авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы и возможности их использования

На правах рукописи

Морозова Ольга Владимировна

ЛАККАЗЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ,

ЛАККАЗА-МЕДИАТОРНЫЕ СИСТЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ

ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель доктор химических наук, профессор А.И.Ярополов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская доктор химических наук И.Н.Курочкин

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится «5» декабря 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « 2 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с ужесточением требований к экологической безо пасности химических процессов все большие масштабы приобретает использова ние биокаталитических технологий в промышленности. Промышленное получе ние биокатализаторов на основе технических ферментов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2004 году составил почти 1, миллиарда долларов.

В промышленных биокаталитических процессах широко используются раз личные ферменты. Особый интерес представляет лакказа, которая способна ката лизировать реакции окисления широкого круга органических веществ молекуляр ным кислородом. Каталитические и электрокаталитические свойства лакказы дают возможность ее широкого использования в целлюлозно-бумажной промышленно сти для делигнификации бумажной пульпы, в текстильной промышленности для отбеливания тканей, для детоксикации и обесцвечивания сточных вод, для биоде градации ксенобиотиков, для создания антимикробных композиций, в пищевой и косметической промышленности, при получении древесноволокнистых плит без применения токсичных связующих, при производстве моющих средств, при раз работке катодов биотопливных элементов и других областях [Durn et al., 2002;

Mayer & Staples, 2002;

Cuoto & Herrera, 2006]. Так, например, фирма «Novozymes»

(Дания) выпускает на основе лакказы коммерческие препараты для отбеливания и обработки текстильных изделий, делигнификации бумажной пульпы и обработки корковой пробки [http://www.novozymes.com].

Помимо использования лакказ в различных биотехнологических процессах этот фермент представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных иссле дований его структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением актив ного центра лакказ, в который входят четыре иона меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе ферментативного окисле ния субстратов позволяет осуществлять восстановление молекулярного кислорода до воды, минуя стадию образования пероксида водорода.

Интерес к практическому использованию лакказ возрос после открытия соеди нений «усиливающих» действия фермента, так называемых медиаторов [Bourbonnais, Paice, 1990]. Это позволило существенно расширить область их практического применения. Таким образом, создание высокоэффективных лакка за-медиаторных систем (ЛМС) для использования в биотехнологии является в на стоящее время весьма актуальным.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в сравнении свойств лакказ, выделенных из различных базидиальных грибов, для установле ния сходства и различий их физико-химических характеристик, а также поиск ре докс-медиаторов этих ферментов с целью создания эффективных ЛМС. Для дос тижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести в одинаковых условиях сравнение основных физико-химических ха рактеристик лакказ базидиальных грибов Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima с целью выявления наиболее стабиль ного, высокопотенциального и каталитически активного фермента 3. Разработать схему отбора потенциальных редокс-медиаторов лакказ 4. Найти соединения, которые наиболее полно отвечали бы требованиям, предъяв ляемым в настоящее время к медиаторам лакказ 5. Провести апробацию лакказа-медиаторных систем на примере делигнификации лигноцеллюлозы.

Научная новизна работы. Проведенные исследования позволили впервые срав нить в одинаковых условиях биохимические и электрокаталитические свойства лакказ, выделенных из культуральных жидкостей различных родов и видов бази диальных грибов.

Предложена схема отбора потенциальных медиаторов лакказ и эксперимен тальные методы их тестирования, что значительно облегчает поиск новых медиа торов фермента.

Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-3-метил-пира золоны-5 и показана возможность использования сульфопроизводных 1-фенил-3 метил-пиразолона-5 в процессе делигнификации лигноцеллюлозы.

Практическая ценность работы. Впервые в одинаковых условиях проведено комплексное сравнительное изучение лакказ, выделенных из различных источни ков. Показано, что все исследованные грибные лакказы относятся к высоко редок спотенциальным ферментам и являются высокоактивными как в гомогенных ре акциях окисления субстратов-доноров, так и в гетерогенных электрохимических реакциях восстановления дикислорода. Разработана схема отбора органических соединений с целью выявления новых медиаторов лакказ. Найден новый класс со единений – 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые отвечают многим требовани ям, предъявляемым в настоящее время к медиаторам (усилителям действия фер ментов), а именно низкая стоимость, экологическая чистота и достаточно высокая эффективность. В работе показано, что сульфопроизводные 1-фенил-3-метил пиразолона-5 могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ при ферментативной деградации ксенобиотиков, в частности лигниноподобных ве ществ. Группа соединений класса 1-фенил-3-метил-пиразолон-5 весьма многочис ленна, и введением того или иного заместителя можно добиться значительного улучшения медиаторных свойств конкретного соединения. Проведены лаборатор ные испытания ЛМС для делигнификации бумажной пульпы.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на конференции «Biocatalysis-2002».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 7 статей в ведущих российских и международных научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора лите ратуры, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуж дения, выводов и списка цитируемой литературы (278 наименований). Работа из ложена на 139 страницах и содержит 40 рисунков и 11 таблиц.

Сокращения, принятые в тексте. ЛМС – лакказа-медиаторная система;

ABTS – диаммониевая соль 2,2’-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой) кислоты;

HABA – 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота;

HBT – 1-гидроксибензотриазол;

HPI – N-гидроксифталеимид;

PP – 1-фенил-3-метилпиразолон-5;

PPA – 1-фенил 2,3-диметил-4-аминопиразолон-5;

PPA-Na – 1-фенил-3-метил-4-метиламино пиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия;

mSPP – 1-(3’-сульфофенил)-3-метил пиразолон-5;

pSPP – 1-(4’-сульфофенил)-3-метил-пиразолон-5;

VA – вератровый спирт.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена ак туальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из трех частей. В первой части рассматривается строение, свойства и каталитический механизм действия лакказ. Во второй части описаны основные усилители действия лакказ и лакказа медиаторные системы. В третьей части рассмотрены возможности использования лакказ и лакказа-медиаторных систем в биотехнологии.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

