Медицинский университет удк 577.121:612.1

«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

УДК 577.121:612.112.95.014.46

ДЕВИНА

Елена Анатольевна

ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ

ПЕРЕСТРОЙКА АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ

ПОД ВЛИЯНИЕМ СИГАРЕТНОГО ДЫМА

И ЕЕ КОРРЕКЦИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук по специальности 03.01.04 – биохимия Минск 2011 1   Работа выполнена в УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Научный руководитель: Таганович Анатолий Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор, заве дующий кафедрой биологической химии УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Официальные оппоненты: Лелевич Владимир Валерианович, доктор медицинских наук, профессор, заве дующий кафедрой биологической химии УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Буко Вячеслав Ульянович, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биохимической фарма кологии ГУ НПЦ «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси»

Оппонирующая организация: ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования»

Защита состоится 11 ноября 2011 г. в 14.00 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18.02 при УО «Белорусский государственный медицинский университет» по адресу: 220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, 83, тел.: (017) 272-55-98, e-mail: [email protected].

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УО «Белорусский государственный медицинский университет».

Автореферат разослан «» _ 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат медицинских наук, доцент А. И. Герасимович   ВВЕДЕНИЕ В Беларуси от болезней, связанных с курением, ежегодно умирают 15,5 тыс. человек [Наройчик Л., 2010]. Средняя потеря продолжительности жизни курящих белорусов составляет 18 лет, а для возраста 35–69 лет – 21 год.

Бронхо-легочная система в первую очередь, подвергается воздействию табачного дыма. Вдыхание табачного дыма потенциально увеличивает риск заболевания раком, пневмонией, хронической обструктивной болезнью лег ких (ХОБЛ), способствует развитию эмфиземы. За последние годы достиг нут значительный прогресс в понимании морфологической сущности про цессов, лежащих в основе развития большинства этих заболеваний. Остают ся непонятными молекулярные механизмы развития ХОБЛ.

Исследование компонентов, содержащихся в табачном дыме, показало, что при горении табака имеет место цепная химическая реакция с участием активных форм кислорода (АФК) [Pryor W.A., 1993;

  Stone К., 1994]. Экзо генным (табачным) радикалам отводится главная роль в развитии ХОБЛ.

При этом недооценивается значение эндогенных (клеточных) АФК, обра зующихся при контакте субмикроскопических частиц смол и других твер дых продуктов табачного дыма с клетками.

Полагают, что в формировании воспалительного процесса в воздухо проводящих путях активное участие принимают альвеолярные макрофаги (АМ) [Aoshiba K., 2001;

Rahman I., 2006;

Taylor A.E., 2010]. В частности, активируясь, АМ продуцируют повышенное количество АФК, различные цитокины, эйкозаноиды и другие медиаторы воспаления [Barnes P.J., 2004;

Yoshida T., 2007]. Тем самым к месту их нахождения привлекаются лимфо циты, нейтрофилы и фибробласты, которые, в свою очередь, активируются для дальнейшего роста, размножения и функционирования. Однако к началу нашей работы имелись противоречия относительно влияния сигаретного дыма на функциональную активность АМ, образование и катаболизм АФК именно в этих клетках. Не изученными оставались зависимость показателей этих процессов от концентрации сигаретного дыма, длительности его кон такта с АМ. Предшествующие нашей работе данные позволяли осмыслить значимость АФК в развитии ХОБЛ. Они составили основу рабочей гипоте зы для настоящего исследования. Предполагалось, что смолы табачного ды ма, контактируя с АМ в нижних отделах дыхательных путей, снижают их жизнеспособность и фагоцитарную активность в зависимости от дозы и дли тельности контакта. В частности, нарушение способности к обезвреживанию поглощенного материала происходит за счет ингибирования соответствую щих ферментных систем. Накопление АФК причастно к нарушению функ   циональной способности АМ и нуждается в коррекции. Эффективным сред ством для этого могут быть природные антиоксиданты.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Связь работы с крупными научными программами и темами.

Диссертация выполнялась в рамках научно-исследовательской работы кафедры биологической химии УО «Белорусский государственный меди цинский университет»: «Экспериментально обосновать закономерности нарушения метаболизма в клетках легких при синдроме острой дыхатель ной недостаточности и разработать новые критерии для диагностики развития этого состояния при искусственной вентиляции легких», номер гос. регистрации 2005424, сроки выполнения 2004–2012 гг., а также в рамках научно-исследовательского проекта «Исследовать влияние смол сигаретного дыма на функциональную активность и показатели метабо лизма клеток легких» по договору № Б09-010 от 15.04.2009 г. с Белорус ским республиканским фондом фундаментальных исследований, номер гос. регистрации 20091535, сроки выполнения 2009–2011 гг.

Цель исследования: установить особенности окислительного метабо лизма, функциональной активности и жизнеспособности альвеолярных мак рофагов при контакте с сигаретным дымом и сравнительную эффективность антиоксидантов по предотвращению выявленных изменений.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние сигаретного дыма и активных форм кислорода на фагоцитарную активность, жизнеспособность изолированных альвеолярных макрофагов.

2. Определить способность альвеолярных макрофагов к индукции ак тивных форм кислорода и азота, продуктов окисления липидов и белков в результате контакта с экстрактом сигаретного дыма.

3. Оценить активность ферментов антиоксидантной защиты после кон такта альвеолярных макрофагов с экстрактом сигаретного дыма.

4. Определить способность N-ацетилцистеина, куркумина, кверцетина, резвератрола, эпигаллокатехин галлата корригировать изменения функцио нальных параметров и оксидантно-антиоксидантного состояния альвеоляр ных макрофагов, развившиеся в результате контакта клеток с сигаретным дымом.

Объект исследования: изолированные альвеолярные макрофаги крыс, культивируемые в питательной среде, обогащенной сигаретным дымом.

Предмет исследования: показатели фагоцитарной активности и жиз неспособности альвеолярных макрофагов;

показатели, характеризующие   уровень активных форм кислорода, азота, окисления липидов и белков, со стояние антиоксидантной защиты в альвеолярных макрофагах;

показатель активации процессов транскрипции генов провоспалительных цитокинов в альвеолярных макрофагах.

Положения, выносимые на защиту:

1. В результате контакта с экстрактом сигаретного дыма снижается жизнеспособность альвеолярных макрофагов и их фагоцитарная активность, наблюдается уменьшение числа фагоцитирующих клеток и количества по глощенных ими микроорганизмов. Наиболее выраженные изменения, более чем в 2 раза, имеют место при наибольшей из изучаемых концентраций экс тракта сигаретного дыма и при продолжительном контакте с ним альвеоляр ных макрофагов [1, 3, 4, 13, 14].

2. Экстракт сигаретного дыма активирует процессы свободнорадикаль ного окисления в макрофагах легких, снижая активность антиоксидантной системы: уменьшается концентрация нитрит-ионов, количество небелковых соединений, содержащих SH-группу, активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и глутатионпероксидазы (ГПО);

увеличивается количество пероксида водорода, ТБК-активных продуктов перекисного окисления липи дов и карбонильных производных белков в альвеолярных макрофагах. Сте пень изменения более выражена при длительном контакте клеток с экстрак том сигаретного дыма. Имеет место увеличение количества транскрипцион ного фактора NF-B в ядерной фракции альвеолярных макрофагов [2, 3, 11, 12, 15–17].

