Механизмы действия регулятора роста растений стифуна и его протекторные свойства в условиях кадмиевого стресса
На правах рукописи
ЛУБЯНОВ Александр Александрович
МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ
СТИФУНА И ЕГО ПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА В УСЛОВИЯХ
КАДМИЕВОГО СТРЕССА
Специальность 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа – 2009
Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Научный руководитель: кандидат биологических наук Яхин Олег Ильдусович
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кузнецов Виктор Васильевич доктор биологических наук, доцент Баймиев Алексей Ханифович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится «_» 2009 г. в «» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133. при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом – на сайте www.anrb.ru/molgen/dissov.html
Автореферат разослан «» 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. К настоящему времени накоплен большой объем информации о фитотоксическом действии тяжелых металлов (ТМ) [Феник и др., 1995;
Барсукова, 1997;
Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999;
Hall, 2002]. В связи с широким распространением в биосфере ТМ в результате естественных природных процессов и антропогенной деятельности актуален поиск средств, уменьшающих как негативное действие ТМ на рост культурных растений, так и их накопление в растениеводческой продукции. Следует отметить значительный рост в последние годы количества публикаций, в которых обсуждается возможность модификации действия тяжелых металлов на культурные растения при применении регуляторов роста [Башмаков 2002;
Лукаткин и др., 2003;
Kaur, Bhardwaj, 2003;
Серегина, 2004;
Ульяненко и др., 2004;
Janeczko et al., 2005;
Drazic et al., 2006;
Sharma, Bhardwaj, 2007 и др.].
Установлены протекторные свойства регуляторов роста растений в условиях токсического действия ТМ, при применении некоторых из них выявлено уменьшение накопления тяжелых металлов. С другой стороны применение ряда соединений в условиях действия ТМ может напротив приводить к усилению накопления и/или токсического действия металлов на растения. Таким образом, исследование механизмов действия регуляторов роста растений в условиях стресса, вызываемого ТМ, в настоящее время является актуальным.
В Институте биохимии и генетики УНЦ РАН разработан препарат стифун - регулятор роста растений с антистрессовой активностью на основе метаболитов растений семейства злаковых [Патент РФ № 2076603, 1997].
Показано, что стифун обладает ростстимулирующим действием, выраженными фунгицидными свойствами, способностью повышать устойчивость растений к водному дефициту и хлоридному засолению [Яхин, 1999;
Yakhin et al., 1998, 1999, 2000].
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – установление механизмов действия стифуна и его протекторных свойств в условиях кадмиевого стресса.
Были поставлены следующие задачи:
– оценить влияние стифуна на процессы деления и растяжения клеток, морфологические характеристики ядрышек меристематических клеток, содержание свободных аминокислот, эндогенных фитогормонов АБК, ИУК и различных форм цитокининов у растений пшеницы;
– провести цитогенетический анализ действия стифуна на растениях Allium fistulosum;
– исследовать ответные реакции растений пшеницы в условиях действия токсических концентраций ацетата кадмия при применении стифуна, оценивая влияние на морфометрические параметры, митотическую активность и элонгацию клеток, содержание фитогормонов, а также провести цитогенетическую оценку действия кадмия (Cd) при применении данного регулятора роста на растениях лука-батуна;
– изучить влияние стифуна на распределение кадмия в тканях и его аккумуляцию у растений кукурузы, пшеницы, риса;
– оценить влияние стифуна на экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса PCS при действии кадмия.
Научная новизна. Результаты исследований вносят вклад в понимание механизмов действия регулятора роста растений стифуна. Активация роста растений под его влиянием обусловлена усилением интенсивности деления и растяжения клеток. Важную роль в проявлении рострегулирующего действия стифуна играет изменение содержания цитокининов - изопентениладенозина, зеатина, зеатинрибозида, дигидрозеатинрибозида. В условиях токсического действия ацетата кадмия применение стифуна и эпина-экстра приводит к уменьшению уровня хромосомных нарушений, стифун стабилизирует митотическую активность растительных клеток. Стифун и эпин-экстра уменьшают поглощение кадмия у растений кукурузы, пшеницы, риса.
Снижение содержания кадмия в побегах риса под влиянием стифуна при экспозиции проростков на растворе ацетата кадмия сопровождается меньшей экспрессией гена фитохелатинсинтазы PCS1.
Практическая значимость работы. Выявлена способность биорегуляторов стифуна и эпина-экстра повышать устойчивость культурных растений к токсическому действию кадмия и уменьшать его аккумуляцию в растениях.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 2-й Всеукраинской конференции молодых ученых (Харьков, 2001), Международной конференции «Стедентська молодь і науковий прогрес в АПК»
(Львов, 2001), 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002), X международном конгрессе IUPAC (Basel, 2002), XIII конгрессе FESPB (Heraclion, 2002), конференции «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), международной научно-практической конференции «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО» (Уфа, 2003), V и VI съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003;
Сыктывкар, 2007), II международной конференции «Онтогенез растений в природных и измененных условиях окружающей среды: физиологические, биохимические и экологические аспекты» (Львов, 2004), международной научной конференции «Фитопатогенные бактерии. Фитонцидология. Аллелопатия» (Киев, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), IV международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии» (Алматы, 2006), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 4 статьи в журналах, включенных в перечень, рекомендуемый ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы. Работа изложена на 155 страницах, содержит 8 таблиц и 30 рисунков. Список литературы включает 283 наименования.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований - растения Zea mays L. сорта Жемчуг, Allium fistulosum L. сортов Грибовский и Русский зимний, Triticum aestivum L. сортов Жница и Ирменка, Oryza sativa L. сорта Рапан.
