Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров
На правах рукописи
Горюнова Ольга Борисовна
РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
ДЛЯ БОРЬБЫ С ЛИЧИНКАМИ КОМАРОВ
03.00.23 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва – 2009
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского Химико-
Технологического Университета имени Д.И. Менделеева
Научный руководитель: кандидат технических наук, доцент Марквичев Николай Семенович
Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Бирюков Валентин Васильевич доктор биологических наук, профессор Захарчук Леонид Михайлович
Ведущая организация: ОАО «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ»
(ГосНИИсинтезбелок)
Защита диссертации состоится « 20 » октября 2009г. в часов на заседании Объ единенного Диссертационного Совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделее ва (125047, г. Москва, Миусская площадь, д.9) в аудитории 443 (конференц-зал)
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно – библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.
Автореферат разослан «_»2009г.
Ученый секретарь Диссертационного совета ДМ 212.204.13 И.В. Шакир
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Кровососущие комары являются переносчиками таких опасных трансмиссивных заболеваний,как малярия, желтая лихорадка, японский энцефалит и др. Применение химических препаратов для борьбы с комарами не всегда оказывается эффективным, так как у насекомых быстро вырабатывается резистентность к таким препаратам, а это требует увеличения дозировок и посто янной ротации инсектицидов. Кроме того, не обладая избирательностью действия, химические инсектициды вызывают гибель полезных организмов, а накопление инсектицидов в природных экосистемах (воде, почве) определяет их экологиче скую опасность.
Для борьбы со взрослыми комарами альтернативы химическим препаратам на сегодняшний день нет. Однако, для уничтожения личинок комаров широко применяют биологические препараты, основным преимуществом которых являет ся избирательность их действия.
Используемые на сегодняшний день биологические инсектициды, основан ные на спорокристаллической биомассе бактерий Bacillus thuringiensis var. israel ensis (Bti) или Bacillus sphaericus, представляют собой сухие порошки, пасты или жидкости. Данные бактерии обладают высокой специфической активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, а препараты на основе Bti и B.sphaericus являются высокоэффективными инсектицидами. Однако, все исполь зуемые препаративные формы на основе бактерий обладают рядом существенных недостатков. Прежде всего, это непродолжительное остаточное действие: препа раты действуют в течение нескольких дней после внесения в места выплода кома ров – поверхность водоема – и быстро оседают на дно, что приводит к необходи мости повторных обработок. При этом, доза препарата напрямую зависит от глу бины водоема. Разработка биологического препарата для борьбы с личинками ко маров, лишенного перечисленных выше недостатков, является актуальной зада чей, решение которой позволит снизить экологическую нагрузку и экономические затраты.
Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилась разработка новой формы инсектицидного биологического препарата для борьбы с личинками кома ров. Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:
1. Провести выбор среди грибных культур микроорганизм, обладающий наи большей энтомопатогенной активностью в отношении личинок комаров.
2. Изучить свойства и динамику роста гриба, иммобилизованного в Са альгинатном геле. Подобрать субстраты, которые метаболизируются грибом внутри гранулы и обеспечивают выход микроорганизма из гранулы в сво бодное состояние.
3. Исследовать динамику гибели личинок комаров под воздействием свобод ных и иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы клеток грибов.
4. Оценить возможность иммобилизации бактерий Bacillus thuringiensis var. is raelensis в Са-альгинатные гранулы с сохранением их свойств и ларвицид ной активности. Исследовать и сравнить динамику гибели личинок комаров под воздействием свободных и иммобилизованных клеток бактерий.
5. Провести испытания полученного инсектицидного препарата для борьбы с личинками комаров в реальных условиях.
Научная новизна. Впервые разработан биопрепарат для борьбы с личинками ко маров на основе иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы микроорганизмов с одновременным добавлением субстрата, позволяющего увеличить длительность их ларвицидной активности.
Изучен механизм выхода клеток бактерий и грибов из иммобилизованного состояния в свободное и их воздействие на личинки комаров, что легло в основу создания препаративной формы.
Установлено, что одновременное применение иммобилизованных с субстра том клеток бактерий и грибов, обладающих ларвицидной активностью, способст вует увеличению эффективности и длительности действия препарата.
Подобран ингредиент (подсолнечное масло), который одновременно выпол няет внутри гранулы две функции: является компонентом, придающим гранулам свойство положительной плавучести и субстратом для роста и развития клеток из гранулы с последующим выходом в окружающую среду без изменения физиоло гических свойств.
Показано, что применение смеси гранул с различными микроорганизмами, обладающих положительной плавучестью, позволяет увеличить длительность ларвицидной активности препарата до нескольких месяцев.
Практическая значимость. Разработаны новый инсектицидный биологический препарат для борьбы с личинками комаров и технология его получения на основе смеси обладающих положительной плавучестью гранул с иммобилизованными в них бактериями или грибами. Определены основные режимы получения гранул, влияющие на характеристики препарата. Наработана и испытана партия нового инсектицидного препарата. Показано, что препарат обладает высокой эффектив ностью, а норма расхода препарата в результате его локализации на поверхности снижается на порядок по сравнению с уже используемыми биологическими инсе кицидами.
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21- мая, 2006г, г. Санкт-Петербург), на IV международном конгрессе «Биотехноло гия: состояние и перспективы развития» (12-16 марта, 2007г, г. Москва), Межре гиональном совещании по вопросам профилактики ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов (2008г, г. Протвино Московской области), V семинаре-совещании «Со временные технологии и перспективы использования средств защиты растений, регуляторов роста, агрохимикатов в агроладшафтном земледелии» (2008г, г. Ана па), на V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (16-20 марта 2009г, г. Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в журналах ВАК 2 статьи.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах текста и включает рисунков и таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выво дов, приложений и списка литературы, содержащего ссылки, из которых на иностранных языках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований служили штаммы грибов Lagenidium giganteum, Beau veri bassiana, Metarhizium anisopliae, Tolypocladium cylindrosporum, штаммы бак терий Bacillus thuringiensis var. israelensis -1223, 162, 1568, 902, 1532.
Для культивирования микроорганизмов использовали стандартные и модифи цированные жидкие и твердые среды Чапека (для грибов) и L-бульон (для бакте рий).
Количественный учет бактерий и грибов проводили по методу Коха путем вы сева на плотные питательные среды определенного объема исследуемой суспен зии клеток и подсчета выросших на них колоний (КОЕ).
Физиологическое состояние микроорганизмов определяли путем микроскопиро вания препаратов «раздавленная капля» и фиксированных препаратов.
Иммобилизацию микроорганизмов проводили в Са-альгинатном геле. Для про цесса иммобилизации использовали инжекторную установку, состоящую из пери стальтического насоса, инжектора и ротаметра для измерения расхода воздуха.
