Биохимические механизмы нарушения метаболизма костной ткани под действием низкомолекулярных хлорорганических соединений (клинико-экспериментальные исследования)
На правах рукописи
Рамазанова Лейсан Миннимухаматовна
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА
КОСТНОЙ ТКАНИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ
ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
(клинико-экспериментальные исследования)
03.00.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа - 2009
Работа выполнена на кафедре биологической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Камилов Феликс Хусаинович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Шараев Петр Низамиевич Ижевская государственная медицинская академия Росздрава доктор биологических наук профессор Мустафина Ольга Евгеньевна Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Ведущая организация:
Челябинская государственная медицинская академия Росздрава
Защита состоится «» 2009г. в «_» часов на заседании Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71) и на сайте ИБГ УНЦ РАН www.ibg.an rb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected] Автореферат разослан «_»200г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Химические загрязнители занимают ведущее место в комплексе антропогенных воздействий на окружающую среду и здоро вье населения. Синтез и внедрение в промышленное производство все новых соединений неуклонно увеличивает состав и объемы экотоксикантов.
Республика Башкортостан является крупнейшим регионом России с неф техимической и химической промышленностью. По Республике Башкортостан профессиональная патология в химической отрасли в 2002-2006г.г. составила 3,1 случаев на 10000 работающих [Кондрова, 2008]. Вредные условия труда яв ляются причиной формирования не только профессиональной патологии, но становятся патогенетическим фактором развития и прогрессирования общих за болеваний, не относящихся к категории профессиональных. Все чаще при об следовании рабочих регистрируется нарушения здоровья в виде функциональ ных и метаболических изменений отдельных органов и тканей, подчас скры тых, но имеющих тенденцию к росту по мере увеличения стажа работы в не благоприятных условиях труда.
К важнейшим социально-медицинским проблемам современности, наря ду с сердечно-сосудистыми, онкологическими заболеваниями и сахарным диа бетом, относится остеопороз [Казимирко и др., 2006]. Эпидемиологические ис следования состояния минеральной плотности костной ткани (МПКТ) свиде тельствуют о широкой распространенности остеопороза и существенном нега тивном влиянии этого заболевания на состояние здоровья населения.
Остеопороз у мужчин остается малоизученной проблемой [Мсахалая, Ка линченко, 2004]. Остеопоротические переломы у мужчин регистрируются в 2- раза реже, чем у женщин. Частота переломов бедра среди мужчин составляет 10,3-11,0%, у женщин 23,0-26,9%, но смертность мужчин в результате осложне ний от данной патологии с возрастом повышается в 3,2 раза, тогда как у женщин – в 2,2 раза [O'Nell et al., 1996]. По переломам позвоночника смертность среди муж чин в 2,4 раза выше, чем среди женщин с аналогичными переломами [Melton, 1988]. Среди факторов риска развития остеопороза у мужчин отмечаются пожилой возраст, курение, алкогольная зависимость, прием медикаментов, неадекватная фи зическая активность и иммобилизация, но основное внимание уделяется гипогана дизму [Мсхалая, Калинченко, 2004]. Отмечается корреляция между снижением уровня свободного тестостерона и падением МПКТ, резкое уменьшение МПКТ по сле кастрации молодых мужчин [Jackson et al., 1992].
В литературе практически отсутствуют сведения о влиянии химических фак торов, загрязняющих воздушную среду рабочих помещений, на МПКТ у мужчин– работников химических производств. Изучение влияния вредных производствен ных факторов на состояние здоровья, разработка стратегии патогенетически обос нованных профилактических и лечебных мероприятий, является актуальной меди ко-социальной задачей.
Цель исследования. Охарактеризовать метаболизм костной ткани у муж чин-работников химического предприятия, контактирующих с низкомолекулярны ми хлорорганическими соединениями, и при хронической интоксикации ди хлорэтаном самцов-крыс в эксперименте.
Задачи исследования:
1. Оценить состояние минеральной плотности костной ткани у мужчин-работников химического производства (ЗАО «Каустик» г. Стерлитамак) в зависимости от воз раста и стажа работы и изучить содержание в периферической крови показателей кальциево-фосфорного обмена (Са общий, фосфор, активность общей щелочной фосфатазы).
2. Определить содержание в крови фолликулостимулирующего, лютеинезирующе го гормонов, пролактина, тестостерона и эстрадиола у работников химического производства в зависимости от возраста.
3. Изучить состояние оксидантно-антиоксидантной системы у работников произ водства, контактирующих с низкомолекулярными хлорорганическими соеди-нени ями.
4. Исследовать в трубчатых костях самцов белых крыс при хроническом дей ствии дихлорэтана содержание свободного и белковосвязанного оксипролина, гликозаминогликанов, интенсивность биосинтеза коллагена и уровень общего Са, Mg, Р, С-телопептидов, активность общей и костной щелочной фосфатаз в сыворотке крови.
5. Изучить интенсивность свободнорадикального окисления и состояния анти оксидантной защиты (хемилюминесценция, продукты перекисного окисления липидов, общую антиокислительную активность, активность супероксиддисму тазы, каталазы и глутатионпероксидазы) в крови и гомогенате костной ткани у самцов крыс, подвергшихся интоксикации дихлорэтаном в дозах 0,05LD50 и 0,1LD50.