В работе использовали регулятор роста с антистрессовой активностью стифун (препаративная форма – водорастворимый порошок), получаемый по оригинальной технологии [Патент РФ № 2076603, 1997] в группе биологически активных соединений лаборатории молекулярных механизмов устойчивости растений к стрессам Института биохимии и генетики УНЦ РАН к.б.н. И.А.
Яхиным. Стифун применяли в диапазоне концентраций 0.00033 – 3300 мг/л, салициловую кислоту (СК) - 0.01 мМ;
0.1мМ;
1 мМ (Sigma, США), эпин–экстра (д.в. эпибрассинолид - 25 мг/л) – 0.03 мл/л – 0.5 мл/л (ННПП «НЭСТ М», Россия). Ацетат кадмия использовали в диапазоне концентраций 0.0001 мМ – 10 мМ. Контроль – дистиллированная или водопроводная вода, а при гистохимическом определении кадмия – бидистиллированная вода.
Семена растений перед посевом стерилизовали в 70%-ном этаноле. В работе использовались различные способы применения биорегуляторов:
обработка семян или проростков пшеницы, кукурузы, риса их водными растворами в течение 60, 120 мин, проращивание семян в чашках Петри на фильтровальной бумаге, увлажненной раствором биорегулятора в течение 2, 3, 4 сут при 240С – 270С, выращивание растений в водной культуре в течение сут на плотиках из пробкового материала с отверстиями, на которые размещали проклюнувшиеся семена, предварительно проращенные в термостате в течение 24 часов при температуре 240С. Применение ацетата кадмия включало экспозицию растений на его растворах в течение 2, 3, 4, 5 сут. При установлении зависимости «время-эффект» перед экспозицией на растворе ацетата кадмия 2 сут растения лука-батуна обрабатывали биорегуляторами в течение 1 ч, в экспериментах «доза-эффект» использовали экспозицию на растворе биорегулятора, а также совместную экспозицию с ацетатом кадмия.
В опытах определяли линейные размеры, массу корней, побегов и проводили цитологический анализ процессов деления, оценивая митотическую активность меристематических клеток растений пшеницы по методике [Паушева, 1988], лука-батуна – согласно [Методические рекомендации…, 1992], а также растяжения клеток, учитывая клетки, закончившие рост. При анализе анафазных пластинок выявляли общий уровень аберраций и спектр структурных нарушений хромосом: хроматидные и хромосомные фрагменты, одиночные и парные мосты, отставания хромосом [Методические указания, 1992] и другие встречающиеся нарушения. При оценке морфологических характеристик ядрышек использовали метод окрашивания азотнокислым серебром [Bloom, Goodpasture, 1976;
Архипчук и др., 1992]. В цитологических экспериментах использовали световой микроскоп Amplival («Carl Zeiss», Германия) и цифровой фотоаппарат Olympus CAMEDIA C-460 (Индонезия).
Гистохимическое определение локализации кадмия в живых тканях растений с использованием дитизона в качестве специфического реагента проводили по методу Серегина и Иванова (1997). Количественное определение кадмия проводили на атомно-абсорбционном спектрофотометре с пламенным атомизатором ААS-30 («Carl Zeiss», ГДР).
Количественное определение свободных аминокислот проводили с использованием аминокислотного анализатора «Hitachi 835» (Япония).
Содержание свободных форм фитогормонов цитокининов, абсцизовой и индолилуксусной кислот в растениях пшеницы определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [Кудоярова и др., 1986, 1990;
Веселов, 1990, 1998;
Шакирова и др., 1990]. При анализе форм цитокининов использовали экстракционную очистку и тонкослойную хроматографию в системе растворителей (n-)бутанол:аммиак:вода (6:1:2) [Arkhipova et al., 2005].
Оценку экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса PCS1 проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием пары красителей FAM/ROX и технологии межпраймерного переноса флуоресцентной резонансной энергии [Чемерис и др., 2005].
Статистическую обработку проводили с использованием программы Microsoft Excel 2003. Все опыты проводили не менее чем в трех биологических повторах и четырех-пяти аналитических повторностях, выборка составляла не менее 100 растений. В иллюстрациях и таблицах представлены средние арифметические значения и стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Цитологический анализ ростовых процессов при действии стифуна При применении стифуна выявлено возрастание митотической активности меристематических клеток апексов растений пшеницы (рис. 1). Во всех исследованных концентрациях наблюдалось увеличение длины закончивших рост клеток зоны растяжения корней. Существенное увеличение линейных размеров, сырой и сухой массы наблюдалось при дозах стифуна 0.033–330 мг/л, максимальный ростстимулирующий эффект – при 0.033 мг/л.
* * 5 * * * 5 * * * * МИ, % МИ, % * 2 1 0 А 1 2 3 4 5 6 7 Б 1 2 3 4 5 6 Рис. 1. Митотический индекс (МИ) меристематических клеток проростков пшеницы через 48 ч от начала замачивания в растворах стифуна. А – корни, Б – побеги. 1 – контроль, стифун: 2 – 0.033 мг/л, 3 – 0.33 мг/л, 4 – 3.3 мг/л, 5 – 33 мг/л, 6 – 330 мг/л, – 3300 мг/л. * - статистически достоверные различия между контрольным и опытным вариантами (P0.05) Влияние стифуна на баланс фитогормонов растений пшеницы Регуляция клеточного цикла и контроль элонгации клетки находятся под контролем фитогормонов [Swarup et al., 2002;
del Pozo et al., 2005].
