Иммунобиологическая характеристика бесклеточной коклюшной вакцины
На правах рукописи
УСТЮГОВ Яков Юрьевич
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕСКЛЕТОЧНОЙ
КОКЛЮШНОЙ ВАКЦИНЫ
03.00.07 Микробиология
14.00.36 Аллергология и иммунология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук
Пермь - 2008
2
Работа выполнена в лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь и в лаборатории комбинированных вакцин филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Пермское НПО «Биомед»
Научные руководители:
доктор биологических наук Николаева Алла Максимовна кандидат медицинских наук, доцент Шилов Юрий Иванович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Маслов Юрий Николаевич доктор биологических наук, профессор Ребров Анатолий Яковлевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская педиатрическая медицинская академия».
Защита состоится " 7 " ноября 2008 г., в часов на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.
Факс (342) 244 67 11.
Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http:/www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан " 4 " октября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Заболеваемость коклюшем остается серьезной проблемой не только российского, но и зарубежного здравоохранения. Ежегод но в мире заболевает коклюшем около 60 млн. человек, а умирает от него около 1 млн. (Селезнева и др., 2002).
Многолетняя практика применения АКДС-вакцины, содержащей цельно клеточный коклюшный компонент, доказала его профилактическую эффектив ность. При достаточно высоком охвате вакцинацией, АКДС обеспечивает за щиту более 85% привитых (Чупринина и др., 2005). Однако цельноклеточная коклюшная вакцина при всех ее положительных свойствах является одним из наиболее реактогенных препаратов, включенных в национальные календари прививок разных стран (Mattoo, Cherry, 2005). Накоплены данные о разнооб разных проявлениях реактогенности АКДС-вакцины, обусловленных цельно клеточным коклюшным компонентом (Медуницын, 2004, Сухинин, 2005). По требность в менее реактогенном препарате послужила основанием для разра ботки вакцин нового поколения на основе протективных антигенов Bordetella pertussis. Первая бесклеточная коклюшная вакцина была зарегистрирована в Японии в 1981 г. В последующем в Европе и США было создано более 20 по добных препаратов, отличающихся по составу антигенов, методам очистки, ме тоду инактивации токсина, адъювантам (Капио и др., 2005). Некоторые из них в виде монопрепарата или компонента комбинированных вакцин стали коммер ческими, зарегистрированы и применяются на практике во многих странах, включая Россию. Отечественные бесклеточные коклюшные компонеты вакци ны АКДС (Захарова и др., 1998;
Москаленко и др., 2001) пока не вышли из ста дии научно-исследовательской разработки.
Известные бесклеточные коклюшные вакцины содержат в своем составе от 1 до 5 и более протективных антигенов. Тем не менее, вопрос об оптималь ном составе бесклеточных коклюшных вакцин не решен, поскольку представ ляется неясным, какие именно составляющие являются ведущими в формиро вании противококлюшного иммунитета. В связи с этим представляется необхо димой максимально полная доклиническая оценка потенциальных кандидатов в вакцины календаря прививок в сравнении с цельноклеточным аналогом, эпиде миологическая эффективность которого подтверждена сорокалетней практикой.
В Пермском филиале ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» на основе базовых исследований Л.И. Райхера с сотрудниками (1970-1989 гг) разработана технология получения бесклеточного коклюшного препарата на основе комплекса соматических антигенов коклюшного микро ба (патент РФ 2332231).
Целью настоящей работы явилось проведение лабораторно экспериментального (доклинического) исследования иммунобиологических свойств разработанного бесклеточного коклюшного препарата.
Основные задачи исследования 1. Оценить токсичность и аллергизирующее действие бесклеточного кок люшного препарата.
2. Изучить иммуногенность бесклеточного коклюшного препарата на экспериментальных животных.
3. Сконструировать комбинированную вакцину для профилактики дифте рии, столбняка и коклюша с использованием бесклеточного коклюшного ком понента и оценить ее иммуногенность на экспериментальных животных.
Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка токсичности и иммуногенной активности отечественного бесклеточного коклюшного препа рата в сравнении с используемой цельноклеточной вакциной. В экспериментах показано отсутствие у бесклеточной коклюшной вакцины токсичности, аллер гизирующей, гистаминсенсибилизирующей и лейкоцитозстимулирующей ак тивностей. Новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цельноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом Bordetella. pertussis 18323, вызывает образование специфических антител, по вышает пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с коклюшной суспен зией, обеспечивает протективную активность в тесте сингенного переноса спле ноцитов. Протективная активность и аффинность антител, образующихся в от вет на иммунизацию бесклеточным и цельноклеточным препаратами, оказались сходными. Пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro на фитогемагглютинин после иммунизации бесклеточной коклюшной вакциной выше, чем после им мунизации цельноклеточной. Патоморфологические исследования показали значительно меньшую степень выраженности вторичной альтерации в тесте ги перчувствительности при введении бесклеточного препарата.
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные результаты уточняют представления о природе приобре тённой противококлюшной резистентности. Принципиально важно, что новая бесклеточная коклюшная вакцина обладает сходной с традиционной цельно клеточной вакциной протективной активностью и иммуногенностью при меньшей токсичности.