6. Определить содержание половых и гонадотропных гормонов в перифериче ской крови (фолликулостимулирующего и лютеинезирующего гормонов, про лактина, тестостерона и эстрадиола) у самцов - крыс при хроническом действии дихлорэтана.
7. Изучить патогистологические изменения в структуре костной ткани при хро ническом действии ДЭ в суммарной дозе 0,1LД50 у крыс-самцов.
Научная новизна. Впервые получены данные, характеризующие метабо лизм костной ткани при воздействии производственных факторов у работников химического предприятия. Показано, что у мужчин, имеющих производствен ный контакт с различными хлорорганическими веществами (дихлорэтан, хлор пропан, хлорвинил, хлорпропен, дихлорпропан, эпихлоргидрин и др.), во всех возрастных группах чаще, чем у работников контрольной группы, обнаружива ются остеопения и остеопороз. Установлено, что в группе этих мужчин более, чем в два раза чаще выявляется интенсификация процессов свободно-радикаль ного окисления (СРО), наблюдается дезинтеграция гормонального статуса со снижением уровня тестостерона, повышением содержания эстрадиола, фолли кулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов.
Выявлены особенности изменений метаболизма основных компонентов органического матрикса костной ткани (коллаген, гликозаминогликаны (ГАГ)) и патогистологической картины трубчатых костей самцов крыс при хрониче ском воздействии дихлорэтана в низких концентрациях.
Эксперименты с хронической интоксикацией самцов крыс дихлорэтаном в суммарных дозах 0,05 LD50 и 0,1 LD50 позволили выявить, что основными ме ханизмами развития нарушений метаболизма костной ткани в мужском орга низме при длительном воздействии хлорорганических соединений являются интенсификация свободнорадикальных процессов в костях и снижение про дукции половых гормонов.
Теоретическая и практическая значимость. Впервые оценена распро страненность остеопенического синдрома у мужчин-работников химического предприятия, имеющих производственный контакт с хлорорганическими со единениями в низких концентрациях. Выявлены ведущие механизмы остеоток сического действия хлорорганических токсикантов в мужском организме.
Полученные результаты являются фундаментальной основой для разра ботки, апробации и внедрения оптимальных схем профилактики и лечения остеопенических состояний у работников химических предприятий, связанных с хлорорганическим производством.
Разработаны и предложены профилактические мероприятия для работни ков ЗАО «Каустик» с установленными изменениями минеральной плотности костной ткани.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты и основ ные положения диссертационной работы включены в педагогическую практику и учебный процесс кафедры биологической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», внедрены в диагно стическую и лечебно-профилактическую деятельность муниципальных учре ждений здравоохранения «Городская поликлиника №1» и «Городская поликли ника №6» г. Стерлитамака Республики Башкортостан, ООО «Проммедэко» г.
Уфы Республики Башкортостан.
Апробация результатов работы. Основные результаты диссертации до ложены на 72, 73, 74-й итоговых Республиканских научных конференциях сту дентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2007, 2008, 2009), на Всероссийской научно практической конференции, посвященной 75-летию башкирской нефти (Уфа, 2007), на Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкор тостан «Медицинская наука-2007», (Уфа, 2007), на Всероссийской научно практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», (Киров, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на второй Международной научно-практиче ской конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: ис тория и современность» (Санкт - Петербург, 2008), на 6-й международной науч но-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008), на Всероссийской научно практической конференции «Нефть и здоровье» (Уфа, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страни цах, содержит 20 таблиц, 33 рисунка и приложение (31 рисунок);
включает вве дение, обзор литературы, результаты исследования и их обсуждение, заключе ние, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 284 источника, из которых 121 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В работе представлены результаты обследования 212 работников ЗАО «Каустик» (г. Стерлитамак, Республика Башкортостан). Исследования проводились во время плановых профилактиче ских медицинских осмотров с участием терапевта, невропатолога, окулиста, отоларинголога, травматолога-ортопеда и других специалистов. Обследуемые работники были разделены на 2 группы: основную – мужчины - работники про фессий, имеющие постоянный производственный контакт с различными угле водородами и их хлорированными производными и контрольную - работники административно-управленческого аппарата предприятия. Возраст обследуе мых в обеих группах колебался от 20 лет до 61 года.
С целью выявления остеопении и остеопороза у работников была прове дена ультразвуковая остеоденситометрия на определение МПКТ [(Speed of Sound – SOS, м/с) на приборе «Omnisense 7000S» фирмы Sunlight Medical Ltd (Израиль) с применением общеевропейской программы]. Числовым выражени ем состояния МПКТ является Т–критерий – количество стандартных отклоне ний (SD) от данного показателя молодых здоровых лиц (20-29 лет) в возрасте достижения максимальной МПКТ. Колебания Т–критерия в размахе 1,0 SD со ответствует норме. При снижении МПКТ от -1 до -2,5 SD диагностируется остеопения. Если показатели МПКТ равны -2,5 SD и ниже, выявляется ОП;
ис следовано состояние СРО с использованием отечественного хемилюминометра ХЛ-003 [Владимиров, 1989] и ОАА плазмы крови [Клебанов и др., 1988];
изучены в плазме крови уровни гонадотропных и половых гормонов с помощью стандарт ных наборов [тестостерон – RIA Testosterone, direct (Франция), эстрадиол - RIA ES TRADIOL (Франция), пролактин (ЛТГ) - PROLACTIN IRMA KIT (Чехия), ЛГ – LH IRMA KIT (Чехия), ФСГ – FSH IRMA KIT (Чехия)], содержание общего кальция, фосфатов, магния и активности общей щелочной фосфатазы (ОЩФ) с использова нием наборов реактивов [общего кальция, фосфора, магния - «HUMAN» (Герма ния), ОЩФ – «Новофосфаль» фирмы ЗАО «Вектор-Бест»].
