Получение, характеристика и аналитическое применение антител к фуллерену с60
На правах рукописи
Федюнина Нина Сергеевна
ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И АНАЛИТИЧЕСКОЕ
ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛ К ФУЛЛЕРЕНУ С60
Специальность 03.01.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата химических наук
Москва – 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институте биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук доктор химических наук, профессор Научные руководители:
Дзантиев Борис Борисович кандидат биологических наук Жердев Анатолий Виталиевич Шишкин Сергей Сергеевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией Каплун Александр Петрович доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова», профессор кафедры органической химии Федеральное государственное бюджетное
Ведущая организация:
учреждение науки Институт физиологически активных веществ Российской академии наук
Защита состоится «26» апреля 2012 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук;
119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН;
119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.
Автореферат разослан «24» марта 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский Александр Федорович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Фуллерены – новая аллотропная форма углерода, обладающая уникальной геометрической структурой и необычными для углеродных веществ физическими, химическими и биологическими свойствами.
В настоящее время углеродные наночастицы интенсивно применяются в различных областях промышленности и медицины. Рост объемов нанотехнологической продукции обуславливает значимость рассмотрения фуллеренов как фактора риска для здоровья живых организмов и состояния экосистем. Установлено, что углеродные наночастицы проникают через мембраны клеток, преодолевают гематоэнцефалический барьер, что потенциально может приводить к их накоплению в органах и тканях и влиянию на физиологические процессы. В связи с этим актуальна задача разработки высокоспецифичных, чувствительных и быстрых методов определения фуллеренов в биообъектах.
Перспективны для детекции фуллеренов иммунохимические методы, основанные на связывании анализируемых соединений с антителами и сочетающие экспрессность, высокую специфичность, низкий предел обнаружения. Из иммунохимических методов анализа в настоящее время наиболее широко применяется микропланшетный иммуноферментный анализ, что обусловлено развитой приборной базой, обеспечивающей высокую производительность анализа и автоматизацию его проведения.
В литературе ранее не сообщалось о разработке иммуноаналитических систем, пригодных для определения фуллеренов и в растворах и в составе биопроб. Реализация таких систем требует получения специфических антител и детальной характеристики иммунного взаимодействия с фуллеренами, их производными и структурными аналогами в разных реакционных средах.
Цель и задачи работы.
Получение антител к фуллерену С60, характеристика их антиген– связывающих свойств и изучение возможности применения анти– фуллереновых антител для детекции углеродных наночастиц в различных матриксах методом иммуноферментного анализа.
Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:
1) синтез конъюгатов фуллерена С60;
Используемые сокращения и обозначения: АС – антисыворотка, БСА – бычий сывороточный альбумин, ДМФА – диметилформамид, ИФА – иммуноферментный анализ, ППР – поверхностный плазмонный резонанс, ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия, СИТ – соевый ингибитор трипсина, ТГ – тиреоглобулин, ФБ – 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, ЭДФ – этилендиаминфлуоресцеинтио– карбонат, 2,4–D – 2,4–дихлорфеноксиуксусная кислота, IC10 – предел обнаружения, КА – равновесная константа ассоциации.
2) получение поли– и моноклональных антител к фуллерену С60;
3) характеристика аффинности и специфичности полученных антител;
4) выбор среды, оптимальной для сольватации фуллеренов и проведения иммунного взаимодействия;
5) разработка иммуноферментного метода определения фуллерена С60, его производных и структурно близких углеродных наночастиц;
6) апробация метода для определения фуллерена С60 в гомогенатах тканей животных.
Научная новизна работы.
Изучена специфичность взаимодействия анти–фуллереновых антител с водорастворимыми производными фуллерена С60 (конъюгатами фуллерен– белок, фуллеренолом, карбоксилированным фуллереном), а также с немоди фицированными фуллеренами С60, С70 и углеродными нанотрубками.
Впервые разработан иммуноферментный метод определения фуллерена в водно–органической среде и биологическом материале.
Практическая значимость работы.
Показана возможность иммунохимического определения углеродных наночастиц с пределом обнаружения для фуллерена С60 0,4 нг/мл.
Разработанные методы перспективны для использования в токсикологических исследованиях, в экологическом и санитарно–гигиеническом мониторинге, а также для технологического контроля на предприятиях наноиндустрии.
Связь работы с государственными программами.
Работа выполнена при поддержке Федеральных целевых программ «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008– 2011 годы» и «Научные и научно–педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.
Апробация работы.
Основные результаты исследования представлены на Втором и Третьем Международных форумах по нанотехнологиям (2009, 2010), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (2009), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия – новые методы и возможности» (2010), Шестом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2011).
Публикации.
