Реакция усиленной хемилюминесценции, катализируемая анионными пероксидазами растений, и ее применение в иммуноферментном анализе
На правах рукописи
Вдовенко
Марина Михайловна
РЕАКЦИЯ УСИЛЕННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ,
КАТАЛИЗИРУЕМАЯ АНИОННЫМИ ПЕРОКСИДАЗАМИ РАСТЕНИЙ,
И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ
Специальность:
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
МОСКВА – 2011
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор Иван Юрьевич Сахаров
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Александр Габибович Габибов доктор биологических наук, профессор Марина Александровна Мягкова
Ведущая организация:
Институт экспериментальной кардиологии, ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс»
Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Защита состоится 29 марта 2011 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.
Автореферат разослан _2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук И.К.Сакодынская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Иммуноферментный анализ (ИФА) в настоящее время является одним из самых распространенных аналитических методов, используемых для определения разнообразных аналитов. На практике в современных условиях наиболее интенсивно применяется твердофазный вариант ИФА (тИФА). Известно несколько форматов тИФА, при этом во всех форматах последним этапом является определение каталитической активности фермента-метки. Для этого в тИФА используют различные методы детекции, но наиболее чувствительным является хемилюминесцентный метод.
Традиционно в тИФА в качестве метки используется катионный изофермент с пероксидазы хрена (ПХ). И в этом случае субстратом для хемилюминесцентной регистрации активности ПХ является люминол. Так как каталитическая активность ПХ в отношении люминола крайне низка, требуется введение в реакционную среду дополнительных соединений, которые называются усилителями. Наиболее известным усилителем для ПХ является 4 йодофенол. Предел обнаружения ПХ в этом случае составляет 1.0 пМ.
Изучение кинетики данной ферментативной реакции показало, что ПХ продуцирует аналитический сигнал, сильно изменяющийся во времени. Таким образом, для развития новых высокочувствительных тИФА методов требуется решить проблему нестабильности хемилюминесцентного сигнала (ХЛС), а также понизить предел обнаружения пероксидазы.
В последние годы был выделен ряд новых ферментов, относящихся к группе анионных изопероксидаз. В отличие от ПХ эти пероксидазы продуцируют практически неизменный во времени аналитический сигнал. Этот факт позволил продемонстрировать преимущества использования анионной пероксидазы сои (ПС) по сравнению с ПХ в тИФА с хемилюминесцентной детекцией (ХЛ-тИФА). К сожалению, данная группа пероксидаз также имеет недостаток, заключающийся в том, что ХЛС, продуцируемый ими, значительно ниже, чем с применением ПХ. Введение в реакционную среду усилителей ПХ не дает значительного усиления хемилюминесценции. Данный факт ограничивает чувствительность разрабатываемых иммуноферментных тест систем. Все вышеперечисленное однозначно указывает на актуальность поиска эффективных усилителей для анионных пероксидаз, приводящих к высокому по величине и стабильному во времени аналитическому сигналу, что, в конечном счете, позволит качественно улучшить аналитические параметры иммуноферментных тест-систем.
Цели и задачи исследования. Обнаружить эффективные усилители ХЛС, продуцируемого анионными пероксидазами, и продемонстрировать -3 преимущества их применения при разработке высокочувствительных иммуноферментных тест-систем с хемилюминесцентной детекцией.
В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
• Оценить способность 3-(10’-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната натрия (ФТПС) в качестве усилителя ХЛС, продуцируемого анионными пероксидазами сои и батата;
• Сравнить ФТПС с другими производными фенотиазина как потенциальными усилителями ХЛС, продуцируемого ПС;
• Изучить влияние некоторых производных пиридина на усиливающую способность ФТПС;
• Оценить возможности детектирующей системы на основе ПС и ФТПС с 4 морфолинопиридином (МП) в сэндвич и конкурентном форматах ХЛ тИФА.
Научная новизна работы. Открыто, что ФТПС является эффективным усилителем хемилюминесценции, продуцируемой анионными пероксидазами в процессе окисления люминола пероксидом водорода. Впервые для анионных пероксидаз был продемонстрирован эффект вторичного усиления ХЛС под воздействием ряда производных пиридина. Добавление пары усилителей ФТПС/МП в реакционную смесь при наиболее благоприятных условиях окисления люминола пероксидом водорода приводило к понижению предела обнаружения пероксидазы сои до 0.03 пМ. Кроме того, показано, что образующийся ХЛС практически неизменен в течение длительного времени.
Продемонстрированы преимущества использования разработанной системы усиления на основе анионной ПС и усилителей ФТПС/МП в сравнении с традиционно используемой в ХЛ-тИФА катионной ПХ и усилителя 4 йодофенола на примере сэндвич формата тест-системы для определения тиреоглобулина человека. Более того, возможности разработанной детектирующей системы были продемонстрированы в конкурентном формате тИФА для определения охратоксина А и 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты.
Практическая значимость работы. Продемонстрировано, что использование разработанной детектирующей системы на основе коммерчески доступной анионной пероксидазы сои вместо пероксидазы хрена в составе иммуноферментных наборов с хемилюминесцентной детекцией позволяет существенно улучшить их качество за счет понижения предела обнаружения, расширения линейного диапазона определяемых концентраций и большей стабильности хемилюминесцентного сигнала во времени. Разработанный метод анализа был успешно применен для определения тиреоглобулина в сыворотке -4 человека, охратоксина А в образцах соевых бобов и 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислоты в образцах апельсинов.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях «Дни иммунологии в Санкт Петербурге, 2009» (Санкт-Петербург, 2009), «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), «Перспективы развития инноваций в биологии, 2009» (Москва, 2009) и «Ломоносов-2009» (Москва, 2009) и международных симпозиумах «The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, 2010» (Тель-Авив, Израиль, 2010), «Bioluminescence and Chemiluminescence, 2010» (Лион, Франция, 2010) и «Luminescence Spectrometry, 2010» (Прага, Чехия, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы: 4 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 8 тезисов докладов на международных конференциях и симпозиумах.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы (149 ссылок). Работа изложена на 147 страницах и включает рисунков и 15 таблиц.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ натрия усилитель I. 3-(10’-фенотиазинил)-пропан-1-сульфанат – хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами.
