30 40 50 V, мл Оптическая плотность (280 нм) Активность фермента, Ед/мл Градиент фосфатного буфера рН 7,5, мМ с 1М KCl Градиент Трис/HCl рН 9,0, мМ с 10% (об) этиленгликоля Рис. 7. Гидрофобная хроматография на Phenyl-Sepharose CL-6B (схема 2).
В результате без потери активности фермента удалось не только сократить время очистки, но и увеличить выход салицилатгидроксилазы (табл. 1).
Табл. 1. Очистка салицилатгидроксилазы Pseudomonas fluorescens 142NF (pNF 142) на фенилсефарозе.
Условия Удельная Степень Выход, Время очистки активность, очистки, % очистки, ч Ед/мг раз схема 1 1,52±0,03 4,7 31,2 схема 2 1,55±0,03 4,0 50,4 2, Таким образом, для очистки исследуемого фермента в процессе гидрофобной хроматографии необходима замена 200мМ фосфатного буфера рН 7,5 на 10мМ Трис/НСl рН 9,0.
Окончательным этапом очистки салицилатгидроксилазы стала гель фильтрация. Поскольку из литературных данных известно, что салицилатгидроксилаза может состоять как из одной субъединицы (размером от до 57 кДа), так и из двух субьединиц, был выбран носитель Sephacryl S-200, позволяющий разделить молекулы от 5 до 250 кДа (рис 8).
0,06 0, 0, 0, Активность фермента, Ед/мл Оптическая плотность 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 20 40 60 80 100 V, мл Оптическая плотность, (280 нм) Активность фермента, Ед/мл Рис.8. Гель-фильтрация на носителе Sephacryl S-200.
В результате трех стадий очистки удалось получить гомогенный препарат фермента, что подтверждается электрофореграммой (рис 9).
Рис.9. Электрофореграмма образцов препарата на различных стадиях очистки. 1 - маркерные белки (Fermentas), 2 - препарат после ионообменной хроматографии, 3- после гидрофобной хроматографии, 4,5,6 - отдельные фракции после гель-фильтрации.
Выход фермента составил порядка 25%, степень очистки от посторонних белков – порядка 70 раз. Данные по очистке фермента представлены в таблице 2:
Табл.2. Очистка салицилатгидроксилазы Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142).
Конц. Общая Удельная Степень Этапы Выход, белка, активность, активность, очистки очистки % мг/мл Ед Ед/мг (раз) Бесклет.
16,7±0,1 40,4±0,5 0,11±0,02 100 1, экстракт DEAE 4,62±0,05 32,4±0,3 0,39±0,02 80,3 3, Toyopearl Phenyl 2,64±0,05 16,4±0,3 1,55±0,03 40,5 14, Sepharose Sephacryl 0,33±0,02 9,97±0,09 7,55±0,05 24,7 68, Стабильность салицилатгидроксилазы Стабильность салицилатгидроксилазы сравнивали при хранении при положительной и отрицательной температурах. Наилучший результат был достигнут при хранении фермента в фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,5 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ, 0,1 мМ ФАД, и 20% глицерин при температуре -20°С.
Активность фермента в этих условиях к шестому месяцу хранения составила 80%.
При хранении препарата фермента в фосфатном буфере рН 7,5, содержащем ФАД и дитиотреитол для стабилизации белка и ЭДТА при температуре 6°С салицилатгидроксилаза теряла 45% активности за 10 дней, 65% активности за дней и к концу месяца утрачивала активность практически полностью.
Свойства салицилатгидроксилазы Методами электрофореза и гель-фильтрации определено, что салицилатгидроксилаза Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) состоит из одной субъединицы размером 46 кДа.