3. Антиоксидантное действие N-ацетилцистеина (N-АЦ), куркумина, резвератрола, эпигаллокатехин галлата (ЭГКГ) и кверцетина в концентрации 10-5 моль/л на интактные альвеолярные макрофаги проявляется в снижении концентрации пероксида водорода, нитрит-ионов, карбонильных производ ных белков (только N-ацетилцистеин), повышении активности глутатионпе роксидазы, каталазы (за исключением кверцетина), супероксиддисмутазы (за исключением N-ацетилцистеина и кверцетина) и уровня небелковых SH-соединений. Фагоцитарная активность альвеолярных макрофагов повы шается при применении N-ацетилцистеина, куркумина и эпигаллокатехин галлата, тогда как прединкубация альвеолярных макрофагов с резвератролом или кверцетином угнетает эту функцию [5, 7, 8, 9, 10, 18].

4. Использование антиоксидантов способствует нормализации метабо лических и функциональных изменений в альвеолярных макрофагах, вы званных кратковременным (1 ч) воздействием сигаретного дыма с мини мальной концентрацией смол, тогда как повышение концентрации смол и увеличение времени контакта клеток с экстрактом сигаретного дыма ограни чивает эффективность антиоксидантов (вплоть до полной потери антиради   кальной активности или изменения направленности действия). Эпигаллока техин галлат и N-ацетилцистеин по способности корригировать изменения в АМ, возникающие в результате контакта альвеолярных макрофагов с экс трактом сигаретного дыма, превосходят резвератрол, кверцетин и куркумин [5, 7–10, 18].

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем само стоятельно на базе кафедры биологической химии учреждения образова ния «Белорусский государственный медицинский университет». Тема диссертации, постановка цели и задач исследования, определение объема исследований, анализ полученных результатов, подготовка печатных ра бот к публикации проводились совместно с научным руководителем, док тором медицинских наук, профессором, заведующим кафедрой биологи ческой химии УО «Белорусский государственный медицинский универ ситет» А.Д. Тагановичем.

Автором проведен анализ научной литературы, освоены методики и получены приведенные в диссертации результаты (личное участие 100%).

Автором выполнен анализ и обобщение полученных результатов (личное участие 90%), проведена их компьютерная графическая и статистическая об работка (личное участие 100%), данные изложены в статьях [1–5, 7–9, 11, 17] и тезисах докладов [12–16, 18] (личное участие 85%). Соавтор публикаций оказывал помощь в организации и проведении исследований (Принько ва Т.Ю.). АМ из бронхоальвеолярной лаважной жидкости (356 крыс) полу чены соискателем лично (участие 100%). Автор самостоятельно осуществля ла культивирование клеток, получала экстракт сигаретного дыма и твердую фазу сигаретного дыма, выделяла цитоплазматическую и нуклеарную фрак ции альвеолярных макрофагов, определяла показатели метаболизма в АМ и их фагоцитарную активность (личное участие 100%). Техническую помощь при проведении блот-анализа оказывали сотрудники научной группы «Иммунология» лаборатории биохимических методов исследования ЦНИЛ УО «БГМУ». Автором обоснована целесообразность и установлена сравни тельная эффективность использования антиоксидантов для предотвращения повреждения клеток легких (личный вклад соискателя 95%). Сравнительные характеристики антиоксидантов изложены в статьях и материалах конфе ренций [5, 7–9, 18] – вклад соискателя 90%. Полученные результаты исполь зуются в клинике и научных подразделениях Республиканского научно практического центра фтизиатрии и пульмонологии МЗ РБ и внедрены в учебный процесс 1-ой кафедры внутренних болезней УО «БГМУ» и кафед ры биологической химии УО «БГМУ», что подтверждено актами внедрения.

Апробация результатов диссертации. Включенные в диссертацию ре зультаты исследований доложены и обсуждены на республиканской конфе   ренции «Достижения современной биологии, химии и медицины» (г. Минск, 2009 г.), Республиканской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Министерства здравоохранения РБ (г. Минск, 2009 г.), III Между народном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские науч ные чтения-2009» (Санкт-Петербург, РФ, 2009 г.), конференции «Патогенез социально значимых заболеваний человека» (г. Минск, 2010 г.), III Между народном медицинском конгрессе «MedEspra» (г. Кишинев, Республика Молдова, 2010 г.), VIII Международной конференция «Биоантиоксидант»

(г. Москва, РФ, 2010 г.), ежегодных научных сессиях БГМУ (г. Минск, 2009, 2010, 2011 гг.).

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубли ковано 18 научных работ: в том числе 10 статей в рецензируемых научных изданиях, (3 – в зарубежных журналах, 1 – в моноавторстве), 3 – в рецензи руемых сборниках научных трудов, 5 тезисов докладов в материалах конфе ренций (из них 3 – в зарубежных). Общий объем опубликованных материа лов по теме диссертации составил 6,5 авторских листа (из них лично соиска телем 3,9).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (3 главы), заключения, библиографического спи ска, включающего 247 источников литературы (19 – на русском, 228 – на английском языке) и списка публикаций соискателя – 18 работ, приложения.

Работа содержит 17 таблиц и 16 рисунков, изложена на 141 страницах пе чатного текста (основной текст – 96 страниц, таблицы и рисунки – 23, спи ски использованных источников и публикаций соискателя – 22 страниц).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Экспериментальное исследование проведено in vitro на изолированных АМ крыс и выполнено с соблюдением этических норм обращения с живот ными на белых нелинейных крысах-самцах, массой 180–230 г. Эксперимен тальная модель повреждения клеток легких сигаретным дымом позволила варьировать концентрацию и длительность воздействия сигаретного дыма на АМ, исключить влияние на клетки других факторов.

Экстракт сигаретного дыма (ЭСД) был получен методом пропускания дыма от десяти сигарет («Корона», Беларусь;

содержание смол в 1 сигарете – 14 мг, никотина – 1 мг, скорость пропускания 1 сигарета/мин) через 100 мл среды Игла, модифицированной Дульбекко (ДMEМ) с использованием ав   томатического вакуумного насоса. Стандарт ЭСД, соответствующий значе нию оптической плотности (ОD 1,0 ± 0,1) при длине волны 320 нм, рН 7, принимался за 100%. Концентрации ЭСД – 10;

20 и 30% получали путем разведения, стерилизовали с применением бактериального фильтра (диаметр пор 0,22 мкм). Для получения твердой фазы сигаретного дыма (ТФСД) дым от 20 сигарет с использованием вакуумного насоса пропускали через стекло волокнистый фильтр, осадок на фильтре промывали ацетоном (15 мл), испа ряли в струе азота. Осадок взвешивали, растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили в запаянных ампулах при температуре –20 °С.

АМ получали из бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ). Для этого в изолированные и обескровленные легкие через трахею вводили и за бирали физиологический раствор, рН 7,4, температура 37 С. БАЛЖ фильт ровали и центрифугировали 10 мин, 900 об/мин, при температуре +4 °С. Кле точный осадок ресуспендировали. Из популяций клеток АМ выделяли путем адгезии к пластику в концентрации 2,0106 на чашку Петри и инкубировали 120 мин при температуре 37 °С в увлажненной атмосфере с 5%-ным содер жанием СО2.