Концентрации индолилуксусной (ИУК) и абсцизовой кислот (АБК) при действии стифуна в побегах возрастали, в корнях наблюдалась тенденция возрастания ИУК, содержание АБК было меньше по сравнению с контролем (рис. 2).
Корни i PA % от к о н т р о л я Побег Дигидрозеа тинрибозид 300 ИУК Зеатин рибозид АБК Дигидро 200 зеатин зеатин iP Рис. 2. Изменение содержания фитогормонов АБК, ИУК и форм цитокининов в корнях и побегах пшеницы через 48 ч от начала замачивания в растворе стифуна (0.033 мг/л).
При действии стифуна в корнях увеличивались уровни изопентениладенозина (iPA), зеатина, зеатинрибозида, дигидрозеатинрибозида, в побегах возрастал уровень дигидрозеатинрибозида (рис. 2). Исследователи связывали возрастание МИ в корневых меристемах проростков гречихи с высоким содержанием уровня зеатина [Нефедьева, Хрянин, 2000]. По нашим данным повышение концентрации ЦК при действии стифуна сопровождалось 2-кратным возрастанием МИ в корнях (рис. 1А). Для ряда биологически активных соединений было показано, что их ростстимулирующее действие связано с изменениями преимущественно содержания ЦК [Безрукова и др., 2004;
Кильдибекова и др., 2004;
Нургалиева и др., 2006]. Ранее при другом способе применения стифуна – предпосевной обработке семян, в корнях 12 сут растений пшеницы было выявлено возрастание общего уровня ЦК, ИУК, снижение содержания АБК [Яхин, 1999;
Yakhin et al., 1998, 2000].
Влияние стифуна на морфологические характеристики ядрышек в меристематических клетках пшеницы Ядрышко отражает интенсивность метаболических процессов в клетке [Liu et al., 2003], его ответная реакция на внешние факторы происходит очень быстро [Архипчук и др., 1992], поэтому характеристики ядрышка могут использоваться в качестве высокочувствительного теста определения действия внешних факторов на клетку [Соболь, 2001]. При обработке проростков пшеницы стифуном в меристематических клетках листьев и корней возрастали количество и объем аргентофильных ядрышек (табл. 1). Возрастание числа ядрышек может свидетельствовать о возможной активации слабых и латентных ядрышковых организаторов клеток меристемы [Архипчук, 1991]. Увеличение размеров ядрышек, по мнению исследователей, может быть связано с амплификацией рибосомальных генов [Буторина и др., 2002], чем крупнее ядрышко, тем интенсивнее в нем происходит синтез рРНК, и, соответственно, выше интенсивность синтеза белка в клетке [Альбертс и др., 1994;
Соболь, 2001]. Предполагая, что существует прямая связь между суммарным объемом ядрышек и метаболической активностью клеток, при изучении действия регуляторов роста на геном растений исследователи заключили, что фузикокцин, эмистим, гексахлорат, кинетин могли повышать синтез рРНК в клетках меристем [Араратян, 1989;
Артемьева, 1997;
Клицов и др., 2000].
Таблица 1. Морфологические характеристики ядрышек меристематических клеток проростков пшеницы через 48 ч от начала замачивания в растворах стифуна Клетки меристемы листья корни Варианты Концентрация, число объем число объем мг/л ядрышек ядрышек, ядрышек ядрышек, мкм3 мкм контроль вода 1.46±0.07 2.10±0.11 2.40±0.16 3.70±0. 3300 2.27±0.11* 2.90±0.13* 2.30±0.11 4.20±0.30* 330 2.55±0.14* 3.20±0.19* 2.50±0.19 4.50±0.31* 33 2.30±0.10* 3.00±0.18* 2.50±0.18 4.50±0.30* стифун 3.3 2.10±0.08* 2.90±0.14* 2.76±0.20* 4.60±0.32* 0.33 1.54±0.07 2.40±0.12 2.78±0.21* 4.70±0.33* 0.033 1.53±0.07 2.40±0.12 2.80±0.22* 4.70±0.33* * - Статистически достоверные различия между контрольным и опытным вариантами (P0.05) Влияние стифуна на содержание свободных аминокислот у растений пшеницы Свободные аминокислоты играют важную физиологическую роль в растении, участвуя в биосинтезе разнообразных соединений. При действии стифуна пул свободных аминокислот в растениях пшеницы возрастал по сравнению с контролем на 48%, происходило перераспределение свободных аминокислот:
увеличивая суммарное содержание аминокислот в надземной части в 1.9 раза, стифун уменьшал его в корнях в 1.3 раза;
как в корнях, так и в листьях изменялся уровень отдельных аминокислот. Для аланина, аспарагиновой кислоты, глицина, изолейцина, лейцина, пролина, валина, серина, гистидина при действии стифуна наблюдалось уменьшение их уровня в корнях и увеличение в надземной части (рис. 3).