В работе использовали лакказы, выделенные из культуральных жидкостей базиди альных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Определение молекулярной массы лакказ проводили методом градиентного электрофореза в денатурирующих условиях. Содержание ионов меди определяли бихинолиновым методом [Broman et. al., 1962], а также методом лазерной масс-спектрометрии [Maganadze & Shutyaev, 1993]. Спектральные исследования лакказ проводили с использованием спектрофотометра Coulter DU-650 («Beckman», Германия), спек трофлуофотометра RF-5301 PC («Shimadzu», Япония), ЭПР-спектрометра ESC- («Bruker», Германия). Определение потенциала Т1 центра лакказ осуществляли методом окислительно-восстановительного титрования, используя в качестве ме диаторной пары октоцианомолибдат (IV) и (V) калия [Dutton, 1978;

Xu et al., 1996b]. Определение рН-оптимума и каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых лакказами, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Циклические вольтамперограммы записывали на анализаторе CV 50W («BAS», США) работающем в трехэлектродном режиме (рабочие электроды – стеклоуглерод и спектральный графит, электрод сравнения – хлорсеребряный электрод, вспомогательный электрод – платиновая проволока). Спектральные ис следования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей, проводили на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония). Для анализа продуктов окисления вератрового спирта (VA) лакказа-медиаторными системами использовали метод гидрофобной обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления.

Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени удерживания на колонке;

их количество в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром” (Россия).

В третьей главе представлены собственные результаты.

Выделение и основные физико-химические свойства лакказ Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima Из культуральных жидкостей базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima были выделены в гомогенном состоянии лакказы, ос новные биохимические характеристики которых представлены в Таблице 1. Как видно из таблицы все изученные лакказы являются гликопротеинами, имеют оп тимум рН (при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина) в ин тервале 3.5-5.2, значения их изоэлектрических точек находятся в кислой области рН. Как и большинство описанных в литературе лакказ, эти ферменты содержат иона меди на 1 молекулу белка. Необходимо отметить, что все изученные лакказы обладают высокой термостабильностью (сохраняют до 50% первоначальной ак тивности через 52-65 часов инкубации при 50оС), что является важным условием для их использования в биотехнологических процессах.

Таблица 1. Некоторые биохимические характеристики лакказ pH-оптимум* Углеводы, % Т1/2**, ч Мм, кДа pI 70 ± 2 4.2 ± 0.1 3.5-4.5 12 T. hirsuta 64 ± 2 4.7 ± 0.1 3.7-4.9 10 T. ochracea 67 ± 2 3.5 ± 0.1 3.5-4.5 13 C. maxima 65 ± 2 3.5 ± 0.1 3.9-5.2 32 C. fulvocinerea * При использовании в качестве субстрата-восстановителя пирокатехина ** Время полуинактивации при 50оС Были определены кинетические параметры реакций, катализируемых этими лакказами для некоторых органических субстратов и ферроцианида калия (Табл. 2). Как видно из таблицы, лакказа T. hirsuta обладала наиболее высокими значениями каталитических констант по отношению к органическим субстратам.

В то же время, лакказа C. maxima показала наибольшее значение kкат при окисле нии ферроцианида калия.

Таблица 2. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами* T. hirsuta T. ochracea C. maxima C. fulvocinerea Субстрат kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c- пирокатехин 390 142 2.75 80 110 0.73 320 120 2.67 90 85 1. гваякол 430 63 6.83 90 90 1.00 300 160 1.88 95 70 1. синаповая кислота 580 24 24.17 170 11 15.45 330 24 13.75 140 21 6. K4Fe(CN)6 400 180 2.22 150 96 1.56 450 115 3.91 130 170 0. * кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам Оптимум рН для всех изученных лакказ был приблизительно одинаков и нахо дился в интервале рН 3.5–5.0 при использовании в качестве субстрата-донора пи рокатехина (Рис. 1А), а кривая зависимости активности от рН раствора имела ко локолообразную форму. При использовании ферроцианида калия активность фер ментов монотонно падала при изменении рН раствора от 2.5 до 5.5 (Рис. 1Б). Та ким образом, рН-профили активности всех изученных лакказ, при использовании в качестве субстратов как органического, так и неорганического соединения, не отличались от таковых для других лакказ, описанных в литературе.

А Рисунок 1. Зависимость начальной скорости восстановления лакказами молекулярного кислорода от рН реакционной смеси, при использовании V0, мМ О2 /(мин·мг) в качестве субстрата пирокатехина (А) и K4[Fe(CN)6] (Б):

2.5 3.5 4.5 5.5 6. 1 – T. hirsuta, 2 – T. ochracea, 3 – C. fulvocinerea, 4 – C. maxima.

120 Б Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер;

концентрация пирокатехина – 2мМ, K4[Fe(CN)6] – 10 мМ;

концентрация ферментов в реакционной смеси:

(А) 3.3·10-8М (1), 3.2·10-8М (2), 3.8·10-8М (3), 3.4·10-8 М (4);

(Б) 1.3·10-8 М (1,2), 1.5·10-8 М (3), 1.4·10-8 М (4).

2 3 4 5 рН С точки зрения фундаментальных исследований большой интерес представляет структура лакказ и механизма катализа. Активный центр лакказ содержит 4 иона меди, которые подразделяют на три типа по их спектроскопическим характери стикам: Т1 центр – характеризующийся полосой оптического поглощения в облас ти 600 нм и слабым сверхтонким расщеплением в спектрах ЭПР;

Т2 центр – не ви димый на спектрах поглощения, но характеризующийся на спектрах ЭПР сверх тонким расщеплением;

Т3 центр – биядерный диамагнитный медный центр, кото рый может быть идентифицирован на спектрах оптического поглощения по плечу в области 330 нм.

Cпектры поглощения всех изученных в настоящей работе ферментов (Рис. 2) оказались типичными для «голубых» лакказ, описанных в литературе и выделен ных из других базидиальных грибов. В них присутствовали сигналы меди Т1 цен тра (пик поглощения на 610 нм) и биядерного комплекса меди Т3 (плечо в области 330 нм).

