Фибриллогенез бета2-микроглобулина и иммунологические изменения при гемодиализном амилоидозе
На правах рукописи
ПОЛЯКОВ
Дмитрий Степанович
ФИБРИЛЛОГЕНЕЗ БЕТА2-МИКРОГЛОБУЛИНА
И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ
ГЕМОДИАЛИЗНОМ АМИЛОИДОЗЕ
03.01.04 – Биохимия
14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург
2011 г.
Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук и в Научно-методическом центре по молекулярной медицине Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" Росздрава.
Научные руководители:
Д.м.н., проф. Михаил Михайлович Шавловский Д.м.н., проф. Арег Артемович Тотолян
Официальные оппоненты:
Академик РАМН, д.м.н., проф. Олег Иванович Киселев Д.м.н., проф. Андрей Семенович Симбирцев Ведущее научное учреждение:
Санкт-Петербургский государственный университет.
Защита состоится 26 мая 2011 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 по защите докторских и кандидатских диссертаций при НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: Санкт-Перербург, 197376, Каменноостровский проспект, дом 69/71.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: Санкт-Перербург, 197376, ул. Академика Павлова, 12.
Автореферат разослан « » 2011 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор биологических наук, проф. Л.В. Пучкова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Терминальная стадия хронической почечной недостаточности - тяжелое, угрожающее жизни состояние, требующее замещения утраченной почечной функции. Актуальность проблемы замещения функции почек обусловлена значительным увеличением числа таких больных во всем мире.
Во второй половине 20 века в связи с разработкой новых технологий появилась возможность продления жизни больным, страдающим тяжелыми заболеваниями почек. Введение в практику процедур очистки крови при помощи диализа позволяет больным, которые прежде неизбежно погибали, относительно комфортно жить в течение десятилетий. Однако вскоре после введения в практику гемодиализного лечения было обнаружено, что у части больных развивается особая форма амилоидоза, так называемый гемодиализный амилоидоз, или 2 микроглобулиновый амилоидоз (A2M). Он носит вторичный характер и его условием служит повышение концентрации в плазме крови особого белка – 2 микроглобулина (2M). Нарушение почечного катаболизма 2M является причиной многократного возрастания содержания белка в плазме крови.
Клинически A2M сопровождается снижением качества жизни больных, и для купирования симптомов амилоидоза приходится прибегать даже к хирургическому лечению. Диагностика A2M затруднена, терапия мало эффективна. До сих пор остаются недостаточно исследованными молекулярные основы патогенеза A2M.
Гемодиализ – пример инвазивной терапии. Так как эта процедура проводится у больных с почечной недостаточностью, то необходимо четко представлять вклад основного заболевания и проводимых лечебных мероприятий в развитие ответных реакций в первую очередь со стороны иммунной системы.
Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не решены многие фундаментальные проблемы развития амилоидозов вообще и A2M в частности.
В основе патогенеза амилоидозов лежит аномальный фибриллогенез конкретного белка, который обусловлен действием совокупности внешних и внутренних факторов. Выяснение роли этих факторов и их относительного вклада позволит не только понять причины патологии, но и будет способствовать разработке эффективных способов лечения этих достаточно тяжелых заболеваний.
Цель исследования Целью настоящего исследования являлось выяснение особенностей фибриллогенеза 2M и молекулярных основ гемодиализного амилоидоза, а также роли иммунных факторов в патогенезе этого заболевания Задачи исследования 1. Получить в очищенном состоянии природный 2M человека и поликлональные антитела к этому белку.
2. Создать генетическую конструкцию для синтеза нативного рекомбинантного 2M человека в бактериальной системе.
3. Создать генетическую конструкцию для синтеза в бактериальной культуре рекомбинантного белка слияния, состоящего из 2M и зеленого флуоресцентного белка.
4. Создать генетические конструкции для синтеза укороченных рекомбинантных 2M, накапливающихся в клетках в виде телец включения.
5. Получить в очищенном состоянии и изучить свойства, в том числе фибриллогенность, рекомбинантных бета-2микроглобулинов и белка слияния.
6. Изучить имунногенность фибрилл, образованных из 2M человека.
7. Определить содержание цитокинов в плазме крови больных, получающих процедуры гемодиализа на протяжении различных сроков.
Научная новизна полученных результатов Предложен новый способ препаративного выделения 2M из диализата плазмы крови больных, получаемого во время лечебной процедуры гемодиафильтрации.
Создана экспрессионная генетическая конструкция, содержащая ген полноразмерного 2M человека. Введенная в структуру гена полинуклеотидная последовательность, которая кодирует лидерный пептид, направляющий синтезируемый белок в периплазму, позволяет получать нативный 2M без образования телец включения. Таким образом, исключаются стадии денатурации и ренатурации, необходимые для извлечения белка из телец включения. Благодаря введенной последовательности из пяти гистидинов на С-конце, синтезируемый в E.coli 2M может быть эффективно и просто очищен на никель-хелатном агарозном сорбенте. Впервые показано, что полученный таким образом белок способен образовывать амилоидные фибриллы, сходные с амилоидными фибриллами, полученными из природного 2M.
Получены генетические конструкции, кодирующие укороченные с N-конца варианты 2M. Показана фибриллогенность и склонность к образованию олигомеров укороченных на 6 и 10 аминокислотных остатков рекомбинантных 2M. Рекомбинантный вариант без 10 аминокислотных остатков получен и охарактеризован впервые.
Впервые создана экспрессионная генетическая конструкция для синтеза в E.coli белка слияния 2M человека с зеленым флуоресцентным белком. Показано, что получаемый белок слияния 2MSF, с одной стороны, обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному GFP, с другой стороны, 2МSF способен образовывать фибриллы, не теряя при этом своих флуоресцентных свойств.
Впервые продемонстрировано, что фибриллы 2M, сформированные как при pH 2,0, так и при pH 7,4, прикрепляются к нитроцеллюлозному фильтру и не деполимеризуются во время стандартной процедуры Dot-BLOT (то есть при слабощелочных pH). При помощи таких фильтров показано, что IgG кролика неспецифически связываются с фибриллами 2M.
Показано, что при гемодиализе у пациентов по мере увеличения сроков терапии возрастает содержание IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN- и TNF- в плазме крови. В то же время содержание IL-10 на начальных этапах гемодиализа возрастает, и далее снижается, достигая нормальных значений.
Научно-практическое значение полученных результатов.
Результаты исследования имеют теоретическое значение, так как вносят вклад в понимание молекулярных и иммунологических механизмов патогенеза гемодиализного амилоидоза, а также других амилоидозов.
Для изучения фибриллогенеза и поиска веществ, ингибирующих данный процесс или способствующих ему, необходимо иметь десятки миллиграммов очищенного 2M. Созданные нами экспрессионные генетические конструкции синтезируют рекомбинантные 2M человека, как полноразмерный, так и его укороченные формы, встречающиеся у больных A2M. Благодаря введенным полигистидиновым последовательностям, созданные рекомбинантные 2M можно получить в необходимых количествах и относительно быстро и эффективно очищать. Для всех полученных белков показана способность к образованию амилоидных фибрилл, что позволяет предложить эти белки в качестве удобных моделей для изучения фибриллогенеза 2M.
Обнаружение факта неспецифического связывания фибрилл 2M человека с IgG кролика, на наш взгляд, имеет научно-практическую значимость, так как этот эффект следует учитывать при дальнейшем изучении гуморального иммунного ответа на фибриллы 2M. Если существует такое же связывание IgG человека с амилоидными фиблиллами 2M, то это может иметь важное значение в понимании патогенеза A2M, а также в подходах к малоинвазивной диагностике данного заболевания. Кроме того, данный факт следует иметь в виду и при разработке таких иммунологических методов диагностики A2M, в которых фибриллы 2M будут использоваться в качестве антигена.