Проведенные исследования – существенная часть доклинических испы таний новых вакцин на пути их продвижения в практику, в частности, для представления в Государственный Институт стандартизации и контроля им.
Л.И. Тарасевича. Результаты исследований используются в лекционных кур сах "Иммунология", "Экспериментальная иммунопатология и иммунотера пия" кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО "Пермский государ ственный университет" (614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15). В лекционном курсе «Биотехнология» кафедры промышленной технологии лекарств с кур сом биотехнологии ГОУ ВПО "Пермская государственная фармацевтическая академия" (614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Бесклеточный коклюшный препарат обладает более низкой токсично стью и аллергизирующей активностью в сравнении с цельноклеточной вакци ной.
2. Новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цельноклеточной за щищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом Bordetella. pertussis 18323 и формирует клетки иммунологической памяти, ко торые функционируют при сингенном переносе протективного иммунитета.
3. Бесклеточная и традиционная цельноклеточная коклюшные вакцины обладают сопоставимой способностью к индукции иммунного ответа. Стиму лирующее влияние бесклеточного препарата на пролиферацию Т-лимфоцитов в культурах с фитогемагглютинином более выражено, а проявления вторичной альтерации при реакции гиперчувствительности менее значительны.
4. Замена в вакцине АКДС цельноклеточного коклюшного компонента на новый бесклеточный создает новую комбинированную вакцину, которая не ус тупает традиционной по иммуногенной активности.
Апробация работы и публикации. Основные положения работы доло жены на Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные про блемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002;
Международ ной конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2004;
Международной научной конференции «Студент и научно-технический про гресс», Новосибирск, 2005;
Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», Пермь, 2008;
Объединенном иммунологическом форуме, Санкт Петербург, 2008. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 118 стр. машино писного текста, содержит 28 таблиц и 10 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав эксперимен тальных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 149 источников литературы, из них 37 отечественных и 112 ино странных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа вы полнена в соответствии с основным планом НИР Института экологии и генети ки микроорганизмов УрО РАН (номер госрегистрации темы 01.9.70 009928) и Филиала государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Мин здравсоцразвития РФ «Пермское НПО «Биомед».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы.
Вакцинные препараты. В работе использовали бесклеточный и цельно клеточный коклюшные препараты производства филиала ФГУП НПО «Микро ген» «Пермское НПО «Биомед» (рис. 1.).
Производственные штаммы B. pertussis (39, 475, 305) Получение маточной куль туры Приготовление коклюшной суспензии (выращивание культуры на твердой питательной среде) Добавление химического Обезвреживание кок реагента, диафильтрация, люшной суспензии ультрафильтрация Добавление формалина, ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫЙ стерилизующая фильтра- ПРЕПАРАТ ция, обезвреживание при температуре 36± 10С БЕСКЛЕТОЧНЫЙ ПРЕПАРАТ Рис 1. Схема получения цельноклеточного и бесклеточного коклюш ных препаратов.
Кроме того, в работе использованы коммерческие комбинированные вак цины: АКДС, содержащая цельноклеточный коклюшный компонент, и Инфан рикс (ГласкоСмитКляйн, Бельгия) с бесклеточным коклюшным компонентом, а также экспериментальная вакцина аАКДС, в которой цельноклеточный кок люшный компонент был заменён на бесклеточный. В работе были использова ны следующие отраслевые стандарты: ОСО-3 (иммуногенности коклюшной ва кины), ОСО-5 (гистаминсенсибилизирующей активность коклюшной вакцины).
Экспериментальные животные. Экспериментальные исследования в системе in vivo выполнены на 600 белых аутбредных мышах-самцах массой 16 18 г (цех лабораторных животных филиала «Пермское НПО «Биомед»), самцах-гибридах первого поколения мышей линий (CBAC57BL/J6)F1 (Питом ник РАМН «Столбовая») массой 10 – 12 г, 200 самцах мышей линии BALB/c (Питомник РАМН «Столбовая») массой 14 - 16 г, 150 нелинейных морских свинках массой 250 - 300 г. Животных содержали в условиях лабораторного ви вария на стандартной диете.
Токсичность и аллергизирующая активность. Опыты по исследова нию острой и хронической токсичности препарата проводили согласно основ ным положениям РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицин ских иммунобиологических препаратов» (М., 1989).
Исследование токсичности в тесте изменения массы мышей, определение гистаминсенсибилизирующей и лейкоцитозстимулирующей активности прово дили согласно «Инструкции по отбору, проверке и хранению производствен ных штаммов коклюшных бактерий» (М., 1987).
Аллергизирующее действие препарата оценивали в тесте гиперчувстви тельности немедленного типа (ГНТ). Мышам вводили внутрибрюшинно вак цинную дозу цельноклеточного (10 млрд) и бесклеточного препаратов (0,15 мг).
Через 7 суток вводили удвоенную дозу препаратов, учет числа выживших жи вотных вели через 24 ч после повторного введения.
Протективную активность коклюшных препаратов определяли в тесте внутримозгового заражения иммунизированных мышей вирулентным штаммом B. pertussis 18323. Заражающая доза вирулентного штамма составляла не менее 100 LD50.