По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах и 5 тезисов докладов.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (7 глав), выводов и списка использованной литературы (188 ссылок). Работа изложена на 110 страницах и включает 51 рисунок и 13 таблиц.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика препаратов фуллерена С60 в диметилформамиде и в смеси диметилформамид – фосфатный буфер Учитывая нерастворимость фуллеренов в водно–солевых растворах и невозможность использовать для целей иммуноанализа растворители, не смешивающиеся с водой, были получены препараты фуллерена С60 («SES Research», США) в диметилформамиде (ДМФА) и в водно–органической смеси ДМФА : фосфатный буфер (ФБ) в соотношении 1:1. Данные препараты были охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (см. рис. 1 в качестве примера) и динамического светорассеяния.
а б Рис. 1. Электронно–микроскопические фотографии препаратов фуллерена С60 с концентрацией 50 мкг/мл: а) в ДМФА, б) в смеси ДМФА с ФБ, полученные на электронном микроскопе JEM/100CX/SEG («Jeol», Япония) Электронно-микроскопические фотографии в цифровой форме анализировали с использованием программы UTHSCSA Image Tool («UTHSCSA», США).
На основании данных регистрации динамического светорассеяния определены гидродинамические радиусы частиц в препаратах фуллерена.
Измерения проводили при 25°С в 20 повторах на приборном комплексе Photocor («Photocor Instruments», США). Полученные данные обрабатывали с помощью программы DynaLS_v2.5.2 («Alango», Израиль).
Результаты применения обоих методов свидетельствуют о том, что препараты фуллерена С60 в ДМФА и смеси ДМФА:ФБ содержат две фракции частиц, отличающихся по среднему диаметру (см. табл. 1, 2).
Таблица 1. Характеристика препаратов фуллерена С60 в ДМФА и смеси ДМФА:ФБ методом ПЭМ Препарат Среднее Среднее Степень Доля фуллерена и значение значение эллиптич- частиц в его концентра- максимальной минимальной ности ± s.d.* препарате, ция, мкг/мл оси ± s.d.*, нм оси ± s.d.*, нм % С60 в ДМФА 20 76±23 62±17 1,14±0,11 167±54 133±42 1,25±0,15 40 71±19 50±16 1,49±0,38 130±30 101±24 1,31±0,28 50 87±35 64±21 1,23±0,17 189±48 161±38 1,22±0,27 200 124±46 112±36 1,12±0,08 237±58 191±27 1,34±0,14 С60 в смеси ДМФА:ФБ 20 63±28 47±12 1,18±0,05 148±44 114±32 1,34±0,26 40 97±26 73±18 1,13±0,09 198±41 167±34 1,21±0,12 50 78±29 58±15 1,17±0,09 181±89 161±65 1,11±0,07 200 108±31 88±19 1,13±0,06 264±43 232±37 1,21±0,13 * – стандартное отклонение.
Таблица 2. Гидродинамические радиусы частиц в препаратах фуллерена С Препарат фуллерена Среднее значение гидро- Доля частиц в и его концентрация, мкг/мл динамического радиуса, нм препарате, % С60 в ДМФА 20 69 600 40 80 500 50 108 430 200 94 800 С60 в смеси ДМФА:ФБ 20 11 350 500 40 89 500 50 50 330 500 200 78 500 Диаметры частиц в препаратах фуллерена С60 в ДМФА и в смеси ДМФА с ФБ, установленные методом динамического светорассеяния, превышают значения, измеренные методом ПЭМ. Это объясняется тем, что гидродинамический радиус включает в себя и электронно-плотное ядро, которое регистрируется методом ПЭМ, и гидратную оболочку частиц.
Полученные результаты свидетельствуют о тенденции фуллерена образовывать кластеры, состоящие из значительного числа молекул.
2. Получение конъюгатов фуллерен С60–белок Поскольку непосредственная иммунизация фуллереном как соединением с низкой молекулярной массой (гаптеном) не вызывает иммунного ответа, были синтезированы конъюгаты фуллерена с белковыми носителями, необходимые как иммуногены для получения анти–фуллереновых антител и как компоненты разрабатываемых иммуноаналитических систем.
Так как молекула фуллерена не содержит реакционноспособных групп, для конъюгации с белками применяли его карбоксильное производное – (1,2– метанофуллерен С60)–61–карбоксильную кислоту, С60–СООН («Sigma– Aldrich», США) (рис. 2б). Синтезированы конъюгаты данного производного с тиреоглобулином (ТГ), бычьим сывороточным альбумином (БСА) и соевым ингибитором трипсина (СИТ) с мольными соотношениями гаптен:белок при синтезе, равными 100:1, 20:1 и 10:1, соответственно. В основе методики конъюгирования лежит активация карбоксильного производного карбодиимидом и последующее взаимодействие с аминогруппами белка.