Заранее приготовленную смесь компонентов для иммобилизации из колбы про пускали через установку со скоростью 500 мл/ч, в область отрыва капель подава ли воздушную струю из компрессора со скоростью 2*10 3 м/мин. Отрывающиеся капли попадали в 2% раствор хлорида кальция, где происходила полимеризация альгината натрия путем сшивки катионами кальция. Полученные гранулы 30 ми нут выдерживали в растворе хлорида кальция, после этого декантировали и про мывали водопроводной водой и использовали для экспериментов.
Оценку ларвицидной активности бактерий и грибов в свободном и иммобили зованном состоянии проводили по следующей методике. В емкости объемом мл добавляли водопроводную воду с осажденными взвешенными частицами, по мещали по 20 личинок комаров Aedes aegypty одинакового возраста (I-II возраста) и добавляли в исследуемых концентрациях свободные или иммобилизованные клетки бактерий или грибов. Контролем служили емкости с личинками без добав ления каких-либо микроорганизмов. Для препятствования вылета комаров и сни жения испарения влаги емкости закрывали непритертым стеклом. Емкости вы держивали при комнатной температуре. Через каждые трое суток проводили под кормку личинок сухим дейтритом, входящим в состав кормов для аквариумных рыбок. Через определенные промежутки времени проводили подсчет живых и мертвых личинок и рассчитывали процент их гибели (ларвицидную активность).
Мертвыми считали обездвиженные личинки, не реагирующие на внешние раз дражители и свет.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор штамма гриба Известно большое количество микроскопических грибов, обладающих энто мопатогенной активностью в отношении личинок двукрылых насекомых. На первом этапе работы были проведены сравнительные анализы ларвицидной ак тивности глубинно выращенных суспензий 4-х видов грибов: Lagenidium giganteum, Beauveri bassiana, Metarhizium anisopliae, Tolypocladium cylindrosporum. В емкости с личинками добавляли суспензии исследуемых гри бов, выращенных глубинным способом до стационарной фазы, так, чтобы кон центрация клеток в исследуемом объеме составляла 10 6 КОЕ/мл. Объем вносимой суспензии зависел от исходной концентрации клеток. Эксперименты с каждым штаммом проводили в 3-х повторностях. Через 7 дней подсчитывали живые и мертвые личинки и рассчитывали процент их гибели. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Гибель личинок комаров Aedes aegypty на 7-е сутки под воздействием энтомопатогенных грибов.
Количество мертвых ли- Гибель личинок, Название микроорганизма чинок на 7 сутки, шт % 9±1 45 ± Lagenidium giganteum 15 ± 1 75 ± Beauveria bassiana 18 ± 1 90 ± Metarhizium anisopliae 19 ± 1 95 ± Tolypocladium cylindrosporum Из таблицы 1 видно, что максимальная гибель личинок наблюдалась при воз действии грибов M. anisopliae и T.cylindrosporum. Известно, что гриб M. ani sopliae обладает активностью в отношении более чем 200 видов насекомых раз личных групп, поэтому, для дальнейших исследований был выбран гриб T.cylindrosporum, обладающий специфической энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, что является особенностью его физиологии.
2. Сравнительный анализ ларвицидной активности гриба Tolypocladium cyl indrosporum, выращенного глубинным и поверхностным способами Из литературы известно, что у грибов жизнеспособность и активность кони диоспор и бластоспор могут существенно различаться. Исследовали ларвицидную активность гриба T. cylindrosporum, выращенного глубинным и поверхностным способом. Микроорганизм культивировали на жидкой и твердой модифицирован ной среде Чапека в колбах и на чашках Петри. По окончании поверхностного культивирования споромицелиальную биомассу гриба смывали физиологическим раствором с чашки Петри, определяли концентрацию клеток (КОЕ) гриба, выра щенного глубинным и поверхностным способом. Далее проводили оценку ларви цидной активности гриба, выращенного как глубинным, так и поверхностным способом. Гибель личинок на 7-е сутки экспозиции составила 95% ± 5 при ис пользовании T. cylindrosporum, выращенного поверхностным способом, и 100% глубинным способом. Это свидетельствует об отсутствии различий в ларвицид ной активности T. cylindrosporum, выращенного глубинным и поверхностным способом.
3. Исследование особенностей развития и ларвицидной активности глубин ной культуры гриба Tolypocladium cylindrosporum, при росте на различных источниках углерода Дальнейшие исследования были направлены на изучение особенностей раз вития T. cylindrosporum при периодическом глубинном культивировании на раз личных источниках углерода. Глубинное культивирование проводили в периоди ческих условиях в колбах объемом 250 мл со 100 мл питательной среды Чапека при температуре 25С и постоянном перемешивании на ротационной качалке при скорости 200 об./мин. В качестве источников углерода были использованы сахара, их смеси, крахмал, глицерин, а также растительные масла и н-алканы. При глу бинном культивировании исследовали морфо-физиологические свойства гриба, динамику роста и потребления субстратов. Одновременно по стандартной мето дике оценивали ларвицидную активность клеток T. cylindrosporum, выращенных до стационарной фазы развития на различных источниках углерода.
Таблица 2.
Экспериментальные и расчетные данные при культивировании гриба Tolypocladium cylin drosporum на различных источниках углерода.
Максимальная Удельная Ларвицидная концентрация Время выхода активность, Название субстрата скорость роста, биомассы, на стационар, ч µ, час-1 % X, г/л µ 1=0, Мальтоза 33,18 118 95 ± µ 2=0, µ 1=0, Сахароза 12,0 96 90 ± µ 2=0, Глюкоза 20,96 110 µ=0,04 95 ± Фруктоза 17,3 118 µ=0,0244 90 ± 24,5 118 µ=0,022 95 ± Глюкоза + мальтоза ~ 0,1 - µ 1=0 Лактоза 9,46 81 µ=0,029 90 ± Глицерин 2% Глицерин 6% 9,24 81 µ=0,028 90 ± Крахмал 23,2 118 µ= 0,030 95 ± Подсолнечное масло 34,24 96 - 100 ± Кукурузное масло 21,08 96 - 90 ± Соевое масло 38,16 96 - 95 ± Льняное масло 32,01 96 - 90 ± Оливковое масло 22,24 96 - 85 ± где µ 1 – удельная скорость роста, µ 2 – удельная скорость роста при эффекте диауксии.
Во всех исследуемых вариантах, за исключением культивирования на н алканах, наблюдался рост гриба, который можно охарактеризовать классической S – образной кривой. При росте на мальтозе, сахарозе, лактозе и крахмале наблю дался эффект диауксии.
Характер роста гриба при культивировании на средах с различными субстра тами был идентичен: в первые сутки культивирования наблюдался незначитель ный рост мицелия гриба. На вторые-третьи сутки мицелий начинал интенсивно расти и ветвиться. К середине третьих-четвертых суток культивирования наблю далось образование бластоспор, количество которых в дальнейшем увеличива лось.
