Влияние бактерий yersinia pestis, francisella tularensis и их антигенов на экспрессию тoll-подобных рецепторов (tlr2, tlr4) клетками врожденного и адаптивного иммунитета

На правах рукописи

СМОЛЬКОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS,

FRANCISELLA TULARENSIS И ИХ АНТИГЕНОВ НА

ЭКСПРЕССИЮ ТOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

(TLR2, TLR4) КЛЕТКАМИ ВРОЖДЕННОГО

И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА

03.02.03 – микробиология

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:

кандидат медицинских наук, доцент Никифоров Алексей Константинович доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Щуковская Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

Девдариани Зураб Леванович, доктор медицинских наук, профессор, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, зав. лабораторией Елисеев Юрий Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России, зав. кафедрой

Ведущая организация – Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «21» марта 2012 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.078.01 при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул.

Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан 18 февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Внедрение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в организм хозяина распознается системой врожденного иммунитета посредством набора генетически детерминированных, так называемых паттернраспознающих рецепторов (ПРР), которые имеют высокий аффинитет к консервативным микробным молекулярным фрагментам, характерным для широкого спектра микроорганизмов (пептидогликану, липополисахариду, липотейхоевым кислотам, липопротеинам, липопептидам, флагеллину, вирусной РНК, бактериальной ДНК, богатой CpolyG последовательностями, белкам теплового шока, поринам, -глюкану, маннану и др.) и получившим название патоген-ассоциированные молекулярные компоненты (PAMPs – pathogen-associated molecular patterns) [Симбирцев А.С., 2005;

Takeda K., Akira S., 2003;

Uematsu S., Akira S., 2006].

ПРР представляют собой группу различных по строению и происхождению молекул, обладающих способностью взаимодействовать с PAMPs с целью их прямой нейтрализации или запуска каскада провоспалительных реакций, направленных в конечном счете на блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление патогена из организма [Ehlers S., Bulfone-Paus S., 2004].

Показано, что ключевую роль в распознавании бактериальных и вирусных патогенов играют Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLRs), локализующиеся на различных иммунокомпетентных клетках и обеспечивающие проведение внутриклеточного активационного сигнала.

Эволюционная стабильность Toll-подобных рецепторов не уступает их микробным лигандам [Байракова А.Л. и др., 2008;

Hallman M. et al., 2001].

В настоящее время идентифицировано 13 Toll-подобных рецепторов.

Каждый из TLRs имеет присущий ему сигнальный путь, активация которого индуцирует созревание дендритных клеток, преобразование рекогносцировочного сигнала в растворимые медиаторы (цитокины, хемокины) и последующее взаимодействие их с цитокин/хемокиновыми рецепторами на Т и В-лимфоидных клетках, развитие адаптивного иммунитета [Хаитов Р.М. и др., 2008;

Alexopoulou L. et al., 2002;

Hornung V. et al., 2002;

Netea M.G. et al., 2004;

Tsan M.F., Gao B., 2004;

Gorden K.B. et al., 2005;

Herbst-Kralovetz M.M., Pyles R.B., 2006;

Paul-Clark M.J et al., 2006].

рецепторы экспрессированы конститутивно на Toll-подобные моноцитах/макрофагах, нейтрофильных гранулоцитах, дендритных клетках, различных популяциях лимфоцитов, эндотелиальных клетках, клетках эпителия кишечника, респираторного и урогенитального тракта [Becker M.N. et al., 2000;

Wong X. et al., 2002;

Guillot L. et al., 2004;

Sha Q. et al., 2004;

Xu D. et al., 2004].

В условиях введения синтетических лигандов для конкретных TLRs показано их важное значение в формировании неспецифической резистентности к представителями рода Listeria, Francisella, M. tuberculosis, возбудителям лейшманиоза и малярии. Установлена ключевая роль TLR4 в развитии лептоспирозной инфекции и бруцеллеза [Campos M.C. et al., 2004;

Katz J. et al., 2006;

Viriyakosol S. et al., 2006].

Имеются единичные сообщения о важной роли TLR4 в патогенезе чумной инфекции и развитии резистентности к чуме [Montminy S.W. et al., 2006;

Airhart C.L. et al., 2008], а также возможной роли TLR2 в опосредованной антигенами rLcrV и YopB Y. pestis ингибиции функции макрофагов [Sharma R.K. et al., 2004].

Мало изучено в условиях in vivo влияние клеток Y. pestis, F. tularensis и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей.

Отсутствуют сведения о сравнительном анализе экспрессии иРНК TLR2, TLR и экспрессии генов цитокинов Th1(IFN-) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа у биомоделей в ответ на введение вакцинных штаммов Y. pestis, F. tularensis, антигенов чумного и туляремийного микробов. Отсутствуют также сведения о влиянии вакцинации коммерческими живыми чумной, туляремийной вакцинами на экспрессию TLR2 и TLR4 и продукцию цитокинов Th1 (IFN-) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей.