С учетом особенностей гаптена методика карбодиимидного синтеза была модифицирована;
показана оптимальность сочетания двух активаторов, N–гидроксисукцинимида и 1–циклогексил–3–(–2–морфолиноэтил)–карбоди имид мето–п–толуол сульфоната, и мольного соотношения гаптена и активаторов 1:35:20, соответственно.
NH БЕЛОК O O C OH C CH CH Cl N N (H3C) 2HCHN N NH(CH2)5COOH а в б H NH(CH2)5COOH O O C C NH БЕЛОК H Cl Cl г д Рис. 2. Структура реагентов, использованных при разработке иммуноанализа фуллерена: а) конъюгат фуллерен–белок, б) (1,2–метанофуллерен С60)–61– карбоксильная кислота, в) карбоксильное производное атразина, г) конъюгат 2,4–дихлорфеноксиуксусная кислота–белок (2,4–D–белок), д) фуллерен аминокапроновая кислота Количественный состав конъюгатов характеризовали спектрально. Как видно из рис. 3, кривые 1–3, спектры поглощения синтезированных конъюгатов содержат характерные для фуллерена С60 пики при 330 нм.
2, Оптическая плотность 1, =330 нм 1, 0,5 0, 250 300 350 400 450 Длина волны, нм Рис. 3. Спектры поглощения: 1) С60–БСА, 2) С60–ТГ, 3) С60–СИТ, 4) СИТ, 5) ТГ, 6) БСА, 7) (1,2–метанофуллерен С60)–61–карбоксильной кислоты На основании спектральных характеристик конъюгатов определено мольное соотношение гаптен:белок, равное 36:1, 9:1 и 2:1 для С60–ТГ, С60–БСА и С60–СИТ, соответственно. Данный состав был подтвержден титрованием свободных реакционноспособных аминогрупп.
3. Получение антител В качестве иммуногенов были выбраны конъюгаты с максимальным (С60– ТГ, 36:1) и минимальным (С60–СИТ, 2:1) числом молекул гаптена, содержащие белковую компоненту с высокой (660 kDa) и относительно небольшой (20 kDa) молекулярной массой.
На базе вивария Института биохимии им. А.Н.Баха РАН проведено три цикла иммунизации кроликов и получены 9 препаратов поликлональных антисывороток.
В рамках совместной работы на базе Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения получены 10 препаратов моно клональных антител.
4. Измерение констант взаимодействия производных фуллерена с антителами методом поверхностного плазмонного резонанса Связывание полученных антител с водорастворимыми антигенными препаратами количественно характеризовали на приборе Biacore Х («BIAcore», Швеция), регистрируя эффект поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Для измерения констант взаимодействия антиген–антитело использовали декстрановые чипы СМ5.
В предварительных экспериментах конъюгат С60–БСА или карбоксильное производное фуллерена разводили в буфере с различными значениями pH (от 2,5 до 6,5) и пропускали через неактивированный чип. Максимальный отклик системы был зафиксирован при использовании 10 мМ ацетатного буфера, рН 3,0.
На следующем этапе проводили активацию поверхности сенсорного чипа, используя раствор гидрохлорида N–этил–3–(3–диметиламинопропил) карбодиимида и N–гидроксисукцинимида (1:1), после чего пропускали раствор С60–БСА или С60–СООН в выбранном буфере;
непрореагировавшие активные группы блокировали этаноламином. Далее в ячейку прибора вводили антитела в концентрациях от 4 до 200 нМ и, исходя из регистрируемых сигналов сенсора, вычисляли константы реакции антиген–антитело.
Взаимодействия проводили в 50 мМ HEPES буфере, рН 7,4, скорость потока варьировали от 5 до 75 мкл/мин. В контрольной ячейке на поверхности чипа антиген не иммобилизовали, а остальные реагенты вносили так же, как в опытной ячейке. После измерений через ячейку пропускали регенерирующий раствор – 0,1 М глициновый буфер, рН 2,0, в котором комплекс антиген – антитело полностью диссоциирует и антитела удаляются с поверхности чипа.
На рис. 4 представлена характерная зависимость сигнала сенсора от концентрации антител.
Моноклональные антитела (10 клонов), полученные против фуллерена С60, были протестированы методом поверхностного плазмонного резонанса.
Равновесные константы ассоциации (КА) конъюгата С60–белок и карбоксильного производного фуллерена С60 с моноклональными антителами восьми клонов к фуллерену С60 варьировали в диапазоне от 2,7·106 до 6,6·107 М–1 в зависимости от клона и иммобилизованного антигена (табл. 3).
Для двух клонов (Е1 и F6) связывание с антигеном было крайне низким и не давало возможности вычислить константы ассоциации.