корни M ET надземная часть PHE % от ко нтроля LEU 300 ALA LYS CYS TYR ASP 200 PRO ILE VAL GLY HISARG SER GLU THR Рис. 3. Влияние стифуна (3.3 мг/л) на содержание свободных аминокислот в корнях и надземной части 14-суточных растений пшеницы Подобное изменение и распределение отдельных фракций аминокислот, и в том числе - из ряда вышеперечисленных, исследователи связывали со способностью растений засухоустойчивого сорта пшеницы поддерживать высокий уровень транспорта этих соединений между корнями и листьями в условиях засухи [Авксентьева, 2004]. Повышение эпибрассинолидом засухоустойчивости растений было обусловлено увеличением уровня свободных аминокислот, участвующих в осморегуляции [Пустовойтова и др., 2001]. Активация синтеза аминокислот у озимой пшеницы в фазу кущения как результат применения молибдена могла способствовать повышению устойчивости растений к холоду [Hu et al., 2002]. При действии стифуна в растениях пшеницы увеличивалось содержание цистеина, лизина, тирозина, и значительно – фенилаланина и метионина. Фенилаланин является предшественником многих фенольных соединений, обладающих антиоксидантными свойствами и участвующими в процессе лигнификации растительных клеток. Лизин также может участвовать в процессах лигнификации. Фенилаланин способен преобразовываться в тирозин, который может являться предшественником флавоноидов. Метионин необходим для репликации и транскрипции ДНК, синтеза протеинов в растении [Hu et al., 2002].
Следует отметить, что применение стифуна и в данном опыте приводило к увеличению биомассы и линейных размеров растений. Показано возрастание при действии стифуна содержания различных белков [Яхин, 1999].
Существенным является то, что стифун обладает способностью повышать антипротеолитическую активность [Яхин и др., 1998]. Накопление свободных аминокислот в наших экспериментах, вероятно, связано с активацией их биосинтеза.
Повышение уровня свободных аминокислот, активация их синтеза как результат применения физиологически активных веществ обсуждаются в литературе в связи с устойчивостью растений к стрессовым факторам [Пустовойтова и др., 2001;
Hu et al., 2002]. По литературным данным глицин, метионин, цистеин обладают способностью связывать металлы [Peer et al., 2005]. Метионин является предшественником никотинамина, способного участвовать в детоксикации ТМ и формировании устойчивости к стрессу, вызываемому тяжелыми металлами [Sharma, Dietz, 2006]. Пролин может принимать прямое участие в детоксикации тяжелых металлов за счет их связывания, или опосредованное – в качестве осмопротектора, возрастание его содержания рассматривается в качестве возможного механизма, отвечающего за повышение устойчивости растений к действию ТМ [Wu F.-B. et al., 2004;
Sharma, Dietz, 2006]. Выявленное нами увеличение содержания перечисленных аминокислот при применении стифуна позволяет предполагать его протекторные свойства в условиях токсического действия ионов тяжелых металлов.
Стабилизирующее действие стифуна на митотическую активность клеток пшеницы при действии ацетата кадмия В предварительных экспериментах было выявлено, что стифун и эпин экстра в определенной степени предотвращали ингибирование кадмием линейных размеров, сырой и сухой массы побегов и корней. Стифун при ингибирующем действии кадмия увеличивал МИ клеток корневой меристемы пшеницы до уровня контроля, стабилизировал фазовый индекс (рис. 4).
телофаза,% * анафаза,% ** 6 * метафаза,% ФИ, % МИ, % 60 профаза,% 2 Б А 1 2 3 1 2 3 Рис. 4 Влияние стифуна (3.3 мг/л) и ацетата кадмия (1 мМ) на митотический (А) и фазовый (Б) индексы меристематических клеток корней 3–суточных проростков пшеницы. 1–контроль, 2–стифун, 3–ацетат кадмия, 4–ацетат кадмия+стифун.
* – Статистически достоверные различия между контрольным и опытным вариантами (P0.01);
** – статистически достоверные различия по сравнению с действием ацетата кадмия (P0.01) При действии кадмия (1 мМ) значительно уменьшалась площадь клеток (на 62%) в зоне растяжения корней по сравнению с контролем, что происходило прежде всего за счет уменьшения длины клеток. Стифун предотвращал уменьшение площади клеток на 52% по сравнению с действием только кадмия.
Цитогенетическая оценка действия кадмия на растениях лука-батуна при применении регуляторов роста При применении стифуна происходило уменьшение повреждающего действия кадмия на клетки корневых меристем лука-батуна, что проявлялось в снижении количества всех типов хромосомных аберраций (табл. 2), наряду с этим биорегулятор уменьшал уровень аберраций хромосом у лука-батуна по сравнению с контролем (табл. 2,3). Происходило снижение при действии стифуна общего уровня хромосомных аберраций на 44% (3.78 мкМ Cd), 51% (37.8 мкМ и 378 мкМ) по сравнению с действием только Cd. При установлении зависимости «время-эффект» выявлено уменьшение стифуном уровня хромосомных аберраций: при 18 ч экспозиции на растворе ацетата кадмия (37. мкМ) на 62%, 36 ч – на 71%, 54 ч – на 70% по сравнению с действием только Cd. Эпин-экстра снижал количество аберраций, индуцируемых кадмием - на 60%, 66%, 68% при 18 ч, 36 ч, 54 ч, соответственно. Через 36 ч и 54 ч экспозиции стифун и эпин-экстра существенно уменьшали количество отставаний хромосом, индуцированных ацетатом кадмия (табл. 3). Стифун и эпин-экстра снижали количество К-митозов, значительно возраставших при действии кадмия. При применении биорегуляторов в условиях действия ацетата кадмия индекс аберраций кластогенного типа (ИАКТ) уменьшался по сравнению с действием только кадмия.
