Структурная организация субтеломерных районов хромосом видов родов triticum l. и aegilops l. генетика –

На правах рукописи

СЕРГЕЕВА ЕКАТЕРИНА МИХАЙЛОВНА

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СУБТЕЛОМЕРНЫХ РАЙОНОВ

ХРОМОСОМ ВИДОВ РОДОВ TRITICUM L. И AEGILOPS L.

Генетика – 03.02.07

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

1

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Учреждения российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Салина Е.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Таранин А.В.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН г. Новосибирск кандидат биологических наук Кочетов А.В.

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «» 2010 г. на заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: [email protected].

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение субтеломерных районов хромосом является актуальной задачей, решение которой позволит расширить современные представления о структурно-функциональной организации и эволюции генома эукариот. Субтеломерные участки хромосом примыкают к теломерам, и выполняют ряд важных функций — отвечают за позиционирование хромосом в интерфазе, оказывают влияние на их поведение и митозе и мейозе (Louis, 1995;

Feldman et al., 1997). Особенно важным является изучение структурной организации и дивергенции субтеломерных участков хромосом в процессе эволюции у аллополиплоидов — это представляет огромный интерес для понимания функционирования полиплоидного генома. Виды трибы Triticeae, которая содержит большое количество природных аллополиплоидов с известным происхождением и для которой получен ряд искусственных аллополиплоидов, являются удобным объектом для изучения организации и эволюции полиплоидного генома.

На настоящий момент благодаря реализации проектов по секвенированию геномов детально охарактеризована структура субтеломерных участков хромосом человека (Riethman et al., 2001, 2004), некоторых хромосом риса Oryza sativa (Yang et al., 2005) и Arabidopsis thaliana (Kuo et al., 2006). Субтеломерные районы хромосом этих видов имеют ряд характерных особенностей, таких как наличие множественных сегментальных дупликаций, присутствие хромосом специфичных тандемных повторов и мобильных элементов, а также генов.

О структуре субтеломерных участков хромосом Triticeae и других видов растений с большим размером генома известно гораздо меньше в связи с тем, что в настоящее время полная нуклеотидная последовательность их геномов неизвестна. Однако ряд работ по клонированию и анализу отдельных последовательностей ДНК, локализованных на концах хромосом, показал, что субтеломерные районы у разных таксонов содержат различные семейства высокоповторяющихся тандемных последовательностей ДНК, которые часто являются видоспецифичными и геномспецифичными в аллополиплоидном геноме (Jones, Flavell, 1982;

Ohtsubo et al., 1991;

Wu, Tanksley, 1993a;

Vershinin et al., 1995;

Salina et al., 2006). Тандемно организованные субтеломерные повторы чередуются с дисперсными уникальными и низкокопийными последовательностями, образуя специфичные комбинации последовательностей ДНК на концах хромосом (Sykorova et al., 2003;

Alkhimova et al., 2004).

Кроме того, показано, что субтеломерные участки хромосом подвержены изменениям в процессе эволюции, сохраняя при этом свою функцию. Например, при образовании природных и искусственных аллопополиплоидов пшеницы отмечены обширные геномные перестройки в этих районах, а именно делеции и амплификации различных семейств субтеломерных тандемных повторов (Jones, Flavell, 1982;

Zhang et al., 2002;

Salina et al., 2004).

Изучение структурной организации субтеломерной ДНК мягкой пшеницы и эволюции отдельных последовательностей, входящих в ее состав, в ряду диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops, как природных, так и искусственно синтезированных, существенно расширит имеющуюся информацию о структуре субтеломер злаков и позволит определить вклад различных последовательностей в формирование и дивергенцию этих районов хромосом.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы является: изучение структурной организации субтеломерных участков хромосом и оценка вклада различных последовательностей ДНК, присутствующих в субтеломерных районах, в дивергенцию геномов родов Triticum L. и Aegilops L.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Сравнительное исследование структурной организации ВАС-клонов Triticum aestivum, содержащих субтеломерные маркеры Spelt1 и Spelt52, методами ПЦР-анализа, Саузерн-блот и дот-гибридизации, флуоресцентной гибридизации in situ и субклонирования;

2. Аннотирование и анализ первичной структуры двух ВАС-клонов мягкой пшеницы ВАС_2050О8 и ВАС_2383А24, маркированных субтеломерными повторами Spelt52 и Spelt1, соответственно;

3. Проведение филогенетического анализа последовательностей ДНК, которые являются компонентами субтеломерных районов хромосом Triticum и Aegilops;

4. Изучение распределения ДНК-транспозона и LTR Caspar ретротранспозона Fatima на хромосомах диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops;

5. Поиск маркеров к вариабельным участкам субтеломерных районов хромосом для оценки уровня геномных изменений, происходящих в процессе эволюции и при образовании аллополиплоидов Triticum-Aegilops.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Показано, что использование повторяющихся последовательностей Spelt1 и Spelt52 в качестве зондов позволяет эффективно отбирать ВАС-клоны, содержащие субтеломерные последовательности, из геномных ВАС библиотек мягкой пшеницы Triticum aestivum.

2. Впервые были получены данные о первичной структуре субтеломерных участков хромосомы 3B и длинного плеча хромосомы 4B мягкой пшеницы, содержащих маркеры Spelt1 и Spelt52.

3. Получены данные о роли ДНК-транспозона Caspar в формировании субтеломерных районов хромосом у видов Triticum и Aegilops.

4. Впервые показан значительный вклад LTR-ретротранспозона Fatima, входящего в состав субтеломерной ДНК, в дифференциацию генома В тетраплоидных и гексаплоидных видов пшениц, и диплоидного предшественника генома В Aegilops speltoides.