Спектры ЭПР, характеризующие ионы меди Т1 и Т2 центров изученных лакказ, имели сходные характеристики (Рис. 3).

1. 0. 1. Рисунок 2. Спектры оптического поглощения лакказ 1. Поглощение, о.е.

1 – T. hirsuta, 0. 2 – T. ochracea, 3 – C. maxima, 0. 4 – C. fulvocinerea.

0. Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0);

500 550 600 650 700 750 800 длина светового пути 1 см;

скорость 0. сканирования 120 нм/мин;

t = 20°С;

концентрация ферментов ~ 1 мг/мл 0.2 250 350 450 550 650 750, нм Рисунок 3. ЭПР-спектры лакказ T1 Cu 20 мT 1 – T. hirsuta, 2 – T. ochracea, 3 – C. maxima, 4 – C. fulvocinerea.

Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0);

температура 77оК;

Х-диапазон, микроволновая мощность 20 мВ;

амплитуда модуляции 0.5 мТ;

концентрация ферментов ~ 1 мг/мл.

T2 Cu На Рис. 4 представлены спектры возбуждения (I) и излучения (II) флуоресцен ции исследованных лакказ, записанные при комнатной температуре. Возбуждение в области биядерного медного центра (330 нм) приводит к эмиссии при 432, 438, 436 и 443 нм для лакказ T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima, соот ветственно. Необходимо отметить, что эти спектры не сильно различаются между собой и хорошо согласуются с литературными данными [Shin et al., 2000].

II I 4 Рисунок 4. Спектры возбуждения (I) и Интенсивность флуоресценции излучения флуоресценции (II) лакказ 1 – T. hirsuta, 2 2 – T. ochracea, 3 – C. maxima, 4 – C. fulvocinerea.

Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0);

t = 20°С;

концентрация ферментов ~ 1 мг/мл;

300 350 400 450, нм Спектральные характеристики Т1, Т2 и Т3 центров лакказ, полученные на осно вании данных спектрофотометрии, ЭПР-спектроскопии и флуоресценции пред ставлены в Таблице 3.

Таблица 3. Спектральные характеристики Т1, Т2 и Т3 центров лакказ T1 T2 T (спектрофотометрия и ЭПР) (ЭПР) (флуоресценция) Максимум Максимум Максимум g|| A|| g|| A|| (10-4 см-1) -4 - поглощения (10 см ) испускания возбуждения (нм) (нм) (нм) 607 2.19 95 2.26 186 418 T. hirsuta 608 2.20 94 2.24 194 422 T.ochracea 607 2.18 94 2.24 193 425 C. maxima 607 2.18 94 2.23 210 418 C. fulvocinerea В результате проведенных исследований были определены основные физико химические характеристики ферментов и спектральные характеристики ионов ме ди, входящих в состав активного центра лакказ, выделенных из культуральных фильтратов базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Показано сходство биохимических и спектральных параметров иссле дованных ферментов.

Определение потенциала Т1 центра лакказ.

Одной из основных характеристик лакказ является стандартный окислительно восстановительный потенциал Т1 центра ферментов. Значения этого потенциала варьируются у различных лакказ от 430 до 790 мВ отн. НВЭ [Solomon et al., 1996;

Shleev et al., 2005b]. T1 центр фермента является первичным акцептором электро нов, поступающих от субстратов-восстановителей. Непосредственно лакказы окисляют только те соединения, окислительно-восстановительный потенциал ко торых не превышает или превышает незначительно редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента [Xu, 1997]. Кроме того, от редокс-потенциала Т1 центра зави сит эффективность катализа для большинства субстратов лакказ, что делает лакка зы с высокими потенциалами Т1 центра весьма перспективными объектами для биотехнологических целей, например, для обесцвечивания бумажной пульпы, биоремедиации и деградации различных ксенобиотиков. Определение редокс по тенциалов ионов меди первого типа лакказ было необходимо для выявления наи более высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях окисления субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных интермедиатов, что весьма важно при проведении биотехнологических процессов.

В качестве примера на Рис. 5 представлены спектры поглощения растворов лакказы T. hirsuta, записанные в процессе окислительно-восстановительного тит рования. Аналогичные данные были получены при окислительно восстановительном титровании лакказ T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima.

Восстановление Т1 медного центра сопровождалось уменьшением пика поглоще ния в области 610 нм.

1. 0. Рисунок 5. Спектры 1. lg[(A/(A0-A)] потенциометрического титрования 2 0. в анаэробных условиях Т1 центра 0. 0. лакказы T. hirsuta.

-0. Поглощение, опт. ед.

Вставка: Кривая титрования в -1. 760 780 800 820 840 полулогарифмических координатах.

0.030 E, mV A0 и A – поглощение при 610 нм растворов окисленной и частично восстановленной лакказы.

0. Условия: 0.1 М фосфатный буфер, рН 6.0;

1- фермент (7 мкМ) и 2 мМ K3Mo(CN)8;

2-6 - добавление к исходному раствору 0. K4Mo(CN)8 до конечной концентрации 2 мМ.

0. 500 600 700, нм Основные электрохимические характеристики Т1 центров изученных лаккказ представлены в Таблице 4. Как видно из таблицы, тангенс угла наклона прямой титрования составляет 49, 56 и 57 мВ для лакказ T. hirsuta, C. maxima и C. fulvocinerea, соответственно, что позволяет предположить факт одноступенча того, одноэлектронного процесса восстановления иона меди первого типа. Это хо рошо согласуется с литературными данными, полученными для лакказ из других источников.

Таблица 4. Электрохимические характеристики Т1 центра лакказ Потенциал Т1 центра, Тангенс угла наклона Лакказа мВ кривой титрования, мВ 790 ± 10 32 ± T. ochracea 780 ± 10 49 ± T. hirsuta 750 ± 5 56 ± C. maxima 780 ± 10 57 ± C. fulvocinerea Примечание: потенциалы приведены относительно нормального водородного электрода В то же время тангенс угла наклона прямой титрования лакказы T. ochracea составляет 32 мВ, что формально указывает на возможность протекания двухэлек тронного процесса восстановления фермента. Однако, даже в случае одноэлек тронного редокс-процесса, уменьшение угла наклона линейного участка кривой титрования может быть связано с наличием в процессе реакции стадии, не отно сящейся непосредственно к восстановлению иона меди.