Цель исследования –изучить влияние чумного, туляремийного микробов и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей.

Основные задачи исследования Оценить иммунобиологическую активность (токсичность, 1.

иммуногенность, протективность) препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.

2. Изучить влияние вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, химической чумной вакцины, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из указанных штаммов, на экспрессию паттернраспознающих Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов клетками врожденного и адаптивного иммунитета биомоделей.

3. Провести исследование экспрессии генов цитокинов Th1 (IFN-) и Th (IL-4)–зависимого ответа у биомоделей при введении вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, химической чумной вакцины, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из данных штаммов.

4. Исследовать индуцированную вакцинным штаммом F. tularensis НИИЭГ экспрессию генов паттернраспознающих Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов, цитокинов (IFN-, IL-4) у экспериментальных биомоделей.

5. Сравнить уровень экспрессии иРНК TLR2 и TLR4, цитокинов (IFN-, IL-4) у биомоделей, индуцируемой протективным антигенным комплексом (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.

6. Изучить влияние вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокинов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей. Оценить возможность применения полученных результатов в качестве показателя эффективности вакцинации против чумы и туляремии.

Научная новизна. Получены новые сведения о характере влияния рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277 – продуцента капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенного из него препарата капсульного антигена Ф1, экспериментальной химической чумной вакцины, препаратов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов на экспрессию in vivo иРНК Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов. Показано, что рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277, выделенный из него препарат капсульного антигена Ф1, химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 уже в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

Установлено, что введение препарата протективного антигенного комплекса из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывает повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Препараты протективного антигенного комплекса, полученные из вирулентного штамма голарктического (F. tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцируют усиление экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса из штамма F. tularensis В399 A'Cole неарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.

Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокинов Th1 (IFN-) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа у биомоделей, индуцируемой вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантным штаммом Y. pestis КМ 277, химической чумной вакциной, капсульным антигеном чумного микроба, выделенным из Y. pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ, вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, протективным антигенным комплексом туляремийного микроба различных подвидов. Получены новые данные, свидетельствующие о преимущественной экспрессии клетками врожденного и адаптивного иммунитета иРНК TLR2 и IFN- в условиях in vivo.

Впервые проведено сравнительное изучение влияния вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокинов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей, оценена возможность применения полученных данных для разработки критериев оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Установлено, что вакцинация людей против чумы и туляремии отечественными живыми вакцинами вызывает различные изменения уровня экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 в лейкоцитах периферической крови. Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации против чумы и туляремии транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в мононуклеарных клетках введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводило к исчезновению детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как гранулоцитами, так и мононуклеарными клетками вакцинированных доноров.

Выявленные отличия в экспрессии иРНК TLR4 мононуклеарными клетками, активация которого важна для формирования полноценного адаптивного иммунитета, могут быть одной из причин формирования различного по продолжительности поствакцинального иммунитета при чуме и туляремии.

На основании полученных новых данных об однотипности митоген- и антигениндуцированной продукции IFN- как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей, предложено использование параметров индуцированной Т-клеточным митогеном конканавалином А (лигандом TLR2) продукции маркерного цитокина IFN- в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Практическая значимость. Результаты исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Определение экспрессии генов Толл-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных», которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №7 от 16.12.2010г), утверждены директором института и применяются в практической деятельности отдела иммунологии, лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб». Материалы исследования используются при чтении лекций на курсах первичной специализации по специальностям «Бактериология» и «Эпидемиология» с основами безопасной работы с патогенными биологическими агентами I – II групп при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту 1. Рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277 – продуцент капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенный из него капсульный антиген Ф1, а также химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

2. Протективный антигенный комплекс, полученный из вакцинного штамма голарктического подвида F. tularensis 15 НИИЭГ, вызывает повышение экспрессии клетками адаптивного (спленоцитами) иммунитета как TLR2, так и TLR4, в отличие от препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из вирулентного штамма F. tularensis 503/ голарктического подвида и штамма F. tularensis А179 среднеазиатского подвида, которые индуцируют повышение экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса, полученный из штамма F. tularensis В399 A'Cole неарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.

3. Препараты капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, препараты протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, в дозе 100 мкг не оказывают токсического действия и не вызывают по данным проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммунокомпетентных клеток по типу апоптоза.

Протективная активность капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, в 3 раза выше по сравнению с препаратами капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.