Полученные результаты позволили перейти к разработке иммуно ферментного анализа с использованием 8 клонов антител.
Сигнал сенсора, RU 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1, Концентрация антител, мкМ Рис. 4. Зависимость максимального сигнала сенсора от концентрации моноклональных антител, клон С12 (красные точки – экспериментальные данные, кривая – их аппроксимация с помощью программы «BIAevaluation», режим «Steady state affinity») Таблица 3. Равновесные константы взаимодействия C60–БСА и С60–СООН с моноклональными антителами Моноклональные КА х 107, М– антитела Производное фуллерена С60–БСA C60–СOOH Клон В1 1, 6, Клон В2 3,9 3, Клон В11 3,3 5, Клон С12 4,4 5, Клон D3 5,7 1, Клон F11 3,6 2, Клон G4 1,4 2, Клон Н1 3,7 0, 5. Скрининг антител Полученные препараты поли– и моноклональных антител характеризовали по величине титра в микропланшетном иммуноферментном анализе. Титр поликлональных антисывороток варьировал от 1:10.000 до 1:700.000 в зависимости от иммуногена и иммобилизованного конъюгата фуллерен–белок. В ходе иммунизации наблюдалось снижение титра сывороток и чувствительности анализа. Для дальнейших исследований были выбраны три антисыворотки после первого цикла иммунизации (АС1 и АС против С60–СИТ, АС 3 против С60–ТГ). Для моноклональных антител величина титра варьировала от 0,5 до 3.000 нг/мл в зависимости от клона и иммобилизованного конъюгата.
Примеры кривых иммуноферментного титрования поли– и монокло нальных антител при регистрации специфических и неспецифических взаимодействий представлены на рис. 5, 6. Отсутствие взаимодействия антител с иммобилизованными немодифицированными белками и карбодиимидными конъюгатами этих же белков с другими гаптенами (рис. 5, кривые 4,5;
рис. 6, кривые 5–7) подтверждает специфичность полученных антител к фуллерену, а не к структурам белка–носителя и «мостикового»
участка белок–гаптен в составе иммуногенного препарата.
2, 2, 1, A 1, 0, 4- 0, 10- 10-7 10-6 10- 10- Разведение антисыворотки Рис. 5. Кривые микропланшетного иммуноферментного титрования АС 1 на иммобилизованном конъюгате С60–ТГ (1), АС2 (2) и АС3 (3) на иммоби лизованном конъюгате С60–БСА, АС1 на иммобилизованном конъюгате 2,4–D– ТГ (4), АС1 на иммобилизованном БСА (5) 1, 0, 0, A 0, 0, 0,0 2 103 1 10 [Моноклональные антитела], нг/мл Рис. 6. Кривые микропланшетного иммуноферментного титрования моноклональных антител: 1) клон С12 на иммобилизованном конъюгате С60– СИТ, 2) клон Н1 и 3) клон В1 на иммобилизованном конъюгате С60–ТГ, 4) клон В1 и 5) клон Н1 на иммобилизованном ТГ, 6) клон Н1 и 7) клон В1 на иммобилизованном конъюгате 2,4D–ТГ 6. Конкурентный ИФА конъюгатов С60–белок с использованием поли– и моноклональных антител Изучение возможности применения анти–фуллереновых антител для детекции углеродных наночастиц было начато с разработки иммуноферментного метода определения конъюгированных производных фуллерена. Интерес к детекции данных препаратов обусловлен тем, что при попадании в живые организмы наночастицы фуллерена образуют комплексы с различными белками.
Три конъюгата С60–белок (С60–БСА, С60–СИТ, С60–ТГ), три антисыворотки и 8 клонов моноклональных антител были протестированны в схеме, основанной на конкурентном взаимодействии антигена (конъюгат С60–белок), адсорбированного в лунках микропланшетов, и антигена в растворе (тестируемой пробы) со специфическими антителами и последующем выявлении образующихся иммунных комплексов с помощью меченных пероксидазой антивидовых антител.
Для оптимизации анализа (снижения предела обнаружения) были проварьированы: время проведения стадии конкурентного взаимодействия (от 0,5 до 2 ч), иммобилизуемые конъюгаты фуллерен–белок и их концентрации (от 0,1 до 1 мкг/мл), а также ионная сила реакционной среды (от 5 до 25 мМ ФБ) и детергент (Тритон X–100, Tвин 80). В результате было показано, что для ИФА на основе поликлональных антител при сорбции конъюгата С60–ТГ в концентрации 0,1 мкг/мл, использовании АС1 в разведении 1:25.000 и при продолжительности инкубирования антигена–конкурента с антителами 1 ч в реакционной среде 5 мМ ФБ с 0,05% Тритона Х–100 достигается минимальный предел обнаружения С60–БСА, равный 0,4 нг/мл (по белку) (рис.
