Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества
На правах рукописи
Белов Алексей Алексеевич
РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННЫХ
ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ
МЕДИЦИНСКИХ МАТЕРИАЛОВ НА
ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ВОЛОКНООБРАЗУЮЩИХ ПОЛИМЕРОВ,
СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА
03.00.23 - биотехнология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора технических наук
МОСКВА - 2009
Работа выполнена в отделе биотехнологии ОАО Научно - Исследовательского института текстильных материалов, г. Москва.
доктор химических наук, Научные консультанты:
Казанская Новелла Федоровна доктор технических наук, профессор Филатов Владимир Николаевич доктор химических наук,
Официальные оппоненты:
профессор Штильман Михаил Исаакович доктор биологических наук, профессор Максименко Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор Донова Марина Викторовна
Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Защита состоится « » 2009 г. в 10 часов 30 мин. на заседа нии диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047 Москва, Миусская пл., д. 9) в аудитории 443.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан « » 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Полимерные системы с иммобилизованными белками и другими разнообразными биологически активными веществами (БАВ) находят все более широкое применение в биотехнологии и различных областях медицины. Уникальные свойства ферментов, такие как высокая спе цифическая активность, непревзойденная субстратная специфичность и другие, предопределили перспективность их практического применения. Несмотря на высокую эффективность использования различных ферментов в медицине и промышленности, следует учитывать их лабильность, антигенные и пироген ные свойства. Нативные ферментные препараты дороги и многие из них дефи цитны, они быстро выводятся из организма, либо утилизируются им, что огра ничивает их широкое применение. Преодолеть эти недостатки удается иммоби лизацией ферментов на различных природных и синтетических носителях.
Важной предпосылкой к интенсивному внедрению энзимологии в медицину и фармацевтику явилось решение теоретических и практических вопросов моди фикации ферментов с приданием им новых свойств, причем именно таких, ко торые имеют практическое значение для терапии человека. При этом возникает необходимость изучения методов иммобилизации, свойств носителя и его влияния на свойства иммобилизованного биологически активного вещества, а также исследования полученных иммобилизованных препаратов в модельных эксплуатационных условиях.
Известно, что с древнейших времен и до настоящего времени для изготов ления медицинских перевязочных средств во всем мире используются материа лы из природной целлюлозы. Изделия из целлюлозы обладают прекрасными санитарно-гигиеническими свойствами, но при этом целлюлоза не взаимодей ствует химически с биологическими субстанциями, она пассивно участвует в процессе очищения раны: всасывает раневое отделяемое, защищает рану от аэ рогенной контаминации и сохраняет термальный режим в раневой среде. Мо дифицированные текстильные материалы, даже не содержащие лекарственные вещества, взаимодействуют с раневым отделяемым, т.е. принимают участие в активном очищении раны. Наличие же лекарственного препарата в материале способствует заживлению раны. Ферменты, иммобилизованные на перевязоч ных материалах, активно участвуют в процессе заживления ран, не вызывая по бочных эффектов. Необходимо учитывать, что перевязочные материалы – од норазовые средства с небольшим сроком эксплуатации (до 72 часов), поэтому их биологическая активность должна максимально реализоваться при наложе нии на рану. Введение в очаг поражения лекарственных средств, иммобилизо ванных на текстильных носителях, не вызывает побочных эффектов и позволя ет одновременно решить несколько задач: повысить действенность препарата, снизить его расход, устранить нежелательное воздействие препарата на здоро вые органы и ткани.
Работа выполнялась по планам и научно-техническим программам: Мин легпром СССР (1986-1989 гг.), ГКНТ и Министерства науки и технической по литики РФ (1990-1993 гг.), Минпром РФ (1993 г), Миннауки РФ (1997- гг.), Минпромнауки РФ (1999-2002 гг.), Минпромэнерго РФ (2004-2006), АО “Московский комитет по науке и технике” при правительстве г. Москвы (1993 1994 г., 2000-2002 г.), в рамках ФЦНТП на 1996-2001 и 2002-2006 гг. «Исследо вания и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техни ки», в рамках государственной научно-технической программы России «Но вейшие методы биоинженерии», в рамках исследовательских программ НИИ текстильных материалов (1986-2008 гг.).
Цель и задачи исследования. Цель работы - создание высокоэффектив ных раневых покрытий нового поколения, создание и разработка промышлен ной технологии их получения. Кроме того, нами были проведены многоплано вые исследования полученных иммобилизованных БАВ на модифицированных текстильных носителях.
В связи с этим решались следующие задачи:
1. Разработка промышленных технологий получения иммобилизованных лекарственных препаратов.
2. Получение иммобилизованных биологически активных препаратов на текстильных носителях, которые сохраняют лечебные свойства и стерильность после высушивания на протяжении необходимого времени хранения (не менее 3-х лет) в стандартных условиях.
3. Разработка удобных и достоверных методов оценки содержания биологи чески активных веществ на нерастворимых текстильных носителях и методов определения биологической активности ферментных препаратов, иммобилизо ванных на этих носителях.
4. Исследование физико-химических свойств полученных препаратов.
5. Выявление связи между потерей протеолитической активности у моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения. Уста новление максимально допустимого срока, в течение которого сохраняются достаточные лечебные свойства иммобилизованных препаратов.
6. Экспериментальное обоснование возможности эффективного биомеди цинского использования иммобилизованных на текстильных носителях лекар ственных препаратов.
7. Проведение токсикологических и санитарно-гигиенических испытаний разработанных материалов.
Научная новизна работы. Разработаны лабораторные и промышленные технологии получения текстильных материалов с иммобилизованными биоло гически активными веществами (протеиназами, ингибиторами и лекарственны ми препаратами) различного спектра действия.
Впервые получено новое поколение перевязочных средств - текстильных материалов комплексного действия, в состав которых входят хитозан и протео литический комплекс из гепатопанкреаса краба (Патент RU № 2 323 748 C2).
Разработаны методы оценки содержания различных биологически актив ных веществ на нерастворимых модифицированных текстильных носителях и методы оценки биологической активности иммобилизованных препаратов.
Впервые установлена взаимосвязь между потерей протеолитической ак тивности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных тек стильных носителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения в стандартных условиях.
Установлены радиопротекторные свойства диальдегидцеллюлозы (ДАЦ) высокой степени окисления (более 1,5 мгЭкв/г) и полиамидного текстильного материала в случае гамма-стерилизации.
Впервые проведено токсикологическое изучение текстильных материалов медицинского назначения (ДАЦ-коллитин, ДАЦ-ингибитор, “Мультиферм”).
Доказано, что изученные материалы не обладают токсическим, гемолитиче ским, аллергенным действием, а также цитотоксическим эффектом и мутаген ной активностью.
Практическая значимость работы. Разработанные технологии получе ния текстильных материалов медицинского назначения с иммобилизованными БАВ позволяют получить новое поколение перевязочных средств и покрытий для лечения гнойно-некротических ран.
Разработана технология производства полиферментных препаратов (на основе протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба и модифициро ванных текстильных носителей). Для полученных препаратов проведены кли нические испытания и разработан необходимый комплект нормативно технической документации. Получены разрешающие документы на серийный выпуск медицинских изделий и их использование на территории РФ.
Организовано серийное производство и промышленный выпуск иммоби лизованных форм различных биологически активных веществ на модифициро ванных текстильных носителях. Осуществляются поставки разработанных из делий в лечебно-профилактические учреждения Миндравсоцразвития РФ и клиники Минобороны РФ.
Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее резуль татам получено более 10 авторских свидетельств СССР и патентов РФ;
резуль таты работы были отмечены дипломами и медалями ВВЦ и других российских и международных выставок.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы бы ли представлены: на 3-ей Всес. науч.-техн. конф. "Актуальные проблемы произ водства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотера певтических препаратов" (Москва, 1987);
Всес. совещании "Биологически ак тивные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1988);
5-ой Моск. конф. по органической химии и технологии (Москва, 1989);
1-ом Всес. Радиобиол. съезде (Москва, 1989);
1-ой Всес. конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материа лов" (Москва, 1989);
20-th FEBS Meet. (Budapest, 1990);
2-й Нац. конф. "Биома териали" (Варна,1990);
Всес. конф."Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990);
VII Всес. симп. "Инженерная энзимология" (Мо сква, 1991);
Всес. научной конф. "Проблемы модифицирования природных и синтетических волокнообразующих полимеров (Москва, 1991);
I Рос. нац.
конгр. "Человек и лекарство", (Москва, 1992);
1, 2, 3-ей Межд.конф. "Современ ные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов" (Москва, 1992, 1995, 1998);
3, 4, 5, 6-th Int. Cong. on Wounds, Burns and Dressings, (Tel-Aviv, 1994, 1996,1998, 2000);
IV, V, VI симп. "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997, 2002, 2007);
Int. conf. BIO CATALYSIS-98, 2000, 2002, 2005, Fundamentals & applications (Puschino on the Oka 1998, Moscow 2000, 2002, St. Petersburg 2005);
Всерос. науч.-техн. конф.
"Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва 1998, 2002, 2006);
Моск. конф. «Иммобилизация лекарственных средств на текстильные носители - современный подход к снижению лекарст венной нагрузки (Москва, 2001);
II Межд. науч.-техн. конф."Текстильная химия – 2004";
1-м, 2-м, 3-м, 4-м Межд. конгрессах «Биотехнология состояние и пер спективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005,2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 111 печатных работы, из них 12 авторских свидетельств СССР и патентов РФ и 25 статей.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введе ния, обзора литературы, 5 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, списка литературы и приложений.
Текст изложен на 421 стр., включает 116 таблиц, 38 рисунков и 27 прило жений. Библиография содержит 368 публикаций.
