Теоретические и экспериментальные подходы для изучения механизмов транспорта цисплатина в клетки с помощью белка ctr1
Таким образом, Ag-диета избирательно вызывает снижение содержания только той меди, которая ассоциирована с ЦП. Дефицит меди в этой форме снижает скорость роста опухолей человека у иммунодефицитных мышей. Наличие ионов серебра во внеклеточной среде влияет на цитотоксические свойства цисплатина.
Скорость поступления цисплатина в клетки снижена у животных с низким уровнем внеклеточной меди.
Научно-практическое значение полученных результатов состоит в том, что они углубляют знания о механизмах, лежащих в основе нарушений метаболизма меди, ведущих к развитию медь-ассоциированных болезней;
кроме того, они расширяют общие представления о метаболизме металлов в организме млекопитающих. В практическом плане, использование разработанной модели животных с изменяющимся уровнем меди в крови позволит изучить роль меди в индукции и скорости роста опухолей. Выявление связи между уровнем меди во внеклеточной среде и токсическим эффектом цисплатина открывает перспективу для оптимизации протоколов применения этого противоопухолевого препарата в клинике.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Белок CTR1 импортирует цисплатин при участии ионов меди Cu(II).
2. У лабораторных грызунов Ag-диета вызывает обратимое снижение содержания меди, ассоциированной с ЦП, и не влияет на метаболизм меди в печени.
3. Дефицит меди, индуцированный Ag-диетой, может быть компенсирован однократным введением сульфата меди.
4. Скорость роста опухолей человека в организме иммунодефицитных мышей снижается при дефиците меди, связанной с ЦП.
5. Ионы серебра влияют на цитотоксическое действие цисплатина.
6. Распределение цисплатина в организме мышей зависит от уровня меди в крови.
способствует электростатическому притяжению катионов, а гидрофильность дистальной части N-концов и их гликозилирование препятствуют слипанию с мембраной и друг с другом.
Канонический анализ топологии доменов в белке CTR1 предсказывает, что ТМД1 начинается с 68 а.о. и продолжается до 86 а.о., он расположен на расстоянии 22 а.о. от описанного выше метионинового сайта (Sharp, 2003).
Предполагаемое начало ТМД1 определяется нечетко, так как CTR1 содержит достаточно протяженную область гидрофобных а.о., разделенных единичными заряженными а.о. (рис. 1, см. вкладку). Поэтому допустимо считать, что начало ТМД1 расположено значительно ближе к N-концу, чем следует из канонического анализа трансмембранных доменов, то есть длина ТМД1 может составлять 27-29 а.о., а метионин-богатый мотив 3 располагается у устья купрофильной поры вблизи критических для переноса меди остатков метионина 150 и 154, принадлежащих ТМД2. Длина консервативного линкера между удлиненным ТМД1 и мотивом 3 позволяет последнему сближаться с устьем канала. Так как Met-домены не обладают конформационной жесткостью, геометрия образуемых ими комплексов, скорее всего, не фиксирована, поэтому специфичность по отношению к Cu(I) невелика, а лабильность (характеризуется скоростью образования и распада комплекса в реакциях нуклеофильного замещения) значительна. Теоретически, эти мотивы должны связывать любые мягкие электрофилы – Cu(I), Ag(I), Hg(II), Pt(II), Au(III) и т.п., что отчасти подтверждается экспериментально (Rubino et al., 2010;
Arnesano et al., 2008).
Таким образом, описанные свойства N-концевого домена CTR1 полностью соответствуют его биологической роли, которая состоит в первичном захвате иона меди и удержании его в восстановленном состоянии вблизи устья канала, образованного ТМД2 и ТМД3. Наличие большого количества мягких нуклеофильных групп и изоляция иона от молекул воды в гидрофобном метиониновом окружении мотивов 3 делают восстановленную форму Cu(I) энергетически более выгодной, чем Cu(II), и препятствуют окислению или диспропорционированию: ион(ы) меди (I) "растворен(ы)" в прочно связанной вблизи устья канала нанокапле тиоэфира. В отличие от медьтранспортных белков, в данном случае специфичность первичного связывания не очень важна, так как общая высокая аффинность транспорта по отношению к Cu(I)/Ag(I), скорее всего, определяется далее сайтами по ходу канала (например, Met150 и Met154 (Guo et al., 2004)). Эти сайты находятся в предорганизованной геометрии (De Feo et al., 2009), а поэтому энергетически более выгодны для соответствующих по свойствам ионов в силу увеличения хелатного эффекта.
2. Предполагаемое функциональное значение медьсвязывающих мотивов N-конца CTR1 позвоночных Значительная консервативность N-концевого домена CTR1 у позвоночных, образование в нем трех мотивов и сохранение относительно постоянной длины указывает на возникновение новых консервативных функций. В самом деле,
Наибольшей накопительной способностью обладают печень и надпочечники. В печени серебро аккумулируется во фракциях, плотность которых в градиенте сахарозы соответствует плотности митохондрий (рис. 6,А). К тому же, эти фракции окрашиваются Mitotracker-580 Red, специфическим флуоресцентным красителем, который применяется для выявления фиксированных митохондрий.
По данным иммуноблотинга, эти фракции также содержат иммунореактивную субъединицу 4 (Cox4i1) митохондриального белка СОХ.
А Б Рис. 6. Распределение серебра (А) и меди (Б) в органеллах клеток печени крысы, фракционированных в ступенчатом градиенте сахарозы методом равновесного ультрацентрифугирования. Обозначения: кружки – контроль, ромбы – Ag-мыши, треугольники – отмена Ag-диеты. По оси абсцисс: номер фракции градиента;
по оси ординат:
концентрация, мкг/л.
У мышей после отмены Ag-диеты оксидазная активность восстанавливается частично уже через три дня и полностью через 2 недели.
Концентрация серебра постепенно снижается во всех органах. Уровень и распределение меди в клетках печени не меняются во время Ag-диеты и после ее отмены (рис. 6,Б).
С целью установить, влияет ли дефицит церулоплазминовой меди на метаболизм меди в клетках печени, было изучено влияние Ag-диеты на
5. Наличие ионов серебра во внеклеточной среде влияет на цитотоксические свойства цисплатина in vitro. У мышей с низким уровнем внеклеточной меди снижается скорость поступления цисплатина в почки и печень.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Zatulovskiy Е., Samsonov S., Skvortsov A. Docking study on mammalian CTR1 copper importer motifs // BMC Systems Biology, 1 (Suppl 1): 54, 2007.
2. Клотченко С. А., Цымбаленко Н. В., Соловьёв К. В., Скворцов А. Н., Затуловский Е. А., Бабич П. С., Платонова Н. А., Шавловский М. М., Пучкова Л. В., Броджини М. Влияние