5. Впервые охарактеризованы протяженные ряды тандемных повторяющихся последовательностей Spelt1 и Spelt52 у Triticum aestivum.

6. Получен цитогенетический маркер (ВАС_2383А24), который позволяет выявлять хромосомы или хромосомные транслокации с участием генома В у тетраплоидных и гексаплоидных видов пшениц, и Aegilops speltoides в различном геномном окружении.

Положения, выносимые на защиту.

1. В формирование субтеломерных районов хромосом Triticum и Aegilops внесли вклад как тандемные повторяющиеся последовательности Spelt1 и Spelt52, так и мобильные элементы – ДНК-транспозон Caspar и LTR ретротранспозон Fatima.

2. ДНК-транспозоны семейства Caspar являются характерной компонентой субтеломерных районов хромосом диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops за счет того, что содержание элементов Caspar в субтеломерных районах существенно выше, чем в других районах хромосом.

3. Семейство gypsy LTR-ретротранспозонов Fatima внесло существенный вклад в дивергенцию генома В пшеницы за счет появления и амплификации в процессе эволюции геном-специфичных вариантов семейства Fatima у его предполагаемого предшественника Aegilops speltoides.

Апробация работы. Результаты настоящей работы были представлены на XLII Международной научной студенческой конференции “Студент и научно технический прогресс” (Новосибирск, 2004 г.);

Международной Конференции “Генетика в России и мире”, посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (Москва, 2006 г.);

Международной молодежной научно методической конференции “Проблемы молекулярной и клеточной биологии” (Томск, 2007 г.);

VI Международной конференции по биоинформатике, регуляции и структуре генома (Новосибирск, 2008 г.);

XI Международном симпозиуме по генетике пшеницы (Брисбен, Австралия, 2008 г.);

Российско французской конференции “Проблемы и перспективы биотехнологии растений” (Новосибирск, 2008 г.);

Объединенном симпозиуме 19th ITMI/ 3rd COST Tritigen (Клермон-Ферран, Франция, 2009 г.).

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации имеется публикаций, из них 3 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах и 1 — в сборнике трудов международной конференции.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно.

Подготовка препаратов для флуоресцентной гибридизации in situ и анализ препаратов проводились к.б.н. И. Г. Адониной. Отбор ВАС-клонов из геномной библиотеки Triticum aestivum сорта Ренан проводился д.б.н., проф. Е.А. Салиной, определение нуклеотидной последовательности ВАС-клонов проводилось в лаборатории Б. Шалуба (INRA, Франция).

Структура и объем диссертации: Диссертация содержит следующие разделы:

введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит 28 рисунков, 8 таблиц, 8 приложений, список цитируемой литературы включает 247 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал. В работе использованы образцы ДНК синтетических аллополиплоидов Triticum-Aegilops и ДНК родительских растений, любезно предоставленные доктором Фельдманом (Израиль);

набор нуллитетрасомных линий Triticum aestivum сорта Чайниз Спринг (IPK Gatersleben, Германия) и образцы ДНК различных видов Triticum и Aegilops (Таблица 1).

Таблица 1. Список растительного материала, использованного в работе Вид, популяция Геномная Источник формула Синтетические аллополиплоиды Чайниз спринг TS01 BBAADDSS, Dr. Feldman Triticum aestivum 2n=8x=56 Израиль Aegilops speltoides Лэнгдон TL01 BBAASS, Triticum durum 2n=6x= Aegilops speltoides BBAASlSl, Капелли TH Triticum durum 2n=6x= Aegilops sharonensis TS86 TD01 SSCC, Aegilops speltoides 2n=4x= Aegilops caudata AbAbSS, TMB02 TS Triticum boeoticum 2n=4x= Aegilops speltoides SshSshAbAb, TH02 TMB Aegilops sharonensis 2n=4x= Triticum boeoticum SlSlUU, TH01 TU Aegilops sharonensis 2n=4x= Aegilops umbellulata AuAuS lS l, TMU06 TL Tritcum urartu 2n=4x= Aegilops longissima Диплоидные виды AbAb, 2n= K- Triticum monococcum L.

AbAb, 2n= TMB02 Dr. Feldman Triticum boeoticum Boiss.

Израиль AuAu, 2n= TMU06, TMU Tritcum urartu Thum. Ex Gandil.

TS01, TS86 SS, 2n= Aegilops speltoides Tausch TS05, TS41, TS42, TS47, k- Sl Sl, 2n= TL01, TL05, TL02, Dr. Feldman Aegilops longissima Schweinf et TL03, TL04 Израиль Munschl.

SlSl, 2n= TH01, TH02 Dr. Feldman Aegilops sharonensis Eig Израиль SsSs, 2n= TE12, TE Aegilops searsii Feldman et Kislev ex Hammer SbSb, 2n= TB Aegilops bicornis (Forssk.) Jaub. et Spach.

TU04 UU, 2n= Aegilops umbellulata Zhuk.

TD01 CC, 2n=14 Dr. Feldman Aegilops caudata L.

Израиль TQ27 DD, 2n= Aegilops tauschii Coss.

Природные аллополиплоиды Капелли, Лэнгдон, BBAA, Dr. Feldman Triticum durum Desf.

Краснокрутка 2n=4x=28 Израиль B(p) S1E, K7500, BBAA, Н. П. Гончаров, Triticum dicoccum (Schank) Schuebl.

Dichter, k-327430, 2n=4x=28 ИЦиГ СО РАН Krausei,19360, Altay PI266811, 467005, BBAA, Triticum dicoccoides (Koern. ex 467019, 467027, 2n=4x= Aschers. et Graebn.) Schweinf.

467014, 467016, 414718, 414720, 414728, 478710, 481493, GGAbAb, К-38555, ssp.