БАВ - биологически активное Список использованных сокращений:
вещество, ДАЦ - диальдегидцеллюлоза, ДМСО - диметилсульфоксид, Кл – кол литин, ЛВ - лекарственные вещества, ПА – протеолитическая активность, ПИП - поливалентный ингибитор протеиназ, ПК – протеолитический комплекс из ге патопанкреаса краба, ПКА - поликапроамид;
ПКА-ГА – частично гидролизо ванный поликапроамид, модифицированный глутаровым альдегидом;
Тр – трипсин, Хт – хитозан, BzArgNA - паранитроанилид N-бензоил-D,L-аргининa, BzArgOEt – этиловый эфир N-бензоил-D,L-аргининa, 2М - 2- макроглобу лин, 1ПИ - 1- ингибитор протеиназ.
Работа выполнена в отделе биотехнологии ОАО НИИ текстильных ма териалов в рамках совместных исследований с Российским химико технологическим университетом им. Д.И.Менделеева (каф. биотехнологии), МГУ им. М.В.Ломоносова (Химический факультет, каф. химической энзимо логии), Институтом экспериментальной кардиологии Российского кардиологи ческого научно-производственного комплекса МЗ РФ, НИИ лазерной медици ны, Московской медицинской академией им. И.М.Сеченова, Московским госу дарственным медико-стоматологическим университетом, Московской государ ственной текстильной академией им. А.Н.Косыгина, Всероссийским НИИ мяс ной промышленности, Государственным институтом кровезаменителей и ме дицинских препаратов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В главе I обобщены и проанализированы данные литературы по методам активации и свойствам некоторых волокнообразующих текстильных носителей на основе целлюлозы и поликапроамида для иммобилизации БАВ. Проведен анализ способов получения и свойств ферментов, иммобилизованных на альдегидсодержащих производных целлюлозы и поликапроамида. Рассмотрены результаты использования нативных и иммобилизованных ферментов для лечения ран различной этиологии.
В главе II описаны использованные материалы и методы.
Глава III посвящена разработке методов оценки функциональных свойств созданных материалов. Установление качества лекарственных средств регламентируемым нормам предполагает применение различных аналитических методов. При этом окончательный вывод о качестве лекарственного средства в значительной степени зависит от качества самого метода, который должен отвечать определенным требованиям. Общие принятые в мире рекомендации по производству лекарств в виде GMP – правил содержат требования к методам испытаний, которые используются для оценки соответствия медицинской продукции установленным спецификациям в отношении точности и достоверности. Поэтому необходимо оценить пригодность тех или иных аналитических методов для предполагаемого их применения в оценке качества лекарственных средств.
При работе с иммобилизованными на текстильных носителях БАВ необходимо большое внимание уделять правильному и точному определению как функциональных групп на носителе после его модификации и количеству иммобилизованного БАВ, так и методам определения ферментативной активности иммобилизованных препаратов. Модифицированные текстильные носители активно взаимодействуют с различными ионогенными веществами, и могут частично, а иногда и полностью деструктировать под действием окружающей среды (например, в ходе опыта или в условиях раны).
Нами были проанализированы и сравнены результаты 6 методов (по Ло ури, Брэдфорду, Гурвичу (в разных модификациях), элементный анализ, ами нокислотный анализ) определения количества белка, иммобилизованного на текстильных носителях. Особенностью работы с перевязочными материалами является то, часто приходится иметь дело с образцами, содержащими менее 0, масс.% (менее 1 мг/г) биоактивного компонента. Как было показано (табл.1), определению количества иммобилизованного белка с помощью общепринятых методов определения белка (по Лоури, Брэдфорду и т.д.), мешают "свободные" альдегидные и различные ионогенные группы, кроме того методы с использо ванием красителей из-за значительного взаимодействия (сорбции) красителя и матрицы могут привести к получению заниженных результатов. Следствием этого может быть кажущаяся "активация" биологически активного вещества после иммобилизации.
Таблица 1.
Сравнение методов определения белка на иммобилизованных текстильных носителях (мг белка/г носителя).
Метод Лоури- Бредфорда Гурвич Гурвич HCN Носитель Гартри отражение анализ** ДАЦ-Тр 3,050,30 3,180,90 3,151,15 3,251,20 2,351, * (0,75) ПКА-А-Тр - - ?
0,880,20 0,720, * (0,151) ПКА-А-Тр - - ?
0,720,20 1,060, * (0,083) * в скобках дано содержание карбонильных групп в мгЭкв/г;
? - метод нельзя использовать;
** расчет проводили, исходя из содержания азота в образцах.
Для рассматриваемых текстильных носителей (целлюлоза и поликапроамид) наиболее подходящим и дающим точное значение количества иммобилизованного белка был признан метод Лоури в модификации Гартри.
При измерении ферментативной активности иммобилизованного на текстильном носителе белка определение ее истинного значения также затруднено, т.к. выделяющийся в результате протеолиза хромофор сорбируется носителем как за счет ионогенных групп, так и за счет физической сорбции.
При определении активности с измерением в ультрафиолетовой области (например, при 280 нм) анализ осложняется не только из-за взаимодействия выделенных аминокислот с носителем, но и за счет влияния "осколков" матрицы, образующихся в результате гидролитической деструкции (рис.1) на измеряемую величину оптической плотности.
Д – оптическая плотность Длина волны, Рис. 1 УФ-спектр раствора, полученный после инкубации (37С, 24 ч) образца ДАЦ (навеска ДАЦ 0,15 г, в 5 мл в 1/15 ФБ (рН 7,8), степень окисления ДАЦ 0,75 мгЭкв/г).
Погрешность определения контрольного образца может в несколько раз превосходить значение изменения оптической плотности в ходе реакции, особенно при повышенных температурах (выше 37С). Нами показано, что не существует универсального метода, позволяющего определять ферментатив ную активность для всех типов носителя.
Таким образом, при работе с текстильными носителями необходимо все гда в контрольных опытах учитывать свойства носителя и влажность образцов.
Для модифицированных текстильных носителей- ДАЦ и ПКА- нами разработа ны такие методики, в которых используются доступные реактивы и приборы.
На рис.2 приведена технологическая схема производства, которая типич на для всех получаемых в настоящей работе изделий. Отличия заключаются в Подготовка текстильного ма териала Химическая модификация носителя Отмывание модифицирован ного носителя от остатков продуктов реакции Сушка полученного носителя Иммобилизация БАВ на мо дифицированном текстиль ном носителе.
Сушка полученного препарата Раскрой и упаковка готового изделия Гамма-стерилизация готового изделия Рис. 2. Технологическая схема производства.
выборе носителя, степени и методе модификации матрицы, концентрации БАВ и составе раствора для иммобилизации. Все выпускаемые нами изделия долж ны сохранять стерильность и величину ПА (по казеину) не менее 0,1 ПЕ/г в конце срока хранения (3 или 5 лет).
При подготовке текстильного материала его разрезают на куски требуе мого размера и в случае необходимости отмывают от замасливателей. В зави симости от типа используемого носителя проводили его химическую модифи кацию перйодатом (при использовании целлюлозы - рис.3) или глутаровым альдегидом (в случае поликапроамида - рис.4).
CH2OH CH2OH O O H H [JO4]- H OH.....O.....O H H C C H OH n n O O H H целлюлоза диальдегидцеллюлоза (ДАЦ) Рис. 3. Получение диальдегидцеллюлозы.
C N C CH 2 N H H O O n поликапроамид (ПКА) а. гидролиз ПКА [Н]+ или R1NHCOR2 R1COОН + R2NH [ОН] б. активация ПКА R2NH2 + OHC-CH2-CH2-CH2-CHO R2NHC-CH2-CH2-CH2-CHO +Н2О глутаровый альдегид (ГА) ПКА-ГА Рис. 4. Получение активированного поликапроамида.
После химической модификации носителя и отмывки его от продуктов реакции, модифицированный текстильный носитель высушивается на воздухе до остаточной влажности не более 10%.
Иммобилизацию БАВ на модифицированном текстильном носителе про водили (если это не оговорено) путем взаимодействия альдегидных групп мо дифицированного текстильного носителя с аминогруппами боковой цепи белка с образованием ковалентной азометиновой связи (рис.5).
O N E Pol Pol C C + E NH2 H2O + H H Рис. 5. Схема получения препаратов иммобилизованных ферментов.
После иммобилизации и высушивания материал разрезают на салфетки требуемого размера. Формируют изделие. Каждое готовое изделие запаивают герметично в полиэтиленовый пакет. Затем запаивают в пакет из ламинирован ной бумаги и укладывают в картонные коробки по ГОСТ 7333-89. Упакованные в картонные коробки салфетки стерилизуют гамма-облучением на установке МРХ-25 с использованием в качестве источника излучения Со.
Нами оформлена необходимая нормативно-техническая документация на промышленно выпускаемые модифицированные текстильные носители и полученные материалы на их основе. В Институте химической физики РАН РФ д.б.н. И.И.Пелевиной были проведены токсикологические, а во Всероссийском научно-исследовательском и испытательном институте медицинской техники санитарно-химические исследования наших материалов. В остром и хроническом опытах изучено токсическое действие текстильных материалов на животных. При этом оценивалось их влияние на жизнеспособность клеток в культуре ткани и мутагенная активность по тесту Эймса. Проведённые исследования показали, что исследованные материалы обладают достаточными механическими, гигиеническими свойствами и по показателям нетоксичности могут быть с успехом использованы в клинике.
В главе IV подробно описана разработка технологии иммобилизации препаратов трипсина на модифицированных текстильных носителях (ДАЦ, ПКА-ГА и ПКА-А) и исследование свойств полученных препаратов.
Одной из важнейшая характеристик качества лекарственных форм, важной для производства медицинских материалов, является их стабильность.
Как известно, стабильность активного ингредиента лекарственной формы (в случае фермента – это активность) зависит не только от его физико химических свойств, но и от свойств вспомогательных веществ, а также от тех нологических процессов получения лекарственной формы.