Таблица 2. Влияние стифуна (0.33 мг/л) на спектр структурных аберраций хромосом (%) в клетках корневой меристемы лука-батуна сорта Грибовский при экспозиции 18 ч на растворе ацетата кадмия при установлении зависимости «доза эффект»
Число нарушений на 100 проанализированных анафаз фрагменты мосты отста Вариант ИАКТ ФЭА вания хрома- хромо- оди- парные хромо тидные сомные ночные сом контроль 0.14 0.28 1.13 0.28 2.69 1 стифун 0 0.17 0.99 0.17 1.83 0.74 0. ацетат 0.20 0.41 3.89 0.82 7.17 2.91 кадмия, 3.78 мкМ ацетат кадмия, 0 0.22 1.57 0.45 4.71 1.22 0. 3.78 мкМ + стифун ацетат 3.25 0.81 8.94 0.81 3.25 7.55 кадмия, 37.8 мкМ ацетат кадмия, 1.50 0.75 3.58 0.42 2.11 3.42 0. 37.8 мкМ + стифун ацетат кадмия, 1.09 2.17 9.24 1.63 4.35 7.72 378 мкМ ацетат кадмия, 0.87 0.43 4.78 0 3.04 3.32 0. 378 мкМ + стифун Примечание: 1) ИАКТ – индекс аберраций кластогенного типа;
2) ФЭА – фактор эффективности антимутагенеза Следует отметить, что при установлении зависимости «доза-эффект» и «время-эффект» на растениях лука-батуна выявлено предотвращение стифуном в определенной степени обусловленного действием исследованных концентраций кадмия уменьшения митотической активности меристематических клеток. Применение биорегуляторов стабилизировало ФИ в условиях негативного действия Cd.
Таблица 3. Влияние регуляторов роста стифуна (3.3 мг/л) и эпина-экстра (0. мл/л) на спектр структурных аберраций хромосом (%) в клетках корневой меристемы лука-батуна сорта Русский зимний при действии ацетата кадмия (37. мкМ) при установлении зависимости «время-эффект»
Число нарушений на проанализированных анафаз фрагменты мосты отста Варианты ИАКТ ФЭА вания хрома- хромо одиноч двой- хромо сом тидные ные ные сом ные 18 ч контроль 0.71 0.36 0.53 0.53 2.65 - стифун 0.17 0.28 0.50 0.17 1.95 0.36 0. эпин-экстра 0.22 0 0.44 0.44 2.22 0.30 0. ацетат кадмия 1.14 0.73 3.68 0.92 2.74 3.04 ацетат кадмия + 0.26 0.13 0.26 0 2.84 0.31 0. стифун ацетат кадмия + 0.63 0 0.39 0.15 2.55 0.55 0. эпин-экстра 36 ч контроль 0.45 0.15 1.45 0.30 3.89 - 0.16 0 0.25 0 2.74 0.46 0. стифун 0.30 0 0.92 0.31 2.80 0.26 0. эпин-экстра ацетат кадмия 0.89 0.51 2.68 0.89 9.31 2.11 ацетат кадмия + 0.24 0 0.24 0.24 3.36 0.31 0. стифун ацетат кадмия + 0.39 0 0.79 0.20 3.55 0.59 0. эпин-экстра 54 ч контроль 0.58 0 0.69 0.28 5.39 - 0.21 0 0.32 0.21 2.80 0.49 0. стифун 0.26 0 0.51 0.23 3.88 0.30 0. эпин-экстра ацетат кадмия 1.20 0.50 1.70 1.00 9.00 2.84 ацетат кадмия + 0.33 0.33 0.33 0 3.31 0.64 0. стифун ацетат кадмия + 0.85 0 0.85 0.14 2.40 1.19 0. эпин-экстра Примечание: 1) ИАКТ – индекс аберраций кластогенного типа;
2) ФЭА – фактор эффективности антимутагенеза При исследовании корреляционных зависимостей между митотическим индексом и частотой клеток с аберрациями при модификации цитогенетического действия ацетата кадмия изучаемыми биорегуляторами для вариантов «доза-эффект» (рис. 5 А), «время-эффект» (рис. 5 Б, В) выявлено, что митотический индекс линейно возрастал, при этом количество аберрантных клеток снижалось (рис. 5). Коэффициент линейной корреляции (r) составил для стифуна (0.33 мг/л) –0.81 («доза-эффект») и –0.88, –0.79 для стифуна (3.3 мг/л) и эпина-экстра (0.03 мл/л), соответственно («время-эффект»). Значения коэффициентов корреляции для исследованных зависимостей при действии биорегуляторов указывают на наличие отрицательной высокой силы корреляционной связи между митотическим индексом и частотой клеток с аберрациями.
Частота аберрантных клеток, % Частота клеток с аберрациями, % 20 15 10 8 y = -3,22x + 41,1 6 y = -1,96x + 23, 5 2 R = 0,6525 2 R = 0, 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 А Б Митотический индекс, % Митотический индекс, % Рис. 5. Зависимость между митотическим индексом и частотой клеток с Частота аберрантных клеток, % аберрациями при модификации цито 20 генетического действия ацетата кадмия стифуном (А, Б), эпином-экстра (В):
(А) - «доза-эффект»:
10 1 – контроль, 2 – стифун, 3 - ацетат кадмия y = -1,82x + 22,1 (3.78 мкМ), 4 – ацетат кадмия (3.78 мкМ) 5 + стифун, 5 - ацетат кадмия (37.8 мкМ), R = 0, 6 – ацетат кадмия (37.8 мкМ) + стифун, 0 7 - ацетат кадмия (378 мкМ), 8 – ацетат 12 кадмия (378 мкМ) + стифун.
0 2 4 6 8 (Б) - «время-эффект», фиксация на 18-й, В Митотический индекс, % 36-й, 54-й ч.
(В) - «время-эффект», фиксация на 18-й, 36-й, 54-й ч.