Таким образом, все изученные лакказы относятся к высокопотенциальным ферментам и благодаря высокому редокс потенциалу Т1 центра являются высоко активными в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров. Электрохими ческие исследования лакказ представляют интерес для понимания механизма ка тализа и возможности использования этих ферментов в гетерогенных биоэлектро каталитических системах.

Биоэлектрокаталитические свойства лакказ Методами циклической вольтамперометрии исследованы прямые (безмедиа торные) электрохимические реакции восстановления дикислорода с участием лак каз T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima, адсорбированных на элек тродах из спектрального графита. В аэробных условиях для всех исследованных лакказ показана возможность прямого электронного переноса с электрода на фер мент с последующим восстановлением молекулярного кислорода. На Рис. 6 пред ставлены циклические вольтамперограммы немодифицированных и модифициро ванных лакказами электродов из спектрального графита в насыщенных кислоро дом буферных растворах.

При адсорбции на электродах все лакказы сильно уменьшали перенапряжение реакции электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Необходимо отметить, что для лакказы C. fulvocinerea наблюдалась более низкая электроката литическая активность по сравнению с другими изученными ферментами, в то время как ее активность в гомогенном растворе (Табл. 2) сравнима с активностью других лакказ. Возможно, это объясняется высоким (32%) содержанием углеводов в лакказе C. fulvocinerea, что может оказывать влияние на ориентацию молекул фермента на поверхности электрода, а также затруднять перенос электрона с элек трода на Т1 центр фермента.

Как видно из Рис. 6, начало электровосстановления дикислорода на электро дах, модифицированных лакказами, находится в области 800 мВ, то есть сущест вует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов (Табл. 4) и началом ре акции электровосстановления дикислорода на электроде. Таким образом, все изу ченные в работе лакказы могут быть использованы в качестве катализаторов для создания катода биотопливного элемента.

15 T. ochreacea T. hirsuta 10 Рисунок 6.

Ток, мкА Ток, мкА Электровосстановление - - - - молекулярного кислорода 2 - - на немодифицированных (1) - - и модифицированных (2) - - лакказами электродах из -50 150 350 550 750 950 -50 150 350 550 750 950 Е, мВ (отн.НВЭ) Е, мВ (отн.НВЭ) спектрального графита.

C. fulvocinerea C. maxima Условия: насыщенный кислородом 50 мМ цитратно 5 1 Ток, мкА фосфатный буфер (рН 3.0);

Ток, мкА 0 скорость развертки потенциала – -5 - 2.

10 мВ/с;

- - стартовый потенциал – 1100 мВ - - - - - - -50 150 350 550 750 950 -50 150 350 550 750 950 Е, мВ (отн.НВЭ) Е, мВ (отн.НВЭ) Принципы отбора медиаторов лакказ Первоначально медиаторами называли соединения – субстраты фермента, в ре зультате окисления которых образовывались устойчивые высокопотенциальные продукты, способные вступать в химические неферментативные реакции с други ми соединениями. При этом окисленный медиатор восстанавливался до первона чальной формы и таким образом формировался замкнутый цикл. Простейшая схе ма функционирования лакказа-медиаторных систем представлена на Рис. 7.

О2 лакказа медиаторок субстрат Рисунок 7. Принцип функционирования ЛМС Н2О лакказаок медиатор субстраток Оптимальный редокс-медиатор должен быть хорошим субстратом лакказы, его окисленная и восстановленная формы должны быть стабильны и не должны инги бировать ферментативную реакцию или инактивировать фермент, а процесс его редокс-превращения должен быть циклическим. Соединения, которые в литерату ре называют медиаторами лакказ, на самом деле ими вообще не являются или их можно отнести к медиаторам с большой натяжкой. В первую очередь это связано с низкой стабильностью образующихся интермедиатов и, как следствие, низким числом редокс-циклов. В связи с этим в литературе появился термин «enhancer», то есть усилитель действия фермента.

Принимая во внимание требования к редокс-медиаторам, была предложена схема отбора и экспериментальных методов тестирования органических соедине ний – потенциальных медиаторов лакказ, включающая 4 стадии:

1. Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необхо димости наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также –OH и –NH2 групп.

2. Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомо генных ферментативных реакциях, катализируемых лакказой.

3. Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина.

4. Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина системой медиатор/лакказа.

Первичный отбор соединений на основе их структурных формул Реакционная способность ароматических и гетероциклических соединений час то зависит от природы и положения заместителей. Влияние заместителей на окис ление этих соединений определяется как электронными эффектами, так и стериче скими факторами. Наша задача состояла в том, чтобы выбрать соединения для ис пользования в ЛМС с наилучшими каталитическими параметрами в гомогенной ферментативной реакции и оптимальными характеристиками электрохимической реакции на электроде (значение редокс потенциала, обратимость реакции). При первичном отборе усилителей необходимо учитывать, что введение в структуру соединения тех или иных заместителей должно приводить к увеличению стабиль ности образующихся в результате реакции радикалов. Окисление соединений, в структуре которых присутствует гидроксильная группа, приводит к образованию нестабильных фенокси-радикалов, способных к реакции конденсации, а наличие аминогруппы вызывает димеризацию/полимеризацию промежуточных форм со единения. Электрон-донорные заместители (алкильная, фенильная и аминогруп пы), увеличивая скорость окисления соединения и обеспечивая при этом стабиль ность образующихся радикалов, уменьшают окислительно-восстановительный по тенциал соединения. Электрон-акцепторные группы (например, карбоксильная или сульфо- группы), увеличивают окислительно-восстановительный потенциал соединения [Xu et al., 2001] и улучшают его растворимость в водных растворах.