Функции белков, также как и их стабильность, определяются аминокис лотной последовательностью, которая в свою очередь обусловливает коллек тивные взаимодействия, приводящие к формированию специфической конфор мации фермента. Химическая модификация приводит к структурным измене ниям белка (иногда очень небольшим), которые обусловливают значительные изменения его стабильности. Модификация -аминогрупп в молекуле Тр при водит к разрыву ряда чувствительных (нековалентных) связей и изменению свойств иммобилизованного препарата.
Можно условно выделить три основных стадии изменения ПА иммоби лизованного препарата: вследствие иммобилизации, в процессе высушивания и при хранении. В процессе иммобилизации на модифицированном текстильном носителе относительная ПА БАВ (отношение ПА БАВ, используемого для иммобилизации, к удельной ПА препарата, полученной в процессе иммобили зации) может, достигнув 100%, начать уменьшаться (за счет автолиза, денату рации, термоинактивации, связывания носителя с активным центром фермента или переход в раствор иммобилизованных конгломератов). Нами показано, что ПА полученных нами ферментов, иммобилизованных на модифицированных текстильных материалах, во влажном состоянии после иммобилизации, не ме няется при подобранных оптимальных условиях иммобилизации в течении, как минимум, 70 часов при температуре 57С. Снижение ПА начинается при вы сушивании препаратов на воздухе при комнатной температуре (стадия 1). По сле высушивания иммобилизованных образцов остается от 30 до 90 % первона чального значения ПА, в зависимости от условий иммобилизации, использо ванных белков или носителей. Причем данное явление не связано с попаданием молекул белка в поры матрицы, т.к. типично как для целлюлозных, так и ПКА носителей (несмотря на отсутствие пор у последних), а является следствием по тери воды во время высушивания (изменение микроокружения фермента). Как известно, дегидратация белка даже в процессе лиофилизации может приво дить к его частичной денатурации. Таким образом, снижение ПА связано в ос новном с уменьшением влажности иммобилизованного препарата от 100 % до 2 6%.
Нами были найдены оптимальные условия, метод модификации и сте пень модификации текстильного носителя, при которых практически не проис ходит инактивации Тр в процессе иммобилизации. Показано, что для исполь зования в качестве перевязочных средств наиболее пригодной является ДАЦ со степенью окисления до 1.5 мгЭкв/г (в виде аппликаций), 2.55 мгЭкв/г (в виде корпии) и более 7.5 мгЭкв/г (в виде порошка). Выбор оптимальных условий иммобилизации (рН раствора, температура, состав раствора для иммобилиза ции и т. п.) заключался в выборе таких параметров, при которых относительная ПА в процессе иммобилизации была максимальна и не изменялась до начала высушивания образцов, а падение ПА в процессе хранения оказывалось мини мальным. На технологии получения иммобилизованного Тр, Кл, ПК, ПИП нами получены авторские свидетельства и патенты, в которых приведены эти опти мальные условия.
На рис. 6 и 7 представлены зависимости изменения протеолитической активности (оптимальные условия получения) иммобилизованных препаратов Тр в процессе иммобилизации, высушивания и хранения (при комнатной тем пературе 205С, в темноте). Происходящая дегидратация фермента при вы сушивании иммобилизованных препаратов Тр может приводить к изменению структуры белка. Как известно, инактивация фермента может происходить да же при хранении сухого препарата (например, из-за агрегации или окисления белка). Вторая стадия инактивации иммобилизованных препаратов характери Ln(A/Ao) 2. А/Ао 0. 0.8 0. 0.6 1. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 10 20 30 40 Время хранения, мес.
Время хранения, мес.
Рис.6. Изменение ПА трипсина, иммоби- Рис. 7. Кинетика изменения ПА лизованного на модифицированные трипсина, иммобилизованного на текстильные носители, при хранении. модифицированные текстильные носители, при хранении.
зуется также относительно быстрой потерей ПА Тр. Для наших образцов эта стадия продолжается в течение 26-ти месяцев хранения в вышеприведенных условиях. Данная стадия характеризует лабильную фракцию образца. Третья, медленная стадия инактивации, происходит в течение последующего времени наблюдения. Полученные данные могут быть объяснены не только наличием "лабильной" и "стабильной" фракций иммобилизованного фермента, хорошо известными для иммобилизованных протеолитических ферментов. Вследствие высокой гигроскопичности носителя (влажность исследуемых целлюлозных препаратов ~ 5%, а полиамидных ~ 2%) и неустойчивости азометиновой связи, инактивация иммобилизованных препаратов в процессе хранения может быть вызвана, по-видимому, теми же причинами, что и в растворе фермента, но про цесс протекает с меньшей скоростью. Иммобилизация фермента, как известно, ведет к изменению его конформационной подвижности, а ее снижение, в свою очередь понижает активность. С другой стороны, снижение конформационной подвижности препятствует процессам денатурации и автолиза и позволяет им мобилизованному ферменту сохранять работоспособность в экстремальных (для нативного фермента) условиях. Поэтому должна существовать некоторая оптимальная жесткость связывания, которая регулируется характером присое динения фермента к носителю, природой, длиной и жесткостью линкера, свя зывающего фермент с полимерным носителем, и природа самого носителя. На бухающий носитель при многоточечном связывании может вызывать денату рацию фермента, что наблюдается и для препаратов иммобилизованного Тр при хранении в стандартных условиях. На рис. 7 приведены кинетические данные изменения ПА Тр, иммобилизованного на модифицированных текстильных но сителях, полученные в оптимальных условиях и представленные в полулога рифмических координатах. Кинетика инактивации иммобилизованных фермен тов, в процессе хранения, описывается характерной для гидрогеназ сложной экспоненциальной (A/Ao=a1*e-k1 + a2*e-k2) зависимостью. В полулогарифми ческих координатах установленные зависимости имеют вид ломаной линии, каждая из которых описывается уравнением первого порядка. Значения эффек тивных констант скорости инактивации (kин) для препаратов ДАЦ-Тр, ПКА-ГА Тр, ПКА-А-Тр полученных в оптимальных условиях соответственно равны 0,19 и 0,005;
0,15 и 0,005;
0,25 и 0,05 мес-1. Кинетические закономерности тако го рода могут быть объяснены общим механизмом инактивации, включающим существование двух форм фермента, различающихся активностью и устойчи востью к денатурирующим воздействиям. То есть, вне зависимости от конкрет ных деталей механизма и соотношения элементарных констант, двухэкспонен циальный характер инактивации показывает, что механизм инактивации вклю чает, по крайней мере, две различающиеся по активности или устойчивости формы фермента.
Облучение является общепринятым методом стерилизации медицинской продукции, который используется в промышленном масштабе. Как показывает многолетняя практика использования излучений для стерилизации, доза 25 кГр обеспечивает достаточный для безопасного применения уровень микробиоло гической чистоты, и, именно эта доза является достаточной для стерилизации изделий самого разного состава и медицинского назначения, хотя в ряде случа ев допустимы меньшие, а иногда требуются большие дозы.
Стерилизацию немодифицированных ферментов и иммобилизованных препаратов, запаянных в полиэтиленовые пакеты, осуществляли на гамма установке МРХ--25М (с источником Со60, мощность 1,1 Гр/с) при 293 К в дозе 25 кГр. На рис.8 и в табл.2 приведены данные о действии гамма облучения в дозе 25 кГр на ферментативную активность трипсина (измеренную с использованием различных белковых и синтетических субстратов). За 100% принято значение ПА данного образца до облучения.
Аобл/Ао Субстрат А/А 0. Казеин 0,80±0, 0. ДАЦ-Тр 0. Азоколл 0,87±0, Немод. Тр 0. ПКА-ГА ПКА-А 0. BzArgNA 0,84±0, ПКА-А 0. BzArgOEt 0,84±0, 0 2 4 6 8 10 Степень модиф. носителя, мгЭкв/г Рис.8. Действие гамма- облучения в дозе Таблица 2. Действие гамма 25кГрей на ПА немодифицированного и им- облучения в дозе 25 кГрей на мобилизованного на текстильные ферментативные активности носители Тр. немодифицированного Тр.
Согласно экспериментальным данным доза излучения, допустимая для полимеров, сильно зависит от их структуры, но поглощенная доза 25 кГр обычно еще не вызывает значительного изменения их свойств, определяющих пригодность соответствующих изделий для медицинского применения.
Как видно из данных, приведенных на рис. 8, при степени окисления ДАЦ более 1 мгЭкв/г текстильный носитель оказывает на фермент защитное действие. Защитное действие модифицированного текстильного носителя при увеличении содержания альдегидных групп на матрице связано, на наш взгляд, не только с увеличением количества связей между альдегидными группами и белком, но и с радиопротекторными свойствами альдегид содержащего полимера. При увеличении степени модификации носителя остается большое количество свободных альдегидных групп, которые могут взаимодействовать с радикалами.
Анализ представленных в настоящем разделе данных свидетельствует о том, что процесс изменения ферментативной активности Тр, иммобилизованного на различных модифицированных текстильных носителях, - очень сложный и не до конца изучен. К тому же наличие различных ионов на текстильной матрице (которые могут остаться в ферментных препаратах после «осаждения» белковой фракции или иммобилизации) может оказывать в процессе хранения разрушающее действие не только на ферментативную активность белка, но и на модифицированный текстильный носитель.
Кинетика инактивации иммобилизованного трипсина для препаратов белка, полученного после полного удаления солей (препараты для медицинских целей) приведена на рис. 6-7.