Созданный нами рекомбинантный белок слияния 2M и зеленого флуоресцентного белка может быть использован для визуализации промежуточных стадий фибриллогенеза, а также для исследования внутриклеточной локализации как зрелых фибрилл, так и префибриллярных структур.
Результаты, полученные при изучении содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе, позволяют утверждать, что IL-10 и IL-6 могут служить маркерами клинического течения 2-микроглобулинового амилоидоза.
Представленные данные могут быть использованы для образовательных целей на кафедрах высших учебных заведений в курсах лекций по биохимии, молекулярной биологии и иммунологии.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Предложен эффективный способ препаративного выделения 2M из гемодиафильтрационного диализата плазмы крови больных, который позволяет получать очищенный 2M человека в нативном состоянии.
2. Показано, что созданные экспрессионные генетические конструкции для синтеза в бактериальной культуре позволяют получать нативный полноразмерный рекомбинантный 2M человека, рекомбинантный белок слияния (состоящий из 2M и зеленого флуоресцентного белка), а также укороченные варианты 2M (без шести и десяти N-концевых аминокислот).
3. Установлено, что все полученные рекомбинантные белки обладают способностью к фибриллогенезу. Для укороченных вариантов 2M, кроме того, показана склонность к олигомеризации.
4. Показано, что белок слияния 2MSF обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному GFP, но при этом способен образовывать фибриллы в условиях фибриллогенеза, описанных для 2M.
4. Выявлено, что иммуноглобулины класса G кролика неспецифически связываются с фибриллами, сформированными из 2M человека.
5. Показано, что с увеличением срока, в течение которого больные подвергались процедуре хронического диализа, уровни IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN- и TNF- в плазме крови увеличивались. При этом содержание IL-10 понижалось после трех лет диализа до уровня, статистически не различающегося с нормой.
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: III международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009», 13 международная Пущинская школа-конференция «Биология – наука 21 века» (28 сентября – октября, 2009, Пущино), 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 19 – 23 апреля года), 7 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010», 15-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 18 – 22 апреля 2011 года).
Внедрение результатов работы Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процессы отдела молекулярной генетики ГУ Научно исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул.Ак.Павлова, 12);
кафедры медицинской биологии и генетики ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Россия, 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).
Личный вклад автора в проведение исследования Лично соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях;
создание и проверка экспрессионных генетических конструкций, выделение и очистка белков, используемых в работе, получение фибрилл;
приготовление препаратов для флуоресцентного анализа, MALDI-TOF и ДНК-секвенировния также были выполнены соискателем. Кроме того, соискатель подготавливал образцы плазмы крови больных на гемодиализе и принимал участие в определении в них содержания цитокинов (совместно со старшим научным сотрудником НМЦММ на базе СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова, к.м.н. К.А.Сысоевым), проводил статистическую обработку полученных результатов. Электронная микроскопия и исследование оптических свойств 2M и его производных, в частности фибриллярных форм, проводились совместно с сотрудниками Лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков НИИ цитологии РАН.
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 09-04 00788), программы “Ведущие научные школы РФ” (НШ-1961.2008.4) и Минобрнауки (ГК от 09.03.2010 №_02_740_11_ 5141).
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав и списка литературы, в котором приведено 217 источника, в том числе 7 работ на русском языке и 210 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 23 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение 2M из ультрафильтрата плазмы больных, находящихся на хроническом гемодиализе. Концентрацию диализата осуществляли при помощи ультрафильтрации, используя мембраны с порами, проницаемыми для соединений с молекулярной массой кДа (Hollow fiber cartridge, “Amicon”). Далее концентрат подвергали ультрафильтрации на мембране, проницаемой для белков с молекулярной массой 30 кДа. При необходимости, дальнейшую концентрацию с одновременной заменой буфера осуществляли на центрифужном фильтре с порами, проницаемыми для белков с молекулярной массой 5 кДа (Lot.: 2173558, “Sigma”).
Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле осуществляли в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) (Laemmli et al. 1970) 99 см при градиенте напряжения 20 В/см.
Идентификация выделенного белка методом MALDI-TOF. Выделенный из диализата больного 2M подвергали электрофорезу и исследовали методом MALDI-TOF.
Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com).
Получение поликлональных антител кролика к 2M человека. Иммунизацию кроликов осуществляли фрагментом ПААГ, содержащим 100 мкг нативного 2M, по стандартной схеме (Харбоу и др. 1977). Забор крови осуществляли на 10-ый день после последней иммунизации. Фракцию IgG получали методом высаливания сульфатом аммония (Брок и др.
1987). Аналогично проводили иммунизацию кроликов фибриллами 2M, но вводили внутрикожно не фрагмент ПААГ, а PBS, содержащий 100 мкг фибрилл 2M.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл. В состав реакционной смеси входили праймеры (по 10 пМоль), буфер для Taq-полимеразы x1, 6 нМ dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 50 нМ MgCl2, 1 единица Taq полимеразы. ПЦР проводилась в пробирках объемом 0.6 мл на аппарате «Терцик» (Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР. Температурный профиль ПЦР: 5 минут 95°С – 1 цикл;
1 минута 95°С, 1 минута 56°С, 1 минута 72°С – 30 циклов, минут 72°С – 1 цикл.
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% ПААГ, электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле, окрашивание ПААГ бромистым этидием, окрашивание ПААГ нитратом серебра проводились по стандартным методикам.
Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора WizardSV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США) согласно инструкции производителя.
Получение компетентных клеток E. coli. Бактерии E.coli выращивали в LB среде в стерильном флаконе, содержащем LB-среду, при 37°С при постоянном покачивании до OD600=0.3–0.4. Клетки осаждали центрифугированием, и осадок ресуспендировали в 0,1 М CaCl2, после чего инкубировали во льду в течение 20 минут. Полученные компетентные клетки E. coli использовали сразу или оставили на 1-3 дня во льду для дальнейшей трансформации.
Лигирование. Вставка ПЦР-продуктов в плазмиды осуществлялась при помощи лигазной реакции. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Лигирование проводили в течение 1-16 часов при температуре +4°С. Количество ПЦР-продукта для лигирования определялось из формулы: ПЦР-продукт (нг) = a*b*c/d, где a – количество плазмиды (нг), b – размер ПЦР-продукта (п.н.), с – молярное соотношение плазмиды и ПЦР продукта, d — размер плазмиды (п.н.). Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. На 1 реакцию брали 40 нг плазмиды.
Для трансформации компетентных клеток E. coli штамма DH5() или BL21(DE3), к компетентным клеткам добавили лигазную смесь или плазмидную ДНК и инкубировали во льду 15 мин. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали при 42°С 5 мин. и во льду 2 мин. Затем добавили среду LB и инкубировали 1 час при 37°С при постоянном покачивании, после чего высевали на чашки Петри, содержащие агаризованную LB-среду с ампицилином. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, отбирались для последующих исследований.
Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli. Культуру клеток E.coli культивировали ночь при 37°С в LB среде с ампициллином. Клетки осаждали центрифугированием, к осадку добавляли 50 мМ глюкозу, 25 мМ TrisHCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, затем ресуспендировали. Добавляли 0.2Н NaOH, 1% SDS, перемешивали в течение 5 минут.
Добавляли 5М CH3COOK, 11.5% CH3COOH, несколько раз переворачивали пробирку. Затем инкубировали во льду 5 минут и центрифугировали. К супернатанту добавляли изопропиловый спирт, инкубировали при -20°С. После центрифугирования сливали спирт и растворяли осадок в воде. Добавляли РНКазу и нкубировали пробу на водяной бане при 37°С. Дальнейшее выделение ДНК представляло собой стандартную фенол-хлороформную экстракцию. Качество и примерную концентрацию выделенной плазмидной ДНК проверяли электрофоретическим разделением в 0.8% агарозном геле.