При отборе соединений в качестве усилителей действия лакказ необходимо при нимать во внимание, что их редокс-потенциал должен быть выше 450 мВ [Bourbonnais et al., 2000], в противном случае они не могут принимать участие в окислении нефенольных подструктур лигнина.

В силу возможного масштабного коммерческого использования медиаторов, эти соединения должны быть доступны и иметь при этом низкую стоимость. По иск нетоксичных гетероциклических соединений показал, что одним из наиболее перспективных классов органических соединений, которые могли бы использо ваться в качестве медиаторов лакказ, являются соединения с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые производятся в промышленных масшта бах и имеют низкую себестоимость. Одним из наиболее известных соединений данного класса является метамизол натрия или анальгин (PPA-Na), который ис пользуется в медицинской практике в качестве обезболивающего средства.

1-Фенил-3-метил-пиразолоны-5 (в дальнейшем именуемые фенилметилпиразо лоны) относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в своем составе два заместителя электрон-донорной природы – метильную и фенильную группы, и присутствуют в растворе в виде двух таутомерных форм (Рис. 8).

H3C H3C C CH2 C CH Рисунок 8. Таутомерные превращения N C N C O OH N N фенилметилпиразолонов Субстратная специфичность Было исследовано около двадцати соединений различной структуры, в том числе гетероциклических, N-OH соединений и производных бензойной кислоты.

Исследования гомогенных реакций с участием лакказы T. hirsuta позволили ото брать соединения, которые могут являться усилителями действия фермента. Среди этих соединений выраженные субстратные свойства по отношению к лакказе об наружены у 1-фенил-3-метилпиразолона-5 (РР), его сульфо- (mSPP и pSPP) и ами нопроизводных (PPA и PPA-Na), а также у N-гидроксифталеимида (HPI) и 3-амино-(6-гидрокси)-бензойной кислоты (HABA). Структурные формулы этих соединений представлены на Рис. 9.

H3C H3C H3C N N N OH N OH OH N N SO3H SO3H mSPP pSPP РР 1-(4’-сульфофенил)- 1-(3’-сульфофенил) 1-фенил-3 метилпиразолон-5 3-метил-пиразолон-5 3-метил-пиразолон- Рисунок 9.

CH NH H3C H3C N Структурные CH2SO3Na N формулы N N O OH N H3C органических веществ – потенциальных медиаторов лакказ.

PPA-Na PPA 1-фенил-3-метил-4-метиламино 1-фенил-2,3-диметил 4-аминопиразолон-5 пиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия O NH C N OH HO C C O HO O HPI HABA N-гидроксифталеимид 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота Исследование зависимостей начальной скорости гомогенных ферментативных реакций от концентрации исследуемых соединений показало, что кинетика реак ций описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Для оценки эффективности взаимодействия лакказы с этими соединениями было проведено сравнение с од ним из субстратов лакказ – гидрохиноном. Результаты представлены в Таблице 4.

Как видно из таблицы, производные фенилметилпиразолона с сульфогруппой в фенильном кольце (pSPP и mSPP), либо аминогруппой в гетероцикле (PPA), явля ются субстратами, сравнимыми по своим каталитическим константам с гидрохи ноном. Эффективность процесса ферментативного окисления РР намного ниже, что, возможно, связано с его гидрофобностью.

Введение в гетероцикл фенилметилпиразолона электрон-донорных групп (ами ногруппы в положение 4 и метильной группы в положение 2) увеличивает значе ние kкаж/Kм в случае PPA более чем в 18 раз. Однако, это значение в несколько раз меньше, чем для сульфо-производных фенилметилпиразолона. В случае PPA-Na, введение заместителей (метильной и метан-сульфоновой групп) в аминогруппу мало отражается на скорости ферментативной реакции, но значение Км увеличива ется более чем в 10 раз. Возможно, более слабое взаимодействие лакказы с PPA-Na объясняется проявлением стерического фактора.

Таблица 4. Кинетические и электрохимические параметры субстратов лакказ kкаж,**с-1 Kм, мМ (kкаж/ Kм)·10-4, М-1с-1 I/Iдиф*** Соединение E1/2, мВ HQ 52.0 0.3 17.3 -20 -- PP* 9.7 2.1 0.46 430 0, mSPP 51.5 0.22 23.4 660 1, pSPP 43.9 0.29 15.0 570 0, PPA 35.1 0.41 8.66 0, PPA-Na 36.5 5.0 0.73 -- HPI* 3.6 6.0 0.06 870 2, HABA 43.4 0.28 15.5 390 -- E1/2 – потенциал полуволны окисления субстрата (скорость развертки потенциала 5 мВ/с);

Iдиф – анодный ток окисления медиатора;

I – прирост анодного тока при окислении медиатора (0.2 мМ) в присутствии VA (2 мМ).

Примечания:

Рабочие растворы содержали 2% этилового спирта ** kкаж определяли по уменьшению концентрации кислорода без учета стехиометрии реакции *** Определение I и Iдиф проводили при потенциале 1000 мВ Взаимодействие лакказы с HPI характеризуется низким сродством этого суб страта к ферменту и низкой скоростью реакции, а HABA является субстратом лак казы, сравнимым по своим кинетическим параметрам с гидрохиноном.

Электрохимические исследования промежуточных соединений, образующихся при окислении медиаторов Были проведены вольтамперометрические исследования отобранных соедине ний. В качестве примера на Рис. 10 представлены циклические вольтамперограм мы, записанные в растворах mSPP и HPI.

Рисунок 10. Циклические mSPP HPI вольтамперные кривые mSPP и HPI Ток, мкА - Условия: 0.1 М цитратно - фосфатный буфер, рН 5.0;

- концентрация медиаторов 0.2мМ;

- скорость развертки потенциала - - 4 5 мВ/с (1), 25 мВ/с (2), 100 мВ/с (3), 200 мВ/с (4).