Удельная скорость роста, рассчитанная по экспериментальным данным, вы ход биомассы и ларвицидная активность при культивировании на различных ис точниках углерода представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, лучшими субстратами для накопления биомассы T.
cylindrosporum являются мальтоза, глюкоза, смесь глюкозы и мальтозы, крахмал, подсолнечное, соевое и льняное масла. Рост на н-алканах практически отсутство вал. Ларвицидная активность гриба при росте на различных источниках углерода сохранялась и составляла от 85 до 100%. Большая удельная скорость была при культивировании на мальтозе, глюкозе, сахарозе.
4. Иммобилизация Tolypocladium cylindrosporum в Са-альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью. Оценка ларвицидной активно сти гриба в иммобилизованном состоянии Известно, что иммобилизация микроорганизмов в Са-альгинатные гранулы позволяют сохранить жизнеспособность и активность клеток в течение длитель ного времени.
С целью создания новой формы биопрепарата, в которой микроорганизм за щищен от внешних воздействий окружающей среды при хранении и применении, а также для снижения нормы расхода препарата, была проведена иммобилизация клеток гриба в Са-альгинатные гранулы с субстратом, обладающие положитель ной плавучестью.
Для этого были проведены исследования по биогенной совместимости альги ната кальция и гриба T. cylindrosporum.
Биоразлагаемость альгината кальция под воздействием T. cylindrosporum оп ределяли при культивировании гриба поверхностным способом на твердой пита тельной среде стандартного состава, где в качестве загустителя использовали аль гинат кальция. Контролем служило поверхностное культивирование в аналогич ных условиях на агаризованной среде Чапека. Характер роста колоний был прак тически идентичным. При этом не было отмечено разжижения альгината кальция.
Двухнедельное культивирование на твердой среде с альгинатом кальция показало отсутствие у гриба ферментов, ответственных за метаболизм альгината. Радиаль ные скорости роста колоний гриба в эксперименте и контроле в процессе культи вирования были практически идентичными. Все это свидетельствует об отсутст вии ингибирующего воздействия альгината кальция на развитие гриба T. cylindro sporum и об отсутствии у гриба ферментов, ответственных за его разложение.
Для получения препаративной формы на основе гриба T. cylindrosporum была использована ранее разработанная методика иммобилизации микроорганизмов в альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью, с одновремен ной иммобилизацией с субстратом. В качестве субстрата был выбран крахмал. В качестве агентов, придающих гранулам положительную плавучесть, были иссле дованы н-алканы (додекан, пентадекан) и растительные масла (подсолнечное, со евое, льняное).
Иммобилизацию проводили по следующей схеме: 2% раствор альгината на трия смешивали в равном количестве с 2% раствором крахмала и с глубинной культурой гриба T. cylindrosporum, выращенной на модифицированной среде Ча пека с мальтозой в качестве источника углерода (с концентрацией клеток не ме нее 109КОЕ/мл), в объеме не менее 10% от объема смеси альгината и крахмала. К полученному раствору добавляли н-алканы или растительные масла в количестве 10% от общего объема раствора альгината с клеточной суспензией и крахмалом, проводили эмульгирование с помощью интенсивного перемешивания до получе ния капель масла, размером не более 20-30 нм. Полученная эмульсия была устой чива, что позволило провести ее иммобилизацию.
После иммобилизации были получены гранулы правильной сферической формы со следующими характеристиками: средний диаметр 0,1-0,3 мм, концен трация клеток внутри гранулы не менее 108 КОЕ/мл гранул, концентрация альги ната ~ 1%, концентрация крахмала ~ 1%, концентрация агента, придающего гра нулам положительную плавучесть ~ 10% от общего объема гранулы. Все гранулы независимо от состава обладали положительной плавучестью.
Важнейшей характеристикой новой препаративной формы является сохране ние клетками гриба T. cylindrosporum ларвицидной активности, а также стабиль ности гриба в иммобилизованном состоянии без потери активности. Для проверки этого были проведены эксперименты по определению ларвицидной активности, в которых вместо суспензии клеток в емкости с личинками вносили гранулы гриба.
В емкости с водой помещали по 20 личинок комара Aedes aegypty I-II возраста.
Количество гранул, вносимых в емкость, рассчитывали, исходя из концентрации клеток внутри них так, чтобы она не превышала 106 КОЕ/мл объема. Гранулы равномерно распределяли по поверхности воды в емкости. Емкости выдерживали при комнатной температуре в течение 7 суток. Каждые сутки подсчитывали коли чество живых и мертвых личинок и рассчитывали их процент гибели. Контролем служили емкости без внесения каких-либо микроорганизмов, а также с добавле нием гранул, не содержащих микроорганизмов.
Во всех вариантах эксперимента гибель личинок началась на 3-4-е сутки и к концу 7-х суток составила 100%. В контрольных экспериментах гибели личинок не наблюдалось.
Таким образом, можно сделать вывод, что T. cylindrosporum, иммобилизован ный в Са-альгинатном геле с субстратом в плавающие гранулы, сохраняет ларви цидную активность. В ходе эксперимента было отмечено, что гранулы через 5- дней покрывались визуально заметным слоем мицелия гриба. Можно предполо жить, что образование мицелия на поверхности гранул, происходит за счет мета болизма субстрата, локализованного внутри гранулы. На первой стадии развития клеток гриба внутри гранулы происходит секреция ими ферментов, которые гид ролизуют субстрат внутри гранулы до низкомолекулярных соединений. Низкомо лекулярные соединения, в свою очередь, могут метаболизироваться клетками, на ходящимися внутри гранулы, а также диффундировать из гранулы по градиенту концентраций. Растущий мицелий раздвигает по верхность гранулы и прорастает наружу, при этом часть мицелия все равно остается внутри гранулы (Рисунок 1). Последующий рост мицелия и его дифференциация на конидиеносцы и споры может происходить за счет метаболизма субстрата мицели ем, локализованным внутри гранулы, либо за счет субстрата, диффундированного из гранулы и рас творенного в слое свободной воды, окружающей мицелий. Не исключено также одновременное на Рис. 1. Край гранулы с про росшим мицелием гриба Toly- личие обоих механизмов.
Возрастание концентрации клеток на поверхно pocladium cylindrosporum.
сти гранулы, их локализация на поверхности разде ла фаз и спорование гриба могут являться одной из причин усиления ларвицидной активности гриба в иммобилизованном состоянии. Кроме того, большинство мертвых личинок, пораженных грибом, плавали на поверхности, и на них разви вался мицелий, который на поверхности раздела фаз споровался и, по всей види мости, мог стать источником нового заражения личинок, что, в свою очередь, могло привести к возникновению эпизоотии.