При создании экспрессионной генетической конструкции pETb2m6.8 использовались праймеры 5’ctgtggccatccagcgtactccaa3’, 5’gtcaagcttatcagtgatggtga tggtgcatgtctcgatcccactt3’;
эндонуклеазы рестрикции MscI, HindIII;
плазмида pET22b(+) (Novagen). РНК человека из лейкоцитов здорового добровольца выделяли с помощью TRIzol® Reagent по прилагающимся инструкциям фирмы «Invitrogen» (США). Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью MLV-обратной транскриптазы «АмплиСенс» (Россия) по прилагающимся протоколам. Реакцию рестрикции проводили по стандартной методике с использованием эндонуклеаз рестрикции и по прилагающимся инструкциям фирмы «Fermentas» (Литва).
При создании экспрессионных генетических конструкций pETb2m1.1, pETb2m2.1. в качестве матрицы для ПЦР использовалась плазмида pETb2m6.8. В случае pETb2m1.1, прямой праймер 5’ catatgattcaggtttactcacgt 3’ во фланкирующей части (выделена жирным шрифтом) содержал сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции NdeI (подчеркнут). Для вектора pETb2m2.1 прямой праймер имел следующее строение: 5’ ctgcatatgtcacgtcatccagcaga 3’.
При создании экспрессионной генетической конструкции pTRCb2msf были подобраны праймеры 5'-cagggtaccatccagcgtactccaa-3', 5'-cagggatcccatgtctcgatcccac-3' и эндонуклеазы рестрикции KpnI, BamHI.
Выделение и очистка рекомбинантных 2M осуществлялась из клеток E.coli штамма BL21(DE3), трансформированных соответствующими экспрессионными конструкциями.
Клетки E.coli росли в среде LB, содержащей ампициллин, синтез 2M индуцировали добавлением изопропил--D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Периплазматическую фракцию получали методом «осмотического шока» (Ausubel 1989). Для получения растворимой и нерастворимой внутриклеточной фракции бактериальные клетки отделяли от среды культивирования путем центрифугирования, к отмытому клеточному осадку добавляли PBS, 1 мМ PMSF, 10мМ имидазол и 5 мМ 2-меркаптоэтанол. Клетки разрушали ультразвуком, затем суспензию центрифугировали и супернатант отделяли от осадка.
Супернатант содержал растворимую внутриклеточную фракцию белков, а осадок – нерастворимую, в том числе тельца включения.
2M были аффинно очищены на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте (Invitrogen) (объем колонки 1.5 мл). Для этого к полученному содержимому бактерий добавляли фенилметилсульфонилфторид и имидазол (конечная концентрация 1 мМ и 10 мМ соответственно). (В случае выделения 2M из телец включения, они растворялись в 8 М мочевине.) Раствор фильтровали через металл-хелатный сорбент. Балластные белки отмывали, а целевой белок элюировали раствором, содержащим 200 мМ имидазол.
Содержащие 2M фракции анализировали при помощи электрофоретического разделения в 12 % ПААГ. Концентрацию 2M определяли спектрофотометрически, используя для полноразмерного 2M значение коэффициента экстинкции 280 = 1,63 мл*мг-1см-1.
Формирование фибрилл 2M. Для получения фибрилл природный и рекомбинантные 2M с конечной концентрацией 30 µM инкубировали в 150 или 200 мМ глицин-HCl буфере (рН=2,0) в течение 7 или 14 суток при 37оC при постоянном перемешивании (500 rpm) на термошейкере TS-100 (Biosan). Для получения фибрилл в физиологическом pH, был применен модифицированный метод Кихара и соавторов (Kihara et al., 2005). В качестве «затравки» фибриллогенеза добавляли 1/100 объёма готовых фибрилл той же концентрации, выращенных при рН=2,0 и стабилизированных 0,5 мМ SDS. Кроме того, фибриллы из 2M6 в физиологическом pH получали без стабилизации 0,5 мМ SDS.
Измерение флуоресценции комплексов тиофлавина Т с фибриллами проводили по модифицированному методу (LeVine et al., 1993): 10 мкл раствора фибрилл добавляли к мкл буфера, содержащего 0,15 М NaCl, 25 мМ Na-фосфат, 6 µМ Тиофлавин Т (ThT), рН=7,4.
Пробу тщательно перемешивали, затем инкубировали 5 минут при комнатной температуре и переносили в кювету. Регистрацию спектров флуоресценции проводили с помощью спектрофлуориметра AVANTES AvaSpec-2048 (Источник света AvaLight-LED, 460 нм). Для исключения сигнала, поступающего на регистрирующее устройство спектрофлуориметра вследствие рассеяния излучения, применяли фильтр, отсекающий часть спектра с длиной волны менее 460 нм. В качестве нулевой пробы использовали мономер 2M в той же концентрации.
Полусухой Western-BLOT белков проводили по стандартной методике (Anderson et al., 1982). «Перенос» осуществлялся 1 час при постоянном токе 100 mА. «Окраску»
нитроцеллюлозного фильтра (НЦФ) или PVDF-мембраны осуществляли кроличьими поликлональными антителами к GFP, 2M или фибриллам 2M. Вторыми антителами являлись конъюгированные с пероксидазой хрена IgG козы против IgG кролика («ICN», США).
Dot-BLOT. На НЦФ наносили по 1 мкл антигена. «Окраску» НЦФ осуществляли как при Western-BLOT.
Исследование содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе. В исследование было включено 86 пациентов с терминальной стадией ХПН, получающих постоянное лечение в отделении диализа ГОУДПО СПбМАПО. Все больные получали гемодиализ или гемодиафильтрацию на высокопоточных либо высокоэффективных диализаторах с синтетической мембраной полисульфон. Процедура диализа осуществлялась трижды в неделю (два раза через день и один раз через два дня).
Образцы венозной крови брали у всех больных не ранее, чем через двое суток после последней процедуры гемодиализа. Взятие крови осуществлялось в стерильную пробирку с K3-EDTA, центрифугировали 10 минут при 5000 g, полученную плазму хранили при -200С до проведения анализов. Контрольную группу составили практически здоровые лица (n=13). Во всех образцах определяли IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-, TNF- при помощи X-MAP-технологии методом мультиплексного анализа белков на анализаторе BioPlex-100 (Bio-Rad, США) с использованием коммерческой тест-системы. Статистическое исследование проводили методами непараметрической статистики с помощью критерия Манна-Уитни для независимых признаков (сравнение групп между собой) и критерия Спирмана для выявления корреляции между различными признаками с применением компьютерных программ Statistica и MS Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение 2M из диализата больных на хроническом гемодиализе.