Экспериментальные исследования выполнены на 220 белых беспородных самцах крыс половозрелого возраста массой 180-230 г. Животные содержались в одинаковых условиях, на стандартной диете вивария. При проведении опытов соблюдали положения Хельсинской декларации о гуманном отношении к живот ным.
Учитывая, что работники ЗАО «Каустик» находятся под влиянием произ водственных факторов, в основном постоянного интермитирующего действия низкомолекулярных ациклических хлорорганических соединений, включая ДЭ, были проведены эксперименты с хронической интоксикацией животных ДЭ.
ДЭ в оливковом масле вводили ежедневно внутрижелудочно с помощью специ ального металлического зонда в течение 60 дней в суммарных дозах 25 мг/кг (0,05 LD50) и 50 мг/кг (0,1 LD50). Контрольная группа животных получала толь ко оливковое масло.
У животных в крови и гомогенатах эпифизов трубчатых костей (бедренная) ис следовали состояние оксидантно-антиоксидантной системы (хемилюминесцентный анализ по Владимирову (1989);
содержание ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) с помощью набора реактивов «ТБК-АГАТ», ООО АГАТ-МЕД, Москва;
уровень про дуктов ПОЛ по Волчегорскому (1989). Активность каталазы [КФ 1.11.1.6] определяли по методу Королюк с соавт.(1988), СОД [КФ 1.15.1.1] и ГПО [КФ 1.11.1.9] с помощью наборов RANSOD и RANDOX фирмы Randox Labor. Ltd., ОАА по методике, описан ной Клебановым (1988). В сыворотке крови изучали уровни маркеров костного мета болизма: ОЩФ и КЩФ наборами ИФА Metra BAR EIA Kit фирмы Quidel Corporaa tion, С-концевых телопептидов – ИФА Serum Cross Laps ELISA фирмы Nordic Bios cience Diagnostic A/S (Дания), содержание кальция, магния и фосфора.
У животных определяли массу тела, печени и трубчатых костей: бедрен ной, большеберцовой, плечевой - на электронных весах Scout Pro (Китай).
Окраской гематоксилином-эозином изучали гистологическую картину срезов бедренной кости. В гомогенатах костной ткани определяли содержание СО и БСО, общих ГАГ по Шараеву с соавт. (1990), интенсивность включения мечен ного 14С-пролина в коллаген костной ткани на установке «Бета-2» с использова нием сцинтилляционной жидкости (раствор Брея).
В плазме крови определяли уровни половых и гонадотропных гормонов.
Статистические методы исследования. Статистическую обработку по лученных данных проводили с помощью профессионального пакета Statistica 6,0 фирмы Stat Soft. В группах выборки оценивали следующие параметры: зна чения средних величин, среднеквадратичные отклонения, соответствие распре деления признака закону нормального распределения. Сравнение групп прово дили с использованием параметрических (t – критерий Стьюдента) методов.
Различия считали достоверными при уровне значимости Р0,05.
Благодарности. Выражаем благодарность директору ООО «Проммедэко» Г.В. Ивановой и профессору кафедре гистологии ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» Ф.А. Каюмову за помощь в проведении данной работы.
Результаты исследования мужчин - работников химического производства У 113 работников проведено обследование МПКТ основных профессий химического предприятия (ЗАО «Каустик»), имеющих производственный кон такт с различными хлорорганическими соединениями (ДЭ, хлорпропан, хлор пропен, хлорвинил, дихлорпропан, эпихлоргидрин и др.) и алифатическими уг леводородами жирного ряда, и у 31 работника административно-управленче ского аппарата, бухгалтерии (группа контроля) в возрасте 20-61 года.
Состояние минеральной плотности костной ткани У мужчин работников основной группы снижение МПКТ составило 94,7%, а контрольной группы – 61,3%. В основной группе остеопения была вы явлена у 69,0% (Т-критерий от -1,0 до -2,5 SD), остеопороз – у 25,7% (Т-крите рий от -2,5 SD) (рис.1).
основная группа контрольная группа % 20-29 30-39 40-49 50-61 20-29 30-39 40-49 50-61 годы остеопения остеопороз норма Рисунок 1. Частота остеопении и остеопороза у работников в зависимости от возраста Показатели кальций-фосфорного обмена и активность ОЩФ Результаты исследования биохимических показателей, характеризующих состояние минерального обмена: общего Са, Р, Mg и активность ОЩФ (рис.2), не противоречат данным, полученным при остеоденситометрии. Са и Р входят в состав основного вещества костной ткани – гидроксиапатита кальция. Недоста ток Са2+ приводит к снижению пика костной массы, дефицит Р и Mg – к подавле нию функции остеобластов и ограничению костной минерализации [Marie et al,1993].