Triticum timopheevii Zhuk.

viticulosum, var. typica 2n= 4x = GGAbAb, Triticum militinae Zhuk. et Migusch.

2n = 4x = KU-3065, KU-7631, BBAADD, KOMUGI Triticum compactum Host KU-3242, KU-4331, 2n=6x=42 Япония KU-4332, KU-4389, KU-1208, KU-302, KU- KU-154, KU-155, BBAADD, KOMUGI Triticum macha Dekapr. et Menabde KU-194, KU-197, 2n=6x=42 Япония KU-1812, KU-1813, KU-1814, KU-1815, KU-1816, KU- KU-1021, KU-1029, BBAADD, KOMUGI Triticum spelta L.

KU-1035, KU-1046, 2n=6x=42 Япония KU-1064, KU-1077, KU-1092, KU-1100, KU-1116, KU-1126, KU-1131, KU-1138, KU- KU-162-1, KU-162-2, BBAADD, KOMUGI Triticum sphaerococcum Persiv.

KU-3004 2n=6x=42 Япония Ренан, Чайниз спринг, BBAADD, Triticum aestivum L.

Саратовская 29, 2n=6x= Балаганка, Дуванка 501, Победа, Цезиум 94, Саратовская 36, Алтайская Клоны. ВАС-клоны, содержащие субтеломерные повторы Spelt1 и Spelt52, предоставлены Салиной Е.А. (ИЦиГ СО РАН) и Б. Шалубом (INRA, Франция).

Для двух ВАС-клонов ВАС_2050О8 и ВАС_2383А24 в лаборатории Б. Шалуба (INRA, Франция) была определена полная нуклеотидная последовательность.

Выделение ДНК. Выделение суммарной ДНК растений проводили с использованием протеиназы К согласно описанной ранее методике (Дрейпер с соавт., 1991). Выделение ДНК ВАС-клонов проводилось с использованием стандартного метода щелочного лизиса с некоторыми модификациями (Maniatis с соавт., 1982).

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Приготовление препаратов и гибридизацию проводили согласно методике, описанной в статье Салиной с соавт. (Salina et al., 2006). Идентификация хромосом, принадлежащих к геномам В и D пшеницы, проводилась с помощью гибридизации с зондами pSc119 и pAs1, согласно стандартной генетической номенклатуре (Gill et al., 1991;

Badaeva et al., 1996).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей. Поиск гомологичных нуклеотидных последовательностей в базах данных проводился с использованием алгоритма BLAST (Altschul et al., 1990). Для множественного выравнивания использовались программы Multalin (Corpet, 1998), либо ClustalW (Thompson et al., 1994);

для построения филогенетических древ использовалась программа MEGA4 (Tamura et al., 2007). Аннотирование нуклеотидных ВАС последовательностей проводилось согласно протоколу, предложенному Международным консорциумом по секвенированию генома пшеницы (http://www.wheatgenome.org/index.php). Расчет времени инсерции LTR ретротранспозонов проводился согласно ранее разработанному методу (SanMiguel et al., 1998;

Ma, Bennetzen, 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Сравнительный анализ ВАС-клонов, содержащих субтеломерные маркеры Spelt1 и Spelt Специфичными маркерами субтеломерных участков хромосом Ae.

speltoides и генома B полиплоидных пшениц являются тандемные повторы Spelt1 и Spelt52. На основании присутствия этих последовательностей из геномной ВАС-библиотеки мягкой пшеницы сорта Ренан были отобраны клонов (Salina et al., 2009). Сравнительный анализ ВАС-клонов, содержащих субтеломерные маркеры Spelt1 (4 ВАС-клона) и Spelt52 (5 ВАС-клонов), включал в себя: а) оценку длины вставки геномной ДНК;

б) оценку содержания повторяющихся последовательностей в составе ВАС-клонов, в том числе повторов, встречающихся в субтеломерных участках хромосом злаковых, таких как Spelt1 (Salina et al., 1998), Spelt52 (Salina et al., 2004), pSc119.2 (McIntyre et al., 1990), pAs1 (Nagaki et al., 1995). Результаты анализа представлены в Таблице 2. Также проведен анализ хромосомной локализации ВАС-клонов на хромосомах T. aestivum. Гибридизация в субтеломерных районах хромосом пшеницы наблюдалась только для ВАС_2050О8, при гибридизации остальных ВАС-клонов сигнал покрывал хромосомы T. aestivum по всей длине.

Таблица 2. Сравнительная характеристика ВАС-клонов, содержащих субтеломерные маркеры Spelt1 и Spelt Длина, Содержание повторяющихся последовательностей т.п.н. последовательностей Номер ВАС-клона Число копий* Присутствие** Приблизительное повторяющихся Spelt1 Spelt52 pSc pAs1 Хромосомная локализация присутствия 119. содержание Отобран на основании ** 2322J20 Spelt1 93 7 - - - 54 дисперсная*** 2383A24 113.5 6 - - - 80 -«- (В-геном) 2424P01 97 5 - - - 70 -« 112D20 86.5 1-2 5 - - 62 -« 110O07 Spelt52 162.5 - 24 - - 56 -« 110B21 168 - 23 - - 73 -« 2050O8 120 - 27 - - 25 субтеломерная 478L20 153.5 - 27 - + 33 дисперсная*** 1487N20 165.5 - 28 - - 62 -« * оценка проведена с использованием методов Саузерн-блот и дот-гибридизации ** оценка проведена с использованием метода Саузерн-блот гибридизации *** выделены протяженные фрагменты с субтеломерной локализацией С помощью субклонирования и in situ гибридизации протяженных (свыше т.п.н.) фрагментов ДНК мы также показали локализацию в субтеломерных районах хромосом мягкой пшеницы для двух ВАС-клонов: ВАС_2322J20 и ВАС_478L20.