-16 - 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 Е, мВ (отн. Ag/AgCl) На вольтамперных кривых фенилметилпиразолона и его производных наблю дались ярко выраженные токи окисления этих соединений в области потенциалов 450-660 мВ. Для PP, РРА и рSPP реакции окисления были необратимы, что под тверждалось отсутствием реакции электровосстановления на катодной ветви цик лических вольтамперограмм. На вольтамперных кривых, записанных в растворах mSPP (Рис. 10) и PPA-Na, проявлялись незначительные катодные токи, которые были в 4-6 раз меньше анодных. По-видимому, необратимость электродных реак ций для фенилметилпиразолона и его производных связана с неустойчивостью продуктов окисления и включением их в химические реакции до того, как они успевали восстановиться на электроде.

В отличие от производных фенилметилпиразолона, при высоких скоростях раз вертки потенциала система с HPI была квази-обратимой, что подтверждалось на личием на вольтамперограммах катодного пика (Рис.10). Потенциал средней точ ки между катодным и анодным пиками равен 870 мВ и его условно можно при нять за редокс потенциал этой пары. По-видимому, при низких скоростях разверт ки потенциала продукт, образующийся при окислении, был недостаточно стабилен и не успевал восстановиться на электроде. Таким промежуточным продуктом мо жет быть NO• радикал, как это было показано для таких медиаторов лакказ как HBT, TEMPO [Fabbrini et al., 2002;

Cantarella et al., 2003].

Образование описанных выше интермедиатов исследуемых соединений проис ходило за счет их неферментативного окисления на электродах. Зависимость мак симального анодного тока от квадратного корня из скорости развертки потенциала имела линейный характер, что свидетельствовало о том, что для всех исследован ных соединений электродный процесс протекал в диффузионно-контролируемом режиме.

Потенциалы полувысоты анодного пика для всех изученных производных фе нилметилпиразолона, а также для HPI и HABA, представлены в Таблице 4. Как и следовало ожидать, потенциал полувысоты анодного пика зависел от природы заместителя в структуре фенилметилпиразолона. Он увеличивался при введении электрон-акцепторной сульфогруппы в фенильное кольцо (mSPP и pSPP) и умень шался при введении в гетероцикл электрон-донорной аминогруппы (РРА).

Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при ферментативном окислении усилителей действия лакказ Были проведены дополнительные спектральные исследования продуктов гомо генного окисления двух соединений класса фенилметилпиразолонов – PPA-Na и mSPP в присутствии лакказы T. hirsuta.

В случае PPA-Na спектры поглощения интермедиатов, образующихся в резуль тате ферментативного окисления, зависели от соотношения концентраций медиа тора и фермента в растворе (Рис. 11), что указывало на возможное образование не скольких промежуточных продуктов окисления медиатора.

0.8 5 PPA-Na – 10-3 M Лакказа – 10-7 М 0.6 Рисунок 11. Изменение во времени 0. спектров поглощения продуктов 0. Оптическая плотность реакции, образующихся в процессе ферментативного окисления PPA-Na, 300 350 400 450 с участием лакказы T. hirsuta при различных концентрациях медиатора 1.2 PPA-Na – 10-3 M и фермента Лакказа – 2•10-6 М 0. 1- исходный спектр;

2 - 1 мин;

0. 3 - 10 мин;

4 - 30 мин;

5 - 60 мин.

Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, 0.3 рН 5.0.

350 450 550 650 750, нм Основываясь на электрохимических данных по гетерогенному окислению PPA-Na, можно предположить существование как минимум трех основных про межуточных продуктов ферментативного окисления данного субстрата (с потен циалами максимумов анодных пиков 290, 570, и 770 мВ).

При ферментативном окислении mSPP образовывалось, по-видимому, два ин термедиата (Рис. 12). При этом продукт с полосой поглощения при 340 нм являл ся более высоко редокспотенциальным, так как его формирование протекало на более поздней стадии ферментативной реакции. Можно предположить образова ние двух основных интермедиатов mSPP со значениями потенциалов 660 и 850 мВ, соответствующими максимумам поглощения при 270 и 340 нм, соответст венно. При этом образование первого продукта являлось быстрым процессом, в то время как образование второго продукта – процесс более медленный. Похожее двухступенчатое поведение при ферментативном окислении было показано для ABTS, что позволяет предположить сходство механизмов ферментативного окис ления обоих субстратов лакказы [Bourbonnais & Paice, 1990;

Sols-Oba et al., 2005].

Рисунок 12. Изменение во времени Оптическая плотность спектров поглощения продуктов mSPP – 10-4 M 3 реакции, образующихся в процессе 0. Лакказа – 10-6 М ферментативного окисления mSPP с 0. участием лакказы T. hirsuta:

0.4 1 – исходный спектр;

0. 2 – 10 мин;

3 – 30 мин.

Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, 230 280 330 380 рН 5.0.

, нм Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии медиаторов Методом циклической вольтамперометрии было изучено взаимодействие ото бранных соединений с модельным соединением лигнина – вератровым спиртом (VA). Этот метод позволяет исследовать не только электродные процессы, но и сопряженные с ними химические реакции.

В качестве примера на Рис. 13 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах вератрового спирта, медиаторов (mSPP, PPA-Na, HPI), а также смеси VA-медиатор. Необходимо отметить, что до потенциала 1000 мВ ве ратровый спирт электрохимически не активен.

mSPP PPA-Na 0 1 -3 - Ток, мкА -2 - 2 - 2 - - -4 - 1 - 3 - -6 -18 - 200 500 800 1100 200 500 800 1100 250 550 850 Е, мВ (отн. Ag/AgCl) Рисунок 13. Циклические вольтамперные кривые, записанные в растворах (1) медиатора (0.2 мМ);

(2) вератрового спирта (2 мМ) и (3) смеси медиатора и вератрового спирта в тех же концентрациях Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0;

скорость развертки потенциала 5 мВ/с В присутствии mSPP (Рис. 13), а также pSPP и РРА, окисление вератрового спирта происходило с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. На анодной ветви кривой наблюдалось увеличение тока окисления в об ласти потенциала 1000 мВ. В то же время, добавление к раствору PPA-Na верат рового спирта не приводило к увеличению токов окисления (Рис. 13).