4. Вакцинация людей против чумы и туляремии живыми вакцинами вызывает различные изменения уровня экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 в лейкоцитах периферической крови. Введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводит к исчезновению в мононуклеарных клетках привитых детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцирует экспрессию иРНК TLR2 и TLR4.

5. Сравнительная оценка спонтанной, митоген- и антиген индуцированной продукции IFN- и IL-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной указывает на преимущественное развитие Th1-зависимого иммунного ответа.

Параметры индуцированной лигандом TLR2 Т-клеточным митогеном конканавалином А продукции маркерного цитокина IFN- предложены в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008);

IX Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008);

Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010);

научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2009–2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях – 4.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 85 отечественных и зарубежных источников. Объем диссертации составляет 177 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 18 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы В работе использовали: 1) Штаммы микроорганизмов – рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277 (ЕV11МpFSK3) Kmr –продуцент капсульного антигена;

вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ (Pgm-, pFra+, pCad+, pPst+);

вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ;

вирулентный штамм Y. pestis 231 (pPgm+, pFra+, pCad+, pPst+);

вирулентный штамм F. tularensis 503/840. Все указанные штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». 2) Антигены – убитые нагреванием клетки вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ;

коммерческий препарат «Тулярин» производства ГУП НПО «Микроген» (Россия), представляющий собой взвесь убитых нагреванием клеток вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ;

Т клеточный митоген конканавалин А (Con A;

“Sigma”, США);

капсульный антиген (ФI), выделенный из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277 и вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ;

экспериментальная химическая чумная вакцина (серия 2), состоящая из ФI чумного микроба и основного соматического антигена (ОСА) возбудителя псевдотуберкулеза;

протективные антигенные комплексы туляремийного микроба, полученные из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ subsp. holarctica, вирулентных штаммов F. tularensis 503/840 subsp. holarctica, F. tularensis B399 ACole subsp.

nearctica, F. tularensis A-179 subsp. mediasiatica.

Препараты капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ любезно предоставлены доктором биологических наук, профессором Т.М. Тараненко (лаборатория биохимии и протеомики РосНИПЧИ «Микроб»). Все препараты протективного антигенного комплекса туляремийного микроба, капсульный антиген (ФI), выделенный из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, получены из лаборатории экспериментальной биотехнологии РосНИПЧИ «Микроб».

Экспериментальная часть выполнена с использованием в качестве биомоделей 600 аутбредных и 250 инбредных мышей линии BALB/c массой (18 2) г, полученных из отдела экспериментальных животных с виварием РосНИПЧИ «Микроб».

В ходе выполнения работы были обследованы 38 вакцинированных волонтеров и 8 не привитых доноров в качестве группы сравнения.

Вакцинацию отечественными коммерческими живой чумной вакциной производства ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора и живой туляремийной вакциной производства ГУП НПО «Микроген» проводили накожным способом в плановом порядке согласно приказу Минздрава России от 27.07.2001 №229 «О национальном календаре профилактических прививок и календаре прививок по эпидемическим показаниям» и в строгом соответствии с утвержденными инструкциями по применению вакцин. Клинические лабораторные исследования проводились согласно лицензии на медицинскую деятельность №ФС-64-01-001191 от 03.09.2010г, выданной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на осуществление медицинской деятельности РосНИПЧИ «Микроб».

Микробиологические и биологические методы. Для культивирования чумного микроба использовали агар Хоттингера рН 7,2±0,1, для культивирования туляремийного микроба – FT-агар с глюкозо-витаминной добавкой (ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, Y. pestis КМ 277 и Y. pestis 231 выращивали при температуре 28C в течение 48 ч. Штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis 503/840 – при 37C в течение 48 ч.

Для последующей работы (приготовление иммунизирующих и заражающих доз, убитых клеток) с плотных питательных сред визуально и под малым увеличением микроскопа отбирали колонии чумного и туляремийного микробов, типичные по своим культурально-морфологическим свойствам.

Одновременно контролировали бактериоскопически морфологические и тинкториальные свойства клеток в мазках, окрашенных по Граму.

Убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ использовали в качестве индуктора экспрессии изучаемых Toll-подобных рецепторов и продукции цитокинов. Для их получения из двухсуточной культуры чумного микроба готовили взвесь клеток в стерильном физиологическом растворе по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-59-85П 10 единиц, эквивалентному 1 х 109 м.к. в 1 мл.

Полученную взвесь прогревали при 60C в течение 1 ч 20 мин [Павлова Л.П., 1964].

Необходимые концентрации культур чумного и туляремийного микробов для иммунизации экспериментальных биомоделей и определения напряженности иммунитета в тесте активной защиты мышей готовили методом серийных разведений в соответствии с МУ 3.3.1.1113-02 «Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба» и МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба».