Как известно, ряд соединений различной химической природы является усилителями люминесценции, катализируемой ПХ в процессе окисления люминола пероксидом водорода. В отличие от этого, люминесценция, образующаяся в аналогичной реакции и катализируемая анионными пероксидазами, практически не увеличивается в присутствии традиционных усилителей ПХ. Отсутствие в арсенале исследователей усилителей анионных пероксидаз сдерживало применение этих ферментов в практической аналитической практике.
Недавно было найдено, что натриевая соль 3-(10’-фенотиазинил)-пропан 1-сульфаната (ФТПС, рисунок 1) способна усиливать интенсивность ХЛ, образующейся в присутствии ПХ. Учитывая этот факт, нами была предпринята попытка оценить усиливающую способность ФТПС в отношении анионных пероксидаз, выделенных из сои (ПС) и батата (ПБ). Так как ПБ, в отличие от -5 ПС, коммерчески недоступна, то предварительно этот фермент был нами выделен в препаративных S количествах из кожуры клубней батата.
Первоначальная оценка усиливающего эффекта N ФТПС проводилась в условиях, ранее описанных в литературе как наиболее благоприятные для каталитического соокисления люминола и ФТПС под SO3Na действием ПХ. Как видно на рисунке 2, добавление Рисунок 1. Химическая ФТПС в субстратную смесь значительно увеличивало интенсивность регистрируемой хемилюминесценции, структура натриевой соли 3-(10’-фенотиази- продуцируемой как ПС, так и ПБ. Усиливающий нил)-пропан-1-сульфа эффект ФТПС, рассчитанный при концентрации ната (ФТПС).
ферментов, равной 30 пМ, в случае ПС и ПБ составил 37 и 25 раз, соответственно.
А Хемилюминесценция, у.е.
Б Хемилюминесценция, у.е.
б 1500000 б 1000000 500000 а а 0,1 1 10 100 0,1 1 10 [ПС], пМ [ПБ], пМ Рисунок 2. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации анионных пероксидаз сои (А) и батата (Б) в отсутствие (а) и в присутствии (б) ФТПС. Экспериментальные условия: [ФТПС] = 0.75 мМ;
[люминол] = 1.25 мМ;
[H2O2] = 2.5 мМ;
100 мМ трис-буферный раствор, pH 8.6.
Конечно, эти величины не так значительны, как величины усиления, обнаруженные ранее для усилителей ПХ, которые в некоторых случаях достигали 1000 раз. Однако неверно было бы уделять этой разнице слишком большое значение. Это связано с тем, что в отсутствие усилителей в субстратной смеси ПС и ПБ являются значительно более активными биокатализаторами по отношению к люминолу, чем ПХ. Более того, первичная оценка усиливающего действия ФТПС была проведена при условиях, благоприятных для катализа ПХ. В целом, значения интенсивности свечения (рисунок 2), полученные в ходе этих предварительных экспериментов, -6 однозначно свидетельствуют о том, что в лице ФТПС был обнаружен эффективный усилитель ХЛС, катализируемого ПС и ПБ. Здесь следует подчеркнуть, что ФТПС является первым обнаруженным усилителем анионных пероксидаз.
Из литературных данных хорошо известно, что субстратная специфичность и рН-стабильность ПХ и анионных пероксидаз сильно отличаются между собой. Из этого следует, что условия для наиболее продуктивного каталитического соокисления люминола и ФТПС в присутствии ПС, ПБ и ПХ могут быть различными. Таким образом, нами была поставлена задача оптимизировать условия реакции соокисления люминола и ФТПС пероксидом водорода, катализируемой ПС и ПБ.
При поиске наиболее благоприятных условий для катализа ПС в субстратной смеси варьировались концентрации люминола, пероксида водорода, триса, ФТПС, а также значение рН реакционной среды. В качестве параметра слежения было использовано отношение ХЛС, образующегося в присутствии ПС (ХЛСПС), к фоновой интенсивности ХЛС, полученного в отсутствие фермента (ХЛСФ). Данное отношение было использовано нами, так как именно этот параметр является определяющим для оценки предела обнаружения любой детектирующей ферментной системы. В результате оптимизации наиболее благоприятные условия в случае использования ПС в качестве катализатора соокисления люминола и ФТПС пероксидом водорода оказались: 50 мM трис-буферный раствор, pH 8.3, содержащий 0.75 мM люминола, 0.5 мM H2O2 и 1 мM ФТПС. По той же методике были оптимизированы условия соокисления люминола и ФТПС пероксидом водорода, катализируемого и ПБ: 50 мM трис-буферный раствор, pH 8.3, содержащий 0.75 мM люминола, 0.1 мM H2O2 и 1 мM ФТПС.
Таким образом, наиболее благоприятные условия, определенные для ПС и ПБ, в значительной степени отличались от условий проведения аналогичной реакции, катализируемой ПХ (100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.6, 1.25 мМ люминола, 2.5 мМ Н2О2, 0.75 мМ ФТПС), что с нашей точки зрения объясняется различием каталитических свойств катионных и анионных пероксидаз. Кроме того, условия, определенные для ПБ, были практически идентичны, за исключением более низкой концентрации H2O2, условиям, определенным для ПС. Причина более низкой концентрации H2O2, по видимому, связана с меньшей стабильностью ПБ по отношению к пероксиду водорода, который является суицидным субстратом пероксидаз. Оптимизация экспериментальных условий проведения реакции ферментативного соокисления люминола и ФТПС в присутствии пероксидаз позволила повысить -7 величину усиливающего эффекта ФТПС для ПС и ПБ до 240 и 139 раз, соответственно.