2. Аннотирование и анализ первичной структуры ВАС_2050О8, имеющего субтеломерную FISH-локализацию Последовательность ВАС_2050О8 длиной 119737 п.н. аннотирована и помещена в GenBank под номером GQ165812. Схема организации субтеломерной последовательности ВАС_2050О8 представлена на Рисунке 1.

С помощью BLAST-поиска в базе данных картированных контигов EST пшеницы (http://wheat.pw.usda.gov/GG2/blast.shtml) и поиска гомологичных последовательностей в базе данных геномных и белковых последовательностей риса Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/) нам удалось установить, что BAC_2050O8 локализован в дистальной части длинного плеча 4B хромосомы.

Рисунок 1. Схематическое строение ВАС_2050О8. MITE — miniature inverted transposable element (миниатюрный инвертированный мобильный элемент);

цифра после названия элемента означает порядковый номер элемента этого семейства в ВАС клоне;

-р (partial) после названия элемента — неполный элемент 3. Аннотирование и анализ первичной структуры ВАС_2383A24, имеющего B-геном-специфичную FISH-локализацию Последовательность ВАС_2383А24 длиной 113605 п.н. аннотирована и помещена в GenBank под номером GU817319. Схематическая организация ВАС_2383А24 представлена на Рисунке 2. Хромосомная локализация ВАС_2383А24 определена с помощью ПЦР-анализа набора из нуллитетрасомных линий мягкой пшеницы сорта Чайниз Спринг с использованием ISBP-маркеров: подобраны специфичные праймеры к точке инсерции ретротранспозона Fatima_2383A24-2 в Barbara_2383A24-1p. Метод ISBP-маркеров (insertion site-based polymorphism) заключается в использовании праймеров, окружающих точку инсерции мобильного элемента, которые дают специфичный продукт амплификации (Devos et al., 2005, Paux et al., 2006). На основании полученных данных BAC_2383A24 был локализован на хромосоме 3В.

4. Анализ последовательностей ДНК, входящих в состав ВАС_2050О8 и ВАС_2383А Филогенетический анализ последовательностей Spelt1 и Spelt В составе BAC_2050O8 представлены 25 полных мономерных единиц последовательности Spelt52, расположенных в ориентации “голова-к-хвосту”.

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей мономерных единиц и их сравнение с консенсусной последовательностью показали, что в среднем процент гомологии последовательностей с консенсусом составил 93% (88–96%). Филогенетический анализ показал, что в составе BAC_2050O присутствуют только мономеры подсемейства Spelt52.2.

Рисунок 2. Схематическое строение ВАС_2383А24. MITE — miniature inverted transposable element (миниатюрный инвертированный мобильный элемент);

цифра после названия элемента означает порядковый номер элемента этого семейства в ВАС клоне;

-р (partial) после названия элемента – неполный элемент Последовательности семейства Spelt1, представленные в ВАС_2383А24, образуют ряд из 6 тандемных мономерных единиц. Уровень гомологии каждого мономера с консенсусной последовательностью составил 96–98%.

Филогенетический анализ показал присутствие видоспецифичных нуклеотидных замен в последовательности повтора Spelt1.

Анализ хромосомного распределения и филогенетический анализ ДНК транспозонов семейства Caspar ДНК-транспозон Caspar_2050O8 составляет порядка 10% от всей длины ВАС_2050О8, и содержит открытую рамку считывания, кодирующую транспозазу. Для анализа хромосомной локализации транспозона Caspar_2050О8 был использован ВАС-клон 2050О8. Дополнительно с помощью ПЦР получен зонд cas2, соответствующий участку последовательности, кодирующей транспозазу. Проанализировано распределение транспозона Caspar_2050O8 на хромосомах диплоидных и полиплоидных видов пшениц и эгилопсов (Рис. 3 а, Табл. 2). Показано, что зонды ВАС_2050О8 и cas гибридизовались на субтеломерные участки хромосом изученных видов.

Локализация обоих зондов на хромосомах совпадает, однако сигнал зонда cas слабее, чем сигнал BAC_2050О8. Наблюдался внутривидовой полиморфизм распределения сигналов гибридизации на хромосомах разных сортов T. aestivum, и полиморфизм в числе сайтов гибридизации зонда Caspar_2050O8 на хромосомах диплоидных видов.

С помощью BLASTN-поиска с использованием в качестве зонда последовательности элемента Caspar_2050O8 в базах данных были выявлены и взяты в анализ 46 последовательностей транспозазы, принадлежащих видам пшеницы T. aestivum, T. monococcum, T. durum, Ae. tauschii и ячменя Hordeum vulgare (Рис. 4).

Рисунок 3. Локализация зондов к элементам Caspar и Fatima на метафазных хромосомах видов Triticum: (а) ВАС_2050О8 (Caspar) на хромосомах T. aestivum сорта Саратовская29;

(б, в, г, д) ВАС_2383А24 и (е) 2383A24/15 (Fatima) на хромосомах (б) T. aestivum сорта Саратовская 29, (в) Ae. speltoides и T. monococcum на одном слайде, (д) Ae. speltoides и Ae. tauschii на одном слайде, (г, е) T. aestivum сорта Чайниз спринг.

Использованные комбинации зондов: (а) ВАС_2050О8 (зеленый), (б, в, г, д) BAC_2383A24 (зеленый), (е) 2383A24/15 (зеленый);

(а) pAs1 (красный), (б) pSc (красный), (г) геномная ДНК Ae. tauschii (красный), (д) ВАС_112D20 (красный) Филогенетический анализ показал, что большинство элементов формируют три основные ветви на древе, две из которых сформированы элементами из родов Triticum и Aegilops (группы Clifford и Caspar_Triticinae), а третья — элементами из H. vulgare (группа Caspar_Hordeinae). Кроме того, присутствует четвертая группа, обозначенная нами как «смешанная», которая содержит элементы, выделенные из пшеницы и из ячменя (Рис. 4).