В системах иммобилизованных ферментов часто наблюдается смещение оптимума рН (по отношению к немодифицированному ферменту). Как следу ет из полученных нами данных, ДАЦ не сдвигает рН оптимум иммобилизо ванного трипсина (аналогичные данные были получены нами и для других ис следованных ферментов: ПК, Кл, Кр и др.). Поликапроамидный носитель, об работанный глутаровым диальдегидом, сдвигает рН оптимум протеолитиче ской активности в щелочную область рН. Сдвиг рН-оптимума иммобилизован ного на ПКА Тр связан с отрицательным зарядом модифицированной поли амидной матрицы. ДАЦ также имеет небольшой отрицательный заряд за счет карбоксильных групп, но их количество очень мало и они не оказывают суще ственного влияния на положение рН-оптимума иммобилизованных препаратов (см. рис.9).
А/Аmax 1. 0. 0. 0. 0.20 Тр ДАЦ-Тр ПКА-ГА-Тр 0. 5.50 6.50 7.50 8. рН Рис. 9. рН-зависимость ПА по казеину немодифицированного Тр и Тр, им мобилизованного на текстильные носители.
Для перевязочных средств с иммобилизованными ферментами важно, чтобы фермент сохранял активность в течение времени лечения. Полученные в ходе выполнения данной работы данные для нативных и иммобилизованных ферментов показывают, что всегда существует две температурные области, где стабильнее или нативный фермент или модифицированный (рис.10).
1 А/Ао Тр (1.0 мг/мл) 0. Тр (0.005мг/мл) 0. ДАЦ-Тр 0. ПКА-ГА-Тр 0. ПКА-А-Тр 0. 0. 0. 0. 0. 0 10 20 30 40 50 60 70 Время инактивации, ч Изменение протеолитической активности модифицированного и Рис. 10.
немодифицированного трипсина (1/15 М ФБ, рН=7,8) в зависимости от времени (при 37 С).
ДАЦ-трипсин сохраняет при 37оС до 20 % от первоначальной активности в течение 3-х суток, что очень важно при обработке ран. Кроме того, ДАЦ содержит значительное количество пор, проницаемых для Тр (заполняемых ферментом в процессе иммобилизации). При длительных экспозициях иммобилизованных препаратов в жидкой среде происходит высвобождение ферментов во внешнюю среду (восстановление первоначальной ПА).
Таким образом, использование иммобилизованных ферментов на модифицированных текстильных носителях способствует значительному сохранению ПА Тр по сравнению с растворами фермента используемым в медицинских целях (лечебная концентрация Тр более 1 мг/мл).
Нами также было исследовано влияние ряда физиологически активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях. Целесообразность совместного применения ферментов и различных ЛВ обоснована способностью ферментов увеличивать проницаемость тканей, вследствие чего облегчается проникновение лекарственных препаратов в очаг воспаления, тогда как при от сутствии антибактериальных препаратов это свойство ферментов может при вести к распространению воспалительного процесса.
Мочевина - одно из наиболее доступных и часто используемых веществ, действующих на струп для его разрыхления и последующего отторжения нек ротических тканей. Полученные нами данные о действии растворов мочевины на ПА ДАЦ-трипсина (рис. 11) показывают, что при использовании концен трированных растворов мочевины целлюлозный носитель защищает фермент.
Это может происходить благодаря действию нескольких факторов: присутст вие как таковых углеводородов, модификация некоторых аминогрупп реакцией связывания, наличие большого количества связей белок-носитель.
В наших работах (совместно с проф. П.И.Толстых) было показано уско рение лечения гнойных ран препаратами иммобилизованного трипсина, обра ботанных 20% раствором мочевины по сравнению с трипсином, иммобилизо ванным на ДАЦ. Полученные данные приведены в таблице 3.
Средние сроки, Раневое покрытие, ис- сутки пользуемое для лече-Очище- Полное А/Ао ния ран ние ра- зажив 0. ны ление 0. Медицинская марля 11,6±0,7 23,7± 0. 0, 0. 0. Дальцекс-трипсин 7,1± 19,1± ДАЦ-Тр 0. 0,5 0, 0. Тр Дальцекс-трипсин + 6,2± 16,3± 0., 20% раствор мочевины 0,2 0, 0. Местное применение 8,5± 21,6± 0,1% раствора натив- 0,4 0, 0 2 4 6 8 ного трипсина Концентрация, мочевины М Рис. 11. Влияние раствора мочевины Таблица 3. Результаты лечения (1/15М ФБ, рН 7,8) на ПА различных гнойных ран в эксперименте форм трипсина. in vivo (на крысах).
Получено разрешение МЗ РФ на промышленное производство волокнистых ра невых покрытий, содержащих трипсин и мочевину, разработанных НИИ тек стильных материалов совместно с МГТУ им. А.Н.Косыгина.
Одна из проблем, возникающих при использовании текстильных аппли каций, это их травматичность. К тому же, высыхая на воздухе или под повяз кой, поверхность раны обезвоживается, и на ней образуется твердая корочка (струп). Подобный высохший слой представляет собой естественное препятст вие для мигрирующих эпидермицитов, что значительно удлиняет время зажив ления. Нами было установлено, что 10%-ный раствор ДМСО не испаряется полностью с поверхности текстильного материала через 72 часа при 37С, что способствует сохранению атравматичных свойств аппликации.
Показано, что ДМСО и его водные растворы способствуют гидролитиче ской деструкции ДАЦ, а это в свою очередь будет способствовать более легко му снятию салфетки с раны (повышение атравматичности текстильных препа ратов). При изучении закономерностей воздействия растворов ДМСО на иссле дованные препараты выявлено, что изменение ПА наших образцов имеет поро говый вид аналогично данным других авторов. Увеличение температуры уско ряет снижение ПА иммобилизованных препаратов. ДМСО может быть исполь зован в качестве растворителя на конечной стадии заживления раны, когда не обходимо создание условий, благоприятных для восстановления кожного по крова.
Нами установлено, что растворы таких ЛВ, как мексидол (3-окси-6 метил-2-этилпиридина сукцинат), фурагин, фурацилин, суперлимф, 20 не оказывают влияния (в лечебной дозе) на гидроксиэкдизон протеолитическую активность как немодифицированного, так и иммобилизованного на текстильных носителях Тр.
Таким образом, проведённые физические, биофизические, микробиоло гические исследования показали, что раневые покрытия, в состав которых вхо дит трипсин, обладают достаточными для раневого покрытия механическими, гигиеническими, свойствами и по показателям нетоксичности могут быть с ус пехом использованы в клинике для лечения гнойных ран.
Результаты исследований, полученных в настоящей главе, легли в осно ву опытно-промышленного регламента на получение медицинского (лекарст венного средства) препарата «Дальцекс-трипсин» ПР 007891-01-2002 и салфет ка с трипсином ТУ 9393-011-05824192-2003, а также ФС и ВФС на препараты «Дальцекс-трипсин» и «Пакс-трипсин», на салфетки «Протеокс-ТМ» - соим мобилизованный трипсин и мексидол ТУ 9393-010-05824192-2003, выпускае мых в настоящее время для нужд медицины на опытном производстве НИИТМ.
Приказом Минздравсоцразвития России № 296 от 2.12.04 Дальцекс-трипсин (пункт 16) включен в перечень жизненно необходимых лекарственных средств.
В главе V описана разработка технологии получения препаратов проте олитических комплексов из отходов переработки пищевого сырья, иммобили зованных на модифицированных текстильных носителях, и исследование свойств полученных иммобилизованных композитов. Повышенное внимание к полиферментным препаратам объясняется их большей доступностью, просто той получения и выделения, более низкой стоимостью, а также тем, что смесь ферментов дает лучший результат при лечении ран. Протеолитические поли ферментные препараты в настоящее время производятся из различного сырья.
В данной работе были использованы: Коллитин (Кл), Криллаза (Крз) - поли ферментный препарат из отходов производства криля «Bio Phausia» (Uppsala, Швеция), ПК.
Полиферментный препарат коллитин получают из поджелудочной желе зы свиней (ВФС 42-2483-95). Кл применяется в качестве лекарственного сред ства для наружного применения и может найти широкое применение в медици не благодаря комплексному действию. Для более полной характеристики Кл нами были определены его элементный и аминокислотный составы. Определе ние молекулярных масс белков, входящих в состав Кл, проводили методами электрофореза и гель-хроматографии. Полученные данные подтверждают по лиферментный состав Кл, выделенные белки имеют молекулярную массу в пределах 20-30 кДа. С использованием различных белковых и синтетических субстратов были определены ферментативные активности. Как нами установ лено, Кл обладает трипсино-, химотрипсино- и эластазоподобной активностя ми.
Наибольшее распространение среди полиферментных протеолитических препаратов получил протеолитический комплекс, получаемый из гепатопан креаса краба (ПК). Его физико-химические и биологические свойства изучены довольно хорошо. ПК содержит в своем составе помимо истинной коллагеназы другие сериновые протеиназы (как минимум 9), что и объясняет его широкую субстратную специфичность и уникальные терапевтические свойства. Харак терным признаком ПК является его низкая изоэлектрическая точка (pI ниже 3,5). Для более полной характеристики ПК мы определяли ферментативные ак тивности с использованием различных белковых и синтетических субстратов (табл.4).
Таблица 4.
Ферментативные активности коллитина и ПК.
Субстрат, активность Казеин, Азоколл, BzArgNA, BzArgOEt, BocAlaONp, BzTyrOEt, нМоль/мг/мин мкМоль/мг/мин нМоль/мг/мин мкМоль/мг/мин ПЕ/мг Ед/мг Кл 1,2±0,3 0,053±0,003 60 3,6 280 7, ПК 3,2±0,3 0,016±0,004 43 3,3 164 0, Кл был иммобилизован на ДАЦ, а ПК - на различные целлюлозные носи тели (Ц, ДАЦ разной степени модификации, Ц-Хт, ДАЦ-Хт). Полученные об разцы высушивались на воздухе либо без отмывки, либо в случае необходимо сти отмывались водой и фосфатным буфером до отсутствия в промывных водах белка, либо сначала восстанавливались в кислых условиях бисульфитом на трия, затем отмывались водой и фосфатным буфером от продуктов реакции.