Ранее было показано, что в отношении НАДФН салицилатгидроксилазы могут проявлять меньшую активность, чем к НАДН: 60% от активности с НАДН у Trichosporon cutaneum (Sze, 1984), 50% у Pseudomonas putida (Balashova, 2001) и 1% у Pseudomonas putida в работе (Suzuki, 1969). Активность салицилатгидроксилазы Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) исследовалась в присутствии НАДФН и НАДН, показано, что активность в присутствии НАДФН составила 60% от активности с НАДН.
У исследуемого фермента флавиновый кофактор не связан с апоферментом ковалентно – он теряется в процессе гидрофобной хроматографии или диализа. Для установления флавинового кофактора проверяли активность салицилатгидроксилазы в присутствии флавинов: ФМН, ФАД и рибофлавина.
Активность исследуемый фермент проявлял исключительно в присутствии ФАД.
Для подтверждения протекания реакции гидроксилирования с одновременным декарбоксилированием салицилата в присутствии очищенной СГ было проведено определение продуктов трансформации в реакционной смеси.
Реакцию трансформации проводили в течение 1 мин, за ходом реакции наблюдали спектрофотометрически (рис. 10 Б). После остановки реакции добавлением ортофосфорной кислоты белок отделяли центрифугированием. Супернатант исследовали ВЭЖХ (рис 10 А).
Нулевая линия Салицилат Салицилат+НАДН Интенсивность сигнала Салицилат+НАДН +фермент, через 1 мин Время А Б Рис. 10 А. Данные ВЖХ: состав реакционной смеси после трансформации салицилата салицилатгидроксилазой Б. Спектры поглощения салицилата, катехола, НАДН, НАД+ в ходе реакции трансформации салицилата салицилатгидроксилазой.
Трансформация салицилата показала, что салицилат превращается в катехол и при этом происходит потребление НАДН, что согласуется с литературными данными.
Для описания ферментативной реакции, катализируемой салицилатгидроксилазой Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) использовали уравнение Михаэлиса-Ментен.
6 3, 5 2, v, мкмоль/(мин·мг) v, мкмоль/(мин·мг) 4 2, 3 1, 2 1, 1 0, 0 0, 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 [NADH], мкМ [Sal], мкМ Рис. 12. Кинетическая кривая Рис. 11. Кинетическая кривая зависимости скорости реакции от зависимости скорости реакции от концентрации НАДН. Концентрация концентрации салицилата.
салицилата 100 мкМ. [НАДH] – Концентрация НАДН 100 мкМ. [Sal] – концентрация НАДН, v – скорость концентрация салицилата, v – реакции.
скорость реакции.
Значения констант Михаэлиса салицилатгидроксилазы Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) по салицилату и НАДН составили 1,3±0,1 и 9,9±0,9 мкМ соответственно (рис 11, 12). Диапазон Км, определенных для других салицилатгидроксилаз, составляет 0,5-4,94 мкМ по салицилату и 2,6-80 мкМ по НАДH. Таким образом, полученные данные согласуются с литературными.
Зависимость активности салицилатгидроксилазы от температуры и рН Для выявления оптимальных условий функционирования салицилатгидроксилазы Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) изучали зависимость активности от температуры и рН. Максимальную активность фермент проявляет при рН 7,5 (рис 13).
Активность, % 4 5 6 7 8 рН Рис. 13. Зависимость активности салицилатгидроксилазы от рН реакционной смеси Такой же оптимум рН 7,5 был показан для салицилатгидроксилазы Pseudomonas sp. (Yamamoto, 1965) и Trichosporon cutaneum (Sze, 1984). Оптимум при более высоких значениях рН проявляли салицилатгидроксилазы Pseudomonas putida (Suzuki, 1981;
Suzuki, 1991) при рН 7,8 и 8,0 соответственно. Оптимум при рН 7,0 проявляли салицилатгидроксилазы Pseudomonas putida (Balashova, 2001) и Pseudomonas sp. (White-Stevens, 1972). Таким образом, рН оптимум исследуемого фермента соответствует оптимуму для других изученных салицилатгидроксилаз.