Как хорошо известно, одним из важнейших аналитических параметров любой детектирующей системы является значение предела обнаружения (ПО) анализируемого вещества. Поэтому были изучены зависимости интенсивности свечения от концентраций ПХ, ПС и ПБ, полученные при условиях, благоприятных для каждого из ферментов. Из полученных данных были рассчитаны значения ПО для каждой пероксидазы (таблица 1). Данный расчет основывался на определении, что величина ПО равна концентрации фермента, при которой регистрируется интенсивность хемилюминесценции, превышающая интенсивность фоновой (неферментативной) реакции на удвоенное значение стандартного отклонения.
Таблица 1. Сравнение систем усиления хемилюминесценции.
Экспериментальные условия:
Предел для ПХ: [люминол] = 1.0 мM;
[H2O2] = 2.0 мM;
Пероксидаза обнаружения [4-йодофенол]= 2.0 мМ;
100 мM трис-буферный пероксидазы, пМ раствор, pH 8.5;
для ПС: [люминол] = 0.75 мM;
[H2O2] = 0.5 мM;
Сои 0.16 [ФТПС]= 1.0 мМ;
50 мM трис-буферный раствор, pH 8.3;
Батата 0. для ПБ: [люминол] = 0.75 мM;
[H2O2] = 0.1 мM;
[ФТПС]= 1.0 мМ;
50 мM трис-буферный раствор, Хрена 0. pH 8.3.
В эксперименте, где в качестве катализатора и усилителя были применены ПХ и 4-йодофенол (4-ИФ) значение ПО оказалось равным 0.9 пM. В отличие от ПХ, в случае ПС значение ПО было равно 0.16 пM, т.е. ПО был ниже более чем в 5 раз. При использовании ПБ в качестве биокатализатора реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствии ФТПС, проведенной при оптимальных условиях, ПО был равен 0.5 пМ. Полученное значение ПО было несколько выше, чем ПО для ПС в присутствии ФТПС, но ниже, чем ПО для ПХ в присутствии 4-йодофенола. Таким образом, применение детектирующей системы на основе анионных пероксидаз и усилителя ФТПС привело к понижению значения предела обнаружения по сравнению с традиционно используемой системой усиленной хемилюминесценции.
-8 Как сообщалось ранее, одним из преимуществ анионных пероксидаз перед ПХ является их практически неизменный во времени ХЛС. Эти исследования проводились без добавления в реакционную среду каких-либо усилителей, так как в то время не было известно ни одного усилителя анионных пероксидаз. Как можно видеть на рисунке 3, максимальная интенсивность свечения, образующаяся в присутствии ФТПС, как в случае ПБ (кривая а), так и в случае ПС (кривая б) достигалась через 5 минут после начала реакции, а затем очень медленно спадала. Нельзя не заметить, что значение интенсивности ХЛС, продуцируемого ПС, было более чем в 3 раза выше ХЛС, продуцируемого ПБ.
По-видимому, этот факт связан с различным составом субстратных смесей для исследуемых пероксидаз. Как уже отмечалось выше, концентрация пероксида водорода в составе субстратной смеси, используемой для анализа ПС, в 5 раз выше концентрации Н2О2, входящего в состав субстратной смеси ПБ, что и приводило к более интенсивному ферментативному соокислению люминола и ФТПС, катализируемому ПС.
Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что ФТПС является эффективным усилителем хемилюминесценции, продуцируемой как минимум двумя анионными пероксидазами, и остававшейся стабильной в течение длительного промежутка времени. Учитывая информацию, что ФТПС усиливает ХЛС, продуцируемый также и катионной ПХ, можно предположить, что ФТПС будет проявлять свои усиливающие качества и в случаях применения других пероксидаз растений.
Рисунок 3. Кинетика интенсивности ХЛС, образующегося в процессе Хемилюминесценция, у.е.
б соокисления люминола и ФТПС в присутствии пероксидаз батата (а) и сои (б). Экспериментальные условия:
[ПБ] = [ПС] = 30 пМ;
[люминол] = 0.75 мM;
[ФТПС] = 1.0 мM;
50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3;
а (а): [H2O2] = 0.1 мM;
(б): [H2O2] = 0.5 мM.
0 300 600 900 1200 Время, сек В связи с тем, что из анионных пероксидаз только ПС является коммерчески доступной, все последующие исследования проводились исключительно с ПС. Принятое решение также подкреплялось полученными данными о том, что интенсивность продуцируемого ХЛС и чувствительность -9 определения пероксидазной активности выше в присутствии ПС, чем в присутствии ПБ.
II. Сравнение производных фенотиазина как усилителей пероксидаза зависимой хемилюминесценции.
Обнаруженный нами эффект усиления хемилюминесценции под действием ФТПС в присутствии анионных пероксидаз стимулировал проведение сравнительного изучения производных фенотиазина, содержащих различные заместители, как потенциальных усилителей пероксидаза-зависимой ХЛ. Для сравнения были выбраны следующие доступные нам производные фенотиазина: дипразин, хлорацизин, нонахлазин, этацизин, перфеназин, (3-(10’ фенотиазинил)-пропионовая кислота (ФПК) и 3-(10’-(2’-хлор)-фенотиазинил) пропионовая кислота (ХФПК). Химические формулы исследуемых производных фенотиазина приведены на рисунке 4. В контрольных экспериментах была использована ФТПС (рисунок 1).
S S S N S O C O CH Cl NH CH3 N N N Cl N C2H5 C 2H N O O C CH2 CH2 N C CH2 CH2 N CH3 O C CH2 CH2 N H3C C2H5 C 2H Дипразин Хлорацизин Нонахлазин Этацизин S S S N Cl Cl N N N N OH CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH Перфеназин 3-(10’-(2’-хлор)-фенотиазинил)- 3-(10’-фенотиазинил) пропионовая кислота (ХФПК) пропионовая кислота (ФПК) Рисунок 4. Структурные формулы производных фенотиазина.