Кинетика изменения ферментативной активности образцов иммобилизованного Кл аналогична изменению ПА препаратов Тр, иммобилизованного на модифи цированные текстильные носители.
При отмывке сорбированного белка после иммобилизации ПК на Ц или ДАЦ, из-за низкой pI протеиназ ПК, на матрице остается малое количество иммобилизованного белка. В связи с этим нами был синтезирован носитель, имеющий положительный заряд (Ц-Хт, ДАЦ-Хт). Для этого целлюлозная мат рица (немодифицированная или окисленная перйодатом) была сначала обрабо тана раствором хитозана, и на нее затем был иммобилизован ПК. К тому же хитозан (точнее - продукты его деградации) обладает ранозаживляющими и биоцидными свойствами.
На рис. 12 представлены полученные в настоящей работе зависимости изменения ПА ПК при иммобилизации на различные текстильные носители и изменение ПА иммобилизованных препаратов в процессе иммобилизации и хранения (при комнатной температуре, в темноте). Для всех рассматриваемых типов носителей (как и для иммобилизованного Тр) можно выделить три ста дии инактивации ПК, иммобилизованного на текстильные носители (подробно обсуждено в разделе о Тр). Значения kин для препаратов ДАЦ-Кл, ДАЦ-Кр, ДАЦ-ПК, ДАЦ-Хт-ПК полученных в оптимальных условиях соответственно равны 0,39 и 0,07;
0,20 и 0,013;
0,28 и 0,06;
0,11 и 0,04 мес-1. В процессе хране ния иммобилизованных препаратов происходит деструкция текстильного носи теля из-за того, что коммерческие препараты полиферментных комплексов со держат разнообразные ионы, разрушающие текстильный носитель в процессе хранения и эксплуатации, поэтому скорость инактивации иммобилизованных комплексов выше скорости инактивации иммобилизованного Тр.
1 А/Ао 0. 0.8 Ц-ПК ДАЦ(0,44)-ПК 0. ДАЦ(0,57)-ПК(6,0) 0. ДАЦ(0,57)-ПК(7,0) 0. ДАЦ(2,9)-ПК 0.4 Ц-Хт-ПК ДАЦ(0,41)-Хт-ПК 0. ДАЦ(2,9)-Хт-ПК 0. 0. 0 6 12 18 24 30 Время хранения, мес.
Рис. 12. Изменение ПА ПК, иммобилизованного на целлюлозных матрицах, в процессе хранения (в скобках дано содержание альдегидных групп мгЭкв/г).
Нами показано, что гамма-облучение в меньшей степени (~ на 2535%), влияет на амидазную активность ДАЦ-Кл (по BzArgpNA), чем на общую протеолитическую активность (субстрата казеин);
аналогичные данные были получены и для ДАЦ-Тр. Это может быть связано с различным действием гамма облучения на иммобилизованные ферменты, входящие в состав полиферментной композиции Кл. Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что действие гамма облучения (доза 25 кГрей) практически одинаково на исследованные немодифицированные протеолитические препараты.
Таблица 5.
Действие гамма облучения в дозе 25 кГрей на ферментативные активности (А/А ) Кл, панкреатической эластазы и Тр.
Кл Эластаза Тр Фермент Субстрат Казеин 0,83±0,10 0,87±0,10 0,80±0, Азоколл 0,86±0,10 0,86±0,10 0,87±0, Денатурированный коллаген 0,89±0,10 BzArgpNA 0,87±0,10 0,88±0,12 0,84±0, BzArgOEt 0,78±0,15 0,84±0, BzTyrOEt 0,98±0,20 BocAlaONp 0,83±0,15 0,79±0,10 измерения не проводились.
Образцы Кл обладают большей термостабильностью в растворе по срав нению с панкреатическим Тр. Особенно это касается щелочных значений рН и концентраций ферментов, используемых для медицинских целей.
pH оптимум ПА Кл сдвинут в щелочную сторону по сравнению с Тр (аналогично панкреатической эластазе). Иммобилизация Кл на ДАЦ, как и в случае с Тр, не сдвигает профиль рН оптимума ферментативной активности.
На рис. 13 приведены рН-зависимости протеолитической активности растворов ПК и иммобилизованного ПК (субстраты казеин по Гаммерстену и азоколл). Ни ДАЦ, ни Ц не сдвигают рН-оптимума иммобилизованного ПК (аналогично Тр). Как следует из полученных нами данных, рН–оптимум дейст вия протеиназ, входящих в состав ПК, лежит либо в нейтральной, либо в сла бощелочной области рН, что согласуется с данными других авторов. Для хито зансодержащих матриц с иммобилизованным ПК отсутствует сдвиг рН оптимума ферментативной активности в кислую область значений рН, т.к. по ложительный заряд матрицы (за счет хитозана) при иммобилизации нейтрали зуется за счет отрицательно заряженного комплекса.
А/А7. А/A7, А 0, 0,8 Б 0, 0, 0, ПК 0, Ц-Хт-ПК ПК ДАЦ(0,41)-Хт-ПК 0,2 0, ДАЦ(0,75)-Хт-ПК ДАЦ-Хт-ПК ДАЦ(2,9)-Хт-ПК" 5 6 7 8 5 6 7 рН рН активности ПК и ПК, Рис.13. рН-зависимость протеолитической иммобилизованного на хитозансодержащих целлюлозных матрицах.
А – субстрат казеин по Гаммерстену, Б - субстрат азоколл.
При щелочных значениях рН (более 8,5) и модификации ДАЦ более 0, мгЭкв/г происходит частичное или полное растворение препарата, и раствор после совместной инкубации, приобретает желтый цвет (от светло-желтого до ярко-оранжевого). Увеличение относительной ПА при этом может быть связано с образованием комплексов казеина, хитозана и (или) раствора ДАЦ, которые легче протеолизируются ПК. Изменение рН-оптимума может быть связано с изменением структуры белка (казеина) в зависимости от значения рН и с экспонированием ранее погруженных вглубь молекулы пептидных связей. При использовании азоколла профиль рН-зависимости ПК не меняется, что может быть связано с тем, что азоколл является суспензией. В целом иммобилизация ПК (и всех исследованных ферментов) на различные целлюлозные матрицы (независимо от их заряда) сужает профиль рН ферментативной активности в изученных диапазонах рН.
На рис.14 и 15 представлены данные о термоинактивации нативного и мо дифицированного ПК в растворе. ПК является более стабильным препаратом чем панкреатический Тр, особенно при рН 7,8 и лечебных концентрациях (бо лее 1 мг/мл). Из данных, полученных нами, следует, что изменение ПА ПК р-р ПК (37С) р-р ПК (45С) Ц-Хт-ПК (37С) Ц-Хт-ПК (45С) р-р ПК 25С р-р ПК 37С р-р ПК 45С ДАЦ(0,44)-Хт-ПК (37С) ДАЦ(0,44)-Хт-ПК (45С) ДАЦ(0,75)-Хт-ПК (37С) ДАЦ(0,75)-Хт-ПК(45С) р-р ПК 55С Ц-ПК 25С Ц-ПК 37С ДАЦ(2,9)-Хт-ПК (37С) ДАЦ(2,9)-Хт-ПК (45С) A/Aо Ц-ПК 45С Ц-ПК 55С Ai/Ao 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0.2 0. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Время, ч. 0 5 10 время, ч. 15 20 Рис.14. Термоинактивация иммобилизо- Рис.15. Термоинактивация иммован ного и немодифицированного ПК в билизованного на хитозансодер растворе 1/15М ФБ (рН 7,8). жащие целлюлозные носители и немодифицированного ПК в 1/15М растворе ФБ (рН 7,8).
не зависит от концентрации комплекса, состава буферного раствора (ФБ, TRIS) или инактивационной среды (NaCl). Иммобилизация ПК на текстильных носи телях также (как и в случае с Тр) не приводит ни к стабилизации, ни к дестабили зации фермента за исключением образцов с высокой степенью модификации ДАЦ (более 0,75 мгЭкв/г) и длительных экспозиций образцов (более 24 часов).
При высокой степени модификации ДАЦ носитель легче подвергается гидроли тической деструкции, что может приводить к образованию стабильных конгло мератов ПК, либо облегчать выход активного фермента в раствор.
Мы исследовали поведение ПК и иммобилизованного на текстильные носители ПК в присутствии различных ЛВ и изучили проявление защитных или деструктурирующих свойств текстильного носителя.
Показано, что мексидол (до конечной концентрации в пробе 1 мас.%), фурагин, фурацилин, 20-гидроксиэкдизон, суперлимф (до 60 мкг/мл), три лон Б (до 500 мг/мл) не оказывают заметного влияния на протеолитическую активность как модифицированного, так и немодифицированного ПК.
Важнейшей характеристикой ферментов, которые могут быть использо ваны в качестве лекарственных препаратов, является их устойчивость к дейст вию ингибиторов, содержащихся в организме человека, и в особенности инги биторов крови. При изучении взаимодействия иммобилизованного фермента с белками плазмы крови необходимо учитывать, что фермент, содержащийся на носителе после иммобилизации (в промышленно выпускаемых препаратах), можно условно разделить на три составляющие: 1-механически включенный, 2-сорбированный и 3-ковалентно связанный.
1 - механически включенный фермент остается после удаления влаги с носителя, он образуется за счет пропиточного раствора. Это тот фермент, кото рый образует «ударную дозу» и выходит с носителя первым. Большая часть включенного фермента взаимодействует с тканевыми ингибиторами протеиназ, а оставшиеся свободными (не образовавшие комплекс с ингибиторами) фер менты начинают процесс протеолиза гнойного отделяемого. В зависимости от условий иммобилизации количество этой фракции может достигать 15%.