5. Исследование особенностей роста и развития Tolypocladium cylindrosporum в Са-альгинатных гранулах, различающихся по своим свойствам Следующим этапом исследований было изучение особенностей роста T.cylindrosporum из Са-альгинатных гранул и при варьировании различных пара метров: концентрации альгината, природы и концентрации субстрата внутри гра нулы. Для этого гранулы с различными концентрациями альгината и субстратами различной природы внутри гранулы помещали на предметное стекло по 3 штуки, затем во влажную камеру, представляющую собой чашку Петри с влажным там поном (Рисунок 2.) Чашки Петри инкубировали в термостате в течение 12 суток при температуре 28°С. Через каждые 24 часа гранулы микроскопировали, измеря ли длину проросшего из гранулы мицелия и отмечали морфо-физиологические характеристики гриба (Рисунок 3). По результатам измерений длины мицелия, проросшего из гранулы, рассчитывали площадь колонии гриба вокруг гранул.
Рис. 3. Образование мицелия Рис. 2. Влажная камера с Са- вокруг гранул с иммобилизо альгинатными гранулами. ванными клетками гриба Toly pocladium cylyndrosporum На рисунке 4 представлены кривые изменения площади мицелия T. cylindro sporum вокруг гранул с различным содержанием альгината: 0,5;
1,0;
1,5;
2,0%.
Концентрацию крахмала внутри гранул составляла 1%.
Рис.4. Динамика изменения площади колонии мицелия Tolypocladium cylindrosporum во круг гранул с различным содержанием альгината.
Минимальная концентрация альгината натрия, применяемого для иммобили зации, ограничивалась механическими свойствами получаемых гранул: гранулы с содержанием альгината кальция менее 0,5% очень неустойчивы и быстро механи чески разрушаются. Максимальная концентрация альгината ограничивалась вяз костью раствора: раствор с содержанием альгината натрия более 4% вязкий и его сложно применять в технологии иммобилизации.
Как видно из рисунка 4, площадь мицелия гриба вокруг гранулы уменьша лась пропорционально увеличению концентрации альгината в них. Максимальная площадь колонии на 12-е сутки достигается при росте из гранул с содержанием альгината 1% и равна 7,5 мм. Формы кривых роста практически не отличались друг от друга и имели S-образную форму. Можно предположить, что на прорас тание и скорость роста мицелия из гранулы накладываются диффузионные огра ничения, которые возрастают с увеличением концентрации альгината.
Характер роста и развития мицелия T.cylindrosporum из гранулы аналогичен росту гриба в свободном состоянии: после прорастания мицелия из гранулы про исходит его рост, с последующим ветвлением и образованием конидиеносцев и спор гриба.
В дальнейшей работе для иммобилизации использовали альгинат натрия с конечной концентрацией 1%.
Для изучения влияния природы субстрата были выбраны крахмал, с концен трациями в грануле 0,5%;
1%;
1,5%, подсолнечное, соевое и льняное масла, с кон центрациями 10%. Данные вещества являются высокомолекулярными или обра зуют эмульсию внутри гранул, что сводит к минимуму возможность их диффузии из гранулы после иммобилизации. Эксперименты по изучению роста гриба из гранул проводили в аналогичных условиях во влажной камере.
Рис. 5. Динамика изменения площади колонии мицелия Tolypocladium cylindrosporum во круг гранул с различным содержанием крахмала.
Рис. 6. Динамика изменения площади колонии мицелия гриба Tolypocladium cylidrosporum вокруг гранул, содержащих различные масла (концентрация 10%).
На рисунках 5 и 6 представлены кривые изменения площади колоний гриба во времени при росте мицелия из гранул, содержащих различные субстраты. Вид но, что наибольшая площадь мицелия к концу 12-х суток, равная 22 мм, дости галась при росте гриба из гранул, содержащих подсолнечное масло в концентра ции 10% от объема (таблица 3) и выражается в сут -1.
При микроскопировании гранул отмечено, что в течение всего эксперимента гриб развивался аналогично росту в свободном состоянии: проросшие гифы на чинали увеличиваться и ветвиться, далее образовывались конидиеносцы, и начи налось спорование. При росте T. cylindrosporum из гранул, содержащих масла, диаметр мицелия был заметно больше, чем при росте из гранул, содержащих крахмал.
Для сравнительной оценки роста гриба вокруг гранул был использован новый показатель – удельная скорость образования колонии. При этом были сделаны следующие допущения: поверхность колонии, растущей на стекле, достаточно однородна, а мицелий находится в одинаковом физиологическом состоянии в лю бой момент времени. Расчет данного параметра проводили по тангенсу угла на клона прямой, полученной при обработке S-образной кривой зависимости площа ди от времени в полулогарифмических координатах (таблица 3).
Из таблицы 3 видно, что расчетные значения удельной скорости роста коло ний, выросших вокруг гранул с различными параметрами, имеют практически одинаковые значения для одних субстратов с различными концентрациями. Это свидетельствует, в первую очередь, о том, что диффузионные ограничения, воз никающие как внутри гранулы при диффузии компонентов питания к клетке гри ба, так и при диффузии компонентов питания из гранулы в окружающую среду и межклеточное пространство, не оказывают существенного влияния на скорость роста мицелия гриба из гранулы.
Таблица 3.
Характеристики роста Tolypocladium cylindrosporum из гранул с различными параметра ми.
Удельная ско Максимальная площадь рость роста µ, мицелия вокруг гранул, мм сут - 0,5% 0,04 0, Альгинат Альги- Альги- Крахмал 1,0% 0,61 7, 1% 1,5% 0,60 6, 2,0% 0,59 5, нат 1% нат 1% 0,5% 0,59 6, Крах мал 1,0% 0,60 7, 1,5% 0,62 4, Подсолнечное, 10% 0,59 22, Масла Соевое, 10% 0,50 17, Льняное, 10% 0,04 4, Следует отметить, что оптимальными характеристиками гранулы для полу чения максимальной площади колонии вокруг гранулы T. cylindrosporum являют ся 1% альгината и 10% подсолнечного масла. При этом масло выполняет в грану ле одновременно две функции: агента, придающего гранулам свойство положи тельной плавучести и субстрата для роста и развития гриба из иммобилизованно го состояния в свободное.
6. Исследование ларвицидной активности бактерий Bacillus thuringiensis var.
israelensis в свободном и иммобилизованном состоянии Как было показано ранее, гибель первых личинок под воздействием иммоби лизованных клеток гриба T. cylindrosporum начинается на 3-4-е сутки. Для бакте риальных препаратов на основе Bti данная характеристика составляет несколько часов. Таким образом, очевидна целесообразность разработки новой препаратив ной формы по созданной нами технологии с использованием бактерий Bti.