Салицилатгидроксилаза Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) проявляет максимальную активность при 35°С (рис. 14), что несколько выше, чем было показано ранее для салицилатгидроксилаз Pseudomonas putida (20°С) (Balashova, 2001), Pseudomonas sp. (25°С) (Yamamoto, 1965) и Pseudomonas sp. (30 °С) (Kamin, 1978).
Активность, % 0 10 20 30 40 50 Т, оC Рис. 14. Зависимость активности салицилатгидроксилазы от температуры реакционной смеси Следует отметить широкий температурный диапазон действия фермента: при 4°С сохраняется 18% максимальной активности, около 50% при 20°С и более 60% при 45°С.
Субстратная специфичность салицилатгидроксилазы Субстратную специфичность салицилатгидроксилазы изучали по отношению к гидрокси-, метил-, амино- и хлорсалицилатам, а также 1-гидрокси-2-нафтоату (табл. 3). За 100% принимали активность фермента по отношению к салицилату. В работе показано, что активность салицилатгидроксилазы Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) зависит от типа и положения заместителя в молекуле салицилата.
Наибольшую активность исследуемый фермент проявляет к салицилатам с заместителем в положении 4, ниже к 5-замещенным и самую низкую к 3 замещенным. Следует заметить, что в целом активность фермента по отношению к хлорсалицилатам ниже, чем к аминосалицилатам и метилсалицилатам.
Табл.3. Субстратная специфичность салицилатгидроксилазы Pseudomonas fluorescens 142NF (pNF 142).
Активность, Активность, Активность, Субстрат Субстрат Субстрат % % % ° ЭЭX COOH OH ЭX 25 1 ° ЭЭX ° ЭЭX ЭX ЭX 47 166 X° N °XN 4 ЭЭX ° ° ЭЭX ЭX ЭX 11 94 XE O EXO 7 ЭЭX ° ° ЭЭX ЭX ЭX 15 43 °“ °“ Цифрами обозначены:1) 1-гидрокси-2-нафтоат, 2) салицилат, 3) 3-метилсалицилат, 4) 4 метилсалицилат, 5) 5-метилсалицилат, 6) 3-аминосалицилат, 7) 4-аминосалицилат, 8) 5 аминосалицилат, 9) 3-хлорсалицилат, 10) 4-хлорсалицилат, 11) 5-хлорсалицилат.
Для установления зависимости между структурой субстрата и активностью салицилатгидроксилазы были проведены квантовохимические расчеты суммарного заряда на карбоксильной и гидроксильной группах молекулы субстрата (табл. 4). Из представленных данных видно, что заместители в пара-положении к группе СООН, то есть в положении 4, не изменяют знак суммарного заряда на группе ОН, а заместители в мета-положении к группе СООН меняют знак суммарного заряда на группе ОН с отрицательного на положительный, что приводит к снижению активности фермента. Этим можно объяснить более высокую активность салицилатгидроксилазы по отношению к 4-замещенным салицилатам.
Табл. 4. Активность фермента к замещенным салицилатам и суммарный заряд на группах СООН и ОН субстрата Субстрат Активность, % Заряд СООН, qCOOH Заряд ОН, qOH салицилат 100 -0,037 -0, 4-метилсалицилат 166 -0,069 -0, 4-аминосалицилат 94 -0,014 -0, 4-хлорсалицилат 43 -0,008 -0, 5-метилсалицилат 81 -0,072 0, 5-аминосалицилат 80 -0,069 0, 5-хлорсалицилат 14 -0,015 0, 3-метилсалицилат 47 -0,071 0, 3-аминосалицилат 11 -0,080 0, 3-хлорсалицилат 15 -0,031 0, 1-гидрокси-2-нафтоат 25 -0,062 0, В целом в ряду заместителей в одном положении определяющее значение имеет величина суммарного заряда на группе СООН – чем ниже заряд на группе СООН, тем выше активность фермента. Исключение составляет случай, когда заместитель находится в положении 3 – здесь, по-видимому, имеет место стерический фактор. Заместитель в положении 3 мешает встраиванию молекулы субстрата в активный центр фермента, так как заряды на группах СООН и ОН для одного и того же заместителя в положении 3 и 5 изменяются незначительно, а активность для заместителя в положении 3 значительно ниже. Этим объясняется низкая активность фермента по отношению к 3-замещенным салицилатам.