2 - сорбированный фермент, связанный с носителем за счет ионных, во дородных, вандер-ваальсовых связей и за счет неспецифической сорбции (как молекулами диальдегидцеллюлозы, так и немодифицированной целлюлозы или другого носителя).
3 - ковалентно связанный фермент: это фермент, связанный азометиновой связью с альдегидными группами матрицы. Причем следует иметь в виду, что часть ковалентно связанного фермента может переходить в раствор вследствие гидролитической деструкции носителя, как в виде растворимых, так и нерас творимых высокомолекулярных конгломератов. Например, чем выше степень окисления ДАЦ и чем более щелочное значение рН среды, тем легче и быстрее идет процесс гидролитической деструкции. Также следует иметь в виду, что в процессе хранения модифицированный целлюлозный носитель деструктуриру ет.
Для изучения взаимодействия текстильных материалов и ингибиторов плазмы крови образцы носителей инкубировали с плазмой крови (соотношение носитель: плазма (вес/объем) = 1:6;
1:10;
1:18;
1:20) при комнатной температу ре. Нами установлено, что изучаемые ингибиторы плазмы крови не подверга ются значительному протеолизу (с потерей ингибиторной активности) самим ПК.
Таблица 6.
Взаимодействие 1ПИ и 2М с целлюлозными носителями, не содержащими ПК.
Время взаимо- Целлюлоза ДАЦ (2,5 мгЭкв/г) действия, ч Носитель : плазма (вес/объем) 1:10 1:20 1:6 1:10 1: 0,25 5±5 6±4 35±10 12±7 7± Сорбция 1ПИ,% 1 5±5 8±3 48±5 18±7 25± 24 0 - - 20±8 Сорбция 0,25 0 0 25±5 7±3 10± 1 8±3 0 42±8 11±5 10± 2М,% 24 9±6 - - 37±7 - измерения не проводились.
Как видно из данных табл.6, сорбция ингибиторов на целлюлозных носи телях зависит от соотношения концентраций плазмы и целлюлозного носителя.
Немодифицированная целлюлоза, в отличие от ДАЦ, в незначительной степени неспецифически сорбирует белковые молекулы. Процесс взаимодействия эндо генных ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным ПК растя нут во времени, что связано, с защитным действием текстильного носителя (табл.7).
Таблица 7.
Взаимодействие иммобилизованного ПК с 1ПИ и 2М в плазме крови (соотношение матрица : плазма крови = 1:10 (вес/объем)) Время кон- ДАЦ ДАЦ-ПК ДАЦ-ПК + 0, такта, ч М NaCl 1 17.5±5,0 28±5 15± Сорбция 1ПИ,% 24 20±5 60±6 35± Сорбция 1 11±5 15±5 11± 24 37±5 72±8 49± 2М,% ДАЦ-ПК – образцы ПК, иммобилизованные на ДАЦ и содержащие 5.2 2.0 мг белка /г, ДАЦ-ПК + 0,1 М NaCl - образцы ПК, иммобилизованные на ДАЦ и отмытые от сорбированного белка водой и 0.1 М NaCl и содержащие 2.51.2 мг белка/г.
Аналогично панкреатическому Тр, иммобилизация ПК на модифицированные текстильные носители предохраняет его от инактивирующего действия ЛВ, особенно высокомолекулярных и белковой природы (ОПИТ, соевый ингибитор и др.).
Для ДАЦ-Кл и ДАЦ-Хт-ПК были проведены токсикологические, медико биологические и клинические исследования. Иммобилизованный на модифи цированных текстильных носителях Кл был разрешен к клиническому приме нению Комитетом по новой медицинской технике. ПК, иммобилизованный на хитозансодержащей матрице (”Мультиферм”, ТУ-9393-025-05824192-2006) разрешен к промышленному выпуску и применению в лечебных учреждениях РФ для лечения гнойно-некротических и ожоговых ран, пролежней и т.п.
Получены положительные результаты клинических испытаний ДАЦ-Кл на ожоговых ранах в Московском НИИ скорой помощи им. Склифосовского и на гнойных ранах в Московской медицинской академии им. Сеченова. Медико биологические исследования препаратов иммобилизованного на модифициро ванные текстильные носители Кл и ПК были проведены в Институте лазерной медицины (отделение проф. П.И. Толстых). Изучение влияния раневых покры тий на течение раневого процесса и скорость очищения и заживления ран про ведено на белых крысах самцах линии ”Вистар” массой 190±10 г, которым на носили плоскостную кожно-мышечную инфицированную рану. Полученные данные приведены в табл. 8.
Таблица 8.
Сравнение результатов лечения гнойных ран у крыс с использованием иммобилизованных ферментов.
Материал и метод Количество Время, сутки Ускорение лечения животных, n заживления Очищение Полное % раны заживление Без лечения (контроль) 20 14,9±0,8 27,2±0,2 Медицинская марля 20 13,3±0,6 24,2±0,5 11, Диальдегидцеллюлоза 20 11,6±0,7 23,7±0,5 12, ДАЦ-трипсин 20 7,1±0,5 19,1±0,5 29, ДАЦ-коллитин 20 4,9±0,5 15,1±1,3 44, Аппликация 20 3,0±0,2 12,1±0,1 55, «Мультиферм»
Местное применение 0,1% 20 8,5±0,4 21,6±0,4 20, раствора трипсина Местное применение 0,1% 20 7,8±0,5 21,2±0,3 22, раствора коллитина Анализ сроков очищения ран от гнойно-некротических масс и полного заживления показал, что иммобилизованные формы ферментов значительно эффективнее, чем соответствующие нативные препараты. Это объясняется тем, что нативные (немодифицированные) ферменты быстро инактивируются и смываются в раневом отделяемом, в то время как иммобилизованные препара ты более стабильны и обладают пролонгированным действием. Кроме того, ле чебный эффект материалов, содержащих комплекс ферментов (Кл или ПК), выше по сравнению с моноферментными препаратами (например Тр).
Таким образом нами доказано, что замена моноферментного препарата трипсина на комплексный полиферментный препарат позволит не только сни зить цену единицы изделия, но и сократит сроки лечения и расширит возмож ности терапии иммобилизованными ферментами.
В главе VI описана разработка технологии получения препаратов иммо билизованного поливалентного ингибитора протеиназ на модифицированных текстильных носителях и исследование свойств полученных препаратов иммо билизованного ингибитора.
Среди большого числа биологически активных веществ в ране особое ме сто занимают системы протеаз и их ингибиторов. Протеолитические фермен ты, вызывая расщепление белковых веществ, образовавшихся при распаде кле ток, способствуют очищению раны и обеспечивают реутилизацию аминокис лот. В то же время повышенная активность протеолитических ферментов мо жет оказывать неблагоприятное действие на процессы регенерации. Можно ожидать, что ингибиторы протеолитических ферментов будут весьма эффек тивны в стимуляции репаративных процессов в ране.
Нами получены препараты поливалентного ингибитора протеиназ (ПИП), иммобилизованного на нерастворимых текстильных носителях (целлюлоза, ДАЦ и ПКА-ГА). Следует особо отметить, что ингибиторная активность полу ченных материалов на текстильных носителях в отличие от препаратов протео литических ферментов не изменяются в течение наблюдаемого срока при хра нении в стандартных условиях.
Для терапевтических целей необходимо знать кинетику выхода иммобилизованного вещества в рану. Благодаря стабильности ПИП в растворе можно оценить кинетику выхода биологически активных веществ с аналогичных текстильных носителей.
Нами показано, что препараты ДАЦ-ПИП обладают значительно боль шим пролонгированным действием по сравнению с полиамидным носителем, особенно в кислой области рН (рис.16,17). Время выхода заданного количества лекарственного препарата можно изменять, варьируя степень модификации носителя (содержание альдегидных групп указано в скобках, мыт - образцы, отмытые от сорбированного белка).
Из данных литературы следует, что в первые дни после вскрытия гнойника в раневом экссудате наблюдается высокая активность про теолитических ферментов. По мере очищения раны от гнойно-некротического ДАЦ(0.2)-Инг(мыт.) 7.8 ДАЦ(0.2)-Инг(не мыт.) 7.8 ДАЦ(0.2)-Инг(мыт) 6. ДАЦ(0.2)-Инг(не мыт.) 6.0 ДАЦ(3,1)-Инг(мыт) 7,8 ДАЦ(3,1)-Инг(немыт) 7, ДАЦ(3,1)-Инг(мыт) 6,0 ДАЦ(3,1)-Инг(немыт) 6, It/Io 0, 0, 0, 0, 0 5 10 15 20 Время, ч Рис.16. Кинетика выхода активного ПИП с препаратов ДАЦ-ПИП (It/Io).
Ц-Инг (мыт) 7.8 Ц-Инг (не мыт) 7.8 Ц-Инг (мыт) 6. Ц-Инг (не мыт) 6.0 ПКА-ГА-Инг (мыт) 7.8 ПКА-ГА-Инг (не мыт) 7. ПКА-ГА-Инг (мыт)6.0 ПКА-ГА-Инг (не мыт) 6. It/Io 0. 0. 0. 0. 0 5 10 15 20 Время, ч.
Рис. 17. Кинетика выхода активного ПИП с препаратов Ц-ПИП и ПКА-ГА ПИП (It/Io).
содержимого (с переходом раневого процесса в фазу регенерации) активность протеиназ значительно снижается, однако она не исчезает полностью до полно го заживления раны. И, как было установлено в эксперименте, ингибиторы протеолитических ферментов не оказывают положительного влияния на тече ние раневого процесса в первой его фазе. Во второй фазе раневого процесса– регенерации – ингибиторы протеаз оказывали стимулирующее влияние на про цессы регенерации. Аналогичные данные были получены при клинических ис пытаниях иммобилизованного на модифицированные текстильные носители ПИП (отделение лечения ожогов Института хирургии им. А.В. Вишневского).