Все эксперименты по оценке усиливающего эффекта фенотиазинов проводились в одинаковых условиях, а именно в условиях, благоприятных для ферментативного окисления люминола, катализируемого ПС. Как видно из данных таблицы 2, практически все производные фенотиазина с положительно заряженными ионогенными группами (дипразин, хлорацизин, нонахлазин, этацизин) обладали отрицательным усиливающим эффектом, т.е. являлись не усилителями свечения, а его тушителями. Из этой группы веществ лишь перфеназин проявлял свойства усилителя пероксидаза-зависимой - 10 хемилюминесценции, однако величина усиливающего эффекта этого вещества была крайне низка. С другой стороны, присутствие в субстратной смеси производных фенотиазина с отрицательно заряженными ионогенными группами в значительной степени повышало интенсивность хемилюминесценции.
Таблица 2. Влияние производных фенотиазина на величину усиливающего эффекта хемилюминесценции, производимой при окислении люминола в присутствии пероксидазы сои.
Экспериментальные Концентрация условия: 50 мМ трис Производное Эффект производного буферный раствор, рН 8.3;
фенотиазина усиления фенотиазина, [люминол] = 0.75 мM;
мМ [H2O2] = 0.5 мM;
[ПС] = А. с положительно пМ.
заряженными ионогенными группами Дипразин 0.2 0.45 ± 0. Хлорацизин 0.2 0.35 ± 0. Нонахлазин 0.2 0.20 ± 0. Этацизин 0.2 0.19 ± 0. Перфеназин 0.2 5.52 ± 0. Б. с отрицательно заряженными ионогенными группами ФПК 1.0 237 ± ХФПК 1.0 76 ± ФТПС 0.2 159 ± 1.0 240 ± Таким образом, максимальным усиливающим эффектом обладали ФПК и ФТПС, которые содержат в своей структуре отрицательно заряженные (в условиях эксперимента) карбоксильную группу и сульфогруппу, соответственно, присоединенные к фенотиазиновому ядру через N-пропильную группировку.
- 11 Последующие эксперименты проводились с использованием ФТПС в качестве усилителя ХЛС, продуцируемого ПС.
III. Вторичное усиление пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.
Как отмечено ранее в литературе, некоторые производные пиридина такие как 4-диметиламинопиридин (ДМАП), 4-морфолинопиридин (МП) и 4 пирролидинопиридин (ПирП) (рисунок 5), не влияя на реакцию окисления люминола, катализируемую ПХ, в присутствии ФТПС, повышали усиливающий эффект данного усилителя. Эти вещества были названы вторичными усилителями. Помня об отмеченном феномене, влияние ДМАП, МП и ПирП на образование ХЛС при соокислении люминола и ФТПС в присутствии ПС было исследовано.
O Рисунок 5. Структурные H3 C CH N N N формулы 4-диметиламинопиридина, N N N 4-морфолинопиридина и ДМАП МП ПирП 4-пирролидинопиридина.
ФТПС ФТПС + МП ФТПС А Б Хемилюминесценция, у.е.
ФТПС + ДМАП ФТПС + МП Отношение ХЛСПС/ХЛСФ ФТПС + ПирП ФТПС + ДМАП ФТПС + ПирП 8,0 8,3 8,6 8,9 9,2 9, 8,0 8,3 8,6 8,9 9,2 9, рН рН Рисунок 6. Зависимость значения ХЛС, продуцируемого ПС при соокислении люминола и ФТПС, (А) и отношения ХЛСПС/ХЛСФ (Б) от состава и кислотности среды. Экспериментальные условия: [ПС] = 30 пМ;
[люминол] = 0.75 мM;
[H2O2] = 0.5 мM;
[ФТПС]= 1.0 мМ;
[МП] = [ДМАП] = [ПирП]= 1.5 мМ;
[H2O2] = 0.5 мM;
50 мM трис-буферный раствор.
Как видно из рисунка 6А, добавление в реакционную смесь, содержащую ФТПС, всех исследуемых вторичных усилителей приводило к повышению - 12 значения ХЛС в 2-3 раза. В отсутствие ФТПС исследуемые вещества на ХЛС не влияли. При этом было найдено, что максимальным усиливающим действием при всех значениях рН реакционной среды обладал 4-морфолинопиридин.
Кроме того, максимальное значение отношения ХЛСПС/ХЛСФ (рисунок 6Б) также наблюдалось в случае введения МП в субстратную смесь.
Дополнительным положительным свойством МП является то, что это вещество в отличие от ДМАП и ПирП нетоксично. Таким образом, в нашей дальнейшей экспериментальной работе МП использовался в качестве вторичного усилителя.
Сравнение кривых зависимости ХЛС от концентрации ПС в присутствии и отсутствие МП (рисунок 7А) показало, что добавление МП до концентрации 1 мМ приводило к повышению крутизны градуировочных кривых, а, следовательно, добавление этого соединения повышало чувствительность определения пероксидазной активности. При концентрациях МП выше 1 мМ все кривые были практически одинаковыми. Этот факт позволил нам выбрать концентрацию МП, равную 1 мМ, как наиболее благоприятную для использования в дальнейших экспериментах.
0, Передел обнаружения ПС, пМ е Б А 250000 д Хемилюминесценция, у.е.
г в 0, б 0, 100000 0, а 0, 0 1 2 3 0,01 0,1 [МП], мМ [ПС], пМ Рисунок 7. Зависимость (А) интенсивности ХЛС, катализируемого ПС, и (Б) предела обнаружения ПС от концентрации 4-морфолинопиридина ( (а), 0.5 (б), 1.0 (в), 2.0 (г), 3.0 (д) и 4.0 мМ (е)). Экспериментальные условия:
[люминол] = 0.75 мM;
[H2O2] = 0.5 мM;
[ФТПС] = 1.0 мM;
50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3.