Для моделирования фибриллогенеза необходимы значительные количества очищенного 2M. Поэтому нами разработан способ препаративного получения 2M из диализата плазмы крови больных, получаемого во время процедуры on line гемодиафильтрации. В плазме крови таких больных концентрация 2M существенно выше нормы. При фильтрации крови через гемодиализные мембраны некоторые количества 2M поступают в фильтрат. В фильтрате содержание балластных белков гораздо меньше, чем в плазме крови, поэтому диализат может служить источником получения 2M. Для получения 2M диализная жидкость подвергалась ультрафильтрации через мембрану, проницаемую для веществ с молекулярной массой 5 кДа. При этом убирался большой объем воды и низкомолекулярные примеси. По данным электрофореза в 12% ПААГ с SDS в растворе после концентрирования присутствуют белки с молекулярной массой 2M, а также более крупные белки, в частности, альбумин (см. рис. 1А). Для идентификации зоны, соответствующей по молекулярной массе 2M, был осуществлен анализ методом MALDI-TOF. В результате было показано, что эта зона состоит из 2M. Стрелкой на рисунке 1А обозначен участок геля, вырезанный для анализа методом MALDI-TOF. Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Аминокислотная последовательность 2M человека:
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSD LSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM Жирным шрифтом выделены пептиды, идентифицированные при помощи масс спектрометрии в препаратах белка, подвергнутых трипсинолизу: K-IQVYSR-H, K-SNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLK-N, R.IEKVEHSDLSFSK.D, K.VEHSDLSFSK.D, R.VNHVTLSQPK.I, K.IVKWDR.D, K.IVKWDRDM., K.WDRDM, SNFLNCY VSGFHPSDIEVDLLK + DEYACR. Кроме того, нами было высчитано «в ручную»
соответствие пика с молекулярной массой 3250.4207Да двум пептидам:
NFLNCYVSGFHPSDIEVDLLK (2496.1922Да) и DEYACR (755.2908Да). В нативном 2M имеется дисульфидная связь между остатками цистеина 25 и 80.
Мы предположили, что данная дисульфидная связь останется стабильной после трипсинолиза. Для определения ожидаемой массы этих двух пептидов, объединенных дисульфидной связью, мы от суммы масс пептидов вычли массу двух атомов водорода. Полученная таким образом масса 3249.4903Да соответствует одному из пиков пептидного фингерпринта 2M.
Таким образом, масс-спектрометрический анализ показал, что быстро мигрирующий компонент с кажущейся молекулярной массой около 12 кДа представляет собой 2M. Для дополнительной очистки концентрат после первой ультрафильтрации дополнительно фильтровали через мембрану, проницаемую для белков с молекулярной массой 30 кДа. На электрофореграмме (рисунок 1А) видно, что полученный 2M мигрирует в виде одной зоны (12 кДа). Выход белка зависит от исходного содержания в диализате, в среднем из 1 литра диализной жидкости можно получить до 1 мг 2M. Так как в ходе выделения каких-либо денатурирующих воздействий не применялось, мы предположили, что нами получен 2M в той конформации, в которой он присутствовал в плазме крови пациентов во время диализа.
Полноразмерный 2M сам по себе не образует фибрилл в водном растворе при физиологических pH. Было показано, что 2M при pH=7,0 даже в концентрациях, превышающих сывороточное содержание 2M у диализных пациентов в тысячи раз (McParland et al., 2000), не образует фибрилл. При закислении среды можно добиться спонтанного (т.е. без затравки) фибриллогенеза. Благодаря удобству и воспроизводимости, этот метод применяется наиболее часто для получения амилоидных фибрилл in vitro (McParland et al., 2000, Radford et al., 2005, Stoppini et al., 2005). Для формирования фибрилл необходимо появление ненативных конформеров 2M (Radford et al., 2005).
На рисунке 2А представлены данные электронной микроскопии фибрилл из полученного нами 2M. Видны характерные фибриллярные структуры. Наличие фибрилл в таких препаратах подтверждается и данными анализа флуоресценции ThT в комплексе с 2M. ThT применяется для количественной и качественной детекции амилоидных фибрилл (LeVine et al., 1993, McParland et al., 2000, Radford et al., 2005). В образцах, содержащих фибриллы, мы наблюдали резкое возрастание флуоресценции по сравнению с контролем – раствором мономера 2M, содержащего ту же концентрацию ThT (рисунок 4). Природный 2M использовался для получения антител, для изучения фибриллогенеза, а также в качестве реперного белка при создании генетических конструкций для синтеза рекомбинантных 2M.
Получение рекомбинантного полноразмерного 2M человека.
Получение достаточных количеств природного 2M требует много времени.
Работа с биологическими жидкостями сопряжена с возможностью инфицирования персонала. Поэтому для дальнейшей работы было решено создать экспрессионную генетическую конструкцию для получения рекомбинантного 2M человека. Рекомбинантные аналоги природных белков могут быть получены в больших количествах. Кроме того, генная инженерия позволяет вносить любые модификации в целевой белок с последующим анализом влияния этих модификаций на его свойства. Мы получили кДНК 2M человека, и на основе кДНК создали серию плазмид с различными модификациями кДНК.
Рекомбинантные 2M обычно формируют тела включения (Chiba et al., 2003, Esposito et al., 2000, Kihara et al., 2005, McParland et al., 2000). Извлечение белка из телец включения требует применения сильных детергентов и последующей стадии рефолдинга. Однако ренатурация происходит не всегда, и не может быть уверенности, что в дальнейшей работе используется белок в нативной конформации (Ventura et al., 2006).
Для получения растворимого рекомбинантного полноразмерного 2M нами была создана конструкция pETb2m6.8 на основе коммерческой плазмиды pET22b(+). кДНК 2M человека получали из тотальной РНК лейкоцитов при помощи обратной транскрипции. Далее осуществляли ПЦР с праймерами, позволяющими встроить продукт ПЦР в соответствующую плазмиду. Таким образом, был получен ПЦР-продукт, содержащий сайт рестрикции MscI на 5’ конце, последовательность, кодирующую полноразмерный 2M человека, а также полигистидиновую последовательность, стоп-кодон и сайт рестрикции HindIII на 3’ конце. Полученный ПЦР-продукт был вставлен в плазмиду. Плазмидная ДНК отобранных клонов была просеквенирована. Одна из плазмид содержала последовательность, кодирующую PelB «лидерный пептид», последовательность 2M, а также полигистидиновую последовательность. Все указанные последовательности находились в одной рамке считывания. Эту плазмиду мы обозначили как «pETb2m6.8».
Рекомбинантный 2M получали из клеток E.coli штамма BL21(DE3), трансформированных созданной нами плазмидой pETb2m6.8. Мы сконструировали вектор таким образом, чтобы 2M синтезировался вместе с бактериальным PelB «лидерным пептидом», транспортирующим белок в периплазматическое пространство бактерии, и впоследствии отщепляющимся под воздействием бактериальной протеазы. Это позволяет получить 2M, не содержащий дополнительного метионина на N-конце и начинающийся сразу с изолейцина, первой аминокислоты 2M человека. Как и ожидалось, в периплазме был обнаружен растворимый 2M. Включение в вектор полигистидиновой последовательности на С-конце дает возможность весьма эффективно и быстро очистить белок на никель-агарозном сорбенте. Экстракция периплазматической фракции позволяет получить раствор, содержащий целевой белок и до 30% балластных белковых примесей. Аффинная хроматография приводит к полной очистке 2M (Рис. 1Б).
По данным электронной микроскопии, рекомбинантный 2M в соответствующих условиях (см. материалы и методы) образует фибриллярные структуры. Наличие амилоидных фибрилл подтверждается и данными анализа флуоресценции ThT в комплексе с 2M (рисунок 4).
Создание генетических конструкций для синтеза укороченных 2M.
В литературе разными группами авторов описано, что в амилоидных отложениях всех исследованных больных A2M встречаются укороченные на первые 6 и 10 аминокислотных остатков варианты 2M. Авторы оценивают процентное содержание интактного 2М примерно в 70%, а содержание 2М с усеченным N-концом - в 30%. У здоровых людей, а также в биологических жидкостях больных A2M укороченных форм 2M не встречается. Это может свидетельствовать о возможном вовлечении данных вариантов 2M в патогенез A2M. Поэтому для дальнейшего моделирования фибриллогенеза мы решили использовать не только полноразмерный 2M, но и 2M без первых шести и десяти аминокислотных остатков. С этой целью мы создали соответствующие экспрессионные генетические конструкции: pETb2m1.1 для получения рекомбинантного 2M человека без первых шести аминокислот (2M6-1) и pETb2m2.1 для получения рекомбинантного 2M человека без первых десяти аминокислот (2M10-2).
Перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей 2M6, в плазмиде pETb2m1.1 нами был вставлен не бактериальный PelB лидерный пептид, а старт-кодон ATG. В результате белок, синтезируемый полученной экспрессионной генетической конструкцией, имел дополнительный метионин на N-конце. В обоих случаях синтезируемый белок формировал тельца включения. В растворимой фракции 2M не обнаруживался.
Очищенные белки в обоих случаях получали из телец включения, которые растворялись 8М мочевиной в присутствии -меркаптоэтанола, и подвергались хроматографической очистке на металл-хелатном никелевом сорбенте. Выход белка составлял 30-40 мг из 1 л бактериальной культуры. По данным электрофореза образцы содержали мономеры (11 кДа), димеры (23 кДа) и тримеры (34 кДа) 2М6. Кроме того, наблюдалась дополнительная зона, соответствующая молекулярной массе около 25 кДа. Диметры и тримеры образованы из мономеров за счет S-S связей. Комплекс, соответствующий дополнительной зоне, устойчив к восстановлению S-S связей при помощи меркаптоэтанола (рисунок 1В, 1Г). Это может свидетельствовать о наличии не дисульфидных ковалентных взаимодействий, участвующих в образовании данного комплекса.
Как и полноразмерные 2M, полученные укороченные 2M6-1 и 2M10 2 в тех же условиях фибриллогенеза образуют амилоидные фибриллы. Наличие амилоидных фибрилл подтверждается и данными анализа флуоресценции ThT (рисунок 4). В образцах, содержащих амилоидные фибриллы, мы наблюдали возрастание флуоресценции по сравнению с контролем.
Оптические свойства исходных мономера 2M и фибриллярных форм белка.
Спектры поглощения растворов природного и рекомбинантного 2M, а также их фибрилл характеризуется максимумом при 278 нм и не различаются по форме.
Фибриллы, сформированные из полноразмерных 2M, обладают наименьшей интенсивностью собственной триптофановой флуоресценции, фибриллы, сформированные из 2M 6-1, — наивысшей. Спектры флуоресценции фибрилл полноразмерных 2M имеют максимумы при 337 нм (как и мономерный 2M). Спектры флуоресценции фибрилл, сформированных из 2M6-1 2M10-2, – при 342 и 348 нм соответственно. Эти отличия объясняются в первую очередь конформационными особенностями упаковки белка в фибриллах, а также аминокислотными отличиями. В любом случае можно говорить о некоторых отличиях вторичной структуры фибрилл, образующихся из рекомбинантных производных 2M.
Эти предположения подтверждаются результатами анализа при помощи КД-спектроскопии в области поглощения пептидных связей. Как и следует из литературных данных, мономерный 2M не содержит альфа-спиралей, бета структурированные участки составляют 40%. В то же время в препаратах фибрилл четко прослеживается изменение соотношения бета-структур и альфа спиральности (рис. 2). В отличие от исходного белка фибриллы содержат от 12 до 35% альфа-спиральных участков. Фибриллы, сформированные из 2M6-1 и 2M10-2, а также фибриллы, сформированные из 2M, выделенного из плазмы крови больных, содержат ~20% -структуры. Фибриллы, сформированные из рекомбинантного полноразмерного 2M, содержат ~13% -структуры. Эти результаты, прежде всего, указывают на частичное преобразование бета-структур в альфа-спирали. Мы, к сожалению, не можем утверждать, что все молекулы 2M и его производных участвуют в образовании фибрилл. Однако изменение вторичной структуры в препаратах указывает на то, что, по крайней мере, олигомерные формы в условиях фибриллогенеза содержат ощутимые количества альфа-спиралей.
Связывание ThT с фибриллами, сформированными разными белками, сопровождается резким возрастанием квантового выхода флуоресценции (Levine 1993). При связывании ThT с фибриллами регистрировался сдвиг максимума с 412 нм (свободный ThT) до 430 на (связавшийся краситель) и возрастал коэффициент молярной экстинкции. Полученные результаты указывают на существенные изменения конформации красителя при его включении с структуру фибрилл. В то же время по уровню возрастания флуоресценции ThT фибриллы 2M сходны с таковыми транстирета. В обоих случаях возрастание флуоресценции при связывании красителя не превышает 13 - 30 раз по сравнению с мономерными формами белков (для фибрилл инсулина эта величина составляет 670 раз). Для исследования причин относительно слабого эффекта возрастания флуоресценции красителя при связывании с фибриллами этих белков были получены спектры возбуждения и спектры эмиссии для разных препаратов 2M и их фибриллярных форм.
Встраивание ThT в фибриллы сопровождается небольшим сдвигом спектра флуоресценции в длинноволновую область. Наиболее длинноволновым является спектр раствора ThT + фибриллы, сформированные из рекомбинантного полноразмерного 2M (max=485 нм). Полученные спектры флуоресценции существенно различаются по интенсивности. Оказалось, что интенсивность флуоресценции раствора ThT + 2M ~ в 20 раз превышает интенсивность флуоресценции свободного красителя в буферном растворе. Можно предположить, что это связывание происходит благодаря высокому содержанию в молекуле 2M -структур (~40%). Интенсивность флуоресценции ThT + фибриллы, сформированные из 2M 6-1 (наиболее интенсивно флуоресцирующего раствора) ~ в 150 раз превышает интенсивность флуоресценции свободного красителя в буферном растворе.
Таким образом, наши исследования подтверждают относительно слабое возрастание флуоресценции при связывании красителя с фибриллами. При этом видно, что укороченные формы различаются по способности фиксировать ThT в структуре фибрилл с усилением его флуоресцентных свойств. Не исключено, что это каким-то образом связано с равновесием между фибриллами и низкомолекулярными формами производных 2M.
А Б В Г Рисунок 1. Электрофоретическое разделение белков в 12% ПААГ.
А, Б, В - окраска Кумасси R-250. 1 – маркер молекулярного веса (Fermentas).
Снизу вверх: 11 кДа, 17 кДа, 28 кДа, 36 кДа, 55 кДа, 72 кДа, 95 кДа, 130 кДа. А: – 2M, выделенный из диализата больных на гемодиализе. 3-концентрат диализата больного, длительное время находящегося на гемодиализе. Б: 2 – рекомбинантный 2M. 3 – 2M выделенный из ультра-фильтрата плазмы больных на гемодиализе. В: 2M6-1 после очистки на никель-агарозной колонке. Г:
«перенос» на НЦФ методом Western-BLOT. Дорожка 3: 2M6-1 после прогревания в додецилсульфате, не содержащем -меркаптоэтанола. Дорожка 3:
2M6-1 после прогревания в SDS, содержащем 2% -меркаптоэтанола.
А Б Рисунок 2. А: электронная микроскопия фибрилл 2M. Б: электронная микроскопия фибрилл 2MSF. Шкала в правом нижнем углу = 100 нм.
Рисунок 3. Спектры кругового дихроизма в дальнем УФ (на 1 а.к.
остаток). На оси абсцисс длина волны в нм.
1– мономер 2M;
2 – фибриллы из 2M10-2;
3 – фибриллы из 2M 6-1;
4 – фибриллы из 2M, выделенного из плазмы крови больных на хроническом гемодиализе;
5 – фибриллы рекомбинантного полноразмерного 2M.
Рисунок 4. Спектры эмиссии комплексов тиофлавина Т с препаратами 2M.