Гуморальный иммунный ответ оценивали в опытах на морских свин ках и кроликах. Титр коклюшных антител в сыворотках животных определяли в реакции агглютинации (РА) и с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем, разработанных в филиале ФГУП НПО «Микро ген» «Пермское НПО «Биомед» (Николаева, 2003).
Протективную активность коклюшных антител оценивали в реакциях пассивной защиты и нейтрализации. Тест пассивной защиты проводили на бе лых аутбредных мышах, которым предварительно вводили внутривенно раз личные разведения сывороток, определяя дозу сыворотки (ЕД50), защищающей 50% мышей от заражения 450-500 LD50 вирулентного штамма B. pertussis 18323.
Реакцию нейтрализации проводили по следующей схеме: последовательные разведения вирулентного штамма B. pertussis 18323 инкубировали с сыворот ками в течение 30 мин, затем интрацеребрально вводили белым аутбредным мышам. Рассчитывали число LD50 штамма B. pertussis 18323, нейтрализуемого сывороткой. Аффинность антител оценивали иммуноферментным методом, ис пользуя для отмывки 8М раствор мочевины (Kashanian еt al., 2008). Индекс аф финности (ИА) рассчитывали по формуле ИА= (ОП2/ОП1) 100%, где ОП1 – оптическая плотность лунок промытых буферным раствором, ОП2 – оптиче ская плотность лунок промытых раствором мочевины.
Пролиферативный ответ лимфоцитов. Выраженность иммунного отве та по пролиферативной активности лимфоцитов крови оценивали в культуре клеток, содержащей 2105 лейкоцитов/лунку, общий объем культуры - 0,2 мл. В качестве антигена использовали коклюшную суспензию в концентрации млрд/мл. Через 72 ч учитывали включение 3Н-тимидина на счетчике Wallac 1414 WinSpectral DSA Guardian (США) в подразделении радиоизотопных ис следований аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН. Для дополнительной оценки иммуномодулирующего действия вакцинных препаратов у тех же жи вотных проводили оценку бласттрансформации лимфоцитов в культурах с фи тогемагглютинином-П (ФГА, Sigma, L-9132, США в концентрациях 5;
10;
мкг/мл).
Адоптивный перенос иммунитета. Способность к накоплению клеток иммунологической памяти и эффекторных клеток характеризовали тесте адоп тивного переноса иммунитета на мышах линии BALB/c. Спленоциты мышей доноров, полученные на 14-е сутки после однократного введения препаратов в вакцинной дозе, вводили мышам-реципиентам внутрибрюшинно в дозе клеток. На следующие сутки животных-реципиентов заражали вирулентной культурой B. pertussis 18323 (100 LD50). Через 14 суток определяли процент выживаемости в группах животных.
Гиперчувствительность замедленного типа. С учетом важной роли ре акций Th1-типа в иммунитете при коклюше исследовали способность вакцин ных препаратов к индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). При постановке ГЗТ вакцины вводили в подушечку стопы правой лапы в объеме 0,03 мл, в левую стопу вводили аналогичное количество изотонического раствора натрия хлорида. Повторное введение осуществляли через 7 суток.
Учет результатов проводили через 24 ч по степени выраженности иммунного воспаления. Рассчитывали индекс реакции по формуле: (Ро- Рк)/Рк100%=ИР, где Ро - показатели массы и толщины в опытной конечности;
Рк - то же в кон трольной конечности. Исследование патоморфологических изменений прово дили совместно с зав. кафедрой патологической анатомии ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера", д.м.н., профес сором Г.Г. Фрейнд и к.м.н., доцентом той же кафедры А.Н. Крючковым. Пара финовые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для дополнительной оценки возможности развития других типов реакций гиперчувствительности исследовали выраженность воспаления через 6 ч после разрешающей инъекции антигена.
Статистический анализ результатов. Полученный материал обрабаты вали с помощью методов вариационной статистики. Результаты в большинстве таблиц и на рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стан дартной ошибки (М±m). Достоверность различий между двумя группами оце нивали по непарному t-критерию Стьюдента. При множественных сравнениях использовали критерий Ньюмена-Кейлса. Различия или показатели связи счи тались значимыми при p0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение токсичности и аллергизирующего действия бесклеточной кок люшной вакцины При изучении бесклеточной коклюшной вакцины в тесте острой токсич ности установлено, что при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам и морским свинкам вакцинной дозы препарата не наблюдается сниже ния массы тела, образования воспалительных экссудатов, некробиотических изменений. Применение бесклеточной вакцины при ежедневном внутримы шечном введении в течение 10 дней в суммарной дозе 5,46 мкг для белых мы шей, 36,56 мкг для морских свинок не вызывает гибели животных, изменения поведенческой и двигательной активности, снижения массы тела, что свиде тельствует об отсутствии токсического действия препарата.