Таблица 2. Результаты FISH зондов к элементу Caspar на хромосомы диплоидных и полиплоидных видов пшениц Локализация зонда на гаплоидном геноме Вид Линия Геномная формула Число хромосомных районов (число хромосом) K-389 2n=2x=14, SS 12 (7) Ae. speltoides TQ27 2n=2x=14, DD 5 (4) Ae. tauschii 2n=2x=14, AuAu TMU38 13 (7) T. urartu 2n=2x=14, AbAb K-20970 13 (7) T. monoccocum Лэнгдон 2n=4x=28, BBAA 26-27 (14) T. durum 2n=4x=28, GGAtAt К-38555 26-27 (14) T. timopheevii Чайниз спринг 29 (18) 2n=6x=42, BBAADD Ренан 28 (17) T. aestivum Саратовская 29 28 (17) Рисунок 4. Филогенетическое древо для последовательностей Caspar-подобных элементов, кодирующих транспозазу. Названия групп (1) Clifford, (2) Caspar_Triticinae, (3) Caspar_Hordeinae, (4) смешанная. В названиях последовательностей: Ta – T.

aestivum, Tt – T. turgidum, Td – T. durum, Tu – T. urartu, Tm – T. monococcum, Aet – Ae.

tauschii, Hv – H. vulgare. Звездочками отмечены последовательности, для которых показана субтеломерная FISH локализация. Треугольниками – элементы, выделенные из протяженных геномных последовательностей, картированных в дистальной трети плеч хромосом. Для кластеров указаны бутстреп-значения при 500 повторностях Анализ хромосомного распределения и филогенетический анализ семейства gypsy LTR-ретротранспозонов семейства Fatima В ВАС-клоне 2383А24 элементы, принадлежащие к семейству gypsy LTR ретротранспозонов Fatima, составляют около 25% общей последовательности ВАС-клона. Субклонирование ВАС_2383А24 показало, что клон 2383А24/ длиной 435 п.н., гомологичный участку, кодирующему обратную транскриптазу gypsy LTR-ретротранспозона Fatima_2383A24-3, гибридизуется на хромосомы генома В мягкой пшеницы, так же, как и целый ВАС_2383А24 (Рис. 3 б, в, г, д, е).

Изучение локализации ретротранспозона Fatima на хромосомах диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops проводили с использованием зондов 2383А24/15 и ВАС_2383А24. Спектр гибридизации, полученный для обоих зондов на хромосомах изученных видов, совпадает. B геном-специфичный спектр локализации элемента Fatima сохраняется в течение эволюции генома B: у диплоидного предка Ae. speltoides и также у аллополиплоидов T. aestivum и T. durum. Используя BAC_2383A24 в качестве зонда, удалось визуализировать транслокацию между хромосомами 4AL/5AL/7BS (Рис. 3 б), что позволяет использовать зонд ВАС_2383A24 для идентификации хромосом, принадлежащих к геному B аллогексаплоида T.

aestivum, методом in situ гибридизации.

Для филогенетического анализа семейства gypsy LTR-ретротранспозонов Fatima были взяты нуклеотидные последовательности, кодирующие полипротеин, представленные как в BAC_2383A24, так и в базах данных. В базе данных повторяющихся последовательностей Triticeae (Triticeae Repeat Sequence Database - TREP) элементы Fatima разделены на две группы, обозначенные как “автономные” и “неавтономные”, которые имеют различающиеся нуклеотидные последовательности, кодирующие полипротеин. Элементы Fatima_2383A24-2 и 3 принадлежат к “автономной” группе, Fatima_2383A24-1 — к “неавтономной”.

Суммарно из баз данных было выделено 29 последовательностей “автономных” и 58 последовательностей “неавтономных” элементов, принадлежащих к видам T. aestivum, T. durum, T. urartu, T. monococcum и Ae. tauschii. Филогенетический анализ показал, что “автономные” элементы разделяются на четыре основные группы. “B-геном-специфичная” состоит из 15 элементов Fatima, выделенных из генома B видов T. aestivum и T. durum. Элемент Fatima_2383A24-3, показавший специфичную для генома В in situ гибридизацию, попадает в эту группу. Восемь элементов, произошедшие из геномов А T. aestivum, T. durum, T. monococcum и T. urartu, формируют две “А-геном-специфичные” группы. Диапазон времени инсерции для элементов этих трех групп составляет 0.6-2.0 млн. лет назад.

Четвертая, “смешанная”, группа содержит 6 элементов с разной геномной принадлежностью. Время инсерции, рассчитанное для этой группы, составляет 2.2-2.7 млн. лет назад. Филогенетический анализ элементов “неавтономной” группы не выявил кластеризации последовательностей по геномному признаку.

ПЦР-анализ природных и искусственных аллополиплоидов Triticum-Aegilops с использованием специфичных праймеров, подобранных к участкам геномных последовательностей ВАС_2050О8 и ВАС_2383А На основании первичной структуры двух геномных последовательностей мягкой пшеницы ВАС_2383А24 и ВАС_2050О8, маркированных повторами Spelt1 и Spelt52, соответственно, были подобраны две пары ISBP-праймеров к инсерциям элементов и Barbara_2383A24-1p/Fatima_2383A24- Claudia_2383A24-1p/Fatima_2383A24-3. Проанализированы образцы ДНК природных аллополиплоидных пшениц и их диплоидных сородичей (Табл. 1).