В присутствии вератрового спирта в растворах гидроксифталеимида наблюда лось значительное увеличение анодного тока в области потенциалов окисления HPI и полное исчезновение тока восстановления на катодной ветви кривой (Рис.

13). Отсутствие катодного тока можно объяснить включением интермедиата элек тродного окисления HPI в процесс химического окисления вератрового спирта вблизи поверхности электрода. Химически восстановленный интермедиат вновь окислялся на электроде, давая увеличение анодного тока. При потенциале 910 мВ и скорости развертки потенциала 5 мВ/с анодный ток в присутствии вератрового спирта увеличивался в 2.5 раза по сравнению с током в отсутствии VA (Рис. 13), что указывало на регенерацию восстановленной формы медиатора в результате каталитического окисления вератрового спирта и на повторное окисление HPI на электроде.

До потенциала 1000 мВ не наблюдалось ускорения электроокисления вератро вого спирта в присутствии низкопотенциального продукта электродного окисле ния HABA, редокс потенциал которого равен 390 мВ.

В Таблице 4 представлены соотношения прироста анодного тока в растворе, содержащем вератровый спирт и медиатор, к диффузионному току окисления са мого медиатора при потенциале 1000 мВ. Как видно из таблицы, эффективность электрокаталитического окисления вератрового спирта возрастала с увеличением потенциала полуволны окисления усилителя. При взаимодействии с вератровым спиртом эффективными являлись соединения, имеющие потенциал полувысоты волны окисления выше 500 мВ.

Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс-усилитель фермента Для выяснения эффективности исследуемых медиаторов при деградации мо дельного соединения лигнина – вератрового спирта, были проведены прямые экс перименты по окислению VA в гомогенном растворе системой лакказа/медиатор.

Продукты окисления разделяли методом ВЭЖХ. Идентификацию продуктов окис ления VA проводили по времени их удерживания на колонке. В качестве марке ров использовали вератровый спирт, вератровый альдегид и вератровую кислоту, количество которых в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с ис пользованием программы “Мультихром” (Россия). Для оценки эффективности аналогичный эксперимент проводили с использованием ABTS в качестве медиа тора. Количественные результаты экспериментов по окислению вератрового спир та в системе лакказа/медиатор представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Окисление вератрового спирта системами лакказа/медиатор Степень конверсии VA после Состав реакционной смеси 48 часов инкубации, (%) mSPP + лакказа + VA 35, pSPP + лакказа + VA 30, PPA-Na + лакказа + VA 3, HPI + лакказа + VA 73, ABTS + лакказа + VA 75, mSPP + VA 3, pSPP + VA 3, PPA-Na + VA 0, HPI + VA 1, ABTS + VA 1, Лакказа + VA 1, Примечание: значения были рассчитаны как среднее по трем измерениям При использовании системы лакказа/HPI была достигнута высокая степень превращения вератрового спирта, сравнимая со степенью окисления VA в присут ствии ABTS. Взаимодействие лакказы с гидроксифталеимидом характеризуется низкой скоростью реакции (Табл. 4). Однако, как показали электрохимические ис следования, образующийся при окислении катион-радикал способен с довольно высокой скоростью окислять вератровый спирт. Благодаря этому общая эффек тивность процесса деградации вератрового спирта системой лакказа/HPI высока и составляет 70% превращения VA за 48 часов реакции.

Иначе обстоит дело с системами лакказа/производные фенилметилпиразолона.

Как показали кинетические исследования (Табл. 4), лакказа с высокой скоростью катализирует окисление сульфопроизводных данного класса. Электрохимически ми экспериментами было показано, что продукты окисления этих соединений не стабильны. Однако потенциал и время жизни продуктов окисления оказываются достаточными для того, чтобы окислить вератровый спирт. Благодаря высокой скорости ферментативного окисления этих производных общая эффективность окисления VA системой лакказа/pSPP или mSPP достаточно высока, в результате чего процент превращения спирта достигает, соответственно, 30 и 35% за 48 часов реакции. Более низкий по сравнению с ABTS процент деградации спирта объясня ется, по-видимому, слабой обратимостью процесса окисления этих производных фенилметилпиразолона.

Как и следовало ожидать на основании электрохимических исследований, в системе лакказа/PPA-Na скорость окисления вератрового спирта оказалась значи тельно ниже, чем при использовании сульфопроизводных фенилметилпиразоло на. В то же время, при использовании PPA-Na окисление вератрового спирта идет до соответствующей кислоты, в то время как большинство известных к настояще му времени медиаторов окисляют вератровый спирт до альдегида [Bourbonnais, Paice, 1990]. По-видимому, несмотря на низкую скорость реакции окисления ве ратрового спирта, высокопотенциальные интермедиаты PPA-Na, образующиеся в присутствии лакказы, способны к дальнейшему окислению вератрового альдегида до вератровой кислоты. Это хорошо согласуется с электрохимическими и спек тральными результатами, полученными для PPA-Na.

Контрольные эксперименты показали, что в отсутствии лакказы исследуемые нами медиаторы практически не способны к окислению вератрового спирта, а лак каза в отсутствии медиаторов окисляет менее 2% VA.

Таким образом, производные 1-фенил-3-метил-пиразолона-5 могут использо ваться в качестве усилителей действия лакказы.

Использование лакказа-медиаторных систем для делигнификации лигноцеллюлозы В рамках выполнения гранта INCO-Copernicus совместно с Центральным на учно-исследовательским институтом бумаги (ОАО «ЦНИИБ») были проведены прямые эксперименты по делигнификации лигноцеллюлозы лакказа медиаторными системами. Для этой цели была разработана лабораторная установ ка, схема которой представлена на Рис. 14.

Рисунок 14. Пилотная установка для делигнификации 3 1 – сосуд для делигнификации;

2 – термостатирующий сосуд;

3 – компрессоры;

4 – мешалка.