Согласно требованиям ВОЗ проведена сравнительная оценка токсичности бесклеточного и цельноклеточного коклюшных препаратов в тесте изменения массы мышей. Полученные результаты показывают, что все изученные вакци ны соответствуют требованиям, предъявляемым к препаратам данного класса:
прирост массы по отношению к контрольным животным составляет более 60% (табл. 1). В группе животных, получавших бесклеточный препарат, прирост массы выше, чем в группе животных, в которой использовали цельноклеточный препарат, что позволяет сделать вывод о меньшей токсичности бесклеточного препарата (p0,05).
Таблица Характеристика токсических свойств бесклеточной вакцины в тестах из менения массы мышей и лейкоцитозстимулирующей активности Число лейкоцитов 103/мл Относительный № серии пре прирост, % бескле- корпуску- бескле- корпус- 0,9% парата точная лярная точная кулярная рас- ОСО вакцина вакцина вакцина вакцина твор NaCl 1 111,0 91,8 5,76 19,36 4,50 22, 2 100,9 85,7 4,64 20,48 3,00 21, 3 101,0 87,0 3,68 20,00 4,12 24, 4 93,7 90,4 5,44 24,00 3,75 47, 5 97,8 76,1 6,08 19,36 5,44 23, 6 100,2 73,4 3,68 23,52 4,25 30,40, 7 95,7 72,1 4,48 19,20 3,70 22, 8 110,0 69,3 4,16 12,16 4,52 21, 9 - - 5,12 17,76 3,16 29, 10 - - 7,84 23,52 4,86 30, M±m 101,3 80,7± 5,1± 19,9±1,2 4,1±0,3 27,5± ±2,2 2,3 0,3 2, ЛСА* - - 0,19 0,73 0,15 Примечание. * - лейкоцитозстимулирующая активность по отношению к от раслевому стандартному образцу (ОСО-3).
Одной из характеристик токсичности коклюшных вакцинных препаратов является их способность вызывать лейкоцитоз, что связано с наличием недо обезвреженного коклюшного токсина. Как видно из табл. 1, введение бескле точного препарата практически не вызывает увеличения количества лейкоцитов.
В сравнении с цельноклеточной вакциной и отраслевым стандартным об разцом (ОСО-5), бесклеточная вакцина не проявляет фармакотоксическую гис таминсенсибилизирующую активность, также обусловленную недообезврежен ным коклюшным токсином.
Из представленных данных видно (табл. 2), что не одна из изученных доз бесклеточного препарата не вызывает сенсибилизации к действию гистамина.
Таблица Гистаминсенсибилизирующая активность исследуемых препаратов Препарат Разведение Количество животных в опыте взято выживших 20 МОЕ/мл 5 ОСО-5 5 МОЕ/мл 5 1 МОЕ/мл 5 1 мг/мл 5 Бесклеточный 0,2 мг/мл 5 0,04 мг/мл 5 20 МОЕ – 1мл 5 Цельноклеточный 5 МОЕ – 1мл 5 1 МОЕ – 1мл 5 Применение вакцинных препаратов может приводить к развитию сенси билизации и аллергических реакций немедленного типа. Установлено, что сен сибилизирующий эффект бесклеточного препарата значимо меньше, в сравне нии с цельноклеточной вакциной (табл. 3).
Таблица Аллергизирующее действие коклюшных препаратов Препарат Выживаемость (%) в тесте ГНТ Бесклеточный 100, Цельноклеточный 27,7* Примечание. * - p0,01 по t-критерию Стьюдента для долей.
Исследование иммуногенной активности бесклеточного коклюшного пре парата Бесклеточная коклюшная вакцина проявляет стабильную протективную активность, которая, судя по доле выживших иммунизированных и заражённых в мозг мышей, не уступает активности цельноклеточного препарата (табл. 4).
Таблица Сравнительная оценка протективной активности коклюшных вакцин № серии Выживаемость, % препарата цельноклеточный препарат бесклеточный препарат 1 62,5 100, 2 75,0 88, 3 83,3 87, 4 62,5 75, 5 93,3 83, 6 76,9 93, 7 81,3 93, 8 87,5 86, M±m 77,8±4,5 88,5±3, Примечание. В каждой группе исходно 14 мышей. При определении выживших исключали мышей, павших в течение первых 72 ч после заражения.
Способность к накоплению клеток иммунологической памяти и эффек торных клеток характеризовали в тесте адоптивного переноса иммунитета.
Адоптивный перенос противококлюшного иммунитета был воспроизведён как с цельноклеточной, так и с бесклеточной вакцинами (табл. 5). Однако перенос спленоцитов от доноров, получивших гель алюминия гидроксида без вакцины, не вызывал у мышей-реципиентов резистентность к внутримозговому зараже нию коклюшными бактериями.
Таблица Показатель выживаемости в тесте адоптивного переноса иммунитета Препарат Число реци- Число живот- Число вы- Процент вы пиентов ных павших живших жи- живае вследствие вотных мости неспецифи ческой гибели Корпуску- 14 4 7 лярный Бесклеточ- 14 2 8 66, ный Гель Al(OH)3 14 4 0 Полученные данные указывают на то, что при иммунизации исследуемы ми коклюшными препаратами формируется состояние иммунной резистентно сти, защищающее животных-реципиентов от интрацеребрального заражения вирулентной культурой B. pertussis 18323.