Ранее субстратная специфичность салицилатгидроксилазы Pseudomonas putida BS202-P1 изучалась по отношению к хлор- и аминосалицилатам (Balashova, 2001), а Pseudomonas putida S-1 по отношению к гидроксисалицилатам (Yamamoto, 1965).
Субстратная специфичность по отношению к метил- и хлорзамещенным в положении 3, 4 и 5 салицилатам исследовалась только для салицилатгидроксилаз NahG и NahW Pseudomonas stutzeri AN10 (Bosch, 1999). Активность этих ферментов зависела от типа и положения заместителя и в наибольшей степени проявлялась к 4 замещенным салицилатам.
Таким образом, в настоящей работе впервые проведено исследование зависимости между субстратной специфичностью салицилатгидроксилазы и величиной зарядов на функциональных группах субстрата.
Роль салицилатгидроксилазы в модификации феназинов Выделение феназиновых пигментов Широкая субстратная специфичность салицилатгидроксилазы, в том числе к полициклическим ароматическим соединениям, может играть важную роль не только в процессах биодеградации, но и в усилении защитных свойств ризосферных бактерий, в частности, в трансформации феназинов, которые являются природными антибиотиками, защищающими растения от фитопатогенов. Для получения феназиновых пигментов использовали периодическое культивирование штамма Pseudomonas aureofaciens BS1393 (препарат «Псевдобактерин-2») на среде Кинг В в течение 48 часов. Затем клетки отделяли центрифугированием, а из подкисленной культуральной жидкости экстрагировали феназиновые соединения хлороформом.
Разделение пигментов осуществляли методом препаративной ТСХ с использованием пластинок «Силуфол» (рис. 15).
Показано, что P. aureofaciens BS1393 выделяет в среду три основных феназиновых соединения: феназин-1-карбоновую кислоту, 2-гидрокси-феназин и 2 гидрокси-феназин-1-карбоновую кислоту. Для получения чистых образцов 2 гидрокси-феназин-1-карбоновую кислоту рехроматографировали на двух пластинках силуфола в нейтральной системе хлороформ – метанол (9:1). Феназин-1 карбоновую кислоту рехроматграфировали в кислой системе 2.
2-ОН-ФКК + ФКК 2-ОН-ФЗ 2-ОН-ФЗ 2-ОН-ФКК ФКК Рис.15. Препаративное разделение Рис.16. Окраска, развивающаяся после феназиновых производных. Фрагмент опрыскивания пластинок 5%-ным пластинки силуфола. Система водным раствором формальдегида с хлороформ - метанол - 25% водный последующим выдерживанием в парах раствор аммиака (90:25:1) аммиака. Пластинки сорбфил.
2-ОН-ФЗ – 2-гидроксифеназин Система 2: хлороформ – метанол – 2-ОН-ФКК – 2-гидроксифеназин-1- уксусная кислота (90:10:1).
карбоновая кислота ФКК – феназин-1-карбоновая кислота Таблица 5. Хроматографическая подвижность феназиновых пигментов.
система 1: хлороформ-метанол-25% водный раствор аммиака (90:10:1);
система 2: хлороформ-метанол-уксусная кислота (90:10:1).