Возбуждение при двух длинах волн: А – 435 нм, Б – 340 нм. На оси абсцисс длина волны в нм, на оси ординат относительная флуоресценция. 1 – фибриллы из 2M 6-1;
2 – фибриллы из 2M, выделенного из плазмы крови больных на хроническом гемодиализе;
3 – фибриллы из рекомбинантного полноразмерного 2M;
4 – фибриллы 2M10-2;
5 – мономер 2M.
А Б В Рисунок 5. А, Б: электрофорез в неденатурирующих условиях. А: ПААГ без окраски. Б: Окраска Кумасси R-250. 2, 3, 5, 6 – белок слияния 2МSF. 1, 4 – контрольный белок sfGFP. В: конфокальная лазерная сканирующая микроскопия препарата 2МSF, содержащего фибриллярные структуры.
Содержание цитокинов в плазме крови: Достоверность медиана (первый квартиль – третий различий Цитокины квартиль) больных и контрольной группы (p) Больные на Контрольная группа хроническом (практически гемодиализе, n=86 здоровые), n= IL-2, pg/mL 3,075 (2,4-3,6) 0 (0-0) 0,000 * IL-4, pg/mL 0,46 (0,4-0,48) 0,04 (0-0,28) 0,001 * IL-6, pg/mL 0,26 (1-1,9) 0 (0-0) 0,002 * IL-8, pg/mL 1,98 (1,11-3,82) 1,003 (0,146-1,35) 0,001 * IL-10, pg/mL 0,19 (0,06-0,39) 0,013 (0-0,207) 0,034 * GM-CSF, pg/mL 9,39 (8,04-10,385) 0 (0-0) 0,000 * IFN- pg/mL 20,52 (18,24-23,94) 0 (0-0) 0,000 * TNF- pg/mL 9,9 (8,8-11,55) 0,09 (0-0,3) 0,000 * * достоверность различий между сравниваемыми группами p0, Таблица 1. Сравнение содержания цитокинов в плазме крови больных, получавших процедуру хронического гемодиализа, и практически здоровых.
Содержание цитокинов в плазме крови: Достовер медиана (первый квартиль – третий ность различий Цитокины квартиль) больных и контрольной группы (p) Больные на Больные на стандартном гемодиафильтрации гемодиализе (n=31) (n=49) Il-2, pg/mL 2,775 (2,175-3,3) 3,075 (2,475-3,6) 0, IL-4, pg/mL 0,44 (0,4-0,48) 0,46 (0,44-0,48) 0, IL-6, pg/mL 0,34 (0-1,905) 0,11 (0-1,15) 0, IL-8, pg/mL 1,98 (1,16-3,715) 1,88 (0,84-3,82) 0, IL-10, pg/mL 0,21 (0,05-0,375) 0,17 (0,08-0,39) 0, GM-CSF, pg/mL 9,045 (7,37-9,548) 10,05 (8,04-11,39) 0,039 * IFN- pg/mL 20,52 (18,24-22,8) 20,52 (18,24-23,94) 0, TNF- pg/mL 9,9 (8,8-11,275) 9,9 (8,8-11,55) 0, * достоверность различий между сравниваемыми группами p0, Таблица 2. Сравнение содержания цитокинов в плазме крови больных, получавших процедуру стандартного гемодиализа и гемодиафильтрации.
цитокины Spearman R t(N-2) p L-2 -0,011115 -0,09817 0, IL-4 -0,068657 -0,60779 0, IL-6 -0,176199 -1,58088 0, IL-8 -0,112412 -0,99913 0, IL-10 -0,263575 -2,41316 0,01816* GM-CSF -0,088059 -0,78075 0, IFN- -0,060920 -0,53903 0, TNF- 0,093940 0,83334 0, * достоверность p0, Таблица 3. Корреляции между содержанием цитокинов в плазме крови и длительностью хронического гемодиализа.
цитокины Spearman R T (N-2) p IL-2 -0,070724 -0,48608 0, IL-4 -0,207708 -1,45572 0, IL-6 -0,350419 -2,56499 0,013571* IL-8 -0,058819 -0,40394 0, IL-10 -0,250010 -1,77020 0, GM-CSF -0,104820 -0,72259 0, IFN- -0,086459 -0,59496 0, TNF- 0,070909 0,48735 0, * достоверность p0, Таблица 4. Корреляции между содержанием цитокинов в плазме крови и длительностью хронического диализа у больных, получающих процедуру гемодиафильтрации.
Получение рекомбинантного белка слияния 2MSF.
Для изучения фибриллогенеза в основном применяются такие биофизические методы как флуоресцентная спектроскопия (взаимодействие фибрилл с различными флуоресцентными красителями), динамическое светорассеяние, электронная и атомно-силовая микроскопия. Эти методы позволяют детально охарактеризовать строение фибрилл, сорбированных на «подложках», или детектировать наличие и определять размер фибрилл в растворе, однако они трудноприменимы для изучения кинетики реакции фибриллогенеза (образование промежуточных префибриллярных форм) и процесса формирования фибрилл in vivo. Поэтому в дополнение к вышеперечисленным методам представляется актуальным использовать конфокальную микроскопию для визуализации промежуточных стадий фибриллогенеза, а также для исследования внутриклеточной локализации как зрелых фибрилл, так и префибриллярных структур. Для этих целей могут быть использованы белки слияния исследуемого белка с superfolder GFP. В частности, нам представляется, что созданный нами модельный белок слияния 2МSF позволит в перспективе более детально изучить процесс фибриллогенеза.
Мы использовали плазмиду pTRC-99а, содержащую ген sfGFP, в качестве исходной, и осуществили вставку гена 2М между промотором и нуклеотидной последовательностью гена superfolder GFP. В результате нами была получена генетическая конструкция на основе плазмиды pTRC99a_P7, содержащая кДНК белка слияния 2МSF с гистидиновым «хвостом» (6-His-tag) из шести гистидинов.
Для этого нами были подобраны праймеры: прямой 5' cagggtaccatccagcgtactccaa - 3' включающий «кламп» - несколько нуклеотидов для препятствования образования праймерами димеров и лучшего «залипания» (cag), и начало последовательности 2M, содержащая сайт рестрикции KpnI (подчеркнут). Обратный праймер 5'- cagggatcccatgtctcgatcccac - 3' включающий «кламп» (cag), сайт для эндонуклеазы рестрикции BamHI ggatcc (подчеркнут) и конец последовательности 2M. Сайты выбирались с учетом рамки считывания плазмиды.
Продукт ПЦР был вставлен в плазмиду pTRC99a-P7 содержащую кДНК sfGFP. Компетентные клетки E.coli BL21(DE3) были трансформированы целевой плазмидой и нанесены на агарозную среду, содержащую ампициллин и IPTG.
Таким образом после культивирования мы добились индукции синтеза белка слияния прямо на чашках Петри. Для определения колоний (т.е. клонов), синтезирующих белок слияния 2MSF, мы наносили выращенные этим способом клетки на предметное стекло и с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии определяли в них флуоресценцию, свойственную GFP.
На рисунке 5А представлены результаты нативного электрофореза в 2МSF.
Также как и контрольный белок sfGFP, и флуоресцирующий в проходящем УФ свете, белок 2МSF обладает флуоресцентными свойствами. По данным SDS электрофореза, полученный белок слияния 2МSF (после восстановления меркаптоэтанолом и прогревания на кипящей водяной бане) имеет молекулярную массу около 40 кДа. При помощи Western-BLOT иммунологически показано наличие как 2М так и sfGFP в составе белка слияния 2МSF, и тем самым доказана правильность экспрессии гена и синтеза белка слияния в бактериальной системе.