Для изучения влияния препаратов, обладающих антиоксидантной ак тивностью, использовали N-ацетилцистеин, кверцетин, куркумин, резверат рол и ЭГКГ в концентрации 10-5 моль/л. АМ инкубировали 120 мин с добав лением антиоксидантов (АО), после чего среду меняли на ДМЕМ, обога щенную ЭСД, или добавляли 20 мкл ТФСД с концентрацией смол 0,7;

1, и 2,1 г/л и продолжали инкубацию в течение 1–20 ч при температуре 37 °С в увлажненной атмосфере с 5%-ным содержанием СО2. В качестве контроля среды, ДMEМ, обогащенную сигаретным дымом (СД), инкубировали без клеток или вносили 20 мкл ДМСО. Клетки снимали скрепером, клеточную суспензию гомогенизировали.

Влияние ЭСД и ТФСД на жизнеспособность оценивали по окраске три пановым синим и по высвобождению из клеток цитозольного фермента лак татдегидрогеназы (ЛДГ) кинетическим методом. Активность фагоцитоза АМ изучали путем добавления бактериальной суспензии Staphylococcus aureus (500106/мл). Определяли фагоцитарный показатель (ФП) и фагоцитарное число (ФЧ). Генерацию активных форм кислорода и азота АМ оценивали путем спектрофотометрического определения концентрации пероксида во дорода (Gallati H., Pracht I., 1985) и нитрит-ионов (Green L.C., 1982) в среде инкубации и в клетках. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в АМ изучали по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарби туровой кислотой (ТБК) (Гончаренко М.С., 1985);

окислительную модифи кацию белков (ОМБ) – по уровню карбонильных производных (Levine R., 1990).  Оценивали активность каталазы (Королюк М.А., 1988), СОД (Кос   тюк В.А., 1990), ГПО (Моин В.М., 1986). Внутриклеточный уровень небел ковых SH-соединений в АМ определяли по методу Sedlak J. (1968). Опреде ляли содержание субьединицы р65 ядерного транскрипционного фактора B (NF-B) методом вестерн-блоттинга в цитоплазматической и ядерной фрак ции АМ с последующим денситометрическим анализом.

Статистический анализ проводили непараметрическими методами с ис пользованием программ «Microsoft Excel 2007» и «Stаtistica 6.0». Данные представлены в виде медиан и интерквартильных размахов. Различия между группами выявляли с помощью U-теста Манна–Уитни.

Результаты собственных исследований Влияние экстракта сигаретного дыма на жизнеспособность и фаго цитарную активность АМ В результате контакта с ЭСД альвеолярные макрофаги теряют жизне способность. Потеря жизнеспособности АМ нарастает по мере увеличения концентрации ЭСД и длительности его контакта с клетками (рисунок 1).

В А жизнеспособность 100 *^ % высвобождения ЛДГ 120 % высвобождения ЛДГ % жизнеспособных АМ *^ 80 * % высвобождения ЛДГ % жизнеспособных АМ * 100 * 5 0 0 0 Контроль 10 20 30 Контроль 10 20 ЭСД,% ЭСД,% Рисунок 1 – Результаты теста с трипановым синим и высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из альвеолярных макрофагов после 1 ч (А) и 20 ч (В) контакта клеток с экстрактом сигаретного дыма  Примечание – Контроль – АМ инкубировали без ЭСД;

* – достоверность разли чий р0,05 по сравнению с контролем;

^ – достоверность различий р0,05 по сравне нию с 10% ЭСД;

n = 6.

Подобные закономерности изменения жизнеспособности АМ, отмечен ные как результат контакта клеток с ЭСД, полностью воспроизводятся смо лами твердой фазы СД и пероксидом водорода в концентрации не менее 10-3 моль/л. Эти данные свидетельствуют о значимости АФК в механизме (ах) влияния сигаретного дыма на альвеолярные макрофаги.

Присутствие ЭСД в среде инкубации АМ приводит к снижению фаго цитарной активности этих клеток, которое заключается как в снижении ко   личества фагоцитирующих макрофагов, так и количества поглощенных ими микроорганизмов, о чем свидетельствует уменьшение ФП на 14,6;

28,1 и 33,4% и ФЧ на 17,5;

23,8 и 24%, соответственно концентрации ЭСД (10;

и 30%) при контакте клеток в течение 1ч с ЭСД. Наиболее выраженное сни жение фагоцитарной активности под влиянием ЭСД происходило после кон такта с ним АМ в течение 20 ч;

количество фагоцитирующих клеток умень шилось на 35,2;

41,1 и 43,5%, по сравнению с контролем, соответственно возрастающей концентрации ЭСД (р0,05).  Количество поглощённых St. аureus одним АМ уменьшилось в 2,4 раза, при этом степень снижения не зависела от концентрации ЭСД.

Пероксид водорода в концентрации 10-3 моль/л, контактируя с АМ, также приводит к снижению фагоцитарной активности. При этом длитель ность контакта клеток с Н2О2 не имеет столь существенного значения, за ис ключением обстоятельства, что при 20 ч их совместной инкубации явствен ным становится двухфазный характер изменения фагоцитарной активности от концентрации Н2О2;

в качестве первой фазы выступает увеличение фаго цитарной активности при минимальной из используемых (10-6 моль/л) кон центрации Н2О2.  При концентрации 10-3 моль/л Н2О2 поглотительная спо собность клеток заметно угнетается.

Показатели окислительного метаболизма в альвеолярных макро фагах, контактировавших с сигаретным дымом Контакт АМ с ЭСД приводит к увеличению в клетках количества пероксида водорода. Нарастание Н2О2 тем больше, чем более концентриро ванный ЭСД контактирует с АМ, хотя выраженные изменения этого показа теля происходят уже при минимальной концентрации ЭСД (10%). Длитель ность контакта не оказывает существенного влияния на рост Н2О2. Суммар ное содержание Н2О2 возросло на 50% в течение 20 ч инкубации АМ с 10% ЭСД. Контакт с ЭСД сопровождается значительным накоплением в АМ про дуктов свободно-радикального окисления: ТБК-активных продуктов и кар бонильных производных белков. Выраженность их накопления возрастает по мере увеличения концентрации ЭСД и длительности контакта с ним.

При инкубации в течение 20 ч АМ с 30% ЭСД уровень продуктов ПОЛ был максимальным. Содержание карбонильных производных белков повы шалось в 2 раза в АМ, контактировавших с 10%, и в 2,5 раза – с 30% ЭСД, Удлинение инкубации увеличивало этот показатель в 7 раз в сравнении с контролем. ЭСД вызывает угнетение активности СОД, каталазы, ГПО. Для кратковременного контакта с ЭСД характерно постепенное снижение актив ности всех трех изучаемых ферментов (таблица 1). Хотя активность СОД че рез 1 ч инкубации с 10% ЭСД не отличалась от контроля, повышение кон центрации ЭСД с 20% до 30 % вызывало снижение активности СОД.