Специфичные продукты амплификации отсутствовали у всех диплоидных видов Aegilops и Triticum, и также у тетраплоидов GGAtAt T. timopheevii и T. militinae;

однако присутствовали у всех проанализированных тетраплоидов BBAA T.

durum, T. dicoccum и T. dicoccoides и большей части проанализированных гексаплоидов BBAADD. У искусственных аллополиплоидов Triticum-Aegilops, полученных с использованием природного тетраплоида в качестве одного из родителей и диплоида в качестве другого, продукт амплификации также присутствовал. Также были подобраны праймеры, ограничивающие кластер субтеломерных повторов Spelt1, выявляющие полиморфизм в ряду диплоидных и полиплоидных видов. Наличие специфичного продукта показано у мягкой пшеницы сорта Ренан, у аллотетраплоида Triticum durum сорта Капелли, и у гибрида этого аллотетраплоида с Ae. sharonensis TH01.

ОБСУЖДЕНИЕ Микроколлинеарность Spelt52-содержащего дистального района хромосомы 4BL с участком 3S хромосомы риса При анализе генного пространства ВАС_2050О8 обнаружен предположительно ортологичный район в геноме риса Oryza sativa.

Последовательности белков, кодируемых четырьмя предсказанными в ВАС_2050О8 генами пшеницы, показали высокую степень гомологии к четырем гипотетическим белкам риса. Гены риса, которые кодируют эти белки, принадлежат к одному контигу OSJNBa0056G13 и локализованы рядом друг с другом в том же порядке, что и порядок соответствующих генов в BAC_2050O8.

Нами показано, что ВАС_2050О8 расположен в дистальном районе хромосомы пшеницы 4ВL. Ортологичный район в геноме риса (контиг OSJNBa0056G13) расположен в дистальном участке хромосомы 3S, который имеет наибольшее сходство с длинным плечом 4B хромосомы пшеницы (Miftahudin et al., 2004;

See et al., 2006). Сравнение протяженности генных областей BAC_2050O8 пшеницы и OSJNBa0056G13 риса показало, что в геноме риса район, охватывающий четыре вероятных гена, составляет 9556 п.н., в то время как соответствующий ему район в BAC_2050O8 — 29612 п.н. Различие обусловлено увеличением межгенного расстояния у ВАС_2050O8 (в сумме 22769 п.н.) по сравнению с п.н. у риса. Межгенный район в ВАС_2050O8 не имеет сходства на уровне нуклеотидной последовательности с межгенным районом риса и превосходит по длине соответствующую область риса более чем в 6 раз, в то время как в целом геном пшеницы более чем в 40 раз превосходит по размеру геном риса. Судя по всему, основное увеличение размера генома пшеницы происходило в районах, свободных от генов.

Консервативность и изменчивость повторов Spelt1 и Spelt52 в процессе эволюции При анализе первичной структуры ВАС_2050О8 и ВАС_2383А24 нами впервые получена информация о первичной структуре протяженных участков тандемных повторов Spelt52 и Spelt1. Для семейства повторов Spelt характерны два типа повторяющихся единиц: Spelt52.1 и Spelt52.2 (Salina et al, 2004). Тандемы, образованные только последовательностями Spelt52.2, показаны для одного образца Ae. speltoides — TS01. В составе BAC_2050O8 мягкой пшеницы нами обнаружены участки тандемных повторов, состоящие только из последовательностей Spelt52.2. Учитывая тот факт, что Ae. speltoides является наиболее вероятным донором генома B полиплоидных пшениц, наличие тандемной организации Spelt52.2 можно использовать как критерий в филогенетических исследованиях для поиска образцов Ae. speltoides — возможных доноров В-генома. При анализе мономеров Spelt1, выделенных из ВАС_2383А24, показано, что повторяющиеся единицы Spelt1 имеют видоспецифичные для T. aestivum нуклеотидные замены, что также можно использовать для филогенетических исследований видов Triticum и Aegilops.

Вклад САСТА ДНК-транспозона Caspar в формирование субтеломерных районов хромосом САСТА ДНК-транспозон Caspar_2050O8 вносит основной вклад в выявление субтеломерной in situ локализации ВАС_2050О8, при этом субтеломерная локализация наблюдается на хромосомах диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, гомологичных транспозазе Caspar_2050O8, показал разделение большинства элементов на 3 основные группы. В каждой из трех филогенетических групп присутствуют элементы, которые могут быть отнесены к дистальным районам хромосом (Рис. 4). Таким образом, преобладание в субтеломерных районах является характеристикой группы близкородственных семейств. Увеличение числа копий элементов Caspar по направлению к теломере, скорее всего, связано с высокой частотой рекомбинации в дистальных районах. Четкое разделение между Caspar подобными элементами ячменя и пшеницы указывает на то, что амплификация этих элементов происходила независимо в разных геномах. Вероятно, Caspar подобные элементы присутствовали в геноме общего предка Triticeae (на что указывает наличие четвертой “смешанной” филогенетической группы), затем по независимым путям произошла амплификация отдельных копий в геномах пшеницы и ячменя.

Вклад gypsy LTR-ретротранспозона Fatima в дивергенцию геномов в процессе эволюции Наличие ретротранспозонов семейства Fatima в составе ВАС_2383А вносит основной вклад в выявление В-геном-специфичного спектра гибридизации на хромосомах пшеницы. Филогенетический анализ в сочетании с результатами FISH показал существование в семействе Fatima отдельных геном специфичных групп, время инсерций которых находится в интервале 0.6–2. млн. лет назад, что совпадает с периодом, соответствующим расхождению видов — предков геномов A и B, и до формирования аллотетраплоида T. dicoccoides (ВВАА) (Huang et al., 2002;

Chalupska et al., 2008). Кроме геном-специфичных групп, для элементов Fatima показано также наличие “смешанной” группы, которая включает в себя элементы, принадлежащие к разным геномам мягкой пшеницы и ее диплоидных сородичей. Рассчитанное время инсерции элементов этой группы составляет 2.2–2.7 млн. лет назад, вероятно, их амплификация имела место в геноме общего предка видов Triticum и Aegilops, так как временной интервал соответствует периоду начала расхождения этих видов.