Для определения напряженности противочумного иммунитета при иммунизации вакцинным штаммом чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ проводили расчет LD50 заражающего вирулентного штамма Y. рestis 231. Для оценки протективных свойств антигенных препаратов чумного и туляремийного микробов применяли метод определения ImD50 при заражении высоковирулентными штаммами Y. рestis 231 и F. tularensis 503/840 дозами 400 LD50 и 100 LD50 соответственно. Гибель от чумной или туляремийной инфекции подтверждалась наличием соответствующей патологоанатомической картины и результатами высевов из органов павших животных на питательные среды. Величину LD50 или ImD50 расcчитывали по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина (1962).

Молекулярно-биологические методы (определение экспрессии генов TLR2, TLR4 и генов цитокинов IFN-, IL-4). Для определения экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 применяли полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Выделение нуклеиновых кислот проводили методом аффинной сорбции на частицах силикагеля с помощью комплекта «РИБО сорб» (ИЛС, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. Для получения препарата чистой РНК без примеси ДНК полученную смесь РНК/ДНК обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКаз «DNase I, RNase-free»

(«Fermentas», Литва) в соответствии с приложенным протоколом. Обратную транскрипцию осуществляли с использованием комплекта «РЕВЕРТА» (ИЛС, РФ). Для проведения ПЦР применяли специфические праймеры (таблица 1, 2).

Таблица 1 – Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе для определения экспрессии TLR2 и TLR4 у людей Экспрессия Названия Последовательность (5 - 3) генов праймеров GAPDH-f GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT GAPDH TGG GAT TTC CAT TGA TGA CA GAPDH-r GCC AAA GTC TTG ATT GAT TGG TLR2h-f TLR TLR2h-r TTG AAG TTC TCC AGC TCC TG TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG TLR4h-f TLR GAA ATG GAG GCA CCC CTT C TLR4h-r Таблица 2 – Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе для определения экспрессии TLR2, TLR4, IFN-, IL-4 у биомодельных мышей Экспрессия Названия Последовательность (5 - 3) генов праймеров -act-f TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C -Actin -act-r TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G tlr2m-f CAG CTT AAA GGG CGG GTC AGA G TLR tlr2m-r TGG AGA CGC CAG CTC TGG CTC A tlr4m-f AGT GGG TCA AGG AAC AGA AGC A TLR tlr4m-r CTT TAC CAG CTC ATT TCT CAC C il4-f CGA AGA ACA CCA CAG AGA GTG AGC T IL- il4-r GAC TCA TTC ATG GTG CAGCTT ATC G ifn-f AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG IFN ifn-r GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG ПЦР проводили на амплификаторе «МС-2 Терцик» (ДНК-технология, РФ). Для анализа продуктов амплификации использовали электрофорез в 2% агарозном геле с маркером молекулярных масс по 100 п.н. «PCR marker with Loading Dye» (Amresco, США). Продукты амплификации визуализировали при помощи системы «Gel Doc» («BioRad», США). Учет результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

Иммуносерологические методы. Для определения концентрации суммарного иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови, цитокинов IL-4 и IFN- в сыворотке крови и супернатантах клеток применяли твердофазный иммуноферментный анализ с использованием коммерческих тест-систем производства ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) и ЗАО «Вектор-БЕСТ» (п.

Кольцово). Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на микропланшетном фотометре для иммуноферментного анализа StatFax- (Awareness Technology, США).

Иммунологические методы. Перитонеальные макрофаги, клетки селезенки, тимуса биомоделей получали общепринятым методом [РД 42-28-10 90]. Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной крови путем центрифугирования в градиенте плотности 1,077 г/мл с применением Lymphocyte Separation Medium (Flow Laboratories, Великобритания).

Жизнеспособность выделенных клеток оценивали с применением красителя трипанового синего. Реакцию лейкоцитолиза проводили в соответствии с МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией». В качестве антигена использовали коммерческий препарат «Тулярин». Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма перитонеальных макрофагов осуществляли методом спонтанного НСТ-теста [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

Определение апоптотических и пролиферирующих клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии. Окраску ДНК иммунокомпетентных клеток митрамицином (Serva, Германия;

Sigma, США), бромидом этидия (Serva, Германия) осуществляли по методу B. Barlogie et al. (1976). Измерения выполняли на импульсном проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия), оснащенном 2048-канальным амплитудным анализатором импульсов Ortho Instruments (USA) модели 2102 для автоматической сортировки клеток и построения гистограмм.

Статистические методы. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel.

Определяли среднее значение (М), стандартную ошибку (m). Достоверность различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при значении р 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение Для объективной интерпретации полученных результатов по действию изучаемых штаммов и антигенов на экспрессию TLR2 и TLR4 на первом этапе исследований была проведена оценка иммунобиологической активности (токсичности, иммуногенности, протективности) препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, а также протективного антигенного комплекса (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.