Из нескольких штаммов Bti, полученных из коллекций Центра прикладной микробиологии (г. Оболенск), Института систематики и экологии животных Си бирского отделения РАН (г. Новосибирск) и ВКПМ (г. Москва), отобрали один, обладающий максимальной ларвицидной активностью.
Для этого провели глубинное культивирование 5 штаммов бактерий на L бульоне при естественном значении рН 6,5-7,0, температуре 25°С и постоянном перемешивании на ротационной качалке при скорости 200 об/мин. Засев культур осуществляли с косяка из пробирки. Культивирование проводили в течение 48 ча сов. К этому моменту все клетки бактерий начинали спороваться и параллельно образовывали кристалл -эндотоксина, что контролировали при микроскопиро вании фиксированных препаратов.
Оценку ларвицидной активности штаммов Bti проводили на личинках кома ров рода A.aegypty I – II возраста в лабораторных условиях по описанной выше методике. В сосуды с личинками вносили по 106КОЕ/мл глубинной культуры. В качестве контроля использовали сосуды с личинками без внесения микроорга низмов. Эксперименты с каждым штаммом проводили в 3-х повторностях. Через 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок и далее рассчитывали про цент их гибели. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Гибель личинок комаров Aedes aegypty под воздействием бактерий B.thuringiensis var. is raelensis Штаммы Bti (коллекционный номер) % гибели личинок Aedes aegypti B.thuringiensis var. israelensis (162) B.thuringiensis var. israelensis (1223) B.thuringiensis var. israelensis (1568) B.thuringiensis var. israelensis (902) B.thuringiensis var. israelensis (1532) Из таблицы 4 видно, что все исследуемые штаммы Bti обладают достаточно высокой ларвицидной активностью. Для дальнейшей работы был выбран штамм Bti 1223 как один из наиболее активных.
Выбранный штамм иммобилизовали в 1% альгинате натрия с добавлением 10% подсолнечного масла для придания гранулам положительной плавучести.
Оценку ларвицидной активности полученных гранул проводили аналогично оценке активности гранул гриба. Доза гранул подбиралась из расчета 1 гранула на 1 см поверхности емкости, что соответствовало концентрации 10 6 КОЕ/мл.
Через 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок и рассчитывали про цент их гибели. После этого удаляли все личинки из емкости и добавляли анало гичное количество живых личинок того же возраста. Аналогичные операции по вторяли в течение всего эксперимента, пока происходила гибель личинок кома ров. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица Изменение ларвицидной активности иммобилизованных клеток B.thuringiensis var. israel ensis 1223 во времени.
Время Количество мертвых ли Гибель личинок Aedes aegypti, % ч чинок, шт 24 20 48 18 72 11 168 2 240 0 Полученные результаты свидетельствовали о том, что бактерии Bti, иммоби лизованные в Са-альгинатном геле сохраняли ларвицидную активность. Ларви цидная активность препаративной формы сохранялась в течение 2-3 дней после внесения.
7. Создание препаративной формы Конечной целью данной работы было создание комплексного препарата, со держащего две культуры микроорганизмов. Важно было исследовать возмож ность иммобилизации микроорганизмов в одну гранулу и изучить взаимное влия ние микроорганизмов.
Для этого были проведены серии экспериментов по изучению:
1. влияния свободных клеток бактерий на рост гриба из гранул. Для этого в чаш ку Петри с агаризованной средой Чапека засевали 0,1мл выращенной глубин но культуры бактерий Bti и в центр чашки помещали гранулу с иммобилизо ванным T. cylindrosporum. Контролем служил рост гриба на среде Чапека без добавления бактерий.
2. влияния на рост гриба клеток бактерий, иммобилизованных в одной грануле.
Для этого готовили гранулы с одновременно иммобилизованными клетками бактерий и гриба, помещали их на предметное стекло во влажную камеру и анализировали рост гриба из гранулы. Контролем служили гранулы, с иммо билизованными клетками T.cylindrosporum без добавления бактерий.
В варианте 1 роста гриба из гранулы не наблюдалось, а бактерии покрыли поверхность агара ровным газоном. В варианте 2 при иммобилизации бактерий и гриба в одной грануле отмечено, что рост T. cylindrosporum из гранулы происхо дит, при этом мицелий более тонкий и слабый, чем в контроле. Максимальная площадь колонии гриба на 8 сутки при росте из гранул с бактериями почти в два раза меньше, чем при росте из гранул без добавления Bti.
Из проведенных экспериментов можно сделать вывод, что бактерии угнетают рост грибов, поэтому иммобилизацию микроорганизмов T. cylindrosporum и Bti проводить в одной грануле не целесообразно.
Следующим этапом работы был подбор оптимального соотношения гранул, содержащих только бактерии или только грибы, в препаративной форме. Крите риями для оценки эффективности препаративной формы были минимизациия времени начала гибели личинок и продолжительность действия препаративной формы. Для этого готовили смеси с различным процентным содержанием гранул с бактериями или грибами (таблица 6) и проверяли ларвицидную активность по лученных препаративных форм. Эксперимент проводили с подсаживанием личи нок.
Препаративные формы проверяли на ларвицидную активность по следующей методике. В емкость с водой помещали по 20 личинок комара Aedes aegypty I-II возраста. Далее вносили один из вариантов препаративной формы в концентрации 1 гранула на 1 см2 поверхности емкости.
Таблица 6.
Варианты исследуемых препаративных форм с различным содержанием гранул с T. cylin drosporum и Bti.
Количество гранул № Количество гранул T. Соотношений гранул B.thuringiensis var. israel варианта бактерий и грибов cylindrosporum (%) ensis (%) 1 100 0 1: 2 0 100 0: 3 50 50 1: 4 75 25 3: 5 25 75 1: 6 90 10 9: 7 10 90 1: Первые 8 суток эксперимента через каждые 24 часа производили подсчет живых и мертвых личинок комаров. Мертвые личинки не удаляли из емкости. На 8-е сутки в емкость были подсажены по 20 личинок комара I-II возраста. В тече ние последующих 4-х суток эксперимента через каждые 24 часа проводили под счет живых и мертвых личинок. На 12, 16 и 20-е сутки эксперимента в емкость проводили подсадку по 20 личинок I-II. Подсчет живых и мертвых личинок про водили каждые сутки в течение всего эксперимента. Дополнительное количество препарата в ходе всего эксперимента не вносили. Каждую неделю объем воды в емкостях доводили до первоначального отстоянной водопроводной водой. Ли чинки подкармливали сухим дейтритом в течение всего эксперимента. Экспери менты с каждой препаративной формой проводили в трех повторностях. В каче стве контроля был проведен эксперимент по аналогичной схеме без внесения ка кой-либо препаративной формы.