Иммунизация экспериментальных животных бесклеточной коклюшной вакциной вызывает образование антител, которое по титрам в РА и ИФА не отличается от ответа на цельноклеточную (табл. 6).
Таблица Уровень антител в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных бесклеточным, цельноклеточным препаратами и ОСО- Уровень антител (средняя геометрическая титра) после первой прививки после второй прививки Препарат РА* ИФА** РА* ИФА** бескле- корпус- бесклеточ- корпус точный кулярный ный им- кулярный иммуно- иммуно- муно- иммуно сорбент сорбент сорбент сорбент Бескле- 174,5 92,9 47,8 1522,19 228,5 221, точный [71,1- [51,8- [21,3- [643,7- [166,6- [159,4 428,3] 166,9] 107,3] 3599,4] 213,4] 306,6] Корпус- 190,3 70,88 52,6 [15,5- 1522,19 216,6 206, куляр- [35,2- [19,2- 178,9] [725,3- [122,4- [123,5 ный 1027,2] 261,2] 3194,5] 383,4] 343,9] ОСО-3 439,1 47,7 46,5 [19,6- 1076,35 138,9 219, [85,2- [15,8- 110,7] [373,0- [77,2- [143,2 2262,9] 143,8] 3105,8] 150,1] 335,6] * - величина обратная разведению;
** - условные иммуноферментные единицы.
Можно с уверенностью предполагать сходство репертуара специфично стей образующихся антител. Сыворотки кроликов, иммунизированных бескле точной коклюшной вакциной пассивно защищают мышей также, как сыворотки кроликов, иммунизированных цельноклеточной (табл. 7), однако уступают по следним в опытах нейтрализации заражающей дозы B. pertussis in vitro (табл. 7).
Как видно из табл. 7, ЕД50 сывороток кроликов, иммунизированных как бесклеточной, так и цельноклеточной вакциной, равна 0,029 мл. Максимальная доза (0,5 мл) сыворотки кроликов, иммунизированных бесклеточной вакциной нейтрализует in vitro 22,34 LD50 B. pertussis, в то же время сыворотка кроликов, иммунизированных цельноклеточной вакциной нейтрализует in vitro 58,77 LD50.
Установлено, что аффинность антител, вырабатываемых при использова нии цельноклеточного и бесклеточного препарата, не отличается (табл. 8).
Таблица Характеристика протективных свойств противоколюшных сывороток в тестах пассивной защиты и реакции нейтрализации Препарат Пассивная защита Реакция нейтрализации количество количество Кол-во LD объем количество количество ЕД50, кол-во сыворотки животных выживших мл клеток животных выживших в опыте животных в опыте животных Бесклеточная 1 10 8 0,029 100000 10 вакцина 0,2 10 5 20000 10 22, 0,004 10 4 4000 10 0,0008 10 0 800 10 160 10 Корпускулярная 1 10 7 0,029 100000 10 вакцина 0,2 10 5 20000 10 58, 0,004 10 3 4000 10 0,0008 10 2 800 10 160 10 Неиммунная 1 10 2 100000 10 сыворотка 0,2 10 1 20000 10 - 0,004 10 0 4000 10 0,0008 10 0 800 10 160 10 Таблица Сравнительная оценка аффинности антител Индекс аффинности, % Иммуносорбент антитела к цельноклеточ- антитела к бесклеточному ному препарату препарату Цельноклеточный 85,0±4,1 73,2±6, Бесклеточный 74,3±6,1 84,3±4, Учитывая важную роль клеточного звена иммунного ответа, в развитии противококлюшного иммунитета, провели оценку влияния коклюшных вакцин на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с Т-клеточным митогеном на 14-е сутки после вакцинации. Мононуклеарные клетки крови морских сви нок культивировали в присутствии разных концентраций ФГА и без стимуля ции. Установлено, что уровень пролиферативного ответа животных, иммунизи рованных коклюшными препаратами, в культурах с внесением разных концен траций ФГА достоверно выше, чем в контроле. Как видно из табл. 9, иммуно модулирующая активность бесклеточного препарата более выражена в культу рах с концентрацией ФГА 20 мкг/мл. Полученные результаты важны для обос нования используемых рядом авторов иммунотерапевтических подходов при неинфекционных заболеваниях с использованием вакцин B. pertussis.
Для дополнительной характеристики развивающегося иммунного ответа мононуклеарные клетки крови морских свинок, иммунизированных цельнокле точным и бесклеточным препаратами, культивировали в присутствии взвеси клеток B. pertussis.