Согласно полученным данным все указанные препараты защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, не оказывают в дозе мкг, используемой на последующих этапах исследования, токсического действия и не вызывают по данным проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммунокомпетентных клеток по типу апоптоза.

Установлено, что протективная активность капсульного антигена (Ф1), полученного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, в 3 раза выше (p 0,05) по сравнению с препаратами капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ (Ф1 серия 32 и Ф1 серия 44).

Значения ImD50 (ImD50 min ImD50max) для Ф1 из штамма Y. pestis КМ 277 и Ф1 серии 32, Ф1 серии 44 составили 8,3 (3,819,0) мкг и 29,0 (26,234,3) мкг, 28,94 (20,132,5) мкг соответственно.

В ходе дальнейших исследований установлено, что введение штаммов Y. pestis с различной генетической характеристикой, вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида, а также антигенов чумного и туляремийного микробов (капсульного антигена из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов) оказывает влияние на уровень и кинетику экспрессии иРНК TLR2, TLR4 в клетках врожденного (перитонеальные макрофаги) и адаптивного (спленоциты) иммунитета биомоделей, степень выраженности которых зависит от вводимого антигена и вида возбудителя, из которого он был выделен.

Подкожное введение рекомбинантного штамма Y. pestis КМ (ЕV11МpFSK3) Kmr – продуцента капсульного антигена чумного микроба Ф1, препарата Ф1 из штамма Y. pestis КМ 277, а также экспериментальной химической чумной вакцины индуцирует уже в первые часы повышение экспрессии иРНК TLR2 в спленоцитах мышей линии BALB/c (рисунок 1) с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета (рисунок 2).

Рисунок 1 – Уровни иРНК TLR2 при иммунизации мышей BALB/c рекомбинантным штаммом Y. pestis KM 277, препаратом Ф1 Y. pestis KM 277 и химической чумной вакциной Рисунок 2 – Относительное содержание (в %) пролиферирующих (2 С ДНК) спленоцитов мышей линии BALB/с в условиях введения Ф1 Y. pestis KM 277, Ф1 серии 32, Ф1 серии Примечание: * - р 0, Уровень экспрессии TLR2, TLR4 в спленоцитах во все исследуемые сроки после иммунизации вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ (Pgm-, pFra+, pCad+, pPst+), препаратами капсульного антигена, выделенного из агаровой культуры вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ (Ф1 серия 32), из бульонной культуры Y. pestis EV НИИЭГ (Ф1 серия 44) практически не отличался от показателей в контроле. В перитонеальных макрофагах биомоделей зарегистрировано кратковременное (через 4 ч) повышение экспрессии TLR4 в ответ на введение углеводсодержащего препарата Ф1 серии 32 в отличие от Ф1 серии 44, являющейся чистым белком, которое исчезало через 24 ч после иммунизации инбредных мышей.

В результате проведенного сравнительного анализа экспрессии TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокинов Th1(IFN-) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа у биомоделей, индуцируемой вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантным штаммом Y. pestis КМ 277, химической чумной вакциной, капсульным антигеном чумного микроба, выделенным из Y. pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ, вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, ПАК туляремийного микроба различных подвидов получены новые данные, свидетельствующие о преимущественной экспрессии клетками врожденного и адаптивного иммунитета иРНК TLR2 и IFN- в условиях in vivo.

Экспрессия иРНК IL-4 спленоцитами и перитонеальными макрофагами инбредных мышей, иммунизированных штаммами чумного микроба Y. pestis KM 277, Y. pestis EV НИИЭГ, препаратами капсульного антигена, выделенного из указанных штаммов, была ниже детектируемого уровня в течение всего периода наблюдения, что свидетельствует о превалировании Th1-зависимого ответа в процессе формирования специфической резистентности к чуме.

Введение экспериментальным биомоделям препарата протективного антигенного комплекса из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывало повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Однако препараты протективных антигенных комплексов, полученные из вирулентного штамма голарктического (F. tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцировали усиление экспрессии только TLR2 в сочетании с IFN-.

Препарат протективного антигенного комплекса из штамма F. tularensis В A'Cole неарктического подвида не вызывал изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов, однако индуцировал на ранние сроки усиление экспрессии IFN- и IL-4.

Важным результатом работы является проведенное впервые сравнительное изучение влияния вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокинов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и оценка возможности применения полученных данных для разработки критериев оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Полученные в ходе выполнения работы данные о конститутивной экспрессии у людей гранулоцитами и мононуклеарными клетками крови иРНК TLR2 и TLR4 полностью согласуются с результатами других исследователей [Hornung V. и др., 2002;

Zarember K.A., Godowski P.J., 2002], определивших с применением ПЦР-анализа в режиме реального времени уровни экспрессии различными субпопуляциями клеток периферической крови людей иРНК десяти Toll-подобных рецепторов, первые позиции среди которых по количеству синтезируемой иРНК заняли TLR2 и TLR4.