Добавление МП в реакционную смесь (1 мМ) приводило к понижению значения ПО до 0.03 пM (рисунок 7Б), т.е. МП, действуя как вторичный усилитель, уменьшал значение ПО дополнительно более чем в 5 раз.
Безусловно, добавление в субстратную смесь вторичного усилителя приводило к улучшению характеристик детектирующей системы. Однако с аналитической точки зрения также чрезвычайно важно, чтобы при этом сохранялась и стабильность ХЛС во времени. В этой связи нами была изучена - 13 кинетика ХЛС, продуцируемого при соокислении люминола и ФТПС в присутствии МП как вторичного усилителя и ПС как биокатализатора этой реакции (рисунок 8). Процесс тушения ХЛС формально подчинялся уравнению реакции первого порядка с константами скорости тушения ХЛС в отсутствие и присутствии МП, равными 5.9 х 10-5 с-1 и 1.1 х 10-4 с-1, соответственно. Хотя введение в реакционную среду дополнительно МП и приводило к 2-х-кратному увеличению скорости тушения ХЛС, все же абсолютная величина наблюдаемой константы тушения оставалась чрезвычайно низкой, и во временных пределах анализа (определение пероксидазной активности в тИФА и родственных методах) ХЛС можно считать практически неизменным.
Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, ФТПС + МП Хемилюминесценция, у.е.
что введение в субстратную смесь 120000 МП приводит к увеличению значения отношения ХЛСПС/ХЛСФ до 700 раз.
Кроме того, совместное использо вание ФТПС/МП, люминола и ПС ФТПС позволяет иметь детектирующую систему со стабильным в течение длительного интервала времени ХЛС, 0 300 600 900 1200 предел обнаружения которой ниже Время, сек аналогичного параметра, характер Рисунок Кинетические 8. ного для традиционной системы кривые ферментативной детекции на основе 4-йодофенола, реакции окисления люминола, люминола и ПХ, более чем в 30 раз.
катализируемой пероксидазой Все эти обнаруженные качества сои. Экспериментальные условия:
делают, с нашей точки зрения, [ПС] = 30 пМ;
[люминол] = 0.75 мM;
[H2O2] = 0.5 мM;
[ФТПС]= 1.0 мМ;
исследуемую систему чрезвычайно [МП] = 1.0 мМ;
50 мM трис-буферный перспективной для ее использования раствор, рН 8.3.
в различных форматах иммуно ферментного анализа.
IV. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в сэндвич формате тИФА.
Для того, чтобы оценить возможности полученной нами детектирующей системы на основе ПС/ФТПС/МП, был разработан сэндвич формат тИФА для определения тиреоглобулина (ТГ) человека. Полученная хемилюминесцентная тест-система, после ее оптимизации, была сравнена с тест-системой с колориметрической детекцией для определения ТГ, ранее разработанной в - 14 НИИ вакцин и сывороток имени Мечникова РАМН. Колориметрическая иммуноферментная тест-система (КОЛ-тИФА) имела в своем составе те же реагенты (поликлональные антитела против ТГ и ТГ человека), что и использованные нами в ХЛ-тИФА с применением ПС/ФТПС/МП. В колориметрической тест-системе использовался иммуноконъюгат ПХ с поликлональными антителами против ТГ (анти-ТГ-АТ–ПХ), пероксидазная активность которого определялась в реакции окисления 3,3’,5,5’ тетраметилбензидина. Анализ зависимости оптической плотности от концентрации определяемого ТГ в полулогарифмических координатах позволил рассчитать значение ПО, которое составило 2.0 нг/мл. В отличие от КОЛ-тИФА при детекции ТГ ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП предел обнаружения ТГ был в 10 раз ниже и равен 0.2 нг/мл (таблица 3).
Градуировочные кривые в линейных координатах дали возможность оценить линейный диапазон определяемых концентраций при сравнении двух тест-систем (таблица 3). Переход от КОЛ-тИФА к ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП позволил расширить линейный диапазон анализа ТГ с 2.0-340 нг/мл до 0.2- нг/мл.
Таблица 3. Сравнительная характеристика иммуноферментных тест систем с различной детекцией пероксидазной активности, разработанных для определения тиреоглобулина человека.
Аналитические характеристики тест-системы Тест-система ПО, Линейный диапазон Коэффициент определяемых вариации, % нг/мл концентраций ТГ, нг/мл КОЛ-тИФА 2.0 2.0 - 340 0.04 - 3. ХЛ-тИФА-ПХ/4-ИФ 2.0 2.0 - 700 0.02 - 2. ХЛ-тИФА 0.2 0.2 - 700 0.12 - 2. ПС/ФТПС/МП Для демонстрации преимуществ ХЛ детектирующей системы на основе ПС в ХЛ-тИФА нами было проведено сравнение аналитических параметров тест-систем для определения ТГ человека с применением ПС/ФТПС/МП и ПХ/4-ИФ. Детектирующая система на основе ПХ/4-ИФ была выбрана нами как наиболее чувствительная система (к началу проведения данной работы) и широко используемая в ХЛ-тИФА тест-системах.
- 15 Градуировочные кривые (в полулогарифмических (А) и линейных (Б) координатах) для определения ТГ ХЛ-тИФА с применением как анти-ТГ-АТ– ПХ конъюгата, так и анти-ТГ-АТ–ПС, представлены на рисунке 9. ХЛ-тИФА выполнялся в наиболее благоприятных условиях, найденных для каждого вида конъюгата. При использовании анти-ТГ-АТ–ПХ ПО (рисунок 9А) составил 2. нг/мл, что в 10 раз выше по сравнению с ПО, получаемым при использовании разработанной нами детектирующей системы (таблица 3). Кроме того, ХЛ тИФА-ПС/ФТПС/МП обладал более высокой чувствительностью по сравнению с ХЛ-тИФА-ПХ/4-ИФ, что следует из большего значение тангенса угла наклона градуировочной кривой для тИФА с ПС/ФТПС/МП системой (рисунок 9).