Корреляционные зависимости, полученные в наших опытах, весьма сходны с описанными ранее в других работах [Серебряный, Зоз, 2002;
Серебряный и др., 2005], посвященных исследованию феноменов антимутагенеза и адаптивного ответа у растений при модификации действия мутагенных факторов антиоксидантами амбиолом, анфеном, феноксаном, на основе результатов которых исследователи заключили, что независимо от момента воздействия антимутагена снижение фиксированной частоты мутаций может происходить по механизму стимулируемой репопуляции.
Уровень фитогормонов в растениях пшеницы при применении стифуна в условиях стрессового действия кадмия Длительная экспозиция растений пшеницы на растворе ацетата кадмия высокой концентрации приводила к значительному гормональному дисбалансу (рис. 6).
Аце тат кадмия Ацетат кадмия+стифун 1 2 3 4 5 6 7 % от контроля корни 1 2 3 4 5 6 7 % от контроля побеги Рис. 6. Изменение уровня фитогормонов при действии ацетата кадмия (500 мкМ) и стифуна (3.3 мг/л) в растениях пшеницы: 1 – ИУК, 2 – АБК, 3 – зеатин, 4 – дигидрозеатин, 5 – дигидрозеатинрибозид, 6 – зеатинрибозид, 7 – изопентениладенин, 8 – изопентениладенозин.
Применение стифуна в этих условиях способствовало некоторому увеличению уровней зеатина и дигидрозеатинрибозида как в корнях, так и в листьях, происходило снижение в корнях и возрастание в листьях дигидрозеатина, содержание изопентениладенина в листьях возрастало до уровня контроля (рис.
6). При действии стифуна в этом опыте наблюдалась тенденция предотвращения обусловленного действием кадмия снижения сухой массы корней и побегов. В литературе обсуждается протекторная роль эндогенных цитокининов [Веселов, Фахрисламов, 1999;
Veselov et al., 2003;
Кобылецкая, Терек, 2005] и их синтетических аналогов, обладающих цитокининовой активностью [Бессонова, 1992;
Башмаков, 2001;
Aldesuquy et al., 2006;
Лукаткин и др., 2007] в условиях токсического действия тяжелых металлов.
Следует отметить, что, как было показано, стифун способствовал поддержанию более высокого уровня цитокининов в корнях пшеницы в условиях ПЭГ индуцируемого дефицита влаги и хлоридного засоления [Яхин, 1999].
Гистохимическая оценка распределения кадмия в тканях растений кукурузы и риса при действии регуляторов роста Ингибирование роста клеток растяжением может быть обусловлено снижением пластичности клеточных оболочек в результате накопления в них тяжелых металлов [Серегин, Иванов, 2001]. Полученные нами данные по предотвращению ингибирования роста клеток растяжением при действии стифуна в условиях кадмиевого стресса могли быть обусловлены снижением поступления Cd в растения. В литературе обсуждается возможность модификации поглощения тяжелых металлов биологически активными веществами [Башмаков, 2002;
Choudhury, Panda, 2004]. Мы оценили распределение Cd в растениях при действии регуляторов роста. Характер распределения металла в виде окрашенных комплексов дитизоната кадмия через 1 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч в живых тканях кукурузы (зона деления, растяжения, дифференциации) при гистохимическом исследовании локализации Cd в наших экспериментах соответствовал результатам, полученным ранее Серегиным и Ивановым (1997) на том же объекте. При экспозиции растений на растворе ацетата кадмия в вариантах с применением стифуна, эпина-экстра, салициловой кислоты во всех зонах корней выявлялось существенно меньшее количество и размеры преципитатов дитизонатов кадмия по сравнению с действием только кадмия (рис. 7).
Б А Г В Д Е Рис. 7. Локализация кадмия в корнях кукурузы при предобработке биорегуляторами 2–суточных проростков в течение 1 ч.
А. Экспозиция на растворе ацетата кадмия (378 мкМ) в течение 24 ч (зона растяжения);
Б. ацетат кадмия (378 мкМ) + эпин-экстра (500 мкл/л).
В Экспозиция на растворе ацетата кадмия (378 мкМ) в течение 48 ч (зона растяжения);
Г. ацетат кадмия (378 мкМ) + стифун (33 мг/л).
Д. Экспозиция на растворе ацетата кадмия (378 мкМ) в течение 48 ч (зона дифференциации). Е. ацетат кадмия (378 мкМ) + салициловая кислота (0.1 мМ).
Обозначения: ВК – внутренняя кора;
НК – наружная кора;
Э – эндодерма;
П – перицикл;
ПК – протоксилема;
МК – метаксилема;
Ф – флоэма. Стрелками обозначена локализация преципитатов дитизонатов кадмия. х320.
Следует отметить, что хотя гистохимический метод позволяет проводить оценку локализации ионов металлов в различных тканях растений, в то же время для количественного определения их содержания необходимо использование других методов.
Аккумуляция кадмия у растений кукурузы, пшеницы, риса при применении регуляторов роста В той же постановке экспериментов, где применяли гистохимический подход, мы провели количественное определение содержания ТМ с использованием метода атомно-абсорбционной спектрофотометрии. В вариантах опытов с применением стифуна, салициловой кислоты содержание Cd в корнях 4 сут растений кукурузы при 48 ч экспозиции на растворе ацетата кадмия было меньше на 17%. В другой постановке опытов оценивали влияние биорегуляторов на накопление Cd в растениях кукурузы в динамике (рис. 8 А, Б).
% от контроля % от контроля 60 побег 40 побег корни 20 корни 24 48 72 A Б 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч ч ч ч ч Рис. 8 Влияние биорегуляторов на содержание Cd в растениях кукурузы. Контроль – экспозиция растений на растворе ацетата кадмия (378 мкМ) без биорегуляторов.