  Таблица 1 – Показатели свободнорадикального метаболизма в альвеолярных макрофагах, контактировавших с сигаретным дымом Условия инкубации – 1 ч Условия инкубации – 20 ч Показатели Контроль 10% ЭСД 20% ЭСД 30% ЭСД Контроль 10% ЭСД 20% ЭСД 30% ЭСД Н2О2, нмоль/106 клеток, 6,821 7,801,2 9,641,2,3 7,201 7,421 8,601,2, 4,48 4, n=6 3,60–4,74 6,44–7,20 7,36–8,14 7,80–10,20 4,46–5,42 6,26–7,46 7,40–8,26 8,28–9, NO2–, нмоль/106 клеток, 3,201 2,901,2,3 3,661 5,421,2 5,831,2, 4,26 3,88 8, n=6 3,76–4,61 3,25–4,26 3,20–3,60 2,70–3,10 8,66–9,13 3,24–4,36 5,22–5,66 5,46–6, 1,201 1,801,2,3 1,801 2,201 2,751,2, ТБК-активные продукты, 0,95 1,15 1, нмоль /10 клеток, n = 6 0,80–1,10 0,90–1,20 1,10–1,30 1,50–1,90 1,10–1,20 1,60–2,20 1,80–2,30 2,60–2, Карбонильные произ 2,11 2,81,2 7,21 8, 1,1 1, водные белков, нмоль/мг – – 0,9–1,3 1,8–3,1 1,9–3,9 1,0–1,4 6,8–8,6 6,9–8, белка, n = Соединения, содержа 10,201 9,201,2 8,901,2 6,301 6,301 5, 12,20 10, щие SH-группу, 11,50–16,40 9,80–10,70 9,00–9,40 8,70–9,00 10,00–10,90 5,95–6,55 6,05–6,55 5,25–6, нмоль/мг белка, n = 7,651 7,201 3,401 3,301 3, СОД, мЕ/мг белка, 8,80 8,05 9, n = 10 8,30–9,30 6,90–8,80 6,50–8,20 6,20–7,40 8,80–9,70 3,00–4,55 2,30–3,80 2,40–3, 77,71 68,81 55,11,2 42,21 41,01 39, Каталаза, мЕ/мг белка, 108,0 109, n = 10 104,0–110,4 68,8–84,2 57,0–71,6 53,0–67,2 93,0–118,0 38,0–44,8 36,0–43,2 37,5–41, 52,21 50,11 45,01,2 35,21 31,81 27,11,2, ГПО, нмоль/мин/мг бел- 64, 65, ка, n = 10 59,2–66,1 51,7–56,3 43,2–55,3 41,0–48,6 60,0–68,2 33,3–36,2 27,8–34,6 22,8–29, 1 Примечание – Данные представлены как медиана: 25%–75%;

– р0,05 по сравнению с контролем;

– р0,05 по сравнению с 10% ЭСД, 3 – р0,05 по сравнению с 20% ЭСД.

  Контакт в течение 20 ч приводит к более выраженному снижению ак тивности ферментов уже при 10% ЭСД. Для СОД и каталазы последующее увеличение концентрации ЭСД, контактирующего с АМ, не сопровождается дальнейшим угнетением активности, а для ГПО это имеет место: степень снижения по сравнению с контролем составила 45,6% при 10% ЭСД и 58,1% при 30% ЭСД. Продолжительная инкубация клеток приводит к уменьшению концентрации небелковых соединений, содержащих SH-группу (12,2: 11,8– 16,4 нмоль/мг белка после инкубации интактных АМ в течение 1 ч и 10,6:

10,0–10,9 нмоль/мг белка после – 20 ч). Контакт с ЭСД усиливает эту тен денцию: на 16,3;

24,5 и 28,8% снижается содержание SH-соединений в АМ при инкубации в течение 1 ч с ЭСД, соответственно росту концентрации ЭСД. Длительный контакт клеток (20 ч) с ЭСД вызывал снижение на 40,5%, по сравнению с контролем, независимо от концентрации ЭСД.  Влияние экстракта сигаретного дыма на концентрацию нитрит ионов и содержание NF-B фактора в АМ ЭСД по мере увеличения концентрации и длительности инкубации индуцирует прогрессирующее нарастание количества нитрит-ионов в среде для культивирования АМ. При 10% ЭСД концентрация NO2- составила (медиана: 25%–75%) – 15,6: 13,8–17,1 мкмоль/л, при 30% ЭСД – 36,2: 33,6– 44,0 мкмоль/л. Через 20 ч инкубации содержание NO2- в 30% ЭСД повыша лось до 43,2: 38,8–45,2 мкмоль/л. Альвеолярные макрофаги при инкубации в такой среде уменьшают в ней уровень NO2. Длительная инкубации альвео лярных макрофагов с ЭСД уменьшает концентрацию NO2- в среде, по срав нению с уровнем NO2– в среде, обогащенной ЭСД, и не содержавшей клеток, на 63,4%, независимо от концентрации. При инкубации с ЭСД в течение 1 ч имеет место снижение концентрации нитрит-ионов в АМ. Через 20 ч кон центрация NO2- в альвеолярных макрофагах нарастает по мере увеличения концентрации ЭСД, но не достигает контрольного уровня.

Через 18 ч совместной инкубации ЭСД (10%) с АМ в ядрах клеток уве личивается количество дискретной субъединицы р65 ядерного фактора NF-B на 69,7% по сравнению с контрольным уровнем (18,40: 12,14–19,55 Ед/мкг), составив 31,23: 20,60–33,17 Ед/мкг (р0,05). Это свидетельствует об актива ции ядерного фактора регуляции транскрипции. При этом концентрация об щего белка под воздействием ЭСД снижалась в нуклеарной фракции до 600,4: 540,5–680,5 мкг/мл (контроль 1000,8: 860,8–1030,9 мкг/мл). В цито зольной фракции снижение концентрации белка также было существенным, до 780,9: 570,9–820,2 мкг/мл против контроля 900,8: 870,7–930,2 мкг/мл, в то время как белок р65 в цитозольной фракции макрофагов, подвергнутых кон такту с ЭСД, не выявлялся.

  Коррекция функциональных изменений и показателей оксидантно антиоксидантной системы в АМ, контактировавших с сигаретным дымом Влияние N-ацетил-L-цистеина на последствия контакта АМ с экстрактом сигаретного дыма. N-ацетилцистеин, контактируя с АМ, увеличивает их фагоцитарную активность (ФП увеличился на 10% и отме чалась тенденция к повышению ФЧ). Концентрация соединений, содер жащих SH-группу, выросла на 14,8 и 27,3% соответственно 1 и 20 ч инку бации. На 19,6% увеличилась активность каталазы, ГПО на – 15,7%.

Снижалась концентрация Н2О2 и нитрит-ионов в АМ. Эти изменения про являются в первый час после контакта с N-ацетилцистеином. В дальней шем они или не имеют развития, или исчезают.

N-АЦ препятствовал снижению фагоцитарной активности АМ, уровня небелковых SH-соединений, росту количества Н2О2 и снижению активности антиоксидантных ферментов, концентрации нитрит-ионов в АМ в условиях воздействия ЭСД в течение 1 ч. Активность ГПО и количество небелковых SH-соединений в клетках, обработанных N-АЦ и контактировавших с 10% ЭСД, не отличались от контроля. Концентрация NO2- в интактных АМ сни жалась на 17,2% после прединкубации их с N-АЦ (р0,05), тогда как в АМ, подвергнутых инкубации с ЭСД, если ей предшествовала  обработка N-АЦ, отмечался дозозависимый прирост NO2-. Количество Н2О2 уменьшалось на 20% и на 23,9%, соответственно 10 и 30% ЭСД, по сравнению с АМ, необра ботанными N-АЦ. Продолжительный контакт клеток с ЭСД минимизирует протекторное действие N-АЦ.