Таблица Иммуномодулирующая активность коклюшных препаратов в реакции бласттрансформации лимфоцитов с Т-клеточным митогеном Концентрация ФГА Препарат 20 мкг 10 мкг 5 мкг без митогена Цельноклеточный 4,0757± 3,9083± 3,6912± 3,4134± 0,2720* 0,3424* 0,3005* 0,1200* (11905) (8096) (4911) (2591) Бесклеточный 4,4665± 4,2128± 3,7599± 3,6671± 0,0468*# 0,0911* 0,1868* 0,0658* (29275) (16325) (5754) (4646) Контроль 2,9527± 3,2292± 3,2693± 2,3131± 0,0809 0,0555 0,0394 0, (897) (1695) (1859) (205) Примечание. Приведены значения M±m для показателей log10 имп/мин, в скоб ках – средняя геометрическая имп/мин;
* – p0,05 по отношению к контролю;
# – p0,05 по отношению к цельноклеточному препарату.
Показано, что уровень пролиферативного ответа в группах, иммунизиро ванных коклюшными препаратами, отличается от контрольной группы. При этом не отмечается достоверного отличия уровня пролиферативной активности в ответ на стимуляцию коклюшной суспензией у животных, иммунизирован ных цельноклеточным и бесклеточным препаратами (табл. 10).
Таблица Пролиферативный ответ лимфоцитов морских свинок, иммунизирован ных коклюшными вакцинами, на взвесь коклюшных бактерий in vitro Антиген Препарат иммунизации цельноклеточный бесклеточный контроль Коклюшная сус- 3,9906± 4,1624± 2,3131± пензия 0,3238* 0,0672* 0, (9787) (14535) (206) Без антигена 3,4134± 3,6671± 2,3131± 0,1200* 0,0658* 0, (2591) (4646) (205) Примечание. Приведены значения M±m для показателей log10 имп/мин;
в скоб ках – средняя геометрическая имп/мин;
* – p0,05 по отношению к контролю.
Отсутствие значимых отличий в уровне пролиферативной активности, вызванной бесклеточным и цельноклеточным препаратами, позволяет говорить об их сопоставимой иммуногенности. Обращает на себя внимание повышение спонтанной пролиферации лимфоцитов в культурах без антигена, что, по видимому, является отражением стимуляции лимфоцитов in vivo.
Выраженность клеточноопосредованного иммунного ответа оценивали в реакции ГЗТ. Установлено, что использование цельноклеточной вакцины вы зывает более выраженное иммунное воспаление в сравнении с бесклеточным препаратом (табл. 11).
Таблица Выраженность иммунного воспаления через 24 ч после разрешающей инъ екции антигена Препарат Индекс реакции (М±m) по толщине стопы по массе стопы Бесклеточный 37,3±3,3 16,9±3, Цельноклеточный 46,9±2,9 33,0±5, 0,05 0, р Для интегральной характеристики процессов рекрутирования иммуно компетентных клеток в регионарный лимфатический узел и их пролиферации in situ исследовали изменение клеточности и массы подколенных лимфатических узлов. Установлено, что выраженность ответа со стороны периферических ор ганов иммунной системы сопоставима в сравниваемых группах (табл. 12).
Таблица Выраженность изменения массы и клеточности регионарных лимфатиче ских узлов Препарат Индекс реакции (М±m) по массе лимфатических по количеству ядросодер узлов жащих клеток Бесклеточный 54,9±5,9 77,7±3, Цельноклеточный 56,0±2,9 82,91±1, 0,05 0, р Дополнительные исследования показали, что при использовании иссле дуемых препаратов существенно отличается временная динамика развития вос палительного ответа. При введении цельноклеточной вакцины реакция дости гает своего максимума через 6 ч, тогда как при использовании бесклеточной вакцины максимум ответа приходится на 24 ч. Морфологическое изучение зо ны воспаления показало, что через 6 ч после иммунизации цельноклеточной вакциной в мягких тканях наблюдается обильный клеточный воспалительный инфильтрат вокруг мелких единичных очагов некроза волокнистой ткани и скелетных мышц. В центральных отделах инфильтрата преобладают нейтро фильные гранулоциты, многие из которых находятся в состоянии распада, в пе риферических участках инфильтрата доминируют гистиоциты (макрофаги).
Встречаются также равномерно рассеянные немногочисленные эозинофильные гранулоциты (рис. 2). При иммунизации бесклеточным препаратом через 6 ч наблюдается очаговая обильная клеточная воспалительная инфильтрация сме шанного характера. Индекс реакции по толщине стопы при использовании бес клеточной вакцины составляет 44,92±3,9, а корпускулярной - 56,9±8,1. Таким образом, выраженность в этот временной период воспалительного ответа, в ге незе которого с учетом морфологической картины важная роль может принад лежать повреждению иммунными комплексами, ниже при использовании бес клеточной вакцины. Через 24 ч после иммунизации цельноклеточной вакциной отмечаются обширные некрозы мягких тканей, стенок сосудов. Центральные отделы инфильтрата образованы разрушающимися нейтрофильными грануло цитами (микроабсцессы) и макрофагами. В периферических отделах преобла дают округлые и веретеновидные гистиоциты без признаков распада. Перифо кальный отёк резко выражен (см. рис. 2).
Через 6 ч после разрешающей инъекции коклюшной суспен зией, иммунизация тем же пре паратом.
Гематоксилин и эозин, 80.
Через 24 ч после разрешающей инъекции коклюшной суспен зией, иммунизация тем же пре паратом.
Гематоксилин и эозин, 80.
Через 24 ч после разрешающей инъекции бесклеточным кок люшным препаратом, иммуни зация тем же препаратом.
Гематоксилин и эозин, 80.