Таким образом, В-геном-специфичная FISH локализация gypsy-элементов Fatima в значительной степени объясняется появлением геном-специфичных групп элементов у диплоидного предшественника генома В Ae. speltoides и их амплификацией до момента его вхождения в состав аллополиплоида.

Амплификация геном-специфичных групп элементов могла оказать существенное влияние на дивергенцию хромосом трех геномов мягкой пшеницы, в том числе и таких функционально важных районов хромосом как субтеломеры.

Оценка геномных изменений субтеломерных последовательностей ДНК у природных и синтетических аллополиплоидов пшеницы Одной из задач работы являлась оценка эффективности ПЦР-анализа с праймерами, подобранными к определенным участкам субтеломерных геномных последовательностей (в том числе ISBP-маркерами), для выявления геномных изменений, имевших место в процессе эволюции и при образовании аллополиплоидов Triticum-Aegilops. Использование ISBP-маркеров и праймеров, ограничивающих кластер повторов Spelt1, разработанных в данном исследовании, позволило выявить полиморфизм между природными аллополиплоидами и их диплоидными предками: показано образование специфичных продуктов амплификации у аллополиплоидов, при отсутствии соответствующих фрагментов у диплоидных предков. В ряду искусственных аллополиплоидов изменений выявить не удалось, что, видимо, связано с малым количеством использованных маркеров. Таким образом, использование маркеров, разработанных в данном исследовании к участкам субтеломерных районов, является достаточно эффективным для оценки уровня геномных изменений, происходящих в этих районах в процессе эволюции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучение структуры таких функционально значимых участков хромосом, как субтеломеры, имеет большое значение для развития представлений о структурно-функциональной организации и эволюции хромосом эукариот.

Особый интерес представляет изучение субтеломерных районов в геномах аллополиплоидных и диплоидных видов Triticum и Aegilops, так как это позволит выявить механизмы дивергенции этих районов в процессе эволюции и при формировании аллополиплоидного генома.

Анализ первичной структуры двух ВАС-клонов, содержащих субтеломерные маркеры Spelt1 и Spelt52, показал, что ВАС-последовательности насыщены диспергированными повторяющимися последовательностями (мобильными элементами), которые являются наиболее динамичным компонентом генома. С помощью анализа нуклеотидной последовательности ВАС_2050О8, локализованной в дистальном районе длинного плеча 4B хромосомы T. aestivum, филогенетического анализа и анализа распределения на хромосомах последовательностей, входящих в состав ВАС_2050О8;

идентифицирована группа родственных семейств мобильных элементов, которая является характерной для субтеломерных районов хромосом Triticeae (Caspar подобные семейства САСТА ДНК-транспозонов). С помощью анализа ВАС_2383А24, содержащего субтеломерный маркер Spelt1 и локализованного на хромосоме 3B T. aestivum, нами идентифицирована последовательность, вносящая основной вклад в В-геном-специфичный спектр in situ гибридизации ВАС_2383А24 – gypsy LTR-ретротранспозон Fatima. Филогенетический анализ и анализ распределения на хромосомах пшеницы показали, что это семейство ретротранспозонов вносит существенный вклад в дифференциацию В-генома пшениц за счет образования и амплификации специфичных вариантов элементов.

Из литературных данных известно, что при образовании природных и искусственных аллополиплоидов происходит ряд геномных изменений, затрагивающих как повторяющиеся, так и низкокопийные и уникальные последовательности. В данной работе был проведен поиск ПЦР-маркеров к вариабельным участкам субтеломерных районов хромосом, которые позволили бы эффективно выявлять геномные изменения, происходящие в процессе эволюции и при образовании аллополиплоидов Triticum-Aegilops. Используя информацию о первичной структуре субтеломерных последовательностей ВАС_2050О8 и ВАС_2383А24, мы разработали специфичные праймеры, ограничивающие кластеры субтеломерных повторов Spelt1 и Spelt52, и праймеры, ограничивающие точки инсерций мобильных элементов (ISBP маркеры). ПЦР-анализ со специфичными праймерами, разработанными нами на основе ВАС-последовательностей, показал наличие полиморфизма между природными аллополиплоидами и их диплоидными предками, а именно, появление специфичных продуктов амплификации в геноме аллополиплоидов при отсутствии его у диплоидов;

в ряду искусственных аллополиплоидов Triticum-Aegilops изменений выявить не удалось. Таким образом, использование ISBP-маркеров является эффективным для выявления геномных изменений в субтеломерных районах в ряду аллополиплоидов Triticum-Aegilops, однако для выявления геномных изменений у искусственных аллополиплоидов необходимо разработать большое количество специфичных праймеров к субтеломерным участкам всех хромосом.

ВЫВОДЫ 1. Впервые охарактеризована нуклеотидная последовательность субтеломерного ВАС-клона 2050О8, содержащего маркер Spelt52 и принадлежащего к дистальному району длинного плеча 4B хромосомы мягкой пшеницы. В составе ВАС_2050О8 преобладают САСТА ДНК транспозоны (17.5% от всей длины ВАС_2050О8) и наблюдается низкое содержание ретроэлементов (8.4%);

гены составляют 6.1% данной последовательности.