% * * * контроль рабочие Са Р Mg ОЩФ Рисунок 2. Изменения содержания Са, Р, Mg и ОЩФ у мужчин–работников химического производства У работников основной группы в сыворотке крови выявлено повышение активности ОЩФ и снижение содержания Са, Mg и Р. Показатели фосфорно кальциевого обмена, активность ОЩФ подтверждают развитие у работников основных профессий химического предприятия остеопенического синдрома.
Интенсивность СРО и состояние антиокислительной защиты У 92 мужчин основной группы и у 30 – контрольной была исследована интенсивность течения процессов СРО методом хемилюминесценции плазмы крови и оценена антиокислительная активность плазмы (табл.1).
Таблица 1–Показатели процессов СРО в плазме крови у работников основной и контрольной групп со снижением антиоксидантной защиты Показатели ХЛ, усл.ед.
Группа обследо- Спонтанная ОАА, % Быстрая Светосумма ванных светимость вспышка Контрольная 0,44±0,012 4,27±0,9201 3,13±0,123 79,4±1, Основная 0,89±0,053* 5,29±0,25* 3,57±0,191* 73,3±2,44* Примечание: в данной и последующих таблицах *) Р0,05 по сравнению с контрольной группой.
У рабочих повышены в плазме крови все показатели СРО, ОАА плазмы крови у рабочих по сравнению с контролем, наоборот, снижена.
Изменение содержания половых и гонадотропных гормонов Литературные данные [Галимова, Камилов, 2002;
Козярин, 2003;
Мухоря мов и др., 2005] свидетельствуют, что одним из вероятных механизмов остеопе нического воздействия хлорорганических соединений может быть развитие де фицита андрогенов, контролирующих метаболизм костной ткани. Результаты исследований мужчин, работающих в производственных цехах, во всех воз растных группах уровень тестостерона, контролирующего анаболические реак ции в костной ткани, существенно снижен, что обнаруживается на фоне неиз менного содержания эстрадиола в возрасте 20-39 лет и статистически значимо го его повышения в возрастных группах с 40 лет до 61 года (табл. 2). Это при водит к выраженному падению коэффициента отношений мужских и женских половых гормонов.
Таблица 2 – Уровень половых и гонадотропных гормонов у мужчин - работников химического предприятия Воз- Группы Гормоны раст обследу- Тестосте- Эстрадиол, ФСГ, Ед/л ЛГ, Ед/л Пролактин, емых рон, нМ/л пг/мл нг/мл 20-39 Контроль, 24,2±2,32 34,3±3,06 13,1±1,50 7,0±0,40 14,7±0, лет n= Рабочие, 13,6±2,75* 43,5±9,04* 20,5±8,52* 25,9±7,97* 3,5±0,35* n= 40-49 Контроль, 20,2±3,41 31,2±2,70 12,7±1,91 6,8±0,76 12,3±1, лет n= Рабочие, 8,8±2,52* 140,6±12,1* 41,4±10,39* 25,0±5,93* 20,1±4,02* n= 50-61 Контроль, 15,6±1,83 38,6±3,10 12,0±1,38 4,8±0,36 12,0±0, лет n= Рабочие, 10,3±1,42* 128,5±27,61* 48,4±10,33* 15,2±3,92* 8,9±3,07* n= С целью выявления особенностей влияния хлорорганических производ ных низкомолекулярных алифатических углеводородов на метаболизм костной ткани и уточнения основных патохимических механизмов развития остеопени ческого синдрома у работников химического производства, в дальнейшем были проведены серии экспериментов с интоксикацией самцов крыс одним из соеди нений, постоянно присутствующих в атмосфере производственных помещений - ДЭ.
Результаты экспериментальных исследований самцов - крыс при интоксикации дихлорэтаном Характеристика метаболизма костной ткани У подопытных групп крыс при действии ДЭ наблюдалось дозозависимое снижение концентрации Са, Р и Мg в плазме крови, что является отражением нарушении кальций - фосфорного обмена и метаболизма костной ткани, по скольку в обмене этих макроэлементов важнейшую роль играет костная ткань [Скальный, Рудаков, 2004].
Состояние костного метаболизма, характеризующие активность остеокла стов и остеобластов, уровень компонентов костного матрикса, которые высво бождаются и поступают в кровь в процессе формирования или резорбции кост ной ткани, отражают ряд биохимических маркеров [Ермакова, Пронченко, 2003]. Определение ОЩФ и КЩФ, показывающих интенсивность процессов остеогенеза, и С – концевых телопептидов ( - Cross Laps), отражающие, выра женность костной резорбции с катаболизмом органического матрикса костей, выявило, что у подопытных животных увеличиваются показатели как процес сов остеогенеза, так и резорбции. При этом у крыс, получивших ДЭ в суммар ной дозе 0,05 LD50 повышение активности КЩФ составляет 213,8% к контролю, а С – телопептидов лишь 161,7%. При действии большей дозы токсиканта – 0, LD50 катаболические процессы начинают превалировать над анаболическими (рис. 3).