7). Предел обнаружения фуллерена в конъюгате, рассчитанный на основании мольного соотношения гаптен:белок, составляет 0,04 нг/мл.
0, 0, A 0, 0, 0, 0,1 1 10 100 [Конкурент], нг/мл Рис. 7. Конкурентные кривые ИФА для конъюгатов С60–БСА (1), 2,4D–БСА (2) и белка–носителя БСА (3) с использованием поликлональных антител (АС1) Для ИФА на основе моноклональных антител при сорбции конъюгата С60– ТГ в концентрации 0,5 мкг/мл, использовании клона Н1, продолжительности конкурентного взаимодействия с антигеном 90 мин и выборе в качестве реакционной среды 5 мМ ФБ с 0,05% Тритона Х–100 предел обнаружения конъюгата С60–СИТ равняется 3 нг/мл, а предел обнаружения фуллерена в этом конъюгате – 0,2 нг/мл (рис. 8).
0,8 0, A 0, 0, 0, 1 [Конкурент], нг/мл Рис. 8. Конкурентные кривые ИФА для конъюгатов С60–БСА (1), 2,4D–БСА (2) и белка–носителя БСА (3) с использованием моноклональных антител, клон В Таблица 4. Пределы обнаружения (IC10) конъюгатов С60–белок методом ИФА с использованием поликлональных антител Иммобили– Поликлональные Антиген IC10 IC № зованный препараты в растворе по белку, по С60, антиген нг/мл нг/мл 1 C60–ТГ АС1 C60–БСА 0,4 0, 2 С60–ТГ АС 1 C60–ТГ 1,0 0, 3 C60–ТГ АС 2 C60–БСА 0,6 0, 4 C60–ТГ АС 2 C60–ТГ 1,1 0, 5 C60–БСА АС 3 C60–СИТ 3,0 0, 6 C60–БСА АС 3 C60–БСА 1,0 0, 7 C60–БСА АС 1 C60–БСА 1,1 0, 8 C60–БСА АС 2 C60–БСА 2,4 0, 9 C60–БСА АС 2 C60–ТГ 9,2 0, 10 C60–СИТ АС 3 C60–СИТ 7,1 0, 11 C60–СИТ АС 3 C60–БСА 1,4 0, Таблица 5. Пределы обнаружения (IC10) конъюгатов С60–белок методом ИФА с использованием моноклональных антител Иммобилизованный Клон Антиген в IC10 IC № антиген антител растворе по белку, по С60, нг/мл нг/мл 1 C60–ТГ B1 C60–СИТ 14,8 1, 2 C60–ТГ B11 C60–БСА 18,8 1, 3 C60–ТГ C12 C60–БСА 12,0 1, 4 C60–ТГ C12 C60–БСА 13,6 1, 5 C60–ТГ F11 C60–СИT 13,7 1, 6 C60–ТГ G4 C60–БСА 3,4 0, 7 C60–ТГ H1 C60–СТИ 3,0 0, 8 C60–ТГ H1 C60–БСА 3,8 0, 9 C60–СИT C12 C60–БСА 6,4 0, 10 C60–СИT C12 C60–СИT 7,6 0, 11 C60–СИT F11 C60–БСА 5,1 0, 12 C60–СИT H1 C60–БСА 4,4 0, 13 C60–БСА C12 C60–СИT 7,3 0, 14 C60–БСА C12 C60–БСА 4,4 0, Полученные для разных комплектаций тест–систем пределы обнаружения фуллерена С60 в конъюгатах С60–белок в оптимизированных условиях, не превышающие 2 нг/мл, представлены в табл. 4, 5.
Как видно из табл. 4, строки 5 и 6, 10 и 11, пределы обнаружения, рассчитанные по содержанию фуллерена С60, для одних и тех же иммунореагентов варьируют в довольно ограниченных пределах – не более чем в 3 раза. Это свидетельствует о распознавании антителами непосредственно гаптена и слабом влиянии на степень связывания антител природы белка–носителя.
При сравнении разных сочетаний иммунореагентов с использованием моноклональных антител (табл. 5) установлено, что минимальный предел обнаружения фуллерена С60 в конъюгате С60–белок наблюдается для двух вариантов: клон Н1 либо клон G4 и иммобилизованный конъюгат С60–ТГ.
7. Конкурентный ИФА водорастворимых производных фуллерена На следующем этапе работы была изучена возможность определения водорастворимых производных фуллерена – фуллеренаминокапроновой кислоты в форме натриевой соли, С60(H)3(NH(CH2)5COONa)3 и гидроксилиро ванного фуллерена (фуллеренола) («Интелфарм», Россия). Данные препа раты фуллерена использовали в иммуноферментном анализе в качестве антигенов–конкурентов и изучали их взаимодействие со всеми клонами анти тел. На рис. 9, 10 представлены примеры полученных конкурентных кривых, а также проверки специфичности иммунохимического взаимодействия.