Рис. 2. Зона воспаления в стопе после разрешающего введения исследуе мых препаратов.
Для мышей, иммунизированных бесклеточной вакциной, характерно пре обладание в центральных отделах инфильтрата нейтрофильных гранулоцитов, а по периферии - макрофагов. Степень выраженности перифокального очагового отека варьирует от незначительного до умеренного. Выявляется полнокровие сосудов, единичные очаги кровоизлияний (см. рис. 2). Таким образом, в отли чие от бесклеточного препарата воспалительный ответ при разрешающем вве дении цельноклеточной вакцины характеризуется более выраженными явле ниями вторичной альтерации.
Получение и оценка иммунобиологических свойств комбинирован ных вакцин с бесклеточным коклюшным компонентом Новая бесклеточная коклюшная вакцина была включена как компонент в АКДС вместо цельноклеточной. Комбинированные вакцины аАКДС и АКДС сравнивали между собой и с вакциной Инфанрикс, также содержащей бескле точный коклюшный компонент. Результаты оценки гуморального ответа мор ских свинок на иммунизацию тремя комбинированными вакцинами представ лены в табл. 13.
В то же время при выявлении коклюшных антител в ИФА на подложке иммобилизованной взвесью коклюшных бактерий или бесклеточным препара том в сыворотках крови свинок, иммунизированных вакциной Инфанрикс, оп ределялись достоверно меньшие титры, чем у животных, иммунизированных АКДС и аАКДС (табл. 13).
Содержание дифтерийных антител в сыворотках крови свинок, иммуни зированных вакцинами аАКДС и Инфанрикс, было достоверно ниже, чем после иммунизации АКДС-вакциной, при этом обе вакцины с бесклеточным кок люшным компонентом не отличались по способности стимулировать образова ние антител к дифтерийному анатоксину. Титр столбнячных антител при имму низации вакциной Инфанрикс был значимо ниже титров, полученных в ответ на иммунизацию АКДС и аАКДС вакцинами. Между средними титрами столб нячных антител в сыворотках крови свинок, иммунизированных вакцинами АКДС и аАКДС, достоверных отличий не обнаружено.
Таблица Уровень специфических антител в сыворотках морских свинок, иммуни зированных комбинированными вакцинами, с различными коклюшными компонентами Уровень антител (средняя геометрическая титра) коклюшных дифтерийных столбнячных Препарат РА ИФА бесклеточный коклюшная антиген суспензия аАКДС 861,38 228,5 206,01 1,11 9, [380,62- [166,6-213,4] [131,80- [0,62-1,98]* [ 5,41-15,38] 1949,34] 322,02] АКДС 1493 512,75 392,66 3,55 14, [745,38- [283,75- [210,08- [2,48-5,07] [10,04-21,80] 2991,11] 926,55] 733,92] Инфанрикс 951,03 39,55 130,66 0,89 2, [1,44-3,11]*# [674,83- [22,16- [91,29- [052-1,53]* 71,98]*# 1340,29] 187,06]* Примечание. * - p 0,05 в сравнении с группой, иммунизированной АКДС вакциной;
# - p 0,05 в сравнении с группой, иммунизированной аАКДС-вакциной.
Считается, что в дополнение к выработке антител необходимо формиро вание клеточного иммунитета для обеспечения невосприимчивости к коклюш ной инфекции (Matoo, Cherry, 2005). Поэтому оценка специфического клеточ ного иммунитета в виде реакции ГЗТ представляется нам весьма важной как в плане характеристики иммунобиологических свойств комбинированных вакцин, так и в отношении возможного использования полученных данных для контро ля эффективности вакцинации. Установлено, что уровень иммунного воспале ния при использовании АКДС-вакцины достоверно выше, в сравнении с вакци нами, содержащими бесклеточный коклюшный компонент (табл. 14). При этом уровень ответа со стороны регионарных лимфатических узлов сопоставим по своей выраженности (табл. 15).
Таблица Выраженность иммунного воспаления через 24 ч после разрешающей инъ екции антигена Препарат Индекс реакции M±m по величине отека по массе стопы АКДС 32,62±7,51 27,90±3, аАКДС 14,45±1,55* 12,49±1,12* Инфанрикс 16,55±2,13* 16,12±2,65* Примечание. * - р 0,05 в сравнении с группой АКДС Таблица Выраженность изменения массы и клеточности регионарного лимфатиче ского узла через 24 ч после разрешающей инъекции антигена Препарат Индекс реакции M±m по массе лимф. узлов по количеству (ЯСК) АКДС 53,7±8,64 75,5±2, аАКДС 59,2±7,42 81,1±1, Инфанрикс 54,3±8,35 84,5±1, Примечание. * - р 0,05 в сравнении с группой АКДС.
В сравнительном экспериментально-лабораторном (доклиническом) ис следовании новой бесклеточной коклюшной вакцины установлена её безвред ность и высокая протективная, а также иммуногенная активность. Результаты исследования позволяют рассматривать препарат в качестве кандидата для кли нических испытаний I фазы.
ВЫВОДЫ 1. В экспериментах на животных установлено, что бесклеточная коклюш ная вакцина нетоксична и не обладает сенсибилизирующими свойствами.