% * ОЩФ 450 КЩФ С-телопептиды * * * * * 0 К К 0,05 0,1 0,05 0, 0,05 0,1 К ДЭ LD Рисунок 3. Изменения показателей биохимических маркеров с увеличением дозы интоксикации самцов – крыс ДЭ, *) Р0, В эпифизах трубчатых костей подопытных животных были исследованы содержание коллагена и ГАГ, интенсивность биосинтеза коллагена, выражен ность ПОЛ и состояние антиоксидантной защиты.
В таблице 3 представлены данные содержания фракций оксипролина и ГАГ в эпифизах бедренной кости самцов крыс при хронической интоксикации ДЭ. Как видно, у подопытных животных наблюдается некоторое снижение со держания БСО, общих ГАГ и повышение уровня СО. Эти данные характеризу ют превалирование катаболических процессов.
Таблица 3 – Изменение содержания фракций оксипролина и уровня ГАГ в костной ткани у самцов крыс при интоксикации ДЭ, n= Группа живот- Показатели ных СО, БСО, ГАГ, мкмоль/г мкмоль/г мкмоль/г Контрольная 0,48±0,01 3,59±0,47 1526±56, ДЭ, 0,05 LD50 0,50±0,01 3,52±0,23 1508±9, ДЭ, 0,1 LD50 0,51±0,01 3,51±0,12 1487±12, Об интенсивности синтеза коллагена в костной ткани самцов крыс в усло виях интоксикации ДЭ судили по включению в его состав С-пролина. При этом мы исходили из данных, свидетельствующих о том, что пролин в костной ткани преимущественно включается в состав основного белка костного матрик са - коллагена I типа [Ravn, 1997]. Интоксикация ДЭ приводит к падению тем пов инкорпорации 14С-пролина в коллагеновые белки. Эти изменения носили отчетливый дозозависимый характер. У животных, получавших ДЭ в дозе 0, LD50 отмечалось статистически значимое снижение биосинтеза коллагена в костной ткани по сравнению с контролем (рис. 4).
% * 100 контроль 0,05LД 50 0,1LД Рисунок 4.Уровень удельной радиоактивности коллагена костной ткани при введении 14С – пролина у самцов крыс, *) Р0, Гистологические показатели изменения костной ткани при действии дихлорэтана У подопытных групп крыс, получавших ДЭ в суммарной дозе 0,1LД50 в течение 2-х месяцев, и у контрольной группы животных исследовали гистоло гическую картину состояния бедренных костей (рис. 5). Гистологическая карти на, свидетельствует о развитии остеопороза со снижением содержания мине рального вещества, истончением, рассасыванием и дезорганизацией расположе ния костных пластинок, явлениями деструкции и остеодистрофии, активацией остеогенеза в отдельных участках эпифиза и диафиза кости, заменой костной ткани волокнистой соединительной тканью и нарушением минерализации вновь образованных остеонов.
А Б В Г Рисунок 5. А. Остеоны с кровеносными сосудами бедренной кости контрольной группы животных Б. Остеодистрофия бедренной кости подопытных животных В. Разрастание соединительной ткани с ангиогенезом бедренной кости подо пытных животных Г. Деформация костных пластинок и сужение просвета кана ла остеона бедренной кости подопытных животных. Окраска гематоксилином – эозином. Микрофотография. Ок. 10, об. Показатели состояния окидантно-антиоксидантной системы Об активности процессов свободнорадикального окисления и липоперок сидации судили по изменению параметров железоиндуцированной хемилюми несценции и накоплению продуктов ПОЛ в плазме крови и гомогенате эпифи зов бедренной кости экспериментальных животных (табл. 5).
Таблица 5 - Влияние дихлорэтана на содержание продуктов ПОЛ в плазме крови и в гомогенате костной ткани у самцов крыс Плазма крови Группа ТБК – пр.
Гептановая фаза Изопропановая фаза крыс ДК КД и СТ ДК КД и СТ Контроль, 1,06±0,02 1,03±0,01 0,89±0,03 0,84±0,03 1,26±0, n= 0,05LД50, 1,07±0,04 0,98±0,05 1,04±0,01* 1,05±0,08* 2,23±0,31* n= 0,94±0,03*,# 2,05±0,11*,# 2,63±0,13*,# 0,1LД50, 1,16±0,07* 1,03±0,02* n= Гомогенат эпифиза бедренной кости Контроль, 1,05±0,09 0,97±0,09 1,08±0,10 0,96±0,11 1,48±0, n= 0,05LД50, 1,05±0,02 0,92±0,03 1,30±0,16 1,12±0,17 1,50±0, n= 1,11±0,02# 2,79±0,23*,# 1,85±0,11*,# 0,1LД50, 1,05±0,06 1,04±0, n= Примечание: в данной и последующих таблицах #) Р0,05 между подо пытными группами Результаты исследования показали, что при интоксикации ДЭ в дозе 0,1LД50 в плазме крови наблюдалось статистически значимое повышение пер вичных – диеновых конъюгатов ацилгидроперекисей (ДК) и вторичных продук тов липопероксидации (ПОЛ) – кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ) изопропаноловой фазе, содержащей преимущественно полярные липиды (фосфолипиды и др.). У данной группы животных было выявлено повышение содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК – про дукты). Усиление процессов ПОЛ выявлялось уже при интоксикации дозой 0,05LД50, что сопровождалось повышением содержания вторичных продуктов липопероксидации в плазме крови до 176,9% от аналогичных показателей у контрольных животных. У крыс, получавших ДЭ в дозе 0,1 LД50, было выявле но особенно резкое повышение уровня ТБК – продуктов: в плазме крови до 208,7%, в гомогенатах эпифиза бедренной кости до 125,0%.