Влияние куркумина на последствия контакта АМ с ЭСД. Курку мин повышал фагоцитарную активность интактных альвеолярных макро фагов. ФП и ФЧ спустя 1 ч инкубации увеличились в 1,5 раза. Такая же закономерность сохранялась через 20 ч инкубации. Куркумин оказывал антиоксидантное действие: увеличивалась активность ГПО и каталазы, снижался уровень нитрит-ионов, Н2О2 и ТБК-активных продуктов. Кон центрация небелковых SH-соединений в АМ под влиянием куркумина сначала (1 ч инкубации) снижалась, а затем (20 ч инкубации) увеличива лась. В условиях кратковременного воздействия сигаретного дыма обра ботка АМ куркумином препятствовала снижению фагоцитарной активно сти и росту количества Н2О2, ТБК-активных продуктов ПОЛ. Через 1 ч инкубации АМ с ЭСД в клетках снижалось количество NO2– на 38,8% и 50,0% (соответственно 10 и 30% ЭСД). При длительном контакте АМ с сигаретным дымом куркумин изменял направленность своего действия и оказывал выраженный прооксидантный эффект: стимулировал накопле ние в клетках Н2О2, продуктов ПОЛ и не оказывал влияния на сниженную   активность каталазы в макрофагах, контактировавших с ЭСД. Через 20 ч инкубации с ЭСД активность ГПО была ниже в клетках, обработанных куркумином и контактировавших с ЭСД, по сравнению с клетками, кон тактировавшими с ЭСД, но не обработанными куркумином.

Влияние резвератрола, эпигаллокатехин галлата на показатели оксидантно-антиоксидантного состояния, фагоцитарной активно сти альвеолярных макрофагов, контактировавших с экстрактом си гаретного дыма. Резвератрол (в отличие от ЭГКГ) угнетает фагоцитарную активность интактных АМ. Оба антиоксиданта, независимо от длительности последующей инкубации, не оказывали влияния на уровень карбонильных производных белков и ТБК-активных продуктов ПОЛ в интактных АМ, но снижали уровень катаболитов оксида азота, Н2О2 и стимулировали актив ность антиоксидантных ферментов. Содержание соединений с SH-группой в АМ, обработанных ЭГКГ или резвератролом, через 1 ч инкубации не отли чалось от уровня этого показателя в АМ, не обработанных антиоксидантом.

Длительная инкубация сопровождалась статистически значимым повышени ем концентрации SH-содержащих соединений, составив после обработки рез вератролом 12,6: 11,8–12,9 нмоль/мг белка, ЭГКГ – 13,6: 13,2–13,8 нмоль/мг белка;

контроль – 11,1: 10,7–11,5 нмоль/мг белка.

При контакте в течение 1 ч с 10% ЭСД в клетках, обработанных ЭГКГ, фагоцитарный показатель и фагоцитарное число не отличались от контроль ных значений (когда клетки инкубировались без ЭСД или антиоксидантов).  Для АМ, которые до контакта с ЭСД прединкубировались с резвератролом, медианы ФП и ФЧ не отличались от такового в клетках, подвергнутых инку бации с ЭСД, но без предварительной инкубации с резвератролом.  Имела место более низкая концентрация окисленных производных белков в АМ, подвергнутых обработке антиоксидантами и контактировавшими с ЭСД (10% и 30%). В случае ЭГКГ уровень таких белков не отличался от кон трольного. В интактных АМ, обработанных резвератролом или ЭГКГ, кон центрация Н2О2 была ниже, чем в контроле, при этом контакт с 10% ЭСД в течение 1 ч клеток, предварительно обработанных ЭГКГ, не вызывал досто верного повышения Н2О2. Резвератрол и ЭГКГ препятствовали снижению активности каталазы и ГПО в клетках, инкубированных в течение 1 ч с 30% ЭСД, хотя контрольный уровень активности не был достигнут.  При более длительной инкубации особенность заключалась в том, что концентрация Н2О2, карбонильных производных белков и продуктов ПОЛ была или такой же, как в клетках, необработанных антиоксидантами (ЭГКГ, 10% ЭСД), или даже выше (резвератрол, 30% ЭСД). В клетках, обработанных ЭГКГ, актив ность ГПО и каталазы оставалась сниженной под влиянием ЭСД, а в клет ках, обработанных резвератролом и контактировавших с ЭСД, активность   каталазы и ГПО была еще более низкой, чем в клетках без резвератрола, но контактировавших с ЭСД.   Влияние кверцетина на фагоцитарную активность и показатели оксидантно-антиоксидантного состояния АМ, контактировавших с ЭСД. Кверцетин снижал фагоцитарную активность интактных АМ, и не пре дотвращал снижения ФП и ФЧ при контакте клеток с ЭСД (10% и 30%).

Кверцетин снижал количество Н2О2 и NO2- и повышал активность ГПО в ин тактных АМ как при кратковременной, так и при длительной инкубации.

Подобно куркумину кверцетин сначала уменьшал в АМ концентрацию не белковых SH-содержащих соединений, в дальнейшем она увеличивалась и превышала контрольный уровень. В клетках, обработанных кверцетином, количество Н2О2 снижалось после 1 ч контакта АМ с 10 и 30% ЭСД, остава ясь в 1,5 раза выше контроля, но ниже чем в клетках без кверцетина и кон тактировавших с ЭСД. Уровень ТБК-активных продуктов в клетках, обрабо танных кверцетином, был ниже, чем в пробах без кверцетина в случае 1 ч инкубации АМ с 30% ЭСД (р0,05). Отмечен более низкий уровень карбо нильных производных белков под влиянием кверцетина в этих же условиях эксперимента (2,80: 1,90–3,90 «без кверцетина»;

1,60: 1,45–1,80 нмоль/мг белка «с кверцетином»), с использованием 10% ЭСД (2,10: 1,80–3,15 нмоль/мг белка «без кверцетина»;

1,35: 1,15–1,60 нмоль/мг белка «с кверцетином»).

При более продолжительной инкубации АМ с ЭСД положительный эффект кверцетина, направленный на предотвращение роста ТБК-активных продук тов ПОЛ и продуктов окисления белков, вообще отсутствовал. А в пробах, в которые предварительно вносили кверцетин при контакте клеток с 30% ЭСД, уровень карбонильных производных белков даже вырос (8,45: 6,90– 8,80 нмоль/мг белка «без кверцетина»;

9,20: 8,90–9,60 нмоль/мг белка «с кверцетином»). Этот эффект сопровождался накоплением Н2О2 и падением активности антиоксидантных ферментов. На низкий уровень нитрит-ионов, сниженный под влиянием ЭСД в АМ, кверцетин не оказывал влияния.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные научные результаты диссертации 1. В результате контакта с экстрактом сигаретного дыма альвеолярные макрофаги крысы теряют жизнеспособность. Потеря жизнеспособности на растает по мере увеличения концентрации экстракта сигаретного дыма в среде инкубации клеток и длительности контакта с ним. Эти изменения вос производятся смолами сигаретного дыма, которые сосредоточены в твердой его фазе, и пероксидом водорода в концентрации не менее 10-3 моль/л [1, 3, 4, 13, 14].