Лечебный эффект иммобилизованного ПИП был испытан на больных с ожога ми от 15 до 65 % поверхности тела, препарат накладывали на гранулирующие раны. При применении иммобилизованного ингибитора в раневом экссудате к моменту готовности раны к дермопластике снижалась концентрация белка и активность катепсинов, в то время как в экссудате из контрольных участков эти показатели были повышены. Клинико-лабораторные испытания показали, что иммобилизованный ПИП оказывает благоприятное действие на течение ране вого процесса, купирует воспалительную реакцию в ране и стимулирует рост грануляций.
Таким образом, если в первой фазе раневого процесса патогенетически обосновано применение тех или иных протеолитических ферментов, которые ускоряют очищение раны от гнойно-некротического содержимого и способст вуют более раннему появлению грануляций и эпителизации (о чем подробно нами доложено в главах 4 и 5), то во второй фазе этого процесса угнетение ак тивности протеолитических ферментов в ране с помощью ингибиторов являет ся патогенетически обоснованным, стимулирующим процессы регенерации в ране, в несколько раз сокращает сроки заживления.
В главе VII приводится технико-экономическое обоснование использо вания препаратов иммобилизованных ферментов.
Оценка эффективности использования терапевтических систем на приме ре использования иммобилизованного Тр, которая базировалась на анализе ле чения больных с различными гнойными воспалительными хирургическими за болеваниями приведена в табл.10.
Как видно из данных табл.10, иммобилизованный Тр эффективнее, чем нативный фермент или антисептики по всем показателям в 1,5-4 раза.
Таблица 10.
Клиническая эффективность применения иммобилизованного трипсина для ле чения гнойно-некротических ран.
Эффективность метода лечения, сутки Иммобилизо- Нативный Гипертонический рас Показатели ванный трипсин трипсин твор, антисептики Полное очищение ран 4,5 7,6 8, Койко-день 3,0 10,3 11, Заживление от начала 15,0 19,3 25, лечения Выводы.
В результате выполненных исследований:
1. Решена важная народнохозяйственная и социальная задача по созданию но вого ассортимента текстильных материалов медицинского назначения с задан ными лечебными свойствами.
2. Разработаны технологические режимы получения новых раневых покрытий с заданными свойствами, в том числе соиммобилизацией лекарственных ве ществ разных классов на один носитель с учетом их совместимости и предпо лагаемого синергизма действия. Получены новые медицинские материалы на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащие био логически активные вещества, и определены их области применения. Создана гибкая универсальная технологическая линия, позволяющая выпускать меди цинские изделия на стандартном технологическом оборудовании.
3. Разработаны удобные и достоверные методы определения содержания и ак тивности биологически активных веществ на нерастворимых модифицирован ных текстильных носителях. Всесторонне исследованы энзиматические свой ства полученных иммобилизованных ферментов.
4. Впервые выявлена взаимосвязь между потерей протеолитической активности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных текстильных но сителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком хранения в стандартных условиях.
5. Установлено, что разработанные иммобилизованные препараты не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цитотоксиче ским эффектом и мутагенной активностью.
6. Показано, что в условиях человеческого организма наиболее целесообразно для стабилизации иммобилизованных ферментов использовать комбинацию методов химической модификации и физической сорбции. Такой подход позво ляет получать препараты с широким спектром действия.
7. Показано, что лечебный эффект материалов с полиферментными препаратами выше, чем у моноферментных препаратов (при сравнении сроков очищения и полного заживления ран). Кроме того, изделия, полученные на основе полиферментных препаратов, имеют меньшую себестоимость.
8. Иммобилизованные на нерастворимых текстильных носителях ферменты ме дицинского назначения демонстрируют в медико-биологических испытаниях высокую эффективность действия, применяются (иммобилизованные белки) в малых дозах, не вызывают токсико-алергических реакций, удобны для повсе дневного использования как в быту, так и в стационарах или военно-полевых условиях.
9. В экспериментах на животных показано, что использованная модификация ферментов не влияет существенно на их каталитические свойства, повышает стабильность в биологических системах и не сказывается радикальным обра зом на их удалении из организма. Модифицированные БАВ оказываются более эффективными терапевтическими средствами по сравнению с нативными пре паратами при лечении различных заболеваний.
Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
Авторские свидетельства и патенты:
1. Толстых П.И., Герцен А.В., Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Белов А.А., Арутюнян Б.Н., Ху саинов Р.З. Способ лечения трофических язв. А.С. № 1598269 от 13.05.88. Решение от 08.06.90.
2. Пронин В.И., Рыльцев В.В., Вельшер Л.З., Филатов В.Н., Белов А.А., Шапошников Ю.Т., Игнатюк Т.Е., Розанов Ю.А., Шаборов В.М., Вирник Р.Б. Способ получения средства для лечения эрозивно-язвенных образований внутренних органов. А.С. № 4635886/14 от 24.01.89. Решение от 24.08.90.
Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Способ получения перевязочных 3.
целлюлозных материалов, содержащих иммобилизованный трипсин. А.С. № 1773067 от 24.11.89 Решение от 01.07.92.
Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н., Стекольников Л.И., Пронин В.И., Толстых 4.
П.И., Гостищев В.К., Арутюнян Б.Н., Вельшер Л.З., Белов А.А. Способ получения перевя зочного материала, содержащего фермент А.С. №1683323 от 20.06.89. Решение от 08.06.91.
Рыльцев В.В., Белов А.А., Гриценко С.И., Филатов В.Н. Способ получения текстильного 5.
поликапроамидного носителя для иммобилизации биологически активных веществ. А.С.
№-4855929/05/083643 от 31.07.90, Решение от 26.06.91.
Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е, Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И., Донецкий И.Л..
6.
Способ получения материала обладающего биологической активностью. Заявка №94004263/14 / 004399 от 09.02.94, Решение от 21.12.95.
Грачев С.В., Кассин В.Ю., Воробьева В.М., Павлова Л.А., Белов А.А., Рыльцев В.В., Игна 7.
тюк Т.Е., Филатов В.Н. Способ получения перевязочного материала. Патент РФ № 2108077 от 30.06.93 Решение от 10.04. Промоненков В.К., Бурмака В.В., Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Медушева Е.О., Белов 8.
А.А., Филатов Н.В., Толстых П.И., Толстых М.П., Мельниченко В.И., Петушков Д.В. Спо соб получения перевязочного материала. Патент РФ № 2203684, от 20.11.2000, выдан 10.05. 2003.
Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Филатов Н.В. Медицинская повязка, содержащая 9.
комплекс протеолитических ферментов, включая коллагенолитические протеазы из гепа топанкреаса краба. Патент RU № 2 268 751 C2.
Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н. Медицинская повязка, содержащая комплекс 10.
ферментов из гепатопанкреаса краба, и способ ее получения. Патент RU № 2 323 748 C2.
Статьи Белов А.А, Плеханова Н.Ю., Вирник Р.Б., Игнатюк Т.Е. Сравнительная оценка методов 11.
определения количества трипсина, иммобилизованного на текстильных материалах //Сб.
науч. тр. ВНИИТГП, Разработка новых видов текстильных изделий мед. назначения, ЦНИИТЭИ Легпром. М, 1988, с. 25-29.
Игнатюк Т.Е., Белов А.А., Mедушева Е.О., Егорова И.Н. Инактивация трипсина, иммоби 12.
лизованного на целлюлозных текстильных материалах //Сб. науч. тр. ВНИИТГП "Разра ботка новых видов текстильных изделий медицинского назначения", М.:ЦНИИТЭИЛегпром, 1988, с. 39-45.
Белов А.А., Белова Л.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние -облучения 13.
на ферментативную активность коллалитина в процессе хранения // Радиобиoлогия, 1990, т-30, №-4, с. 519-521.
Белов А.А., Рушайло Б.Е., Гриценко С.И., Рыльцев В.В. Прогнозирование измения протео 14.
литической активности иммобилизованного трипсина в процессе хранения // Сб. науч. тр.
ВНИИТГП М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1990, с. 21- Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф. Взаимодействие растворов 15.
трипсина с текстильными материалами, содержащими поливалентный ингибитор протеи наз //Сб. науч. тр. ВНИИТГП - М. ЦНИИТЭИлегпром, 1991, с. 36- Белов А.А., Гриценко С.И., Белова Е.Н. Применение простых аналитических реакций в 16.
контроле производства трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях // Сб. на уч. тр. ВНИИТГП М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1991, с.42-48.
Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние текстильных носителей 17.
на свойства иммобилизованного трипсина //Хим. волокна 1992. №.4. C.33-34.
18. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Методы определения протеолитической активно сти в промышленных образцах препаратов иммобилизованных протеиназ //Химико фармацевтический журнал 1992. №.11-12. C.101-103.
19. Белов А.А., Гриценко С.И., Таршиц Д.Л., Рыльцев В.В. Определение количества белка на текстильных носителях //Сб. науч. тр. НИИТМ М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1992, с.22-27.
20. Белов А.А., Гриценко С.И., Рыльцев В.В., Рушайло Б.Е. Кинетика инактивации трипсина иммобилизованного на диальдегидцеллюлозе //Сб. науч. тр. НИИТМ М., ЦНИИТЭИ Лег пром, 1992.с.27-30.
21. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф., Рыльцев В.В. Кинетика выхо да поливалентного ингибитора протеиназ с текстильного носителя //Сб. науч. тр. НИ ИТМ - М. ЦНИИТЭИлегпром - 1993. с. 22-27.
22. Белов А.А., Белова Л.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Исследование некоторых свойств коллитина //Сб. науч. тр. НИИТМ М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1993, с.34-37.