Впервые показано, что вакцинация людей против чумы и туляремии отечественными живыми вакцинами вызывает неоднозначные изменения уровня экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 в лейкоцитах периферической крови.

Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации на фоне сформировавшегося адаптивного иммунитета транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в мононуклеарных клетках введение живой чумной вакцины, но не живой туляремийной вакцины, приводило к снижению до недетектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как гранулоцитами, так и мононуклеарными клетками вакцинированных доноров. Зарегистрировано появление в результате одновременного введения живой чумной и живой туляремийной вакцин выраженной экспрессии иРНК TLR2 и TLR гранулоцитами у волонтера с недетектируемым до вакцинации уровнем экспрессии иРНК данных TLRs (рисунок 3).

Выявленные отличия могут быть связаны со структурно функциональными особенностями синтезируемого при разных температурных условиях липополисахарида (ЛПС) чумного микроба – основного лиганда TLR4. Возбудитель чумы при температуре 37С синтезирует тетра ацилированный липид А (эндотоксический компонент ЛПС) с очень слабо стимулирующей TLR4 активностью и одновременно обладающий свойствами антагониста для гекса-ацилированной структуры ЛПС с более выраженным стимулирующим действием, синтезируемым при температуре 28С. Данный феномен связывают с потерей Y. pestis LpxL, одной из «последних»

ацилтрансфераз в цепочке биосинтеза липида А [Montminy S.W. et al., 2006;

Airhart C.L. et al., 2008], со способностью тетра-ацилированного ЛПС снижать экспрессию костимулирующих молекул CD40, CD86, молекул главного комплекса гистосовместимости II класса на поверхности моноцитов и дендритных клеток человека [Telepnev M.V. et al., 2009], ингибировать сигнальные пути активации транскрипционного фактора NF-B [Gelman A.C. et al., 2004], а также регулируемую через TLR4 продукцию IL-12(p40)2, необходимого для реагирования дендритных клеток на индуцированные чумным микробом хемокины, их последующей миграции и имеющего важное значение в инициации формирования антибактериального адаптивного иммунитета [Cooper A.M., Khader S., 2007;

Robinson R.T. et al., 2008].

М – Маркер молекулярных масс по 100 п.н.;

1 – TLR2;

2 – TLR4;

3 – GAPDH.

Рисунок 3 – Экспрессия Toll-подобных рецепторов и GAPDH гранулоцитами крови у волонтера до и спустя 3 мес после сочетанной вакцинации ЖЧВ и ЖТВ ЛПС туляремийного микроба в основном так же имеет тетра ацилированную структуру, обладает очень слабой стимулирующей активностью и не взаимодействует с TLR4 [Gunn J.S., Ernst R.K., 2007]. В то же время, синтезируемый F. tularensis белок теплового шока DnaK способен активно связываться с TLR4 и инициировать высокий уровень продукции цитокинов дендритными клетками [Ashtekar A.R. et al., 2008], что, по видимому, и обуславливает зарегистрированную выраженную экспрессию иРНК TLR4 в мононуклеарных клетках у всех обследованных как после вакцинации живой туляремийной вакциной, так и после сочетанной вакцинации против чумы и туляремии.

Выявленные различия в экспрессии TLR4 мононуклеарными клетками крови вакцинированных против чумы и туляремии могут быть одной из причин формирования различного по продолжительности поствакцинального иммунитета при чуме и туляремии.

Следующим этапом наших исследований было проведение сравнительной оценки спонтанной, митоген- и антигениндуцированной продукции IFN-, IL-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной и возможности использования данного показателя для оценки функциональной активности Th и Th2 клеток в зависимости от напряженности противочумного и противотуляремийного иммунитета. В качестве неспецифического индуктора использовали стандартный коммерческий Т-клеточный митоген конканавалин А, являющийся лигандом TLR2 [Sodhi A. et al., 2007]. В качестве специфических индукторов применяли убитые нагреванием клетки вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ и коммерческий препарат «Тулярин», представляющий собой взвесь убитых нагреванием клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ.

Известно, что у привитых против чумы лиц напряженный иммунитет наиболее выражен в первые месяцы после введения живой чумной вакцины [Самойлова Л.В. и др., 1973]. Установлено, что в этот период митоген индуцированная продукция IFN- в группе вакцинированных в 5 раз превышала уровень спонтанной продукции данного цитокина, что свидетельствует о высокой функциональной активности Т-хелперов 1 типа. По истечению года после вакцинации интенсивность синтеза IFN- в культуре клеток крови под действием митогена значительно снижалась.