0, 0, A 0, 0, 0,1 1 10 100 [Конкурент], нг/мл Рис. 9. Конкурентные кривые ИФА фуллеренаминокапроновой кислоты (1), карбоксильного производного атразина (2) и аминокапроновой кислоты (3), по лученные при иммобилизации конъюгата С60–СИТ и использовании клона В 0, 0, 0, 0, A 0, 0, 0, 0,1 1 10 100 [Фуллеренол], нг/мл Рис. 10. Конкурентная кривая ИФА фуллеренола, полученная при иммоби лизации конъюгата С60–СИТ и использовании клона В Эксперименты показали, что антитела не взаимодействуют с карбоксильным производным атразина и аминокапроновой кислотой, которые содержат пять метиленовых групп и концевую карбоксильную группу, характерные и для модифицированного фуллерена (рис. 9, кривые 2, 3).
При сравнении разных сочетаний иммунореагентов (табл. 6) установ лено, что минимальный предел обнаружения фуллеренаминокапроновой кислоты, равный 0,8 нг/мл, достигается при иммобилизации конъюгата С60–СИТ и использовании клона В1.
Таблица 6. Пределы обнаружения (IC10) фуллеренаминокапроновой кислоты методом ИФА Иммобилизованный Клон IC10, антиген антител нг/мл C60–СИТ B1 0, C60–СИТ B2 2, C60–СИТ C12 3, C60–СИТ D3 7, C60–БСА G4 2, C60–БСА B1 2, C60–БСА C12 3, C60–ТГ G4 1, C60–ТГ F11 8, Минимальный предел обнаружения фуллеренола (табл. 7) равен 0,9 нг/мл и достигается при иммобилизации конъюгата С60–СИТ и использовании клона С12.
Таблица 7. Пределы обнаружения (IC10) фуллеренола методом ИФА Иммобилизованный Клон IC10, антиген антител нг/мл C60–СИТ H1 1, C60–СИТ B1 5, C60–СИТ C12 0, C60–ТГ C12 2, C60–ТГ F11 1, C60–ТГ B1 3, 7. Конкурентный ИФА фуллерена С Немодифицированный фуллерен нерастворим в водных средах и малорастворим в полярных растворителях, совместимых с иммуноанализом.
В связи с этим разработка иммуноанализа невозможна без выбора реакционной среды, оптимальной как для солюбилизации фуллерена, так и для проведения иммунного взаимодействия.
Проведен скрининг различных водно–органических смесей для гидра тации фуллерена С60 с целью применения в иммуноанализе. Потенциально применимые среды можно разделить на три группы: водно–солевые, неполярные и полярные органические растворители. Растворимость фулле рена С60 в водно–солевых средах не превосходит 1 пг/мл. В неполярных органических растворителях (бензол, толуол и т.д.) растворимость фуллерена составляет от 1,5 до 2,9 мг/мл, но данные среды не смешиваются с водно– солевыми растворами. Таким образом, две первые группы непригодны для проведения иммуноанализа.
Растворимость фуллерена С60 в полярном растворителе ДМФА составляет около 50 мкг/мл, что потенциально достаточно для иммуноанали тического применения. Известно, что ДМФА не препятствует иммуно химическим взаимодействиям, если его содержание в реакционной среде не превосходит 15%. С учетом этих особенностей для солюбилизации фуллерена был использован диметилформамид. Перед анализом раствор С в ДМФА разбавляли фосфатным буфером.
Установленные пределы обнаружения немодифицированного фуллерена с использованием различных сочетаний клонов моноклональных антител и иммобилизованных конъюгатов фуллерен–белок приведены в табл. 8.
Следует отметить существенное варьирование пределов обнаружения в зависимости от комплектации аналитической системы. Минимальный предел обнаружения, 2 нг/мл, зафиксирован для сочетания клона Н1 и конъюгата С60–СИТ.
Таблица 8. Пределы обнаружения (IC10) свободного фуллерена С60 методом ИФА Иммобилизованный Клон антител IC10, антиген нг/мл C60–СИТ H1 2, C60–СИТ B1 C60–СИТ C12 C60–ТГ B11 Показано, что анти–С60 моноклональные антитела перекрестно реагируют с фуллереном С70. Предел обнаружения фуллерена С70 составляет 5,5 нг/мл при использовании клона Н1 и конъюгата С60–ТГ.
Также выявлено конкурентное взаимодействие с другим классом углеродных наночастиц – нанотрубками. Предел обнаружения многостенных нанотрубок равен 9 нг/мл при использовании клона В1 и конъюгата С60–СИТ.
8. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ В качестве альтернативного метода, подтверждающего специфич ность связывания полученных антител с фуллереном и его структурными аналогами и регистрирующего при этом взаимодействия в растворе (без использования реагента, иммобилизованного на твердой фазе), был реализован поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА).
ПФИА основан на конкурентном взаимодействии меченного флуоресцентной меткой антигена (трейсера) и немеченого (определяемого) антигена со специфическими антителами, сопровождающемся облучением реакционной смеси плоскополяризованным светом. Молекулы небольших размеров, такие как трейсер, быстро вращаются и между поглощением и эмиссией равновероятно принимают любую ориентацию, излучая, таким образом, деполяризованный свет. При связывании трейсера с антителом образуется иммунный комплекс, который медленно вращается и поэтому в момент эмиссии частично сохраняет ту же ориентацию, что и при поглощении света, а значит, сохраняет и поляризацию излучаемого света. Регистрируемая величина поляризации флуоресценции (mP) отражает отношение связанных и свободных молекул трейсера в реакционной смеси и может быть использована для определения концентрации немеченого антигена, конкурентно препятствующего образованию комплексов антитело–трейсер.
На первом этапе разработки ПФИА методом активированных эфиров был синтезирован конъюгат (1,2–метанофуллерен С60)–61–карбоксильной кислоты (рис. 4а) с флуоресцентной меткой – этилендиаминфлуоресцеин– тиокарбанатом (ЭДФ). При разделении реакционной смеси методом тонкослойной хроматографии наблюдали три полосы, каждую из которых элюировали метанолом и исследовали на связывание с антителами. Для дальнейшего исследования был выбран конъюгат С60–ЭДФ c величиной Rf (ratio of fronts – отношение фронтов), равной 0,7.
Для обеспечения максимальной чувствительности ПФИА оптимизированы концентрации трейсера и антител. Градуировочный график детекции фуллерена С60 представлен на рис. 11.
mP 0,1 1 10 100 [C60], нг/мл Рис. 11. Конкурентная кривая ПФИА фуллерена С60, полученная при использовании моноклональных антител, клон С12 (1), и конкурентная кривая контрольного эксперимента с моноклональными антителами к хлорам фениколу (2) Предел обнаружения данным методом фуллерена С60 – 2,1 нг/мл, фуллеренаминокапроновой кислоты – 1,2 нг/мл, фуллеренола – 5 нг/мл.
Время определения 10 мин.
В системе ПФИА были проведены эксперименты с использованием моноклональных антител иной специфичности. Как видно из рисунка 11, кривая 2, для антител к хлорамфениколу изменения степени поляризации флуоресценции в зависимости от концентрации фуллерена не наблюдается.
Данные ПФИА подтверждают специфичность полученных моноклональных антител. Кроме этого, разработанный ПФИА является первым экспрессным методом определения немодифицированного фуллерена и его водорастворимых производных (продолжительность анализа сокращается в 10 раз по сравнению с ИФА).
9. ИФА фуллерена в биологических образцах Иммуноферментная детекция фуллерена в гомогенатах органов животных требует предварительной пробоподготовки, минимизирующей влияние биоматрикса на результаты анализа. Были апробированы несколько методов пробоподготовки биологических образцов. Экспериментально установлено, что влияние матрикса не устраняется обработкой образцов комплексом грибных протеаз/пептидаз или концентрированными неорганическими кислотами.
При участии сотрудников лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН разработан и оптимизирован способ пробоподготовки гомогенатов органов животных для детекции фуллерена С60.
Способ основан на обработке гомогенатов ледяной уксусной кислотой и трехкратной экстракции С60 толуолом с последующей отгонкой растворителя и переводом фуллерен–содержащего экстракта в смесь ДМФА с фосфатным буфером (1:1). Данный способ обеспечивает распознавание фуллерена антителами и оптимален для пробоподготовки гомогенатов животных тканей.
Методом ИФА фуллерен С60 был обнаружен в гомогенатах печени, почек, селезенки, мозга и легких крыс, подвергшихся однократному внутри брюшинному введению фуллерена (рис. 12, табл. 9).
0, 0, 0, А 0, 0, 0, 0, 10-5 10- 10-4 0, 0, Разведение гомогенатов органов Рис. 12. Конкурентные кривые ИФА фуллерена С60 в гомогенатах почек крысы после внутрибрюшинной экспозиции (1), почек контрольной крысы (2), печени крысы после внутрибрюшинной экспозиции (3) и печени контрольной крысы (4). ИФА проводили с использованием клона Н1 и иммобилизованного конъюгата С60–СИТ Таблица 9. Выявление фуллерена С60 методом ИФА в гомогенатах органов крыс, подвергшихся внутрибрюшинной и внутрижелудочной экспозиции С Орган Внутрибрюшинная Внутрижелудочная экспозиция экспозиция Печень + + Кишечник + + Селезенка + – Легкие + – Почки + – Мозг НО + НО – не определялся.