А - экспозиция растений на растворе ацетата кадмия (378 мкМ) и стифуна (33 мг/л).
Б - ацетата кадмия (378 мкМ) и эпина-экстра (0.03 мл/л).
% от контроля % от контро ля 40 побег 40 побег корни корни 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч А 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч Б Рис. 9. Влияние биорегуляторов на содержание Cd в растениях пшеницы при экспозиции растений на растворе ацетата кадмия (378 мкМ). Контроль – экспозиция растений на растворе ацетата кадмия (378 мкМ) без биорегуляторов, А стифун (33 мг/л), Б - эпин-экстра (0.03 мл/л).
При действии стифуна выявлялась выраженная тенденция снижения концентрации Cd в корнях кукурузы. В побегах изменения в уровне Cd при действии стифуна были более выражены, его концентрация была существенно меньше (рис. 8 А).
При предобработке в течение 1 часа стифуном (рис. 9 А), эпином-экстра (рис. 9 Б) проростков пшеницы через 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч экспозиции на растворе ацетата кадмия отмечалось меньшее накопление Cd как в побегах, так и в корнях.
Влияние регуляторов роста на экспрессию гена фитохелатинсинтазы (PCS1) риса при действии ацетата кадмия Растения имеют развитые системы защиты, обеспечивающие эффективную детоксикацию ионов Cd2+ путем образования комплексов и секвестрации их в вакуоль [Heiss et al., 2003]. Важную роль в этих процессах играют фитохелатины – пептиды, синтез которых осуществляется фитохелатинсинтазами, кодируемыми соответствующими генами, опосредующими детоксикацию металлов [Clemens et al., 1999].
А № цикла ПЦР Б Рис. 10. Влияние стифуна на экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса. А - Кривые амплификации: 1- положительный контроль;
2 – стифун (экспозиция 1 ч);
3 – негативный контроль;
4 -ДНК риса. Б – кривые плавления для данных вариантов, соответственно.
Рис. 11. Влияние стифуна на экспрессию гена фито хелатинсинтазы риса сорта Рапан при экспозиции на растворе ацетата кадмия (378 мкМ) в течение 1. часа. Кривые амплифи кации: 1, 2. - стифун (корни, побеги);
3. ацетат кадмия + стифун (корни);
4. положи тельный контроль (побеги);
5. положительный контроль (корни);
6. ацетат кадмия (побеги);
7. ацетат кадмия (корни);
8. ацетат кадмия + № цикла ПЦР стифун (побеги);
9. отрица тельный контроль.
В отсутствие действия кадмия применение стифуна (рис. 10) и эпина экстра практически не вызывало изменения экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса (PCS1). При действии ацетата кадмия экспрессия гена PCS1 возрастала как в побегах, так и корнях (рис. 11). При действии стифуна при экспозиции растений на растворе ацетата кадмия отмечался сходный с контролем профиль экспрессии гена PCS1 (рис. 11), следует отметить уменьшение накопления металла (на 54%) в проростках при применении биорегулятора.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что механизм рострегулирующего действия стифуна, проявляющегося в усилении интенсивности деления и растяжения клеток, наряду с изменениями уровней фитогормонов АБК и ИУК сопряжен и с увеличением содержания отдельных форм цитокининов:
изопентениладенозина, зеатина, зеатинрибозида, дигидрозеатинрибозида в корнях и дигидрозеатинрибозида в побегах.
2. Установлено увеличение количества и объема ядрышек меристематических клеток пшеницы при действии стифуна, что свидетельствует об активации биорегулятором синтеза рРНК.
3. Выявленные изменения содержания отдельных свободных аминокислот у растений пшеницы при применении стифуна свидетельствуют о повышении адаптивного потенциала растений к стрессовым факторам и, в том числе, – к токсическому действию кадмия.
4. Стифун уменьшает ингибирующее действие кадмия на рост растений пшеницы, а также предотвращает снижение уровня отдельных форм цитокининов, вызванное действием ионов металла.
5. Стифун и эпин-экстра проявляют протекторное действие на растениях Allium fistulosum, выражающееся в уменьшении кластогенного и анеугенного эффектов кадмия, при их применении как до его воздействия, так и при совместной экспозиции с ацетатом кадмия.
6. Впервые с использованием гистохимического метода показано, что при действии стифуна, эпина-экстра и салициловой кислоты происходит модификация распределения кадмия в тканях корней кукурузы и риса при экспозиции на растворе ацетата кадмия, приводящая к уменьшению количества комплексов дитизонатов кадмия и их размеров. Уменьшение накопления ионов кадмия при действии биорегуляторов подтверждено методом атомно абсорбционной спектрофотометрии.
7. Установлено, что обработка стифуном не вызывает изменения экспрессионной активности гена фитохелатинсинтазы PCS1 в проростках риса, но снижает уровень его транскрипции, индуцированный кадмием, что может быть связано с установленным меньшим уровнем накопления кадмия в растениях при действии биорегулятора.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Яхин О.И., Архипова Т.Н., Лубянов А.А. Влияние новых биорегуляторов на рост растений Lactuca sativa L. // Тез. докл. 2 Всеукраинской конференции молодых ученых. Харьков. Украина. 2001. С. 38 – 39.
2. Яхин О.И., Лубянов А.А. Физиологическая активность новых биорегуляторов // Тез. докл. Международной конференции «Стедентська молодь і науковий прогрес в АПК». Львов. Украина. 2001. С.59 – 60.