Для получения фибриллярных структур белка слияния 2МSF был использован метод, описанный в работе (Kihara et al., 2005), с некоторыми модификациями. К раствору белка слияния 2МSF в исходной концентрации мг/мл (рН 7.0, 150мM Na-фосфатный буферный раствор), в качестве «затравки»
реакции фибриллогенеза, была добавлена 1/100 часть объема заранее приготовленных зрелых фибрилл рекомбинантного 2М. В результате этого эксперимента в растворе методом атомно-силовой и электронной микроскопии были зарегистрированы фибриллярные структуры (Рис. 2Б).
Для экспериментов с применением конфокальной микроскопии использовали те же препараты фибрилл 2МSF, что и для экспериментов по атомно-силовой микроскопии. Нами было замечено, что в растворах с значением рН меньше 5.0 sfGFP и белки слияния созданные на его основе теряют способность флуоресцировать. Поэтому фибриллярные структуры 2МSF мы получали при рН 7.0, с использованием «затравки» (необходимое условие фибриллогенеза 2М в таких условиях). При помощи лазерной сканирующей микроскопии нами были зарегистрированы флуоресцирующие структуры, представленные на рисунке 5Б. Разрешающей способности лазерной сканирующей микроскопии, по-видимому, не достаточно для регистрации отдельных фибрилл, поэтому, на наш взгляд, приведённые на микрофотографиях сетевидные флуоресцирующие структуры, это скопления фибрилл (и, возможно, агрегатов), так называемые «надфибриллярные» структуры.
Введение в белок слияния superfolder GFP позволяет, как указано в других исследованиях, исключить формирование телец включения и получать целевые белки в нативной конформации. В отделе молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН ранее проводились эксперименты по получению рекомбинантного белка слияния транстиретина и EGFP. Такая экспрессионная генетическая конструкция позволяла получить белок слияния транстиретина и EGFP, который полностью локализовался в тельцах включения и не обладал флуоресцентными свойствами, по-видимому, из-за нарушений фолдинга. В литературе (Pedelacq et al., 2006) описано получение белков слияния с superfolder GFP, причем отмечается, что, из за повышенной скорости сворачивания и улучшенных характеристик фолдинга superfolder GFP белки слияния, полученные на его основе, как правило, при синтезе в бактериальной системе не образуют телец включения. При этом аналогичные белки слияния с EGFP образуют нерастворимые тельца включения.
Мы предполагали, что superfolder GFP будет препятствовать формированию телец включения белка слимяния.
Таким образом, продемонстрирована возможность получения фибриллогенного белка слияния 2МSF. Белок синтезируются внутриклеточно в бактериальной системе, выделяется в растворимом виде и не образует телец включения. 2МSF, с одной стороны, обладает флуоресцентными свойствами, как и нативный superfolder GFP. С другой стороны, 2МSF способен образовывать фибриллы (по крайней мере, в описанных для 2М условиях фибриллогенеза при нейтральном pH), не теряя при этом своих флуоресцентных свойств.
Гуморальный иммунный ответ на фибриллы 2М.
Мы иммунизировали кроликов фибриллами, полученными из рекомбинантного 2М человека. Нас интересовал вопрос, содержат ли фибриллы 2М антигенные детерминанты, не свойственные мономерному 2М. Способ малоинвазивной лабораторной диагностики A2М, основанный на детекции таких антител, быть востребован. Кроме того, с фундаментальной точки зрения, не до конца ясна роль иммунных реакций в патогенезе как A2М, так и других амилоидозов.
Из сыворотки крови иммунизированных кроликов были выделены иммуноглобулины G. Фракция иммуноглобулинов была аффинно очищена от антител к мономерному 2M. Оставшиеся антитела использовались в дальнейших экспериментах, в частности, была проверена их аффинность к фибриллам 2M.
Как и ожидалось, полученные иммуноглобулины специфически реагировали с фибриллами 2M, но не реагировали с мономерным 2M. Для решения вопроса об аффинности полученных нами анти-ф2M антител к фибриллам, сформированными из других белков или пептидов, мы провели следующий эксперимент. На один НЦФ наносили одинаковое количество (по массе) фибрилл, сформированных из 2M при кислом и физиологическом pH, фибрилл другого происхождения, мономера 2M, мономера лизоцима, а также пятикратный избыток мономера 2M. Затем осуществляли стандартную процедуру Dot-BLOT с использованием очищенных анти-ф2M антител. В результате окрасились только те зоны НЦФ, на которые были нанесены фибриллы, сформированные из 2M при кислом и физиологическом pH. Это свидетельствует об отсутствии специфического реагирования с фибриллами другого происхождения. А тот факт, что места нанесения мономера 2M и его пятикратного избытка не окрасились, свидетельствует о достаточно полной «очистке» исходной кроличьей сыворотки от антител к нативному 2M.
Аналогично подготовленный НЦФ обрабатывали антителами к мономеру 2M. В результате окрасились те зоны НЦФ, на которые были нанесены фибриллы, сформированные из 2M при кислом и физиологическом pH, а также сам мономер 2M. К нашему удивлению, фибриллы 2M окрашивались заметно интенсивнее мономера той же концентрации и примерно с одинаковой интенсивностью с пятикратным избытком мономера. Такой результат повторялся и при кратных разведениях обоих антигенов.
Мы сочли нужным провести контрольный эксперимент для оценки возможности неспецифического взаимодействия фибрилл 2M с иммуноглобулинами класса G. На НЦФ нанесли различные разведения фибрилл рекомбинантного 2M и мономеров 2M, лизоцима, альбумина. Провели Dot BLOT. В качестве первых антител использовались разведения сывороток кроликов, не иммунизированных 2M или фибриллами. В результате окрасились области НЦФ, на которые были нанесены фибриллы 2M. Эти результаты воспроизводились в нашей лаборатории неоднократно. Скорее всего, их можно объяснить неспецифическим связыванием кроличьих IgG с амилоидными фибриллами 2M. То же явление наблюдалось, если использовались в качестве первых антител IgG неиммунизированных кроликов или очищенные IgG против лактоферрина человека.
Таким образом мы обнаружили и, как нам кажется, доказали факт неспецифического связывания фибрилл 2M человека с IgG кролика. Это следует учитывать при дальнейшем изучении гуморального иммунного ответа на фибриллы 2M. К сожалению, нами к настоящему времени не исследован вопрос, есть ли аналогичный эффект с IgG человека. Если существует такое же связывание IgG человека с амилоидными фиблиллами 2M, то это может иметь важное значение в понимании патогенеза A2M, а также в подходах к малоинвазивной диагностике данного заболевания. Кроме того, данный факт следует иметь в виду и при разработке таких иммунологических методов диагностики A2M, в которых фибриллы 2M будут использоваться в качестве антигена.
Содержание цитокинов в плазме крови больных, находящихся на хроническом гемодиализе.
Так как диагностировать A2М достаточно сложно, способ малоинвазивной лабораторной диагностики этого заболевания может быть весьма востребован.
Одним из направлений нашей работы по поиску такого способа является попытка обнаружить цитокиновые маркеры A2М. Кроме того, теоретически не до конца ясна роль иммунных реакций в патогенезе как A2М, так и других амилоидозов.
Поэтому было решено определить содержания цитокинов в плазме крови пациентов на различных сроках хронического гемодиализа.
Содержание всех исследованных цитокинов в плазме крови больных находившихся на хроническом гемодиализе было достоверно повышено по сравнению с контрольной группой (p0,03 для IL-10 и p0,01 для IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN-, TNF-) (Таблица 1).
Первоначально мы оценили корреляции между уровнем IL-2, IL-4, IL-6, IL 8, IL-10, GM-CSF, IFN-, TNF- и длительностью хронического гемодиализа. В результате была обнаружена статистически значимая (p0,03) обратная корреляция между уровнем IL-10 и продолжительностью диализа. При этом для остальных цитокинов подобной зависимости выявлено не было.