23. Ignatyuk T.E., Larionova N.I., Belov A.A., Ryltsev V.V., Zaets I.L.Тhe immobilized proteinase inhibitors in burn treatment // Data Medica J., (Israel), 1994, V.2, № 1, p. 61.
24. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние количества связанного с диальдегидцеллюлозой фермента на активность иммобилизованного трипсина после гам ма-облучения и в процессе хранения //Радиационная биология Радиоэкология, 1994, т. 34, вып. 2, с. 306-310.
25. Апосталиди К.Г., Ильин В.К., Белов А.А., Рыльцев В.В. Использование трипсина и лизо цима, иммобилизованных на целлюлозном носителе, при лечении наружных отитов // Вестник отоларингологии 1994, №-2 (март-апрель), С. 42-43.
26. Белов А.А. Влияние текстильного носителя на свойства иммобилизованных биологически активных веществ //Юбилейный сб. трудов, посвященный 10-летию Международной и Российской инженерных академий, Москва, 2000, с. 68-77.
27. Белов А.А, Филатов В.Н., Рыльцев В.В., Медушева Е.О. Создание промышленной техно логии и организация производства раневых покрытий на основе биологически активных текстильных материалов с учетом требований международных стандартов отчет о НИР/ НИИ текстильных матерралов.- № госрегистрации 01.200.2 05951;
Инв. № 02.200.304026.- М., 2002. Госконтракт № 16.802.11.0005 от 18.03.2002.
28. Белов А.А, Белова Л.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Донских Г.Н., Горбунова М.Н.
Взаимодействие ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным на диальде гидцеллюлозе протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба // Вестн. МГУ, сер.2. Химия, 2003, т.44, № 1, с. 16-19.
29. Филатов В.Н., Рыльцев В.В., Белов А.А, Медушева Е.О. Разработка промышленной техно логии получения нового класса медицинской продукции // Наука и промышленность, № 2-3 (70-71), февр.-март, 2003, с. 40-48.
30. Толстых П.И., Дербенев В.А., Медушева Е.О., Филатов В.Н., Белов А.А, Филатов Н.В., Рыльцев В.В., Денисов В.В., Гостищев В.К., Липатов К.В., Овчарова Т.С. Лечение гной ных ран и язв различного генезиса с использованием терапевтических систем иммобили зованного трипсина. Пособие для врачей. Москва, 2004, 2005, 2008, 14 с.
31. Белов А.А. Влияние водных растворов диметилсульфоксида на немодифицированные и иммобилизованные ферменты //Химическая технология № 12, 2004, С. 35-40.
32. Белов А.А. Влияние физиологически активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильные носители //Сборник научных трудов ФГУП НИИТМ, М.: Дипак, 2006.- с. 12-28.
33. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Кузьмина И.В. Новый текстильный ранозажив ляющий материал с полиферментной активностью– мультиферм //Сборник научных тру дов ФГУП НИИТМ, М.: Дипак, 2006.- с. 34-42.
34. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Казанская Н.Ф. Изменение протеолитической активности трипсина иммобилизованного на альдегидсодержащие текстильные носители в процессе иммобилизации и хранения // Вестн. МГУ, сер.2. Химия, 2006, т.47, № 2, с. 87- 35. Белов А.А., Кузьмина И.В., Белова Е.Н., Марквичев Н.С., Филатов В.Н. Разработка целлю лозных текстильных материалов, содержащих хитозан и протеолитический комплекс из ге патопанкреаса краба, исследование их свойств //Хим. волокна, 2007, № 4, с.3-6.
36. Белов А.А. Протеолитические ферменты, иммобилизованные на текстильных носителях для оказания помощи в чрезвычайных ситуациях //Медицинский алфавит. Скорая помощь и реанимация, 2007,10 (IV), С. 25-28.
37. Белов А.А. Синтез и исследование свойств альдегидсодержащих текстильных материалов с иммобилизованными протеиназами. Процессы старения альдегидсодержащих текстильных материалов //Сборник научных трудов НИИТМ, М.: Дипак, 2008, с. 40-48.
38. Белов А.А., Белова Е.Н., Филатов В.Н., Лебедева А.Н. Разработка и исследование свойств текстильных материалов, содержащих протеолитические ферменты //Хим. волокна, 2008, № 5, с.52-54.
39. Белов А.А., Белова Е.Н., Филатов В.Н. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, для медицинских целей //Биомедицинская химия, 2009, Т. 55.-№ 1, с.61-67.
Тезисы докладов (избранные) 40. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Стекольников Л.И. Действие гамма облучения на ферментативную активность коллалитина и коллагеназы краба //Тез. докл. 3-й Всесоюз.
научно-технической конференции "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов, крови, гормональных и органотерапевтических препаратов", Москва, 1987, с. 208.
41. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Гриценко С.И. Инактивация -облученного трипсина // Тез. докл. Первого Всесоюзного Радиобиологического съезда, Москва, 1989, т.1, с. 17-18.
42. Белов А.А., Игнатюк Т.Е. Оценка специфических свойств перевязочного материала на основе диальдегидцеллюлозы с иммобилизованным трипсином // Тез. докл. Первой Всесо юзной конференции "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" Москва, 1989, с. 135-137.
43. Ignatyuk T.E., Belov A.A., Ryltsev V.V., Filatov V.N. Тhe characteristics of the textile cellulose wound dressings with immobilized enzymes //Proc. 20-th FEBS Meeting, Budapest, Hungary, 1990, p.240.
44. Belov A.A., Ignatyuk T.E., Ryltsev V.V. The use of Bredford method for the analysis of textile biomaterials // Тез. докл. 2 Национальная конференция "Биоматериали", Варна, НРБ, 1990, s.102-103,176-177.
45. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние текстильных носителей на свойства иммобилизованного трипсина //Тез. докл., Всесоюзной научной конференции "Проблемы модифицирования природных и синтетических волокнообразующих полимеров Москва, 1991, с. 85-86.
46. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Толстых П.И., Герцен А.В. Использование азоколла для харак теристики перевязочного материала, содержащего полиферментный препарат "Коллитин" //Тез. докл., Первая Международная конференция "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов" Москва, 1992, с. 105 107.
47. Belov A.A., Ryltsev V.V., Ignatyuk T.E., Filatov V.N. Antiproteinase and polyenzyme wound dressing // Proc. 3-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings, Tel-Aviv, 1994, p. 22, 111.
48. Belov A.A., Ignatyuk T.E., Filatov V.N., Ryltsev V.V. Study properties and immobilization to textile carriers of collagenolitic complex from hepatopancreas of crab // "Proc. 3-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings", Tel-Aviv, 1996, p. 104, 164.
49. Белов А.А., Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Изучение свойств и иммобилизация на текстиль ных носителях полиферментных препаратов //Тез. докл., IV симпозиум "Химия протеоли тических ферментов", Москва, 1997, с. 147.
50. Ryltsev V.V., Filatov V.N., Medusheva E.O., Belov A.A., Moroz N.A. Using of immobilized enzymes in medicine //"Proc. International conference BIOCATALYSIS-98: fundamentals & applications" Puscino on the Oka fundamentals & applications, 1998, Puscino on the Oka, Russia, p.53.
51. Белов А.А., Рыльцев В.В., Денисов В.В. Устойчивость текстильных материалов с иммоби лизованным "Коллитином" к действию инактивирующих агентов //Тез. докл., Всероссий ской научно-технической конференции "Современные технологии и оборудование тек стильной промышленности" (Текстиль-98). Москва, 1998, c. 190-191.
52. Belov A.A., Ryltsev V.V., Medusheva Y.O., Filatov N.V. Сrillase immobilization on textile carriers //" Proc. 6-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings", Tel-Aviv, 2000.
53. Belov A.A., Ryltsev V.V., Filatov V.N., Filatov N.V., Donskikh G.N. Preparation and properties of krillase immobilized on dialdehidecellulose //"Proc. Intern. conf. BIOCATALYSIS- 2000:
fundamentals & applications", 2000, Moscow, p.72.
54. Belov А.A., Belova L.A., Filatov V.N., Lаgunov V.A., Filatov N.V., Donskikh G. N., Byelova Ye.N. Effects of blood plasma inhibitors on the activity of proteases immobilized on dialdehyde cellulose //"Proc. International conference BIOCATALYSIS - 2002: fundamentals & applica tions", 2002, Moscow, p.71-72.
55. Белов А.А., Белова Л.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Филатов Н.В., Горбунова М.Н. Иммо билизация и исследование свойств протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба // Тез. докл., 1-й международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы разви тия". Москва, 2002, с.72.
56. Филатов В.Н., Белов А.А., Медушева Е.О., Рыльцев В.В., Белова Е.Н., Донских Г.Н., Лагунов В.А., Денисов В.В. Биологически активные текстильные материалы // Тез. докл., 1-й международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития", Москва, 2002, с-71.
57. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Денисов В.В., Донских Г.Н. Использование хитозана для придания текстильным носителям специальных свойств // II Межд. научно техн. конф. ”Текстильная химия-2004”, г. Иваново 7-9 сент. 2004, с.131.
58. Belov А.A., Kazanskaja N.F., Filatov V.N., Belova Ye.N. The change of proteolytic activity of trypsin immobilized on aldehyde –containing textile matrix during storage and under model con ditions of inactivation //"Proc. International conference BIOCATALYSIS - 2005: fundamentals & applications", St. Petersburg, 2005, p.68.
59. Белов А.А., Кузьмина И.В., Белова Е.Н., Марквичев Н.С., Филатов В.Н. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба для медицинских целей // Тез. докл., VI симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 2007, с. 147.
60. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Кузьмина И.В., Марквичев Н.С. Синтез и исследо вание свойств полиферментных препаратов на основе протеолитического комплекса из ге патопанкреаса краба, целлюлозы и хитозана // Тез. докл., IV -й международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития". Москва, 2007, с.220-221.