Хроматографическая подвижность № (Rf х100) в системах: Вещество 1 1 15 75 феназин-1-карбоновая кислота 2 43 50 2-гидрокси-феназин 3 2-гидрокси-феназин 30 1-карбоновая кислота Идентификацию пигментов осуществляли на основании окраски и хроматографической подвижности в системах 1 (хлороформ-метанол-25% водный раствор аммиака (90:25:1)) и 2 (хлороформ-метанол-уксусная кислота (90:10:1)) (табл. 5), а также окраски, развивающейся после опрыскивания пластинок 5%-ным водным раствором формальдегида с последующим выдерживанием в парах аммиака (рис 15,16). Чистоту препаратов оценивали с помощью ВЭЖХ (рис 17-19).
Трансформация 2-гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты салицилатгидроксилазой Трансформацию 2-гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты проводили в реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, ФАД, НАДН и очищенный фермент. Реакцию проводили в течение 2 часов, после чего реакционную смесь исследовали методом ВЭЖХ. Полученные пики интерпретировали по времени выхода в сравнении со стандартами. (Табл. 6, рис 17-19) Таблица 6. Время выхода феназиновых пигментов Стандарт Время удержания, мин 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота 6,9±0, 2-гидроксифеназин 3,8±0, феназин-1-карбоновая кислота 6,0±0, 550 MWD: Signal A, 255 nm/Bw:8 nm MWD: Signal A, 255 nm/Bw:8 nm 2-OH-Phz 2-OH-PCA 6, 3, COOH N OH N OH N N 350 mAU mAU 250 150 50 - 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Minutes Minutes Рис. 17. Хроматограмма 2-гидроксифеназина Рис 18. Хроматограмма 2-гидрокси феназин-1-карбоновой кислоты MWD: Signal A, 255 nm/Bw:8 nm MWD: Signal A, 255 nm/Bw:8 nm PCA_2 TP_ 3, 6, COOH N OH N 28 N 500 N mAU mAU 300 COOH N OH 6, N 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Minutes Minutes Рис 19. Хроматограмма феназин-1- Рис. 20. Хроматограмма продуктов карбоновой кислоты трансформации 2-гидроксифеназин-1 карбоновой кислоты салицилатгидроксилазой ВЭЖХ-анализ продуктов трансформации 2-гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты салицилатгидроксилазой показал наличие 2-гидроксифеназина, а также несколько пиков с меньшими, чем у него, временами удержания, один из которых, скорее всего, соответствует дигидроксифеназину (Рис. 20). Масс спектрометрический анализ реакционной смеси после трансформации позволяет сделать вывод о присутствии и гидроксифеназина (пик 197), и дигидроксифеназина (пик 213) (рис. 21).
I m/z Рис 21. Масс-спектр реакционной смеси после трансформации.
Результаты исследования контроля, содержащего фосфатный буфер, 2 гидроксифеназин-1-карбоновую кислоту, ФАД и НАДН (без фермента), показали, что 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота переходит в 2-гидроксифеназин (рис.
22), вероятнее всего, под действием соединений, содержащихся в реакционной смеси (НАДН и ФАД). В случае, когда в реакционную смесь, содержащую фосфатный буфер, 2-гидроксифеназин-1-карбоновую кислоту, ФАД и салицилатгидроксилазу, не добавляли НАДН, 2-гидроксифеназин не образовывался (рис. 23) 35, MWD: Signal A, 255 nm/Bw:8 nm MWD: Signal A, 255 nm/Bw:8 nm K_60 K COOH 32, 6, N OH 30, N OH 27, N 3, N 25, 22, 20, 17, mAU mAU 15, 12, 10, 7, 5, 2, 0, -50 -2, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Minutes Minutes Рис. 22. Хроматограмма контроля, Рис. 23. Хроматограмма контроля, содержащего фосфатный буфер, содержащего фосфатный буфер, 2-гидроксифеназин-1-карбоновую кислоту, 2-гидроксифеназин-1-карбоновую кислоту ФАД и НАДН (без фермента) ФАД и салицилатгидроксилазу (без НАДН) Таким образом, показано, что салицилатгидроксилаза гидроксилирует 2 гидроксифеназин-1-карбоновую кислоту с образованием дигидроксифеназина. В реакционной смеси протекает неэнзиматическое декарбоксилирование 2 гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты. По-видимому, НАДН ускоряет этот процесс.