  2. Присутствие экстракта сигаретного дыма в среде инкубации альвео лярных макрофагов приводит к снижению фагоцитарной активности этих клеток, которое заключается в уменьшении количества фагоцитирующих макрофагов и количества поглощенных ими микроорганизмов. С увеличени ем продолжительности контакта с экстрактом сигаретного дыма снижение становится более выраженным. Пероксид водорода в концентрации 10-3 моль/л, контактируя с альвеолярными макрофагами, также приводит к значительному снижению фагоцитарной активности [1, 3, 4, 13, 14].

3. Контакт альвеолярных макрофагов с экстрактом сигаретного дыма, по мере увеличения его концентрации и длительности контакта с ним, при водит к увеличению в клетках уровня пероксида водорода, продуктов сво боднорадикального окисления липидов и белков, активации ядерного факто ра NF-B. При кратковременном (1 ч) контакте с экстрактом сигаретного дыма, по мере увеличения его концентрации, в альвеолярных макрофагах прогрессирующе снижается уровень нитрит-ионов. При более продолжи тельном контакте (20 ч) с экстрактом сигаретного дыма уровень нитрит ионов в альвеолярных макрофагах растет, но не восстанавливается полно стью [2, 3, 11, 12, 15–17].

4. Экстракт сигаретного дыма вызывает угнетение ферментативного звена антиоксидантной системы в альвеолярных макрофагах: снижается ак тивность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы. Падает уровень соединений, содержащих SH-группу. Эти изменения углубляются при более продолжительном контакте клеток с экстрактом сигаретного дыма и более высокой его концентрации. Продолжительная инкубация (20 ч) кле ток, сама по себе, приводит к уменьшению концентрации в них соединений, содержащих SH-группу. Контакт с экстрактом сигаретного дыма еще больше усиливает его выраженность [2, 3, 11, 12, 15–17].

5. Влияние N-ацетилцистеина, куркумина, резвератрола, эпигаллокате хин галлата и кверцетина на интактные альвеолярные макрофаги крысы про является в их антиоксидантном действии: снижении концентрации перокси да водорода, нитрит-ионов, карбонильных производных белков (только для N-ацетилцистеина), повышении активности глутатионпероксидазы, каталазы (за исключением кверцетина), супероксиддисмутазы (за исключением N-ацетилцистеина и кверцетина), уровня небелковых SH-соединений. Одно временно увеличивается фагоцитарная активность альвеолярных макрофагов (для N-ацетилцистеина, куркумина и эпигаллокатехин галлата). Прединку бация клеток с резвератролом и кверцетином, наоборот, угнетает эту функ цию альвеолярных макрофагов [5, 7–10, 18].

6. Эпигаллокатехин галлат предотвращает угнетение фагоцитарной ак тивности, вызванного кратковременным (до 1 ч) контактом клеток с 10%   экстрактом сигаретного дыма. Другие соединения (см. п. 5), использовав шиеся для предварительной инкубации с альвеолярными макрофагами, не предотвращают полностью снижение фагоцитарной активности, хотя курку мин и N-ацетилцистеин существенно повышают эффективность проявления этой функции такими альвеолярными макрофагами [5, 7–10, 18].

7. N-ацетилцистеин, куркумин, эпигаллокатехин галлат и кверцетин предотвращают нарастание в альвеолярных макрофагах пероксида водорода, вызванное 10% экстрактом сигаретного дыма, а куркумин – и 30% экстрак том. Эти же соединения и резвератрол эффективны в предотвращении нако пления в клетках легких продуктов перекисного окисления липидов, а кур кумин, резвератрол и кверцетин – и продуктов окисления белков. Этот эф фект исчезает спустя 20 ч воздействия 30% экстракта сигаретного дыма на альвеолярные макрофаги. Все вышеуказанные антиоксиданты неэффектив ны в предотвращении снижения уровня нитрит-ионов в альвеолярных мак рофагах, вызванного экстрактом сигаретного дыма [5, 7–10, 18].

8. N-ацетилцистеин, куркумин, резвератрол и эпигаллокатехин галлат эффективно предотвращают вызванное 10% экстрактом сигаретного дыма снижение в альвеолярных макрофагах уровня восстановленного глутатиона, активности супероксиддисмутазы и каталазы. При контакте клеток с 30% ЭСД такое влияние куркумина, резвератрола и эпигаллокатехин галлата неэффективно. Кверцетин не способен предотвращать вышеназванные изме нения.

Компоненты антиоксидантной системы альвеолярных макрофагов, пре терпевшие количественные изменения в результате длительного (20 ч) кон такта клеток с экстрактом сигаретного дыма, минимально подвержены кор ригирующему влиянию применявшимися антиоксидантами. В результате уровень небелковых SH-содержащих соединений, активность супероксид дисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы оставались ниже контрольных значений, как в клетках, контактировавших с экстрактом сигаретного дыма, но не с антиоксидантами. Куркумин, резвератрол и кверцетин приводят к еще большему снижению активности глутатионпероксидазы, а в случае резвератрола и кверцетина – активности каталазы, чем в альвеолярных мак рофагах, контактировавших с экстрактом сигаретного дыма без предвари тельной обработки антиоксидантами [5, 7–10, 18].

Рекомендации по практическому использованию результатов Результаты исследования раскрывают динамику нарушения метаболи ческих процессов в клетке, связанную с концентрацией сигаретного дыма и длительностью его воздействия. Накопление большого количества ради кальных соединений в альвеолярных макрофагах при контакте клеток с си   гаретным дымом обусловлено усиленной генерацией активных форм кисло рода и снижением их катаболизма. Это является основой окислительной деструкции клеточных белков и липидов. Уменьшение концентрации нит рит-ионов и фагоцитарной активности, активация транскрипционного фак тора каппа В способствуют снижению неспецифической иммунной защиты и развитию воспалительной реакции в легких.

Полученные данные позволили обоснованно исследовать соединения, обладающие антиоксидантным действием, для целей коррекции, поскольку доказана взаимосвязь накопления в альвеолярных макрофагах активных форм кислорода со снижением их фагоцитарной активности. Проведена сравнительная оценка эффективности кверцетина, куркумина, резвератрола, эпигаллокатехин галлата и N-ацетилцистеина в предотвращении изменений метаболизма, жизнеспособности и фагоцитарной активности, которые воз никают при контакте клеток с сигаретным дымом.

Продемонстрирована неспособность полифенольных антиоксидантов и N-ацетилцистеина в однократной добавке корригировать возникающие из менения при длительном контакте альвеолярных макрофагов с сигаретным дымом. При непродолжительном контакте клеток с сигаретным дымом дока зана приоритетная значимость использования эпигаллокатехин галлата и N-ацетилцистеина. Результаты работы обосновывают необходимость постоянного восполнения фонда антиоксидантов в клетках легких, которое следует проводить с учетом интенсивности воздействия на них сигаретного дыма.

Полученные сведения рекомендуется учитывать в разработке и исполь зовании антиоксидантной терапии легочных заболеваний у курящих людей.

  СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ Статьи в научных журналах 1. Девина, Е.А. Изменение жизнеспособности и фагоцитарной активно сти макрофагов легких после экспозиции с экстрактом сигаретного дыма / Е.А. Девина, А.Д. Таганович // Лаб. дiагн. (Киев). – 2009. – № 4 (50). – С. 7–12.

2. Девина, Е.А. Влияние сигаретного дыма на компоненты оксидантно антиоксидантной системы в альвеолярных макрофагах / Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, А.Д. Таганович // Лаб. дiагн. (Киев). – 2010. – № 1 (51). – С. 10–14.

3. Девина, Е.А. Влияние экстракта сигаретного дыма на состояние альвеолярных макрофагов крыс / Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, А.Д. Тага нович // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Сер. мед. навук. – 2010. – № 2. – С. 11–15.

4. Девина, Е.А. Особенности изменения функциональной активности альвеолярных макрофагов при контакте с сигаретным дымом / Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, А.Д. Таганович // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Сер. мед.

навук. – 2010. – № 3. – С. 75–80.

5. Девина, Е.А. Влияние N-ацетилцистеина на функциональную актив ность альвеолярных макрофагов, контактировавших с экстрактом сигаретно го дыма, и показатели метаболизма активных форм кислорода и азота / Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, А.Д. Таганович // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Сер. мед. навук. – 2010. – № 4. – С. 72–79.

6. Таганович, А.Д. Перспективы использования антиоксидантов для лечения хронической обструктивной болезни легких / А.Д. Таганович, Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, Н.Д. Таганович / Леч. дело. – 2010. – № 5 (15).

– С. 50–56.

7. Таганович, А.Д. Эффективность куркумина в предотвращении функ циональных и метаболических изменений альвеолярных макрофагов после контакта с сигаретным дымом / А.Д. Таганович, Е.А. Девина, Т.Ю. Принько ва, Л.А.Фефилова // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Сер. мед. навук. – 2011. – № 1. – С. 23–28.

8. Девина, Е.А. Сравнительная оценка антиоксидантного действия рез вератрола и эпигаллокатехин галлата при окислительном стрессе, индуциро ванном сигаретным дымом в альвеолярных макрофагах / Е.А. Девина, А.Д. Таганович // Лаб. дiагн. (Киев). – 2011. – № 1 (55). – С. 12–17.

9. Девина, Е.А. Дозозависимый эффект куркумина на состояние мета болизма альвеолярных макрофагов в условиях воздействия сигаретного ды ма / Е.А. Девина // Рецензир. науч.-практ. ежегодник // ГУ Республиканская   нац. мед. библиотека. – Минск, 2011. – Вып. XV: Достижения медицинской науки Беларуси. – С. 107–108.

10. Кандилинская, О.Л. Лектины лекарственных растений дикорасту щей флоры Баларуси: перспективы использования / О.Л. Кандилинская, Е.Р. Грищенко, Л.В. Обуховская, И.П. Мастибротская, О.М. Масловский, А.Д. Таганович, Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, Т.В. Шман, Н.А. Шуканова, В.В. Голубков // Вестник фонда фунд. исслед. – 2011. – № 2 (56). – С. 169–184.

Статьи в сборниках научных трудов 11. Принькова, Т.Ю. Состояние оксидантно/антиоксидантного равнове сия в альвеолярных макрофагах, подвергнутых воздействию сигаретного дыма / Т. Ю. Принькова, Е. А. Девина, А. Д. Таганович // Труды молодых ученых 2009: cб. науч. работ / Белорусский гос. мед. ун-т;

под общ. ред.

проф. С.Л. Кабака. – Минск, 2009. – С. 129–132.

Статьи и тезисы докладов в материалах конференций 12. Kadushkin, A.H. Features of changes in oxidant/antioxidant of alveolar macrophages exposed to cigarette smoke / A.H. Kadushkin, Е.А. Devina //

Abstract

book 3rd International Medical Congress for young doctors «MedEspera», Chisinau, Republic of Moldova, May 19–21, 2010. – С. 10–11.

13. Девина, Е.А. Влияние экстракта табачного дыма на функциональ ную активность изолированных альвеолярных макрофагов / Е.А Девина, Т.Ю. Принькова, А.Д. Таганович / Достижения современной биологии, хи мии и медицины: материалы республиканской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения В.А. Бандарина, БГМУ, 29 мая 2009 г., Минск. – С. 23–24.

14. Девина, Е.А. Функциональная активность и продукция оксида азота альвеолярными макрофагами в условиях воздействия сигаретного дыма / Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, А.Д. Таганович // Материалы Республикан ской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Министер ства здравоохранения РБ, БГМУ, 19 июня 2009 г., Минск. – С. 335–337.

15. Принькова, Т.Ю. Влияние экстракта сигаретного дыма на актив ность ферментов антиоксидантной системы альвеолярных макрофагов / Т.Ю. Принькова, Е.А. Девина, А.Д. Таганович // Материалы Республикан ской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Министер ства здравоохранения РБ, 19 июня 2009 г. Минск. – С. 499–500.

16. Кадушкин, А.Г. Изменение активности антиоксидантных фермен тов в альвеолярных макрофагах под влиянием экстракта сигаретного дыма / А.Г. Кадушкин, Е.А. Девина // Тезисы докладов III Международного моло   дежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения – 2009», Санкт-Петербург, 2–4 декабря 2009 г. – С. 22–23.

17. Девина, Е. А. Влияние экстракта сигаретного дыма на транскрипци онный фактор NF-kB в альвеолярных макрофагах крыс / Е.А. Девина, Т.Ю. Принькова, О.В. Петракова, Е.В. Соколовская, А.Д. Таганович // Пато генез социально значимых заболеваний человека: материалы конференции, БГМУ, 2010 г. / Белорусский гос. мед. ун-т / под общ. ред. проф. С.Л. Каба ка. – Минск: БГМУ, 2010. – С. 3–6.

18. Девина, Е. А. Эффект куркумина и N-ацетил-L-цистеина на состоя ние метаболизма альвеолярных макрофагов в условиях воздействия сигарет ного дыма / Е. А. Девина, А. Д. Таганович // Биоантиоксидант: тезисы док ладов VIII Международной конференции, Москва, 4–6 октября 2010 г. – М.: РУДН, 2010. – С. 136–137.

  РЭЗЮМЭ Дзевіна Алена Анатольеўна Функцыянальна-метабалічная перабудова альвеалярных макрафагаў пад уздзеяннем цыгарэтнага дыму і яе карэкцыя Ключавыя словы: альвеалярныя макрафагі (АМ), экстракт цыгарэтнага дыму (ЭЦД), антыаксіданты, хранічная абструктыўная хвароба лёгкіх.

Аб’ект даследавання: ізаляваныя альвеалярныя макрафагі пацукоў, культаваныя ў пажыўным асяроддзі, узбагачаным цыгарэтным дымам.

Прадмет даследавання: паказчыкі фагацытарнай актыўнасці;

жыццяздольнасць;

паказчыкі, якія характарызуюць узровень актыўных форм кіслароду (АФК) і азоту, акіслення ліпідаў і бялкоў – канцэнтрацыя пераксіду вадароду, нітрыт-іонаў, ТБК-актыўных прадуктаў, карбанільных вытворных бялкоў;

антыаксідантная абарона – актыўнасць супераксіддыс мутазы, каталазы, глутатіонпераксідазы, узровень небялковых SН-злучэнняў;

паказчык працэсаў траскрыпцыі генаў празапаленчых медыятараў – канцэнтрацыя ядзернага фактару (NF-kВ).