Для делигнификации использовали сульфатную небеленую хвойную целлюло зу Марийского Целлюлозно-бумажного комбината, в качестве ферментного пре парата – фильтрат культуральной жидкости базидиального гриба T. hirsuta, а в ка честве медиаторов испытывали PPA-Na, mSPP, HPI и для сравнения HBT. В об разцах определяли содержание остаточного лигнина (число Каппа). Результаты испытаний представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Делигнификация лигноцеллюлозы системами лакказа-медиатор Состав смеси Число Каппа Делигнификация, % Лигноцеллюлоза 20 Лигноцеллюлоза + лакказа 20 Лигноцеллюлоза + лакказа + PPA-Na 19.6 2. Лигноцеллюлоза + лакказа + mSPP 18.3 8. Лигноцеллюлоза + лакказа + HPI 17.9 10. Лигноцеллюлоза + лакказа + HBT 17.6 12. Лигноцеллюлоза * 31 Лигноцеллюлоза + лакказа + HBT* 26.1 15. * По данным Cheng et al., 2003a Как видно из таблицы, хотя производные фенилметилпиразолона показали бо лее низкие результаты по сравнению с известным медиатором лакказ HBT, они могут использоваться в качестве усилителей действия фермента для деградации лигниноподобных веществ. Коммерческая стоимость производных этого класса соединений на два-три порядка ниже стоимости ABTS, HBT и HPI. Учитывая, что все органические усилители действия лакказ расходуются в процессе фермента тивной реакции, коммерческая стоимость препаратов на их основе имеет большое значение при разработке новых биокаталитических технологий. Необходимо от метить, что группа соединений класса 1-фенил-3-метил-пиразолон-5 весьма мно гочисленна, и включением того или иного заместителя можно добиться значи тельного улучшения медиаторных свойств конкретного соединения.

ВЫВОДЫ 1. Проведено комплексное сравнительное изучение в одинаковых условиях био химических и спектральных характеристик лакказ, выделенных из культураль ных жидкостей базидиальных грибов различных родов и видов – T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Показано, что все изученные лакказы имеют сходные физико-химические характеристики, а также являются термо стабильными и высокоактивными ферментами.

2. Определены редокс потенциалы ионов меди Т1 центров изученных лакказ. По казано, что все лакказы относятся к высокопотенциальным ферментам и спо собны катализировать окисление ряда органических соединений с образовани ем высокопотенциальных интермедиатов.

3. На графитовых электродах, модифицированных лакказами T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima в атмосфере дикислорода устанавлива ется высокий окислительно-восстановительный потенциал, что позволяет ис пользовать эти ферменты в качестве биокатализаторов при создании катода биотопливного элемента. Показано, что существует корреляция между потен циалом Т1 центра ферментов и началом реакции электровосстановления дикис лорода на электроде.

4. Предложена схема отбора органических соединений – потенциальных медиато ров лакказ, которая значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента, включающая 4 стадии: отбор соединений на основе их структурной формулы;

определение каталитических характеристик этих соединений в гомогенных ре акциях, катализируемых лакказой;

анализ циклических вольтамперограмм рас творов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных со единений лигнина;

прямой эксперимент по анализу продуктов окисления мо дельного соединения системой лакказа/медиатор.

5. Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-3-метил пиразолоны-5. Показано, что сульфо- и аминопроизводные этого класса соеди нений могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ для дегра дации нефенольных подструктур лигнина. Показана возможность использова ния этих производных 1-фенил-3-метил-пиразолона-5 для делигнификации лиг ноцеллюлозы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. G.P. Shumakovich, S.V. Shleev, O.V. Morozova, P.S. Khohlov, I.G. Gazaryan, A.I. Yaropolov «Electrochemistry and kinetics of fungal laccase mediators» Bioelec trochemistry (2006) V. 69, № 1, Р. 16- 2. S. Shleev, A. Jarosz-Wilkolazka, A. Khalunina, O. Morozova, A. Yaropolov, T. Ruzgas, L. Gorton «Direct electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes» Bioelectrochemistry (2005) V.67, № 1, P. 115-124.

3. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serez henkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. «Comparison of physico chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes». Biochimie (2004) V. 86, № 9-10, Р. 693-703.

4. С.В. Шлеев, Ир Гвон Хан, О.В. Морозова, Ю.М. Мажуго, А.С. Халунина, А.И.

Ярополов. «Фенил-пиразолоны – новый класс редокс-медиаторов оксидоредук таз для деградации ксенобиотиков». Прикладная биохимия и микробиология.

(2004) Т. 40, № 2, С.165-172.

5. Shleev S.V., Gvon Khan I., Gazaryan I.G., Morozova O.V., Yaropolov A.I. «Novel laccase redox mediators. Spectral, electrochemical, and kinetic properties». Applied Biochemistry and Biotechnology (2003) V. 111, № 3, Р. 167- 6. Шлеев С.В., Газарян И.Г., Горшина Е.С., Кузнецов Б.А., Сереженков В.А.. Бур баев Д.Ш., Морозова О.В., и Ярополов А.И.. «Спектральное и электрохимиче ское изучение активных сайтов лакказ базидиомицетов». Вестник Московско го Университета (2003), Т. 44, № 1, С. 35-39.

7. O. Koroljova-Skorobogat’ko, E. Stepanova, V. Gavrilova, O. Morozova, N. Lubi mova, A. Dzchafarova, A. Yaropolov, A. Makower. «Purification and characteriza tion of the constitutive form of laccase from the basidiomycete Coriolus hirsutus and effect of inducers on laccase synthesis». Biotechnology and Applied Biochemistry (1998) V. 28, № 1, P. 47-54.

8. Shleev S.V., Gazaryan E.A., Gorshina E.S., Kuznetsov B.A., Serezhenkov V.A., Burbayev D.Sh., Morozova O.V. and Yaropolov A.I. «Spectral and electrochemical study of active sites laccases from basidiomycetes». Abstracts of International Con ference «Biocatalysis-2002», June 22-27, 2002, Moscow, Russian Federation, P.133 134.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.