Выводы:
1. На основании культурально-морфологических признаков и биохимических тестов штамм-нефтедеструктор, входящий в биопрепарат «МикроБак», Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) идентифицирован как Pseudomonas fluorescens.
2. Молекулярно-генетическими методами установлено, что штамм P.
fluorescens 142NF(pNF142) содержит ген салицилатгидроксилазы nahG, отнесенный к типу pDTG1, локализованный на плазмиде. Плазмидная локализация салицилатгидроксилазы способствует распространению данного гена в микробной популяции и расширению деградативного потенциала природных микроорганизмов.
Это свойство может быть использовано в биотехнологиях очистки окружающей среды.
3. Предложен эффективный способ культивирования штамма P. fluorescens 142NF(pNF142) с использованием индукции синтеза целевого фермента салицилатом, позволяющий получить биомассу с высоким содержанием салицилатгидроксилазы (210 Ед/л) с высокой удельной активностью (0,065 Ед/мг).
4. Впервые выделена салицилатгидроксилаза, ген которой относится к типу pDTG1. Получен гомогенный препарат фермента. Подобраны условия хранения фермента. Установлено, что салицилатгидроксилазы P. fluorescens 142 NF (pNF142) состоит из одной субъединицы 46 кДа;
является ФАД-содержащим белком;
оптимальные условия функционирования: рН 7,5;
температура 35°С;
константы Михаэлиса по салицилату и НАДН 1,3 мкМ, и 9,9 мкМ, соответственно.
5. Впервые выявлена зависимость между величиной зарядов на функциональных группах субстрата, рассчитанных с помощью квантовомеханических методов, и активностью салицилатгидроксилазы. Активность фермента зависит от положения и типа заместителя в молекуле салицилата:
изменение знака суммарного заряда на группе ОН с отрицательного на положительный приводит к снижению активности фермента, а понижение суммарного заряда на группе СООН приводит к увеличению активности фермента.
6. Впервые показано, что салицилатгидроксилаза участвует в трансформации 2-гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты с образованием дигидроксифеназина, расширяя спектр антибиотических веществ, синтезируемых ризосферным микроорганизмом.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
Статьи:
1. Петриков К.В., Власова Е.П, Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Понаморёва О.Н., Алфёров В.А., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Получение сухой формы биопрепарата для очистки от нефтяных загрязнений и изучение его свойств при долговременном хранении // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2010.
Вып. 1. С. 186-195.
2. Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус, А.П. Соколов, К.А. Понаморев, К.В. Петриков, В.А. Алферов Очистка салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas sp.
142NF(pNF142) // Известия Тульского государственного университета.
2009. Естественные науки. Вып. 9. С. 230- 3. Власова Е.П., Пунтус И.Ф., Петриков К.В. Влияние групп заместителей в молекуле субстрата на активность салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) //Экотоксикология-2009. Современные биоаналитичские системы, методы и технологии. Сборник статей. 26- октября 2009 г, Пущино-Тула 2009, с 86-88.
4. Филонов А.Е., Петриков К.В., Якшина Т.В., Пунтус И.Ф., Власова Е.П., Нечаева И.А., Самойленко В.А. Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus // Биотехнология. 2008. №6. С. 80-85.
5. Петриков К.В., Власова Е.П., Понаморёва О.Н., Алфёров В.А., Якшина Т.В., Нечаева И.А., Ахметов Л.И., Пунтус И.Ф., Самойленко В.А., Филонов А.Е. Сохранение жизнеспособности и деградативной активности микроорганизмов-нефтедеструкторов при различных способах хранения биомассы // Известия Тульского государственного университета. 2008.
Естественные науки. Вып. 2. С. 226-237.