На следующем этапе мы разделили больных на группы в зависимости от длительности диализа. При разделении больных на группы «до 3 лет диализа» и «более 3 лет диализа», было обнаружено статистически значимое различие этих групп по уровню IL-10 в крови (p=0,04). По содержанию всех исследованных цитокинов группа «до 3 лет диализа» статистически значимо отличалось от контрольной группы (p0,03 для IL-10 и p0,01 для IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM CSF, IFN-, TNF-). Аналогичная ситуация наблюдалась при сравнении группы «более 3 лет диализа» и группы здоровых доноров для всех исследованных цитокинов, кроме IL-10. Достоверных различий по IL-10 в последних двух группах не обнаружено: p0,14.
Таким образом, у обследованных больных на гемодиализе уровень цитокинов существенно превышал норму. При этом с увеличением срока, в течение которого больные подвергались процедуре хронического диализа, уровень IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN-, TNF- увеличивался. Содержание же IL-10 снижалось после трех лет диализа до уровня, статистически не различающегося с нормой Среди обследованных пациентов около половины получает гемодиализ, а остальные – процедуру гемодиафильтрации. Мы решили выяснить, существуют ли различия между этими группами по уровню исследованных цитокинов. Группа больных на гемодиализе отличалась от группы на гемодиафильтрации только по уровню GM-CSF (p0,04) (таблица 2). По всем остальным цитокинам статистически значимых различий между группами не было выявлено. Кроме того, не выявлено различий и по такому параметру, как длительность диализа.
Эти результаты сами по себе интересны, так как исследования по сравнению цитокинового статуса у больных на гемодиализе и гемодиафильтрации малочисленны.
При дальнейшем разделении больных, получающих процедуру гемодиафильтрации, на группы «до 3 лет диализа» (n=23) и «более 3 лет диализа»
(n=25), было обнаружено различие между этими группами по уровню IL-6 в плазме крови (p=0,02). По содержанию всех исследованных цитокинов группа «до 3 лет гемодиафильтрации» статистически значимо отличалось от контрольной группы (p=0,05 для IL-10 и p0,005 для IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN-, TNF-). Группа «после 3 лет гемодиафильтрации» значимо отличалось от группы практически здоровых по содержанию в плазме крови IL-2, IL-4, IL-8, GM-CSF, IFN-, TNF- (p0,005). При этом статистически достоверно эти две группы не различались по IL-6 (p=0,3) и IL-10 (p=0,16).
Заболеваемость A2М коррелирует с длительностью хронического диализа (от единичных случаев на первом году гемодиализа до 90-100% через 5-13 лет хронического диализа). Нами обнаружены корреляции между содержанием IL- в плазме крови и длительностью диализа у больных, как на гемодиализе, так и на гемодиафильтрации. Обнаружена корреляция между содержанием IL-6 в плазме крови и длительностью диализа у больных на гемодиафильтрации. Показано, что при разделении пациентов на группы «до 3 лет диализа» и «более 3 лет диализа», такие группы будут различаться по содержанию IL-10 и IL-6 в плазме крови. Эти результаты, на наш взгляд, позволяют предложить IL-10 и IL-6 (но IL-6 только у больных на гемодиафильтрации) для дальнейших исследований в качестве потенциальных маркеров-кандидатов A2М.
ВЫВОДЫ 1. Разработан эффективный способ получения очищенного 2М человека.
2. Создана генетическая контрукция для синтеза полноразмерного 2М человека с полигистидиновым фрагментом и пептидом, направляющим белок в периплазматическое пространство бактерий, что исключает формирование телец включения. Получен рекомбинантный нативный 2М с исключением стадий денатурации и ренатурации.
3. Созданы экспрессионные генетические конструкции, позволяющие получать в очищенном состоянии укороченные варианты 2М человека.
4. Показано, что исходный природный 2М, рекомбинантный 2М и укороченные производные обладают фибриллогенной активностью.
5. По спектральным характеристикам фибриллы разных вариантов 2М имеют некоторые различия, указывающие на их различную способность связывать тиофлавин Т. Выявлено, что фибриллогенез 2М и его производных происходит с возрастанием количества альфа-спиральных структур.
6. С целью визуализации стадий фибриллогенеза на клеточных культурах получена генетическая конструкция и рекомбинантный белок слияния 2М – зеленый флуоресцентный белок. Показано, что очищенный рекомбинантный белок слияния формирует видимые в микроскоп фибриллярные структуры.
7. Обнаружено, что фибриллы 2М обладают способностью неспецифически сорбировать иммуноглобулины G кролика.
8. Показано, что в плазме крови больных, получающих процедуру хронического гемодиализа, повышена концентрация IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-, TNF-.
9. Установлено, что содержание IL-10 в плазме крови больных на хроническом гемодиализе возрастает в первые 3 года терапии и далее снижается до нормальных значений.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:
1. Поляков Д.С., Грудинина Н.А., Соловьёв К.В., Егоров В.В., Сироткин А.К., Алейникова Т.Д., Тотолян Арег А., Шавловский М.М. Бета-2-микроглобулиновый амилоидоз: фибриллогенез природного и рекомбинантных бета-2 микроглобулинов человека // Медицинский академический журнал. – 2010. – Том 10. – № 2. – С. 40-49.
2. Поляков Д.С., Тотолян Арег А., Шавловский М.М. Получение природного бета2-микроглобулина человека // Молекулярная медицина. – 2010. – № 6. – С. 39 43.
3. Поляков Д.С., Грудинина Н.А., Соловьёв К.В., Егоров В.В., Сироткин А.К., Алейникова Т.Д., Тотолян Арег А., Шавловский М.М. Получение рекомбинантного 2-микроглобулина человека и его фибриллогенез при низких и нейтральных значениях рН // Молекулярная медицина. – 2011. - №2. – С. 36-39.
4. Поляков Д.С., Домашенко О.М., Белобородов П.В., Сысоев К.А., Шавловский М.М., Тотолян Арег А. Содержание цитокинов в плазме крови больных, находящихся на хроническом гемодиализе // медицинская иммунология. – 2011, №2-3, С.211-218.
Тезисы докладов:
1. Поляков Д.С., Алейникова Т.Д., Шавловский М.М. Гуморальный ответ на фибриллы бета2-микроглобулина человека. Биология — наука ХХI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 19 23 апреля 2010 года). Сборник тезисов // 2010, Том 2, 166-167.
2. Поляков Д.С., Алейникова Т.Д., Шавловский М.М. Получение и свойства кроличьих антител к фибриллам бета2-микроглобулина человека. Биология — наука ХХI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 19 - 23 апреля 2010 года). Сборник тезисов //2010, Том 2, 172 173.
3. Поляков Д.С., Соловьев К.В., Грудинина Н.А. «Получение белка слияния бета 2-микроглобулина с зеленым флуоресцентным белком», тезисы 3 международного молодежного медицинского конгресса “Санкт-петербургские научные чтения 2009”, Санкт-Петербург, 2009, стр 116.
4. Поляков Д.С., Грудинина Н.А., Соловьёв К.В., Шавловский М.М. «Создание экспрессионной генетической конструкции для получения бета-2-микроглобулина человека в бактериальной системе», тезисы 13 международной Пущинской школы-конференции «Биология – наука 21 века» 28 сентября - 2 октября, 2009, Пущино, стр. 37.
5. Поляков Д.С., Шавловский М.М. Взаимодействие амилоидных фибрилл бета2 микроглобулина с иммуноглобулинами в условиях иммугоблоттинга. Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010». Сборник трудов // 2010, Том 4, 341- 344.