Развитие личинок в контрольном эксперименте проходило по стандартным законам: к 8-м суткам в емкости была обнаружена одна мертвая и две окуклив шихся личинки. На дне стакана были обнаружены хитиновые оболочки личинок, что свидетельствовало об их переходе в более старшую фазу. Все это свидетель ствовало о нормальном развитии популяции личинок. Внесение дополнительного количества личинок на 8-е сутки не изменило общей тенденции развития популя ции. К концу 12-х суток было обнаружено 3 мертвых личинок, 2 взрослых особи и 5 куколок. После внесения личинок на 12-е, 16-е и 20 сутки общая тенденция раз вития личинок сохранилась. После 12-х суток подсчет живых и мертвых личинок был крайне затруднен из-за высокой плотности популяции. Из описанных резуль татов можно предположить, что процент гибели в контрольном эксперименте не превышал 10% от общего количества личинок на каждой стадии внесения новых.
К концу эксперимента окуклилось и образовалось имаго не менее 20 (не менее 25%).
Таким образом, можно сделать вывод, что условия, созданные в контрольном эксперименте, позволяют нормально развиваться личинкам на протяжении дней, проходя характерные для них стадии развития: достижение 4 возраста, ста дии окукливания и стадии имаго.
После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе кле ток Bti первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения препарата. К концу первых суток 18-19 личинок (90-95%), не проявляли признаков жизни. В течение последующих 8 суток в одной из экспериментальных повторностей наблюдали 100% гибель личинок, в двух других повторностях 95%. После дополнительного внесения новых личинок в течение первых суток наблюдали незначительную гибель личинок, к 12-м суткам общее количество по гибших личинок достигало 24-25 штук, что составляло 25% от вновь внесенных личинок. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне сосуда, среди них наблюдались частично разложившиеся личинки. Единичные мертвые личин ки плавали на поверхности воды в емкости. Образование имаго на данной стадии эксперимента не наблюдалось. Внесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки не изменило общей картины гибели личинок: на каждом этапе наблюдали гибель 2- личинок на следующзие сутки после внесения. Начиная с 16-х, суток во всех по вторностях наблюдали образование куколок и имаго, к концу эксперимента их количество было 7 и 3, соответственно.
Таким образом, препаративная форма на основе иммобилизованных клеток Bti воздействовало на личинок комаров в первые моменты времени после внесе ния. Начиная с 8-х суток эксперимента воздействие клеток Bti ослабевает и к 12-м суткам снижалось практически до нулевых значений. Личинки комаров, погиб шие под воздействие прапаративной формы на основе клеток бактерий Bti не яв лялись источником поражения вновь внесенных личинок, о чем свидетельствова ло образование куколок и имаго.
После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе кле ток гриба T. cylindrosporum первые мертвые личинки были обнаружены на 4-е су тки. К 8-м суткам 18-20 личинок, что составляет 90-100%, было поражено грибом T.cylindrosporum. Характерным отличием личинок, пораженных грибом, является их локализация на поверхности раздела фаз, обездвижение и образование харак терной «шапки» гриба на поверхности личинки. После внесения на 8-сутки до полнительного количества новых личинок к 12-м суткам практически вся популя ция была обездвижена. Визуальный анализ показал, что более 80% процентов всей популяции поражены грибом. Последующее снесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки не изменило общей тенденции в поражении личинок грибом T.
cylindrosporum. К концу эксперимента не было выявлено ни одной куколки и има го. Мертвые личинки, в большинстве своем, были локализованы на поверхности с визуальными признаками поражения грибом.
Эксперимент по применению препаративной формы на основе иммобилизо ванных клеток гриба T. cylindrosporum показал практически 100% эффективность препарата. К недостаткам данной препаративной формы можно отнести то, что начало гибели личинок начиналось на 4-5-е сутки после начала эксперимента, достигая максимальных значений на 8-е сутки.
После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе сме си равных количеств иммобилизованных клеток гриба T. cylindrosporum и бакте рий Bti первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения, а к концу первых суток наблюдали 90-95% гибель личинок. Данное ко личество оставалось постоянным в течение последующих 8 дней. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне емкости. После внесения на 8-е сутки дополнительного количества личинок в течение первых суток наблюдали 30-50% гибель личинок. К концу 12-х суток количество мертвых личинок достигало 70 80%, 3 личинки окуклились. Большинство мертвых личинок было локализовано на поверхности и на них визуально были видны поражения грибом. Дополнитель ное внесение личинок на 12, 16 и 20-е сутки не привело к изменению обшей кар тины гибели личинок. К концу эксперимента было выявлено 5 куколок и 2 имаго.
Мертвые личинки были локализованы как на дне емкости, так и на поверхности.
Причем, на личинках, плавающих на поверхности, было отмечено развитие гриба T. cylindrosporum.
После внесения препаративной формы на основе смеси гранул гриба T. cylin drosporum и бактерий Bti в процентном соотношении 25:75, соответственно, ги бель первых личинок была обнаружена через несколько часов. К концу первых суток общее количество мертвых личинок составило 95-100%. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне емкости, только 2 из них плавали на поверхности. После дополнительного внесения личинок на 8-е сутки количество живых личинок к концу 12-х суток составило около 10 штук. 8 мертвых личинок были локализованы на поверхности, и на них были видны поражения грибом. До полнительное внесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки эксперимента со хранили общую картину гибели. К концу эксперимента количество окуклившихся личинок достигло 10, а количество имаго было равно 3.
При внесении препаративной формы на основе смеси гранул гриба T. cylin drosporum и бактерий Bti в процентном соотношении 75:25, соответственно, пер вые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения, к концу первых суток их количество составило около 90%, и локализованы они бы ли на дне сосуда. После внесения на 8-е сутки дополнительного количества жи вых личинок через несколько дней практически вся популяция была обездвижена.
Половина из них была локализована на поверхности жидкости и поражена гри бом. К концу 12-х суток не было выявлено ни одной живой личинки. Данная тен денция сохранилась и после внесения дополнительного количества живых личи нок на 12, 16 и 20-е сутки. К концу эксперимента не было обнаружено ни одной куколки и имаго.
Таким образом, эксперименты по определению ларвицидной активности раз личных препаративных форм показали, что все исследуемые препаративные фор мы обладают ларвицидной активностью. Эффективность и длительность сохране ния ларвицидной активности зависит от микроорганизмов, используемых для им мобилизации. Препаративная форма на основе иммобилизованных клеток Bti имеет очень высокую эффективность применения в первые сутки после внесении и практически теряет ларвицидную активность после 8-12 суток.
Препаративная форма на основе клеток гриба T. cylindrosporum начинает действовать начиная с 4-х суток, проявляя максимальную эффективность к 8-м суткам. Сохранение ларвицидной активности в течение не менее месяца может быть обусловлено либо действием самой препаративной формы, либо за счет гри ба, развившегося на пораженных личинках, которые также локализованы на по верхности жидкости.