6. Власова Е.П., Петриков К.В., Пунтус И.Ф., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Среды и условия культивирования Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) для получения биомассы с максимальной активностью фермента салицилатгидроксилазы // Известия Тульского государственного университета. 2008. Естественные науки. Вып. 1. с. 197-203.
Материалы конференций:
1. Филонов А.Е., Овчинникова А.А., Ветрова А.А., Нечаева И.А., Петриков К.В., Власова Е.П., Росс Д.В., Ахметов Л.И., Пунтус И.Ф., Забелин В.А., Боронин А.М.
Микроорганизмы и биопрепараты для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений // Материалы международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?», сборник статей, Пущино, 22-24 июня 2011г., С. 189 192.
Власова Е.П. Салицилатгидроксилаза и ее роль в биодеградации ПАУ: выделение, 2.
характеристика, применение // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 2, Москва, 21 25 марта 2011. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ имени Д.И.
Менделеева, 2011. с. 69-70.
Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус Салицилатгидроксилаза Pseudomonas fluorescens 3.
142NF(pNF142): свойства и роль в гидроксилировании феназинов. Экотоксикология 2010: Тезисы докладов всероссийской конференции, Тула, 18-19 октября. Тула: Изд во ТулГУ. С 33.
Filonov A.E., Puntus I.F., Vlasova E.P., Alferov V.A. The role of naphthalene 4.
biodegradation plasmids in improving of PGPR Pseudomonas properties. 3rd Congress of European microbiologists «Microbes and Man – Interdependence and Future Challenges» (Gothenburg, Sweden, June 28 – July 2, 2009).
Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус, К. В. Петриков, А.Е. Филонов, О.Н. Понаморева.
5.
Особенности функционирования ферментных систем биодеградации нафталина плазмидосодержащего штамма Pseudomonas sp.142NF (РNF142) при различных условиях культивирования // Материалы Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» Минск, 3–6 декабря 2008 г., c 229-231.
Филонов А.Е., Нечаева И.А, Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Власова Е.П., 6.
Петриков К.В., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Ахметов Л.И. Биоремедиация нефтеразливов в условиях холодного климата: разработка биопрепаратов и их применение. Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал//материалы III Междунар. конф., 28 сентября - октября 2008 г., Пермь/Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Пермь, 2008. – с. 105-106.
Irina Puntus, Andrey Filonov, Lenar Akhmetov, Elena Vlasova, Kirill Petrikov, Irina 7.
Nechaeva, Alexander Boronin, Michael Vainstein Cultivation and storage conditions of oil-degrading strains of genera Pseudomonas and Rhodococcus // XII International congress of bacteriology and applied microbiology 5-9 august 2008, Istanbul, p. 359- Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус, К.В. Петриков, В.А. Алфёров Влияние различных 8.
условий культивирования штамма-нефтедеструктора Pseudomonas sp. 142NF на активность ключевых ферментов биодеградации нафталина //Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2-6 июня 2008г., с.183-185.
К.В. Петриков, Т.В. Якшина, Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус, И.А. Нечаева, В.А.
9.
Самойленко, А.Е. Филонов Изучение выживаемости микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus при различных способах хранения // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2-6 июня 2008г., с.223-225.
Власова Е.П., Петриков К.В., Пунтус И.Ф., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Оценка 10.
активностей ключевых ферментов биодеградации нафталина при различных условиях культивирования штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) – деструктора нефти. // Материалы четвертой международной конференции из серии «Наука Бизнес», Пущино, 15-18 октября, 2007. С.32-35.
Петриков К.В., Власова Е.П., Нечаева И.А., Понаморева О.Н., Филонов А.Е., 11.
Алферов В.А., Боронин А.М. Получение биомассы и сохранение активности микроорганизмов-деструкторов нефти при раздельном и совместном периодическом культивировании. // Материалы четвертой международной конференции из серии «Наука - Бизнес», Пущино, 15-18 октября, 2007. С.126-129.