Что касается линейного диапазона определяемых концентраций, то для ХЛ-тИФА-ПХ/4-ИФ можно отметить его сужение по сравнению с ХЛ-тИФА ПС/ФТПС/МП до 2.0 - 700 нг/мл за счет увеличения значения нижней его границы (таблица 3).
Б Хемилюминесценция, у.е.
Хемилюминесценция, у.е.
А 100000 0 200 400 600 800 0,1 1 10 100 [ТГ], нг/мл [ТГ], нг/мл Рисунок 9. Градуировочные кривые в полулогарифмических (А) и линейных (Б) координатах для определения ТГ ХЛ-тИФА с применением анти-ТГ-АТ, меченными ПС (1) и ПХ (2).
Таким образом, применение системы детекции, основанной на ПС/ФТПС/МП, в сэндвич формате ХЛ-тИФА, разработанном для определения ТГ человека, позволило на порядок понизить значение ПО и расширить линейный диапазон определяемых концентраций ТГ (таблица 3).
С одной стороны, тиреоглобулин человека был выбран нами как модельный объект для демонстрации преимуществ разработанной нами системы усиления ХЛС в сэндвич формате тИФА. С другой стороны, выбор ТГ в качестве антигена был не случаен, а обусловлен также и практической значимостью данного метода анализа.
- 16 Известно, что повышение уровня ТГ – неспецифический признак дисфункции щитовидной железы (в большинстве случаев доброкачественного характера), поэтому в лабораторной диагностике ТГ используется в качестве опухолевого маркера для наблюдения пациентов с диагнозом высокодифференцированного рака щитовидной железы. Выявление повышенной концентрации ТГ у таких пациентов до операции подтверждает способность опухоли продуцировать ТГ и целесообразность использования этого показателя для данного больного в послеоперационном мониторинге в качестве опухолевого маркера. Уровень ТГ быстро снижается после тиреоидэктомии и после постоперационного периода восстановления не должен присутствовать в крови. Поэтому любое появление ТГ в крови человека после проведения операции может сигнализировать о рецидиве рака щитовидной железы. Таким образом, чем чувствительнее будет метод определения ТГ, тем быстрее пациент будет подвержен повторному курсу лечения и тем больше будет вероятность положительного исхода лечения.
В настоящее время иммуноферментной тест-системой с наиболее чувствительной детекцией является коммерческий иммуноферментный набор Immulite®, где ферментом-маркером является щелочная фосфатаза (ЩФ), активность которой определяется хемилюминесцентным методом. Данная тест система позволяет определять ТГ в сыворотке человека на уровне 0.2 нг/мл, т.е.
ее ПО равен ПО для ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП, разработанного в процессе выполнения данной работы.
В этой связи ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП был сравнен с набором Immulite® для определения ТГ человека в образцах сывороток крови. Анализ с применением набора Immulite®, выполнялся в соответствии с инструкциями производителя. Используя ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП, нами были определены концентрации ТГ в тех же образцах сывороток крови (n=10), что были использованы и в работе с набором Immulite®. Хорошая корреляция между данными, полученными при измерении ТГ с помощью ХЛ-тИФА с ПС и ЩФ (y = 1.15x + 2.88, R=0.998), свидетельствует о достоверности результатов разработанного нами метода.
Суммируя полученные данные, следует подчеркнуть, что использование коммерчески доступного препарата анионной ПС в качестве метки в тИФА в комбинации с такими усилителями как ФТПС и МП позволило разработать высокочувствительный ХЛ-тИФА для определения ТГ в сыворотке крови человека, удовлетворяющий требованиям современной эндокринологии.
Чувствительность разработанного метода была сопоставима с ЩФ-зависимым коммерческим набором. Однако принимая во внимание, что стабильность ПС значительно выше по сравнению со стабильностью ЩФ, а цена ее ниже, - 17 использование ПС в качестве фермента-метки открывает широкие перспективы для ее использования в высокочувствительных ХЛ-тИФА (сэндвич формат) для определения самых различных веществ.
V. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-тИФА.
В предыдущем разделе на примере метода определения ТГ человека были продемонстрированы преимущества использования детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в сэндвич формате ХЛ-тИФА. Но, как известно, сэндвич формат позволяет анализировать только высокомолекулярные соединения в тИФА.
Когда же речь идет о низкомолекулярных веществах, то необходимо использовать конкурентный формат тИФА. Поэтому далее мы продемонстрируем возможности изучаемой детектирующей системы в конкурентном формате ХЛ-тИФА на примере двух аналитов, присутствие которых требуется контролировать в пищевых продуктах, а именно охратоксина А (ОТА) и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д).
V.1. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-тИФА для определения ОТА.
Ранее нашими коллегами из Медицинского Университета г. Тайчунг (Тайвань) был разработан прямой конкурентный КОЛ-тИФА для определения ОТА. При этом ферментом-маркером являлась ПХ. При создании ХЛ-тИФА на основе детектирующей системы ПС/ФТПС/МП нами использовались те же моноклональные антитела против ОТА, что и антитела, использованные в КОЛ тИФА.
Таблица 4. Сравнительная характеристика иммуноферментных тест систем с различной детекцией пероксидазной активности, разработанных для определения ОТА.
Аналитические характеристики тест-системы Тест-система ПО, Линейный диапазон Коэффициент IC50, определяемых вариации, % нг/мл нг/мл концентраций ОТА, нг/мл КОЛ-тИФА 0.06 0.58 0.17-2.20 1.7-3. ХЛ-тИФА 0.02 0.08 0.02-0.30 8- - 18 Аналитические параметры этих двух тест-систем были сравнены между собой (таблица 4). Результаты свидетельствует о том, что при переходе от КОЛ тИФА к ХЛ-тИФА метод анализа ОТА был существенно улучшен, что выразилось в том, что значения ПО и IC50 стали значительно ниже, а линейный диапазон определяемых концентраций сместился в область меньших концентраций ОТА.