Препаративные формы с разным соотношением гранул гриба T. cylindro sporum и бактерий Bti так же проявили свою ларвицидную активность на высоком уровне. Снижение в препаративной форме гранул с клетками бактерий Bti в 4 раза не привело к снижению ларвицидной активности в первые сутки, но в то же время позволило достичь оптимальных параметров ларвицидной активности на 8-е и по следующие сутки эксперимента, когда гибель личинок происходит под воздейст вием гриба T. cylindrosporum.
Таким образов, в качестве базового варианта препаративной формы для борьбы с личинками комаров была принята препаративная форма, состоящая из 25% гранул с иммобилизованными гранулами Bti и 75% гранул гриба T. cylindro sporum. Всем гранулам были приданы свойства положительной плавучести за счет иммобилизации растительного масла.
8. Определение эффективной дозы препарата.
Определение нормы расхода препарата проводили на базе Испытательного лабораторного центра (ИЛЦ) ГУП «Московский городской центр дезинфекции»
(МГЦД).
Испытания проводили согласно требованиям документа «Нормативные пока затели безопасности и эффективности дезинфекционных средств, подлежащих контролю при проведении обязательной сертификации» (пункт 3.11: «Средства для борьбы с личинками комаров (микробиологические, на основе уротропина и др.»). В качестве показателя эффективности использовли показатель «Гибель ли чинок через 24 часа, %» для различных концентраций. Эксперименты проводили в 6 повторностях.
Результаты проведенных экспериментов показали, что внесение препарата в дозировке не менее 0,10 мл/м2 (что составляло 1 гранула на 1см2 поверхности) обеспечивает во всех опытах полную гибель личинок комаров при отсутствии ги бели в контроле в течение первых 24 часов.
Существующие нормативные документы не предусматривают определения длительности эффективности действия препаратов. Тем не менее длительность действия препарата определяли исходя из натурных испытаний в реальных усло виях по обработке затопленных подвалов и водоемов не рыбохозяйственного на значения.
9. Хранение препарата.
В экспериментах по изучению срока хранения препарата в качестве консер вирующих агентов исследовали растворы глицерина и лактозы. Глицерин исполь зуют как консервирующий агент для препаративных форм на основе иммобили зованных клеток гриба T. viride и бактерий P. fluoriscens. Лактоза была выбрана, исходя из того, что гриб T. cylindrosporum, как было показано ранее, практически не метаболизирует ее.
Изучали следующие варианты стабильности препаративной формы (ПФ) при длительном хранении:
• ПФ в физиологическом растворе;
• ПФ в 15 растворе глицерина в физиологическом растворе;
• ПФ в 30% раствором глицерина в физиологическом растворе;
• ПФ в 15% растворе лактозы в физиологическом растворе;
• ПФ в 30% растворе лактозы в физиологическом растворе.
Исследование всех вариантов на стабильность в процессе хранения проводи ли в двух вариантах. Первый заключался в том, что ПФ помещали в перечислен ные растворы и закладывали на хранение на один год. В течение года через опре деленные промежутки времени производили отбор проб и определяли концентра цию микроорганизмов. В конце года проводили оценку ларвицидной активности ПФ.
Другой вариант заключался в исследовании хранения ПФ по методу «уско ренного старения» при повышенной температуре. Суть метода заключается в том, что препарат, помещенный в растворы исследуемых консервирующих агентов, подвергали цикличному воздействию пониженных (t=0°C) и повышенных (t=30°С) температур в течение суток. Всего было проведено 30 циклов. Через оп ределенное количество циклов проводили отбор проб гранул и анализировали концентрации клеток бактерий и грибов в них. После последнего цикла проводи ли изучение ларвицидной активности препарата.
Результаты экспериментов по хранению представлены в таблицах 7 и 8.
Как видно из таблицы 7, при изучении сохранности ПФ методом «ускоренно го старения» в варианте хранения иммобилизованных клеток в физиологическом растворе без консерванта, через 10 циклов концентрация клеток упала практиче ски на порядок, далее падение продолжалось и к концу испытаний их концентра ция упала практически на 4 порядка.
При хранении иммобилизованных клеток в 15 и 30% растворах глицерина и лактозы в физиологическом растворе концентрация клеток через 10 циклов прак тически не изменилась, а к концу 30-го цикла снизилась не более, чем на порядок.
Исследования ларвицидной активности, проверенной для образцов препара тов в растворах консервирующих агентов, показали, что иммобилизованные клет ки даже после 30-ти циклов сохраняли свою эффективность на том же уровне, что и свежеприготовленные.
Таблица 7.
Результаты сохранности препарата по методу «ускоренного старения».
Концентрация клеток, КОЕ кл/мл Вариант хранения 0-й цикл 10-й цикл 20-й цикл 30-й цикл TC Bti TC Bti TC Bti TC Bti 3 108 6 109 5 107 7 108 3 105 4 106 8 103 3 ИК в физ. р-ре ИК в 15% р-ре гли 8 108 7 109 4 108 4 109 3 108 8 108 1 108 3 церина в физ. р-ре ИК в 30% р-ре гли 4 108 3 109 3 108 1 109 1 108 8 107 8 107 7 церина в физ. р-ре ИК в 15% р-ре лак 5 108 4 109 3 108 3 109 1 108 2 109 7 107 7 тозы в физ. р-ре ИК в 30% р-ре лак 7 108 8 109 4 108 2 109 2 108 1 109 8 107 8 тозы в физ. р-ре Результаты экспериментов по хранению образцов препаратов при комнатной температуре в течение года показали, что в отсутствие консервирующих агентов концентрация клеток через полгода снижается на порядок, а через год почти на пять порядков, что соответствует полученным по методу «ускоренного старения».
Таблица 8.
Концентрации клеток при хранении препарата при комнатной температуре.
Концентрация клеток, КОЕ кл/мл Вариант хранения 0-й месяц 6-й месяц 9-й месяц 12-й месяц TC Bti TC Bti TC Bti TC Bti 4 108 5 109 1 107 4 108 2 105 3 106 4 103 1 ИК в физ. р-ре ИК в 15% р-ре гли 7 108 6 109 3 108 2 109 1 108 7 108 7 107 2 церина в физ. р-ре ИК в 30% р-ре гли 3 108 4 109 2 108 3 109 1 108 6 108 7 107 2 церина в физ. р-ре ИК в 15% р-ре лак 6 108 7 109 4 108 4 109 3 108 2 109 8 107 7 тозы в физ. р-ре ИК в 30% р-ре лак 5 108 5 109 3 108 2 109 1 108 1 109 7 107 8 тозы в физ. р-ре При хранении иммобилизованных клеток в растворах глицерина или лактозы в течение года снижение концентрации клеток было незначительным и не превы шало одного порядка. Различие между консервантами заключалось в том, что при хранении в растворах глицерина даже в 30% растворе наблюдался рост гриба из гранул, что приводило к слипанию гранул и потере товарного вида. При хранении в 15 и 30% растворах лактозы роста гриба из гранул отмечено не было и эффекта слипания не наблюдалось.