3. Яхин О.И., Лубянов А.А. Исследование физиологической активности новых полифункциональных биорегуляторов // 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. Т. 3. Пущино. 2002. С. 249.
4. Yakhin O.I., Yakhin I.A., Lubyanov A.A. “ALLY-1” as an element of ecologically safe technology of crop protection. In the Book of Abstracts of 10th IUPAC International Congress on the Chemistry of Crop Protection. Basel. Switzerland.
2002. P. 56.
5. Yakhin O.I., Yakhin I.A., Fatkhutdinova R.A., Yumaguzhin M.S., Lubyanov A.A.
Effects of naturally occurring bioregulators on cereals. In the Book of Abstracts of 13th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology.
Hersonissos. Heraclion. Crete. Greece. 2002. P. 260.
6. Яхин О.И., Яхин И.А., Фатхутдинова Р.А., Юмагужин М.С., Лубянов А.А., Вахитов В.А. «Влияние регуляторов роста на морфо-физиологические и цитогенетические параметры растений» // Тез. докл. конференции «Актуальные проблемы генетики». Москва, 2003. C.
7. Яхин О.И., Яхин И.А., Лубянов А.А., Багаутдинов Ф.Я., Зигануров Р.М., Туктаров М.Ф., Азанова-Вафина Ф.Г. Комплексное применение удобрений и регуляторов роста растений для обеспечения стабильной продуктивности пшеницы // «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО». Уфа. 2003. Ч. 2. С. 97-99.
8. Яхин И.А., Яхин О.И., Лубянов А.А. Разработка и механизмы действия препаративных форм антистрессовых биорегуляторов на основе биологически активных веществ растительного происхождения // V съезд общества физиологов растений России. Пенза. 2003. С. 364-365.
9. Яхин И.А., Яхин О.И., Лубянов А.А., Юмагужин М.С., Фатхутдинова Р.А.
Физиолого-биохимические аспекты действия кадмия на растения Triticum aestivum L. // V съезд общества физиологов растений России. Пенза. 2003. С.
365.
10. Yakhin O.I., Yakhin I.A., Lubyanov A.A. Development and action mode study of bioregulators on the basis of natural compounds // In the Book of Abstracts II International conference on plant ontogenesis in natural and transformed environments. Physiological, biochemical and ecological aspects. L’viv. Ukraine.
2004. P. 208.
11. Яхін О.І., Яхін І.А., Лубянов А.А., Кабiров Р.Р., Ханiсламова Г.М., Кунакова Р.В., Калiмуллiна З.Ф., Черних А.Л., Яппаров I.Ф.Фізіолого-біохімічні та еколого-токсикологічні аспекти в дослідженнях біологічної активності природних біорегуляторів // Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія.
Алелопатія. Тези доповідей Міжнародної наукової конференції. Київ. 2005. С.
108.
12. Яхін О.І., Яхін І.А., Лубянов А.А., Онацкий М.М., Кабiров Р.Р., Ханiсламова Г.М., Кунакова Р.В., Калiмуллiна З.Ф., Черних А.Л., Яппаров I.Ф. Комплексне дослідження біологічної активності біорегуляторів на основі рослинної сировини // Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія: Сборник статей. Житомир: "Державний агроекологічний ун-т". 2005. С. 308-313.
13. Яхин О.И., Яхин И.А., Вахитов В.А., Лубянов А.А. К механизму действия природного биорегулятора стифуна // Доклады Академии наук. 2006. Том 411.
№ 1. С. 118-121.
14. Яхин О.И., Лубянов А.А., Постригань Б.H. Молекулярно-генетическое исследование механизмов защитного действия регуляторов роста растений в условиях кадмиевого стресса // Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва. 2006. С.224.
15. Lubyanov A.A., Yakhin O.I. Plant growth regulators have a protective effect under negative cadmium action // IV Международная научная конференция молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии». Тез. докл.
Алматы. Казахстан. 2006. С. 151.
16. Яхин О.И., Яхин И.А., Лубянов А.А., Калимуллина З.Ф., Яппаров И.Ф., Махмудияров Г.А., Маникаев Р.А., Кадыров Ф.Ф., Кунакова Р.В. Научно методологические основы создания и молекулярно-биологические аспекты функциональной активности антистрессовых биорегуляторов на основе природного сырья // VI съезд общества физиологов растений России. Т. 2.
Сыктывкар. 2007. С. 459 – 461.
17. Яхин О.И., Лубянов А.А., Яхин И.А., Вахитов В.А. Протекторная роль биорегулятора стифуна при негативном действии кадмия // Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук. 2007. № 4. С. 19-21.
18. Лубянов А.А., Постригань Б.Н., Яхин О.И. Защитный эффект эпина-экстра при Сd – стрессе // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. Уфа. 2007. С. 79 – 80.
19. Лубянов А.А., Яхин О.И., Яхин И.А. Биохимические аспекты модификации токсического действия кадмия регуляторами роста у высших растений // Материалы Международной конференции IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. 2008. С. 188.
20. Яхин О.И., Лубянов А.А., Калимуллина З.Ф., Яхин И.А., Вахитов В.А., Чемерис А.В., Гималов Ф.Р., Матниязов Р.Т. Антистрессовая активность регулятора роста растений эпина-экстра // Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук. 2009. № 3. С. 25-27.
21. Яхин О.И., Яхин И.А., Лубянов А.А., Вахитов В.А. Влияние кадмия на содержание фитогормонов и свободных аминокислот, его цитогенетическое действие и аккумуляция у культурных растений // Доклады Академии наук.
2009. Т.426. № 5.