При анализе количественного содержания ОТА в экстрактах соевых бобов методом «введено-найдено» значения «открытия» лежали в интервале 72-125% (таблица 5). Полученный разброс значений «открытия» считается вполне допустимым при проведении тИФА.
Введенная Определенная Открытие, Таблица Анализ 5.
концентрация концентрация количественного содер % OTA, нг/мл OTA, нг/мл жания ОТА в образцах экстрактов соевых бобов 0.070 0.050 ± 0.001 72 ± методом «введено 0.100 0.100 ± 0.001 100 ± 1 найдено».
0.150 0.187 ± 0.007 125 ± V.2. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-тИФА для определения 2,4-Д.
Применимость детектирующей системы ПС/ФТПС/МП была также оценена в конкурентном формате ХЛ-тИФА, разработанном для определения 2,4-Д. Данный метод позволил получить типичную для Хемилюминесценция, у.е.
конкурентного формата S-образную градуировочную кривую (рисунок 10).
Предел обнаружения 2,4-Д составил 1.5 нг/мл, в то время как рабочий диапазон лежал в интервале 6.5- нг/мл. Коэффициент вариации в этом 0,01 0,1 1 10 100 1000 случае не превышал 9%.
[2,4-Д], нг/мл Разработка высокочувствитель Рисунок 10. График зависимости ного ХЛ-тИФА для определения 2,4 хемилюминесцентного сигнала от Д являлась фрагментом российско концентрации 2,4-Д, определенной вьетнамского проекта, финанси ХЛ-тИФА на основе детекти руемого РФФИ (08-03-90301-Вьет_а), рующей системы ПС/ ФТПС/МП.
где планировалось определение - 19 данного аналита в плодах цитрусовых. По этой причине образцы экстрактов кожуры апельсинов были получены и переданы нам сотрудниками института биотехнологии (г. Ханой, Вьетнам).
Применимость разработанного тИФА для количественного определения 2,4-Д в экстрактах кожуры апельсинов оценивали методом «введено-найдено».
Для этого в образцы экстрактов кожуры апельсинов, не содержащих 2,4-Д, было введено точно известное количество пестицида и проведено определение концентрации аналита. Результаты приведены в таблице 6. Высокая степень «открытия» указывает на Таблица 6. Анализ количественного содержания 2,4-Д в образцах экстрактов отсутствие эффекта матрикса кожуры апельсинов методом «введено- и, следовательно, на найдено». применимость разработанного метода для определения 2,4-Д Введенная Определенная Открытие, в образцах экстрактов кожуры концентрация концентрация % апельсинов.
2,4-Д, нг/мл 2,4-Д, нг/мл Разработанный ХЛ 10.0 10.4 ± 0.2 104.0 ± 1. тИФА был применен для проведения количественного 100.0 92.0 ± 6.5 92.0 ± 7. определения содержания 2,4 300.0 299.0 ± 22.5 99.0 ± 7.5 Д в 14 образцах экстрактов кожуры апельсинов. В 5 из них концентрация 2,4-Д была определена количественно (таблица 7). В остальных образцах содержание 2,4-Д было столь высоким, что для ее количественного определения требовалось дальнейшее разведение полученных образцов. Здесь следует отметить, Таблица 7. Содержание 2,4-Д в кожуры что во всех анализируемых образцах образцах экстрактов апельсинов, определенное ХЛ-тИФА- уровень существенно 2,4-Д ПС/ФТПС/МП. превышал ПДК (0.005 мг/кг).
Таким образом, на основе Обнаружено Образец детектирующей системы нг/мл мг/кг ПС/ФТПС/МП нами был 1 396.0 ± 24.0 0.079 ± 0.005 разработан прямой конкурентный формат тИФА с хемилюминес 2 510.0 ± 10.0 0.102 ± 0. центной детекцией, позволяющий 3 517.0 ± 19.0 0.103 ± 0.004 с высокой чувствительностью проводить определение 2,4-Д как в 4 521.5 ± 4.5 0.104 ± 0. буферном растворе, так и в 5 522.0 ± 20.0 0.104 ± 0.004 реальных образцах экстрактов кожуры апельсинов.
- 20 Подводя итоги всего раздела, посвященного применению детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в ХЛ-тИФА, следует сказать, что внедрение разработанной нами системы детекции пероксидазной активности как в сэндвич, так и в конкурентный форматы тИФА привело к очевидным улучшениям аналитических характеристик. Таким образом, для разработанной детектирующей системы открываются широкие перспективы ее применения в иммуноферментных тест-системах с повышенной чувствительностью.
ВЫВОДЫ 1. Оценена способность различных производных фенотиазина усиливать интенсивность хемилюминесценции, образующейся в процессе ферментативного окисления люминола пероксидом водорода в присутствии пероксидазы сои. Показано, что соли 3-(10’-фенотиазинил)-пропан-1 сульфоната (ФТПС) и 3-(10’-фенотиазинил)-пропионата являются первыми усилителями люминол-зависимого хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами. Найдено, что эффективность производных фенотиазина как усилителей реакции усиленной хемилюминесценции напрямую зависит от их способности окисляться пероксидом водорода в присутствии пероксидаз.
2. Продемонстрировано, что ФТПС является эффективным усилителем люминол-зависимого хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами. В оптимизированных условиях каталитического соокисления люминола и ФТПС эффект усиления для пероксидаз сои и батата составил 240 и 139 раз, соответственно.
3. Обнаружено, что введение, помимо ФТПС, в субстратную смесь 4 диметиламинопиридина, 4-морфолинопиридина или 4-пирролидинопиридина приводит к дополнительному повышению интенсивности свечения, катализируемого пероксидазой сои, что позволяет позиционировать эти производные пиридина как вторичные усилители пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.
4. Продемонстрировано, что использование системы усиления, включающей ФТПС и 4-морфолинопиридин, позволило понизить предел обнаружения пероксидазы сои до 0.03 пМ. Полученная величина более чем в раз ниже по сравнению с пределом обнаружения пероксидазы хрена в присутствии традиционно используемого усилителя.