Разработанный метод ИФА был также применен для характеристики органов крыс, подвергшихся внутрижелудочной экспозиции фуллереном С60 в условиях хронического эксперимента. Определение проводили в гомогенатах кишечника, печени, селезенки, почек, легких и мозга, предоставленных Институтом физиологически активных веществ РАН. Фуллерен был обнаружен в гомогенатах печени, мозга и кишечника (рис. 13, табл. 9).
0, 0, 0, А 0, 0, 0, 0, 10- 10- 10-5 0, 0, Разведение гомогенатов органов Рис. 13. Конкурентные кривые ИФА фуллерена С60 в гомогенатах мозга крысы на 7–й (1), 18–й (2) и 30–й (3) дни после внутрижелудочной экспозиции фуллереном С60 в дозе 50 мг/животное и в гомогенате мозга контрольной крысы (4). ИФА проводили с использованием клона Н1 и иммобилизованного конъюгата С60–СИТ Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой С18 подтверждено, что в гомогенатах фуллерен содержится в немодифицированной форме.
Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанный метод иммуноферментного анализа эффективен для детектирования свободного фуллерена С60 как в растворах, так и в биологических образцах.
ВЫВОДЫ 1. Получены и охарактеризованы иммунореагенты для детекции фуллерена С60: конъюгаты фуллерена с белками, поли– и моноклональные антитела к фуллерену С60, конъюгат фуллерена С60 с флуоресцентной меткой.
2. Изучена специфичность полученных анти–фуллереновых антител к различным классам углеродных наночастиц. Установлено, что моноклональные антитела против фуллерена С60 обладают перекрестной реактивностью с фуллереном С70 и многостенными углеродными нанотрубками.
3. Изучено взаимодействие водорастворимых производных фуллерена с специфическими моноклональными антителами методом поверхностного плазмонного резонанса. Равновесные константы ассоциации, характеризующие образование иммунного комплекса, варьируют в диапазоне от 2,7·106 до 6,6·107 М–1.
4. Впервые разработаны методы твердофазного иммуноферментного анализа и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, позволяющие определять фуллерены С60, С70 и углеродные нанотрубки с пределом обнаружения фуллерена С60 0,4 нг/мл.
5. Разработан метод пробоподготовки биологического материала для детекции фуллерена С60, основанный на жидкостной экстракции и переводе фуллерен–содержащего экстракта в смесь диметилформамида с фосфатным буфером.
6. Показана возможность применения разработанного иммуноферментного метода для определения фуллерена С60 в гомогенатах органов животных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Hendrickson O.D., Fedyunina N.S., Martianov A.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B.
Production of anti–fullerene C60 polyclonal antibodies and study of their interaction with a conjugated form of fullerene. – Journal of Nanoparticle Research, 2011, v. 13, N 9, pp. 3713–3719.
2. Hendrickson O.D., Fedyunina N.S., Zherdev A.V., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Dzantiev B.B. Production of monoclonal antibodies against fullerene C60 and development of fullerene enzyme immunoassay. – Analyst, 2012, v. 137, N 1, pp. 98–105.
3. Гендриксон О.Д., Пенькова (Федюнина) Н.С., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б.
Получение антител к фуллерену С60. – Сборник тезисов докладов участников Международного форума по нанотехнологиям «Роснанотех 09». Москва, 6– октября 2009 г., сс. 227–228.
4. Пенькова (Федюнина) Н.С., Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б.
Получение и характеристика реагентов для иммунодетекции фуллерена С60. – Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». Москва, 12–16 октября 2009 г., сс. 71–72.
5. Федюнина Н.С., Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Свешников П.Г., Дзантиев Б.Б. Разработка реагентной базы для иммуноферментного анализа фуллерена С60. – Материалы Конференции и школы молодых ученых Съезда аналитиков России «Аналитическая химия – новые методы и возможности».
Москва, 26–30 апреля 2010 г., с. 308.
6. Гендриксон О.Д., Федюнина Н.С., Свешников П.Г., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка иммуноферментного анализа фуллерена С60 на основе моноклональных антител. – Материалы Третьего Международного форума по нанотехнологиям «Роснанотех 2010». Москва, 1–3 октября 2010 г., с. 7/10.
7. Федюнина Н.С., Дзантиев Б.Б. Разработка иммуноферментного метода определения фуллерена С60. – Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 21– 25 марта 2011 г., ч. 1, с. 420.