Мэта даследавання: вызначыць асаблівасці акісляльнага метабалізмy, функцыянальнай актыўнасці і жыццяздольнасці АМ пры кантакце з цыгарэтным дымам і параўнальную эфектыўнасць антыаксідантаў па прадухіленні выяўленых змяненняў.

Метады: біяхімічныя, мікраскапія, імунаэлектрафарэз.

Атрыманыя вынікі і іх навізна: на эксперыментальнай мадэлі вывучана ўздзеянне ЭЦД на функцыянальную актыўнасць і паказчыкі метабалізму АМ. Даказана ўзаемасувязь накаплення ў альвеалярных макрафагах АФК са зніжэннем іх фагацытарнай актыўнасці. Праведзена параўнальная ацэнка эфектыўнасці кверцетыну, куркуміну, рэзвератролу, эпігалакатэхін галлату (ЭГКГ) і N-ацэтылцыстэіну (N-АЦ) у прадухіленні змяненняў, якія ўзнікаюць пры кантакце клетак з ЭЦД. Прадэманстравана няздольнасць поліфенольных антыаксідантаў і N-ацэтылцыстэіну ў аднаразовым дабаўленні карыгіраваць змяненні, якія ўзнікаюць пры працяглым (20 ч) кантакце АМ з цыгарэтным дымам. Пры непрацяглым (1 ч) кантакце клетак з ЦД даказана прыярытэтная значнасць выкарыстання ЭГКГ і N-ацэтылцыстэіну. Вынікі работы абгрунтоўваюць неабходнасць пастаяннага папаўнення фонду антыаксідантаў у клетках лёгкіх, якое трэба праводзіць з улікам інтэнсіўнасці ўдзеяння на іх цыгарэтнага дыму.

Рэкамедацыі па выкарастанні: атрыманыя звесткі рэкамендуецца ўлічваць у тэрапіі і прафілактыцы лёгачных захворванняў у людзей, якія кураць.

Вобласць ужывання: біяхімія, пульманалогія, валеалогія.

  РЕЗЮМЕ Девина Елена Анатольевна Функционально-метаболическая перестройка альвеолярных макрофагов под влиянием сигаретного дыма и ее коррекция Ключевые слова: альвеолярные макрофаги (АМ), экстракт сигаретного дыма (ЭСД), антиоксиданты, хроническая обструктивная болезнь легких.

Объект исследования: изолированные альвеолярные макрофаги крыс, культивируемые в питательной среде, обогащенной сигаретным дымом.

Предмет исследования: показатели фагоцитарной активности;

жизне способность;

показатели, характеризующие уровень активных форм кисло рода (АФК) и азота, окисления липидов и белков – концентрация пероксида водорода, нитрит-ионов, ТБК-активных продуктов окисления липидов, кар бонильных производных белков;

антиоксидантная защита – активность су пероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, уровень небелковых SH-соединений;

показатель процессов транскрипции генов провоспалитель ных медиаторов – концентрация ядерного фактора (NF-kB).

Цель исследования: определить особенности окислительного метабо лизма, функциональной активности и жизнеспособности АМ при контакте с сигаретным дымом и сравнительную эффективность антиоксидантов по предотвращению выявленных изменений.

Методы: биохимические, микроскопия, иммуноэлектрофорез.

Полученные результаты и их новизна: на экспериментальной модели изучено действие ЭСД на функциональную активность и показатели метабо лизма АМ. Доказана взаимосвязь накопления в альвеолярных макрофагах АФК со снижением их фагоцитарной активности. Проведена сравнительная оценка эффективности кверцетина, куркумина, резвератрола, эпигаллокате хин галлата (ЭГКГ) и N-ацетилцистеина (N-АЦ) в предотвращении измене ний, которые возникают при контакте клеток с ЭСД. Продемонстрирована неспособность полифенольных антиоксидантов и N-ацетилцистеина в одно кратной добавке корригировать возникающие изменения при длительном (20 ч) контакте АМ с сигаретным дымом. При непродолжительном (1 ч) кон такте клеток с СД доказана приоритетная значимость использования ЭГКГ и N-ацетилцистеина. Результаты работы обосновывают необходимость посто янного восполнения фонда антиоксидантов в клетках легких, которое следу ет проводить с учетом интенсивности воздействия на них сигаретного дыма.

Рекомендации по использованию: полученные сведения рекоменду ется учитывать в терапии и профилактике легочных заболеваний у курящих людей.

Область применения: биохимия, пульмонология, валеология.

  SUMMARY Devina Elena Anatolievna Functional and metabolic changes of alveolar macrophages under the influence of cigarette smoke and their correction Keywords: alveolar macrophages (AM), cigarette smoke extract (CSE), oxidant/antioxidant balance,  correction, chronic obstructive pulmonary disease (COPD).

Object of research: isolated rat alveolar macrophages cultured in medium enriched with cigarette smoke extract.

Subject of research: indicators of phagocytic activity;

viability;

the level of reactive oxygen and nitrogen species, products of lipid peroxidation and protein carbonyl derivatives;

antioxidant protection – superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, the level of nonprotein SH-compounds;

concentration and localization of nuclear factor (NF-kB) – regulator of transcription of proinflammatory mediators.

Aim of research: to determine the dynamics of oxidative metabolism changes, functional activity and viability of alveolar macrophages subjected to contact with and to evaluate the relative effectiveness of different antioxidants to prevent the revealed changes.

Methods: biochemical, light microscopic, immunoelectrophoresis.

Obtained result and their novelty: the action of cigarette smoke extract on the functional activity and metabolism of rat AM has been studied. The relationship of ROS accumulation in the AM with a reduction of their phagocytic activity has been proved. The effects of quercetin, curcumin, resveratrol, epigallocatechin gallate (EGCG) and N-acetylcysteine (N-AC) on determined metabolic and functional parameters in АМ were carried out. An ability of these antioxidants to prevent the revealed changes was estimated. A comparative evaluation of those antioxidants occurs upon contact of cells with CSE.

Polyphenol antioxidants and N-AC one-phase added to alveolar macrophages demonstrated the inability to prevent changes in AM occurring during prolonged contact (20 h) with cigarette smoke. Brief contact of the cells with cigarette smoke (1 h) demonstrated benefits of EGCG and N-AC application. The data obtained show the necessity of a permanent fund replenishment of antioxidants in lung cells, which should be undertaken with regard to intensity of exposure to cigarette smoke.

Recommendations on usage: obtained information should be take into consideration during treatment of patients with COPD and in smokers to minimize lung changes induced by cigarette smoke.

  Field of application: pulmonology, biochemistry, valeology.

Подписано в печать 28.09.11. Формат 6084/16. Бумага писчая «Кюм Люкс».

Печать офсетная. Гарнитура «Times».

Усл. печ. л. 1,39. Уч.-изд. л. 1,34. Тираж 60 экз. Заказ 634.

Издатель и полиграфическое исполнение:

учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет».

ЛИ № 02330/0494330 от 16.03.2009.

ЛП № 02330/0150484 от 25.02.2009.

  Ул. Ленинградская, 6, 220006, Минск.