Исследования ларвицидной активности, проверенной для образцов препара тивных форм в растворах консервирующих агентов, показали, что препарат даже после года хранения сохранял свою эффективность на том же уровне, что и све жеприготовленный.
Таким образом, из полученных результатов эксперимента можно сделать вы вод, что оптимальным консервирующим агентом для хранения препарата в тече ние не менее года является лактоза в концентрации 15%.
10. Результаты производственных испытаний Для проведения производственных испытаний препарата была наработана опытная партия. Испытания проводили в период с 15.05.2006 по 15.09.2006 г. пу тем обработки затопленных подвальных помещений в г.Москве общей площадью 500 м2.
Препарат вносили по следующей схеме. Непосредственно перед обработкой готовили рабочий раствор путем перемешивания необходимого количества пре парата в водопроводной воде при температуре 22С. Дозу препарата рассчитыва ли, исходя из площади обрабатываемой водной поверхности и нормы расхода препарата 0,1 мл/м2. Объем воды для приготовления рабочего раствора рассчиты вали, исходя из нормы расхода рабочего раствора 10 мл/м2 обрабатываемой по верхности.
Обработки проводили путем нанесения рабочего раствора на водную поверх ность с помощью ранцевого опрыскивателя с постоянным перемешиванием, диа метр форсунок был не менее 0,3 мм.
Перед обработкой проводили подсчет численности личинок и окрыленных комаров сачком диаметром 20 см по методике, описанной в МУ 3.5.2.705- «Борьба с комарами, выплаживающимися в подвальных помещениях». Первона чальная численность личинок в подвале составляла 50 ± 5 экз./м2, имаго – 33 ± экз./м2.
Учет эффективности обработок проводили через каждые 7 дней после обра ботки в течение 4 месяцев. Снижение численности комаров после обработки оп ределяли в процентах по количеству комаров (личинок, имаго) в сравнении с их числом до проведения обработки.
Испытания показали, что после обработки затопленных подвалов препаратом через неделю не было зарегистрировано ни одной личинки или куколки. Количе ство окрыленных комаров на стенах подвалов и лестничных клетках в среднем было менее 1 экз./м2. Количество личинок и имаго остались на том же уровне в течение 4 месяцев после обработки.
Таким образом, из проведенных испытаний можно сделать вывод, что разра ботанный препарат на основе смеси иммобилизованных клеток гриба T.cylindrosporum и бактерий Bti является высокоэффективным препаратом дли тельного действия для уничтожения личинок комаров.
Основные результаты и выводы.
1. Отобран гриб T. cylindrosporum, обладающий наибольшей энтомопатогенной активностью в отношении личинок комаров. При изучении кинетики роста T. cyl indrosporum, иммобилизованных в Са-альгинатных гранулах с субстратами раз личной природы (крахмал, растительные масла), показано, что рост мицелия гри ба на поверхности гранул не отличается по морфо-физиологическим характери стикам от роста при их поверхностном культивировании. Установлено, что на рост мицелия из гранул оказывает влияние природа и концентрация субстрата, иммобилизованного в грануле, а также концентрация альгината. Оптимальными для T. cylindrosporum являются концентрация альгината 1% и концентрация под солнечного масла внутри гранулы 10%.
2. Показано, что клетки T. cylindrosporum, иммобилизованные в Са-альгинатные гранулы, а также в гранулы с одновременно иммобилизованными субстратами различной природы, сохраняют свою ларвицидную активность, стабильность при хранении в течение не менее 1 года.
3. При изучении кинетики гибели личинок комаров A. aegypty под действием гриба T. cylindrosporum, показано, что введение в гранулу таких веществ как н алканы и растительные масла обеспечивает положительную плавучесть гранул, что повышает эффективность их использования за счет пролонгированного дей ствия и локализации на поверхности воды. Показано, что клетки T.
cylindrosporum, иммобилизованные в гранулы с субстратом, вызывают возникно вение эпизоотии личинок комаров A. Aegypty.
4. При изучении кинетики гибели личинок A. aegypty под воздействием клеток бактерий B. thuringiensis var. israelensisis свободных и иммобилизованных в Са альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью, показано, что при иммобилизации бактерии сохраняют свою ларвицидную активность.
5. При изучении взаимного влияния клеток T.cylindrosporum и B. thuringiensis var.
israelensis было показано, что бактерии угнетают рост гриба как в свободном так и в иммобилизованном состоянии. Однако, при одновременном применении им мобилизованных клеток T.cylindrosporum и B. thuringiensis var. israelensis повы шается эффективность и длительность ларвицидной активности препаративной формы. Это легло в основу создания комбинированного препарата на основе сме си гранул иммобилизованных клеток бактерий и грибов.
6. Разработано, испытано и внедрено в производство инсектицидное средство Ба толим на основе смеси Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками T.
cylindrosporum с субстратом и B. thuringiensis var. israelensis в процентном соот ношении 75:25. Показана высокая эффективность средства при его применении в коммунальном хозяйстве для борьбы с личинками комаров.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Алексеева (Горюнова) О.Б., Марквичев Н.С., Борисов Б.А. Инсектицидные свойства глубинных культур микромицета Tolypocladium cylindrosporum в отношении личинок комара Aedes aegypty // Материалы I(IX) Международ ной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт Петербург, 2006. – С. 286- 2. Алексеева (Горюнова) О.Б., Цой А.М., Андриянова Д.А., Марквичев Н.С., Борисов Б.А. Глубинное культивирование энтомопатогенного микромицета Tolypocladium cylindrosporum на различных источниках углерода // Мате риалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состоя ние и перспективы развития». Москва, 2007. – С. 37-38.
3. Мельников Е.А., Алексеева (Горюнова) О.Б., Терешкина Н.Н., Марквичев Н.С., Борисов Б.А. Изучение хранения и прорастания спор нематофильного микромицета Paecilomyces lilacinus, иммобилизованного в кальций альгинатном геле // Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. – С.
298-299.
4. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Биологический препарат для борьбы с ди чинками кровососущих комаров на основе ассоциации энтомопатогенных микроорганизмов // Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009. – С.
205-206.
5. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Рост гриба Tolypocladium cylindrosporum из гранул кальций-альгинатного геля // Биотехнология. - 2009. - №3. – С. 34 39.
6. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Комары – вне закона// Экология и жизнь. – 2009. - №6. - С. 89-