2. Показано, что новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цель ноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом B. pertussis 18323, а также способна формировать клетки иммуноло гической памяти, которые функционируют при сингенном переносе протектив ного иммунитета на модели внутримозговой коклюшной инфекции у мышей.
3. Установлено, что новая бесклеточная коклюшная вакцина не уступает цельноклеточной по способности стимулировать образование специфичных ан тител. Показано, что аффинность антител, формирующихся в ответ на вакцина цию бесклеточным и цельноклеточным препаратами, не отличается.
4. Показано, что уровень пролиферации лимфоцитов в культурах с кок люшной суспензией при иммунизации животных бесклеточным и цельнокле точным препаратами, повышается в одинаковой степени в сравнении с контро лем. Выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с опти мальной концентрацией фитогемагглютинина при иммунизации бесклеточной коклюшной вакциной выше, чем при введении цельноклеточного коклюшного препарата.
5. Установлено, что разрешающее введение цельноклеточной коклюшной вакцины при сенсибилизации коклюшной суспензией или АКДС-вакциной в тесте гиперчувствительности вызывает более выраженные проявления вторич ной альтерации в сравнении с бесклеточным препаратом.
6. Замена в вакцине АКДС цельноклеточного коклюшного компонента на новый бесклеточный создает новую комбинированную вакцину, которая не ус тупает традиционной по иммуногенной активности.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Устюгов Я.Ю. Локальные иммунные и морфологические изменения при введении компонентов вакцины «Бубо-Кок» / Я.Ю. Устюгов, А.Н. Крючков, А.Ю. Увицкий, Л.Е. Увицкая // Современные проблемы экологии, микробиоло гии и иммунологии: Материалы межрегион. конф. молодых ученых – Пермь, 2002. – С. 105-106.
2. Устюгов Я.Ю. Морфологические и гистологические изменения при вве дении вариантов клеточной и бесклеточной противококлюшных вакцин / Я.Ю.
Устюгов, А.Ю.Увицкий // Биология – наука XXI века: Материалы международ ной конф. молодых ученых – Пущино, 2004. – С. 132.
3. Увицкий А.Ю. Изменения при введении комбинированных вакцин и их компонентов. / А.Ю. Увицкий, Я.Ю. Устюгов, А.М. Николаева, В.Д. Семенова // Медицинские иммунобиологические препараты в ХХ1 веке: разработка, про изводство, применение: Материалы всерос. научн. конф. с междунар. участием - Уфа, 2005. - Часть 1. - С. 82-84.
4. Устюгов Я.Ю. Локальные морфологические изменения при введении корпускулярной противококлюшной вакцины. / Я.Ю. Устюгов, А.Ю. Увицкий // Студент и научно-технический прогресс: Материалы международной научной конференции серия биология НГУ. - Новосибирск, 2005. – С. 77-78.
5. Николаева А.М. Опыт разработки и доклинической оценки бесклеточного варианта противококлюшной вакцины. / А.М. Николаева, В.Д. Семенова, А.Ю.
Увицкий, Я.Ю. Устюгов // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества: Материалы международной научно-практич. конф. - Минск-Нарочь, 2005. – С. 155-156.
6. Увицкий А.Ю. Изучение иммуногенности бесклеточного варианта кок люшной вакцины в опытах на животных. / А.Ю. Увицкий, Я.Ю. Устюгов, В.Н.
Сперанская // Современная вакцинопрофилактика: Материалы научно-практич.
конф. – Пермь, 2005. – С. 113-117.
7. Увицкий А.Ю. Взаимная иммуноадъювантность комбинированных вак цин, как причина усиления локальной реактогенности при повторном введении / А.Ю. Увицкий, Я.Ю. Устюгов, А.М. Николаева, В.Д. Семенова, А.Н. Крючков // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2006. - № 3-1. – С.
245-248.
8. Устюгов Я.Ю. Изучение иммунобиологической активности варианта бес клеточной коклюшной вакцины / Я.Ю. Устюгов, А.Ю. Увицкий, А.М. Николае ва, В.Д. Семенова // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2006. - № 3-1. – С. 248-251.
9. Устюгов Я.Ю. Изучение иммуномодулирующего действия корпускуляр ного и ацеллюлярного коклюшных вакцинных препаратов в реакции бласт трансформации лимфоцитов / Я.Ю. Устюгов, А.М. Николаева // Российский иммунологический журнал. – 2008. - № 2-3. – С. 339.
10. Устюгов Я.Ю. Изучение влияния коклюшных вакцин на клеточный и гу моральный иммунный ответ у животных / Я.Ю. Устюгов, А.М. Николаева, Л.Е.
Увицкая // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологи ческих препаратов: Материалы всерос. научно-практич. конф. – Пермь, 2008. – С. 21-22.
11. Устюгов Я.Ю. Протективная активность бесклеточной коклюшной вак цины в тесте адоптивного переноса иммунитета / Я.Ю. Устюгов, А.М. Нико лаева, // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологиче ских препаратов: Материалы всерос. научно-практич. конф. – Пермь, 2008. – С.
23-24.