Данные по исследованию хемилюминесценции в гомогенатах эпифиза бедренной кости и плазме крови крыс, при интоксикации ДЭ, также свидетель ствует об усилении всех показателей, характеризующих интенсификацию про цессов СРО в гомогенатах эпифиза бедренной кости и в сыворотке крови жи вотных, подвергнутых воздействию ДЭ, особенно в суммарной дозе 0,1LД (рис. 6).
А Б * 160 * * * * * * * * * * * * 20 0 0,05LД50 0,1LД 0,05LД50 0,1LД SFe2+ Sp h HFe2+ Рисунок 6. Показатели хемилюминесценции сыворотки крови (А) и гомогената бедренной кости (Б) крыс-самцов (в % к контролю);
SFe2+- светосумма, Sp – спонтанная светимость, h – амплитуда быстрой вспышки, HFe2+ - максимальная амплитуда медленной вспышки При поступлении ДЭ в дозе 0,1LД50 отмечалось наиболее выраженное уменьшение длительность латентного периода (R) между быстрой и медленной вспышками железоиндуцированной хемилюминесценции, что свидетельствует о снижении антиоксидантных резервов или угнетении их антиокислительной способности. При воздействии ДЭ суммарной дозой 0,05LД50 продолжитель ность интервала R в сыворотке крови и в гомогенатах бедренной кости не отли чались от контрольных показателей.
О негативном влиянии ДЭ на состояние антиокислительной защиты у живот ных свидетельствуют и результаты определения активности основных антиокси дантных ферментов, и ОАА плазмы крови, и гомогенатов кости (табл. 6).
ОАА, которая отражает, в основном, неферментативное звено антиокис лительной защиты, и в плазме крови, и в гомогенате костной ткани падала ста тистически несущественно. При интоксикации дозой ДЭ 0,05LД50 в сыворотке крови и эритроцитах отмечалось достоверное ингибирование активности анти оксидантных ферментов – каталазы и СОД, а в гомогенате бедренной кости эти изменения носили лишь характер тенденции. Увеличение дозы ДЭ приводило к более выраженному подавлению активности ферментов в сыворотке крови и гомогенате бедренной кости. Так, в гомогенатах кости активность каталазы снизилось до 74,34%;
СОД – до 86,49%;
ГПО – до 89,52% по сравнению с контрольными показателями.
Таблица 6 - Активность антиоксидантных ферментов и общая антиокислитель ная активность костной ткани и крови при хронической интоксикации ди хлорэтаном самцов крыс Группа крыс Фермент Контроль, 0,05LД50, 0,1LД50, n=7 n=13 n= Сыворотка, 9,77±0,66 6,90±0,89* 5,37±0,88* мкмоль/л 1480,68±64,14*,# Эритроциты, 2946,88±196,89 1979,96±128,83* мкмоль/л Гомогенат Каталаза бедренной ко- 7,56±0,37 6,17±0,42* 5,62±0,41* сти, мкмоль/мг Сыворотка, 157,57±11,43 122,75±13,04* 133,0±16, Е/мл Гомогенат 131,1±12,11 122,8±11,84 113,4±13,07* СОД бедренной ко сти, Е/мг 279,465±124,180*,# Кровь, 1288,73±240,36 698,546±131,420* Е/л Гомогенат ГПО бедренной ко- 180,9±10,56 209,3±30,28* 129,9±53,37* сти, Е/мг ОАА, Плазма 26,6±4,62 - 21,3±6,06 * Гомогенат 67,8±2,46 - 49,4±11,31* % ингиби кости рования Изменение содержания половых и гонадотропных гормонов Хроническое воздействие химических агентов воздуха производственных помещений является сильным стрессорным фактором, приводящим к сдвигам гормонального фона в мужском организме [Козярин, 2003;
Мухорямов и др., 2005]. Особое внимание при длительном воздействии органических соединений привлекают половые гормоны, оказывающие существенное влияние на метабо лизм костной ткани.
При интоксикации ДЭ в дозе 0,05LД50 изменения уровня ФСГ и тестосте рона носили характер тенденции и не претерпевали статистически значимых отклонений от контрольных значений. Более выраженные сдвиги были зареги стрированы при поступлении токсиканта в дозе 0,1LД50. Обращает внимание снижение до 79% от контроля содержания основного мужского гормона – те стостерона. А уровень эстрадиола статистически значимо повышался до 173%.
Содержание гипофизарных гонадотропинов при интоксикации дозой 0,1LД50 снижалось: ЛГ – до 58,4%, ФСГ – до 75,4% от референтных значений, а содержание пролактина, наоборот, увеличивалось по сравнению с контролем в 1,3 раза. В целом, изменения уровней определяемых гормонов носили отчетли вый дозозависимый характер (табл. 7).