2. Впервые охарактеризована нуклеотидная последовательность ВАС-клона 2383А24, содержащего субтеломерный маркер Spelt1 и принадлежащего к хромосоме 3В мягкой пшеницы. В составе ВАС_2383А24 преобладают LTR-ретротранспозоны (49.3% от всей длины ВАС_2383А24), из них 49% приходится на gypsy-семейство Fatima;

гены и ДНК-транспозоны составляют 4.3 и 4% от всей длины ВАС_2383А24, соответственно.

3. Показано, что субтеломерная последовательность Spelt52 в составе ВАС_2050О8 представлена только мономерными единицами типа Spelt52.2, которые имеют высокий уровень сходства друг с другом (93%).

Субтеломерные последовательности Spelt1 в составе ВАС_2383А24 также показывают высокую степень сходства друг с другом (96–98%), и имеют видоспецифичные нуклеотидные замены.

4. Впервые показано, что элементы, принадлежащие к группе родственных семейств САСТА ДНК-транспозонов (Caspar-подобные элементы) имеют преимущественную локализацию в субтеломерных районах хромосом диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops.

5. Впервые показано, что gypsy LTR-ретротранспозоны семейства Fatima вносят существенный вклад в дифференциацию генома В пшеницы за счет появления и амплификации геном-специфичных вариантов семейства Fatima у его предполагаемого предшественника Ae. speltoides в процессе эволюции.

6. Показано, что ПЦР-маркеры, выявляющие наличие инсерций мобильных элементов (ISBP-маркеры), являются эффективными для оценки уровня геномных изменений, происходящих в субтеломерных районах хромосом в процессе эволюции видов Triticum и Aegilops.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Salina E.A., Sergeeva E.M., Adonina I.G., Shcherban A.B., Afonnikov D.A., Belcram H., Huneau C., Chalhoub B.. Isolation and sequence analysis of the wheat B genome subtelomeric DNA // BMC Genomics. 2009. 10. P: 414.

2. Щербань А.Б., Сергеева Е.М., Бадаева Е.Д., Салина Е.А. Анализ изменений 5S рДНК у синтетических аллополиплоидов Triticum x Aegilops // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 4. С.604–611. (перечень ВАК) 3. Щербань, А.Б., Хлёсткина, Е.К., Сергеева, Е.М., Салина Е.А. Геномные изменения на ранних этапах образования аллополиплоида Aegilops longissima x Triticum urartu // Генетика. 2007. Т. 43. № 7. С.963–970. (перечень ВАК) 4. Адонина И.Г., Сергеева Е.М., Щербань А.Б., Салина Е.А. Дивергенция хромосом и геномов видов Aegilops и Triticum в процессе эволюции // Материалы международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск 31 августа – сентября. 2009. С. 52–53.

5. Sergeeva E., Salina E., Adonina I., Chalhoub B. CACTA DNA-transposon Caspar evolution across wheat species through sequence analysis and comparative in situ hybridization // Joint workshop 19th ITMI/3rd COST Tritigen, Clermont-Ferrand, France, August 31 - September 4 2009. 2009. P.177.

6. Salina E., Sergeeva E., Adonina I., Shcherban A., Afonnikov D., Belcram H., Huneau C., Chalhoub B. Structural analysis of subtelomeric chromosomal region of Triticum and Aegilops species // Joint workshop 19th ITMI/ 3rd COST Tritigen, Clermont Ferrand, France, August 31 - September 4 2009. 2009. P.59.

7. Сергеева Е.М., Адонина И.Г., Щербань А.Б., Шалуб Б., Салина Е.А. Анализ структурной организации участка субтеломерного района хромосомы 4BL Triticum aestivum // V Съезд ВОГиС, Москва, 21-28 июня 2009 г. 2009. Ч.1. C.320.

8. Salina E.A., Sergeeva E.M., Adonina I.G., Shcherban A.B., Belcram H., Huneau C., Chalhoub B. Composition and location of wheat BAC sequences marked by Aegilops speltoides subtelomeric repeats // The 11th International Wheat Genetics Symposium proceedings, 24-29 August, Brisbane, Qld, Australia 2008, http://ses.library.usyd.

edu.au/bitstream/2123/3499/ 1/P101.pdf.

9. Salina E.A., Sergeeva E.M., Adonina I.G., Shcherban A.B., Belcram H., Huneau C., Chalhoub B. Structural analysis of subtelomeric chromosomal region of Triticum and Aegilops and its applied to wheat hybrids study // The Russian-French Conference "Problems and Prospects in Plant Biotechnology", October 21-24, 2008, http://www.

bionet.nsc.ru/meeting/ rus_france2008/ 10. Sergeeva E.M., Adonina I.G., Afonnikov D.A., Chalhoub B., Salina E.A.. Analysis of continuous 119737 bp stretch of subtelomeric DNA isolated from Triticum aestivum BAC-library // The Sixth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia, June 22-28, 2008. 2008. P.218.

11. Сергеева Е.М., Щербань А.Б., Адонина И.Г., Салина Е.А. Структурная организация субтеломерных участков хромосом Triticum aestivum по результатам анализа ВАС-клонов // Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 10 - 12 мая 2007 г.). Томск, 2007. С.158.

12. Сергеева Е.М., Щербань А.Б., Адонина И.Г., Салина Е.А. Структурная организация субтеломерных районов хромосом Triticum aestivum по результатам анализа BAC-клонов // Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.). М., 2006. С.180.

13. Сергеева Е.М. Геномные изменения у искусственных аллополиплоидов Triticum Aegilops (2n=4x=28) // Материалы XLII МНСК «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск. 2004. С.67.

14. Хлесткина Е.К., Щербань А.Б., Сергеева Е.М., Салина Е.А. Идентификация делеций геномной ДНК у вновь созданных амфиплоидов // Материалы 2-й научной конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики». Москва, 2003.

C. 198–199.