4-йодофенола, Дополнительным преимуществом разработанной детектирующей системы является высокая стабильность в течение длительного периода времени хемилюминесцентного сигнала.
- 21 5. Оценена возможность системы усиления, включающей ФТПС и 4 морфолинопиридин, в сэндвич формате хемилюминесцентного иммуноферментного анализа на примере метода определения тиреоглобулина в сыворотке человека. Предел обнаружения и рабочий диапазон тест-системы с применением пероксидазы сои как маркерного фермента составили 0.2 нг/мл и 0.2-700 нг/мл, соответственно. Сравнение аналитических характеристик тест систем с применением пероксидаз сои и хрена показали очевидные преимущества первого фермента. Разработанный метод анализа был успешно применен для определения тиреоглобулина в сыворотке человека.
6. С применением системы усиления, включающей пероксидазу сои, ФТПС и разработаны высокочувствительные 4-морфолинопиридин, конкурентные иммуноферментные тест-системы для определения охратоксина А и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Предел обнаружения и рабочий диапазон хемилюминесцентных тест-систем составили 0.02 нг/мл и 0.02-0.30 нг/мл для охратоксина А и 1.5 нг/мл и 6.5-545 нг/мл для 2,4-Д, соответственно. Разработанные тест-системы позволили успешно оценить содержание охратоксина А и 2,4-Д в образцах соевых бобов и апельсинов.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1) M.M. Vdovenko, L. Della Ciana, I.Yu. Sakharov. 3-(10’-Phenothiazinyl) propane-1-sulfonate is a potent enhancer of soybean peroxidase-induced chemiluminescence. Analytical Biochemistry, 2009, V. 392, P.54– 2) M.M. Vdovenko, L. Della Ciana, I.Yu. Sakharov. Enhanced chemiluminescence: a sensitive analytical system for detection of sweet potato peroxidase. Biotechnology Journal, 2010, V. 5, P.886– 3) M.M. Vdovenko, A.V. Zubkov, G.I. Kuznetsova, L. Della Ciana, N.S.
Kuzmina, I.Yu. Sakharov. Development of ultrasensitive soybean peroxidase-based CL-ELISA for determination of human thyroglobulin. Journal of Immunological Methods, 2010, V. 362, P.127– 4) F.-Y.Yu, M.M.Vdovenko, J.-J.Wang, I.Yu.Sakharov. Comparison of enzyme linked-immunosorbent assays with chemiluminescent and colorimetric detection for determination of ochratoxin A in food. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, V. 59, P.809– М.М.Вдовенко, И.Ю. Сахаров. 3-(10’-фенотиазинил)-пропан-1-сульфонат 5) - уникальный усилитель хемилюминесцентного сигнала, образующегося в процессе окисления люминола в присутствии пероксидазы сои. Материалы - 22 докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 13 – 18 апреля, 2009, Москва, Россия, с. М.М.Вдовенко, А.В.Зубков, Г.И.Кузнецова, И.Ю.Сахаров, Н.С.Кузьмина.
6) Определение тиреоглобулина в иммуноферментном анализе с системой усиленной хемилюминесценции при использовании пероксидазы сои. XIII Всероссийский научный форум с международным участием им. Акад.
В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Сант-Петербурге», 8-11 июня, 2009, Санкт Петербург, Россия, с. 7) M.M. Vdovenko, I.Yu. Sakharov. Novel potent enhancer of soybean peroxidese-induced chemiluminescence. International conference “BIOCATALYSIS-2009. Fundamentals and Applications”, June 19-24, 2009, Arkhangelsk, Russia, P. М.М.Вдовенко. Повышение чувствительности иммуноферментных тест 8) систем, основанное на применении реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой сои. Материалы III Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии», 11-13 ноября, 2009, Москва, Россия, с.34- 9) M.M. Vdovenko, L. Della Ciana, I.Yu. Sakharov. Novel potent enhancer of soybean peroxidase-induced chemiluminescence. The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, January 19-20, 2010, Tel Aviv, Israel, P. 10) A.S.Stepanova, M.M.Vdovenko, Nguyen Van Cuong, S.A.Eremin, I.Yu.Sakharov. Chemiluminescent enzyme immunoassay for determination of 2,4 dichlorophenoxyacetic acid. The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, January 19-20, 2010, Tel Aviv, Israel, P. 11) M.M. Vdovenko, A.V. Zubkov, G.I. Kuznetsova, L. Della Ciana, N.S.
Kuzmina, I.Yu. Sakharov. Development of ultrasensitive chemiluminescent ELISA for determination of human thyroglobulin. 16th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, April 19-23, 2010, Lyon, France, P. 12) L. Della Ciana, M.M.Vdovenko, I.Yu. Sakharov, L. Covello, D. Foglietta.
Ultrasensitive chemiluminescent systems for the detection of anionic peroxidases.
XIVth Intern. Sym. on Luminescence Spectrometry, July 13-16, 2010, Prague, Czech Republic, P. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИФА – иммуноферментный анализ;
тИФА – твердофазный иммуноферментный анализ;
ПХ – пероксидаза хрена;
- 23 ПС – пероксидаза сои;
ПБ – пероксидаза батата;
ФТПС – натриевая соль 3-(10’-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната;
МП – 4-морфолинопиридин;
4-ИФ – 4-йодофенол;
ХЛС – хемилюминесцентный сигнал;
ХЛ – хемилюминесцентция;
КОЛ-тИФА – тИФА с колориметрической детекцией;
ХЛ-тИФА – тИФА с хемилюминесцентной детекцией;
ТГ – тиреоглобулин человека;
ОТА – охратоксин А;
2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота;
анти-ТГ-АТ–ПХ – конъюгат поликлональных антител против ТГ с ПХ;
анти-ТГ-АТ–ПС – конъюгат поликлональных антител против ТГ с ПС.
- 24