Таблица 7 – Уровень гонадотропных и половых гормонов у самцов крыс при хронической интоксикации ДЭ Гормон Группа жи вотных ФСГ, Ед/л ЛГ, Ед/л Пролактин, Эстрадиол, Тестостерон, нг/мл пг/мл нмоль/л Контрольная, 5,01±0,06 1,42±0,06 1,25±0,04 18,75±2,34 26,47±1, n= ДЭ 0,05LD50, 4,81±0,06 1,02±0,04* 1,44±0,04 * 25,54±0,86 * 19,26±2,81* n= 3,77±0,07*,# 0,83±0,04*,# 1,66±0,04*,# 32,48±1,36*,# ДЭ 0,1LD50, 20,95±1,46* n= Таким образом, отравление ДЭ сопровождается изменениями профиля половых гормонов в сыворотке крови подопытных животных с преимуществен ным снижением содержания тестостерона и одновременным повышением кон центрации эстрадиола.
Антагонистическое влияние эстрогенов по отношению к андрогенам, а их уровень при введении ДЭ резко увеличивается, прежде всего, сказывается на подавлении гипоталамо – гипофизарно – гонадного секреторного механизма.
При интоксикации ДЭ у подопытных животных снижалась относительная масса печени, нарушались метаболические функции: уменьшался уровень аль бумина, повышалось содержание общего билирубина и активность аланиновой и аспарагиновой трансаминаз. Печень является органом, участвующим в акти вации витамина Д, контролирующего абсорбцию Са в кишечнике, принимаю щего активное участие в метаболизме костной ткани [Шварц, 2005].
Обобщая результаты исследования влияния хронической интоксикации ДЭ, можно констатировать, что патохимические механизмы токсического дей ствия хлорпроизводных алифатических углеводородов на состояние костной ткани связаны с интенсификацией процессов СРО с одновременным снижени ем активности ферментов физиологической антиокислительной защиты;
акти вацией костного ремоделирования с превалированием процессов резорбции;
снижением уровня половых гормонов, изменениями фосфорно–кальциевого обмена, а также с поражением печени.
ВЫВОДЫ 1. Выявлено, что у работников химического предприятия, имеющих произ водственный контакт с хлорорганическими соединениями остеопенический синдром наблюдается в 1,5-2 раза чаще, чем у мужчин других профессий, во всех возрастных группах 2. Установлено, что производственный контакт с хлорорганическими поллю тантами приводит у работников химического предприятия к интенсификации процессов свободно-радикального окисления, снижению антиокислительной защиты, изменению кальций-фосфорного обмена и содержания в крови поло вых и гонадотропных гормонов, независимо от возраста.
3. Показано, что интоксикация самцов крыс дихлорэтаном в течение двух ме сяцев в суммарных дозах 0,05LД50 и 0,1LД50 приводит к дезорганизации микро структуры костной ткани, характерным изменениям гистологической картины с развитием в отдельных участках эпифизов и диафиза деструкции и остеодис трофии, сочетающихся с активацией остеогенеза, заменой костной ткани во локнистой соединительной, нарушением минерализации вновь образованных остеонов.
4. Установлено, что патогенетическую роль в развитии остеопенического син дрома при хроническом действии хлорорганических соединений играет усиле ние свободнорадикального окисления с развитием недостаточности антиокис лительной защиты. При интоксикации дихлорэтаном самцов крыс наблюдает ся активация перекисного окисления липидов, снижение общей антиокисли тельной защиты и активности антиоксидантных ферментов – супероксиддис мутазы, каталазы, глутатионпероксидазы - в гомогенате костной ткани на фоне повышения в крови уровня С-терминального полипептида коллагена I типа.
5. Нарушения метаболизма костной ткани в мужском организме при действии дихлорэтана связаны со снижением уровня основного полового гормона – те стостерона. Дефицит половых гормонов у самцов крыс неблагоприятно сказы вается на метаболизме основных компонентов органического матрикса (колла ген, гликозаминогликаны) и структуре костной ткани с интенсификацией ре зорбтивных и снижением анаболических процессов.
6. Выявлено, что нарушению минерального обмена при интоксикации ди хлорэтаном способствует и токсическое поражение печени, о чем свидетель ствуют снижение в сыворотке крови уровня альбумина, повышение билируби на и активности аланиновой и аспарагиновой трансаминаз.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Высокая распространенность остеопении и остеопороза среди мужчин, имеющих производственный контакт с хлорорганическими соединениями, свидетельствует о необходимости периодического контроля минеральной плотности костной ткани у работников химического предприятия. Полученные данные позволяют выделить группу риска костных переломов у работников предприятия и обосновывают необходимость планирования и проведения про филактических мероприятий, направленных на повышение сопротивляемости организма к неблагоприятным производственным факторам, изменение реак тивности и укрепление здоровья. Установленные патогенетические механизмы развития остеопенического синдрома у мужчин – работников химического производства являются теоретической базой для использования в профилакти ческих мероприятиях антиоксидантов, мембрано- и гепатопротекторов, препа ратов кальция, магния и витамина Д.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Л.М. Рамазанова, И.А. Меньшикова, Ф.Х. Камилов. Нарушения минеральной плотности костной ткани у мужчин работников химического производства // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2008. - №9 (91). С. 199-203.
2. Ф.Х. Камилов, И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова. Корригирующее влияние триовита на остеопеническое действие дихлорэтана // Вестник Уральской ме дицинской академической науки. – Екатеринбург, 2009. - № 1 (23). – С. 74-77.