При культивировании клеток крови вакцинированных против чумы людей с Т-клеточным митогеном Con A отмечалось статистически достоверное повышение продукции IL-4 через 3 месяца после прививки, которое уже не определялось через год с момента вакцинации. Полученные данные свидетельствуют о повышении функциональной активности также и Т хелперов 2 типа и участии Th2-клеток в формировании противочумного иммунитета у людей при вакцинации живой чумной вакциной, что согласуется с результатами экспериментальных исследований S.J. Elvin и E.D. Williamson [2004] в условиях аэрозольного заражения Y. pestis мышей Stat4-/-, Stat6-/- и заключением авторов о возможном смешанном типе Т-клеточного иммунного ответа при чуме со значительным превалированием Th1-зависимого ответа.

Для подтверждения связи выявленных изменений цитокинового профиля у лиц, вакцинированных против чумы, с повышением функциональной активности цитокинсекретирующих мононуклеарных клеток в ответ на введение живой чумной вакцины через 3 месяца после вакцинации был проведен сравнительный анализ уровня митоген- и антигениндуцированной продукции IFN-, IL-4 в смешанной популяции лимфоцитов крови, выделенных в градиенте плотности, при культивировании со специфическим (убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ) и неспецифическим (Con A) индукторами (таблица 3).

В отличие от не привитых доноров, у вакцинированных живой чумной вакциной лиц зарегистрировано достоверное повышение функциональной активности цитокинсекретирующих клеток, в первую очередь Th1-клеток.

Сравнительный анализ продукции IFN- (маркера Th1-клеток) в ответ на митогенную и антигенную стимуляцию выявил однотипность как по вектору, так и по амплитуде в реализации цитокинсекретирующей функции Т-хелперами 1-го типа. Статистически достоверное повышение продукции IL-4 (маркера Th2-клеток) в смешанной популяции лимфоцитов отмечалось только при активации клеток Т-клеточным митогеном Con A. При антигенной стимуляции также наблюдалась тенденция к повышению продукции IL-4, однако значения не были статистически достоверными.

Таблица 3 – Митоген- и антигениндуцированная продукция IFN-, IL- мононуклеарными клетками крови людей, через 3 месяца после вакцинации коммерческой живой чумной вакциной Время Не вакцинированные Вакцинированные инкуба (группа сравнения) -ции Лимфоциты Лимфоциты лимфо Без Con А Без Con А цитов Y. pestis Y. pestis индук- индук Показатель без / с EV EV тора НИИЭГ тора НИИЭГ индук торами M±m M±m M±m M±m M±m M±m 2ч 13,3 ± 0,9 15,6 ± 0,4 22,9± 8,9 12,2 ± 1,7 16,9±3,7 35,7± 4,7* IFN пг/мл 24 ч 11,5 ± 0,4 17,6 ± 3,4 15,3 ± 1,4 15,3 ± 1,4 22,9±2,2* 23,5±5, 2ч 0,53 ± 0,3 0,6 ± 0,5 0,63 ± 0,4 0,3 ± 0,1 0,83±0,15* 0,5 ± 0, IL- пг/мл 24 ч 0,26 ± 0,2 0,43 ± 0,3 0,55 ± 0,3 0,11± 0,05 0,5 ± 0,46 0,37± 0, Примечания: n – везде 8;

* - р 0,05 при сравнении с уровнем спонтанной (без индуктора) продукции цитокина Таким образом, результаты исследования однозначно указывают на преимущественное развитие Th1-зависимого иммунного ответа организма людей на введение живой чумной вакцины, что подтверждается также отсутствием у обследованных лиц положительной сероконверсии (в соответствии с международными стандартами это 4-х кратное повышение титров антител) при определении в системе реакций РНГА и РТНГА антител к капсульному антигену Ф1 чумного микроба.

Полученные данные об однотипности митоген- и антигенинду цированной продукции IFN- как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей, дают основание считать возможным использование параметров митоген индуцированной продукции маркерного цитокина IFN- в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что препараты капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, в дозе 100 мкг не оказывают токсического действия и не вызывают по данным проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммунокомпетентных клеток по типу апоптоза. Капсульный антиген, полученный из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, по своей протективной активности значительно эффективнее (в 3 раза) препаратов капсульного антигена, выделенных из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.

2. Выявленные особенности экспрессии иРНК TLR2, TLR4 в клетках врожденного (перитонеальные макрофаги) и адаптивного (спленоциты) иммунитета биомоделей в ответ на введение штаммов Y. pestis с различной генетической характеристикой, вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида, а также антигенов чумного и туляремийного микробов (капсульный антиген из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективный антигенный комплекс туляремийного микроба различных подвидов), по уровню и кинетике зависят от вводимого антигена и вида возбудителя, из которого он был выделен.

3. Рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277, полученный из него препарат капсульного антигена Ф1, а также химическая чумная вакцина, в отличие от вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и выделенных из него препаратов Ф1, индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 и IFN- уже в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

4. В ответ на введение экспериментальным биомоделям препарата протективного антигенного комплекса (ПАК) из вакцинного штамма голарктического подвида F. tularensis 15 НИИЭГ, зарегистрировано повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Напротив, препараты протективных антигенных комплексов, выделенные из вирулентного штамма голарктического (F. tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцировали усиление экспрессии только TLR2 в сочетании с IFN-. Препарат протективного антигенного комплекса, полученный из штамма F. tularensis A'Cole неарктического подвида, не вызывал изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.

Выявлены отличия уровней экспрессии иРНК TLR2 и TLR 5.

лейкоцитами периферической крови у людей, вакцинированных живой чумной и живой туляремийной вакцинами. Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации против чумы и туляремии транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в мононуклеарных клетках введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводило к исчезновению детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как гранулоцитами, так и мононуклеарными клетками вакцинированных доноров.

6. Результаты проведенной сравнительной оценки спонтанной, митоген- и антигениндуцированной продукции IFN- и IL-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной свидетельствуют о преимущественном развитии Th1-зависимого иммунного ответа организма людей. Выявленная однотипность митоген- и антигениндуцированной продукции IFN- как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей дают основание считать возможным использование параметров индуцированной лигандом TLR2 Т-клеточным митогеном конканавалином А продукции маркерного цитокина IFN- в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации Щуковская Т.Н., Козлова Е.А.*, Саяпина Л.В., Барулина И.С., 1.

Майоров Н.В., Степанов А.В., Осина Н.А., Кутырев В.В. Экспрессия иРНК Toll-подобных рецепторов-2,4 лейкоцитами крови людей вакцинированных против чумы и туляремии//Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. – Волгоград, 2008.

– С. 156 – 157.

Щуковская Т.Н., Козлова Е.А.*, Саяпина Л.В.. Осина Н.А., Попова 2.

П.Ю., Кутырев В.В. Оптимизация экстренной и специфической профилактики особо опасных инфекций: новые перспективы// Вакцинология 2008.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ.

конф. – Москва, 2008. – С. 129.

Саяпина Л.В., Барулина И.С., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., 3.

Козлова Е.А.*, Бессонова О.Л. Цитофлуориметрический мониторинг реактивности лейкоцитов крови людей вакцинированных туляремийной вакциной, индуцированных тулярином и Кон А. //Вакцинология 2008.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ.

конф. – Москва, 2008. – С. 109.

Щуковская Т.Н., Смолькова Е.А., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н.

4.

Митоген-индуцированная продукция IFN и IL-4 в культуре цельной крови людей в различные сроки после вакцинации живой чумной вакциной// Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: Матер.

междунар. конф./ Под ред. А.Б. Жебруна. – СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010. – С. 42.

Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., 5.

Волох О.А., Никифоров А.К. Апоптоз и пролиферативная активность иммунокомпетентных клеток биомоделей при иммунизации С-комплексом туляремийного микроба различных подвидов// Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения стран-участников СНГ: Матер. Х Межгосуд. науч.-практ. конфер. государств-участников СНГ. – Ставрополь, 2010. – С. 269–270.

Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова 6.

Е.М., Волох О.А., Никифоров А.К. ДНК-цитометрия иммунокомпетентных клеток биомоделей в условиях иммунизации препаратами «С»-комплекса туляремийного микроба различных подвидов// Проблемы особо опасных инфекций. – 2011. – Вып. 1 (107). – С. 74–76.

Кузнецова Е.М., Волох О.А., Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., 7.

Шепелёв И.А., Авдеева Н.Г., Кравцов А.Л., Никифоров А.К.

Иммунобиологические свойства антигенных комплексов туляремийного микроба// Проблемы особо опасных инфекций. – 2011. – Вып. 3 (109). – С.

46–49.

Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Смолькова Е.А.

8.

Применение проточной цитометрии при разработке вакцин против особо опасных инфекций: современные достижения и перспективы//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2011. – Вып. (59). – С. 53 – 60.

Щуковская Т.Н., Смолькова Е.А., Шмелькова Т.П., Клюева 9.

С.Н., Бугоркова С.А. Индуцированная продукция IFN- и IL-4 как показатель функциональной активности Th1- и Th2-клеток у вакцинированных против чумы людей// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2011. – Вып. 6 (61). – С. 78 – 83.

*- фамилия автора Козлова Е.А. изменена на Смолькову Е.А.