3. Ф.Х. Камилов, И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова. Влияние хлорорганиче ских поллютантов на метаболизм костной ткани // Медицинская наука и об разование Урала. – 2008. - № 6. – С. 47-50.
4. Ф.Х. Камилов, И.А. Меньшикова, Р.З. Нурлыгаянов, Л.М. Рамазанова и др.
Состояние минеральной плотности костной ткани у рабочих химического производства // Мед. вестник Башкортостана. – 2007. – Т. 2, № 1. – С. 78-82.
5. И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова, Э.У. Нуретдинова, Э.Р. Бикметова. Из менения уровня половых гомонов и минеральной плотности костной ткани у работников химического производства // Материалы 72-й итоговой Республи канской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». – Уфа, 2007. – С. 174-175.
6. Л.М. Рамазанова, И.А. Меньшикова, Э.У. Нуретдинова, Э.Р. Бикметова. По казатели антиоксидантной активности у работников химического производства // Материалы 72-й итоговой Республиканской научно-практиче ской конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». – Уфа, 2007. – С. 219-220.
7. Ф.Х. Камилов, В.О. Щепанский, И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова, и др.
Структурно-метаболические изменения костной ткани у работников химиче ского производства // Материалы Всероссийской научно-практической конфе ренции, посвященной 75-летию башкирской нефти «Нефть и здоровье». – Уфа, 2007. – С. 386-390.
8. Л.М. Рамазанова, И.А. Меньшикова, Э.Р. Бикметова, Э.У. Нуретдинова, и др.
Состояние антиокислительной защиты крови и костной ткани у самцов крыс при длительном воздействии малых доз дихлорэтана // Материалы 73-й итого вой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых «Во просы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2008. - С. 267-269.
9. Ф.Х. Камилов, Г.В. Иванова, И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова, и др. Ха рактеристика метаболизма костной ткани при воздействии хлорорганических соединений // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и моле кулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С. 453.
10. И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова, Г.В. Иванова, Ф.Х. Камилов. Влияние производственных факторов на структурно-метаболические изменения в кост ной ткани // Вестник Российской военно-медицинской академии. Приложение (часть I). Второй Санкт-Петербургский международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека». - 2008. - С. 54.
11. Ф.Х. Камилов, И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова. Метаболические нару шения кости при хронической интоксикации хлорорганическими соединениями // Астраханский медицинский журнал (приложение). 6-я международная науч но-практическая конференция «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань, 2008. – Т. 3, № 3. - С. 96-98.
12. Ф.Х. Камилов, З.С. Терегулова, И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова, и др.
Памятка для работников ЗАО «Каустик» по профилактике остеопороза и остео пении. – Уфа-Стерлитамак, 2008. – 14 с.
13. Ф.Х. Камилов, Л.М. Рамазанова, И.А. Меньшикова, Г.В. Иванова, и др. Па тохимические механизмы действия малых доз хлорированных производных алифатических углеводородов на метаболизм костной ткани // «Нефть и здоро вье». Сборник научных трудов всероссийской научно – практической конфе ренции. – Уфа, 2009. – С. 247–249.
14. Л.М. Рамазанова, И.А. Меньшикова, Г.В. Иванова, Ф.Х. Камилов. Влияние неблагоприятных факторов производства на минеральную плотность костной ткани у работников – мужчин // Проблемы биологии, экологии, географии, об разования: история и современность. Материалы второй международной науч но – практической конференции. – Санкт - Петербург, 2008. – С. 216-218.
15. Л.М. Рамазанова, Э.Р. Бикметова, И.А. Меньшикова. Действие дихлорэтана на обмен коллагена костной ткани при хронической интоксикации самцов крыс //Вопросы теоретической и практической медицины. Материалы 74-й Респуб ликанской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной Году молодежи в России и Году поддержки и развития молодежных инициатив в Республике Башкортостан. Т 2.–Уфа, 2009. – С. 84-85.
16. Л.М. Рамазанова, Ф.Х. Камилов, Г.В. Иванова, И.А. Меньшикова. Механиз мы влияния неблагоприятных факторов производства на минеральную плот ность костной ткани // «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» Материалы Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица, приуроченной к 65-летию Челябинской государ ственной медицинской академии. – Челябинск, 2009. – С. 243-246.
Список сокращений БСО– белковосвязанный оксипролин СОД – супероксиддисмутаза ГАГ–гликозаминогликаны СРО – свободнорадикальное окисление ГПО – глутатионпероксидаза СТ – сопряженные триены ДК – диеновые конъюгаты ТБК – тиобарбитуровая кислота ДЭ – дихлорэтан ТБК-РП – ТБК-реагирующие продукты КД - кетодиены ТФР– трансформирующий фактор роста КЩФ – костная щелочная фосфатаза ФСГ– фолликулостимулирующий гормон МПКТ – минеральная плотность ХЛ – хемилюминесценция костной ткани ЛГ – лютеинизирующий гормон LD50 – доза, вызывающая гибель 50% животных ОАА – общая антиокислительная h – амплитуда быстрой вспышки активность HFe2+ - максимальная амплитуда ОП – остеопороз медленной вспышки ОЩФ – общая щелочная фосфатаза R – латентный период SFe2+ - светосумма ПОЛ – перекисное окисление липидов СО – свободный оксипролин Sp – спонтанная светимость