Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение
На правах рукописи
Колесников Олег Васильевич
ВЛИЯНИЕ КСЕНОБИОТИКОВ И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА СИСТЕМУ
МИКРООРГАНИЗМ-РАСТЕНИЕ
Специальность 03.02.03 микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2012
Диссертация выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО Российского государственного аграрного университета-МСХА имени К.А.Тимирязева Доктор биологических наук, профессор
Научный руководитель:
Емцев Всеволод Тихонович доктор биологических наук
Официальные оппоненты:
Васильева Лина Васильевна кандидат биологических наук Благовещенская Генриетта Германовна ГНУ Всероссийский научно
Ведущая организация:
исследовательский институт кормов имени В.Р.Вильямса Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится «15» февраля 2012 г. В 16 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 при Российском государст венном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева.
Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библио теке Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева
Автореферат разослан «13» января 2011 г., размещён на сайте университета www.timacad.ru и направлен по адре су [email protected] Отзывы на автореферат (в 2-х экземплярах заверенных печатью), просим направлять по адресу: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49;
тел. факс:
8(499) 976-24-
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О.В. Селицкая Актуальность исследования. В настоящее время, в связи с развитием циви лизации, значительно увеличивается антропогенная нагрузка на экосистемы.
В частности, растет количество тяжелых металлов (ТМ), выбрасываемых в окружающую среду. В частности, одним из источников ТМ является авто транспорт, причем это не только свинец, содержащийся в бензине, но и мно жество других металлов и соединений. Этот источник загрязнения отличает ся еще и тем, что действует в непосредственной близости к человеческому жилью, в отличие от различных промышленных объектов, таких как заводы, электростанции, свалки и другие поставщики ТМ в биосферу. При этом ко личество автомобилей в последние годы только увеличивается, технологий же, позволяющих радикально снизить их негативное воздействие на окру жающую среду не предвидится. Первыми под удар попадают зеленые насаж дения вдоль дорог, поглощающие значительную часть вредных веществ из дорожных стоков, задерживающих аэрозоли, снижающих шумовое воздейст вие транспортного потока и вообще играющих важную гигиеническую роль в городских условиях. Таким образом, важной задачей становится повышение устойчивости зеленых насаждений к неблагоприятным факторам.
В последние десятилетия наблюдается рост интереса к различным био логическим технологиям защиты растений и восстановления загрязненных почв. В частности, известно, что обработка растений некоторыми микроорга низмами-симбионтами способна значительно увеличить их устойчивость к самым различным неблагоприятным факторам, начиная от засухи или пони женной температуры до засоления почвы или загрязнения ее ТМ. При этом значительный интерес представляет более глубокое понимание механизмов работы этого симбиоза и поиск путей для повышения его эффективности.
Еще одним способом использования растений в защите окружающей среды является так называемая фиторемедиация — очистка различных сред от загрязнителей с помощью растений. Фактически при этом работают сим биотические микробно-растительные комплексы. Увеличение их устойчиво сти к ТМ и другим неблагоприятным факторам — важная задача, способная повысить эффективность их работы. Еще одним важным для фиторемедиа ции свойством симбиотических микроорганизмов является усиления способ ность растений накапливать тяжелые металлы. В данный момент данные о подобном воздействии микроорганизмов достаточно противоречивы, однако более подробное изучение механизма, вызывающего подобный эффект, мо жет значительно повысить эффективность работы растений гипераккумуляторов или позволит использовать для фиторемедиации обыч ные декоративные виды, не имеющие в норме выраженных гипераккумуля торных свойств.
Цель работы: изучить влияние токсикантов на систему микроорга низм-растение.
Задачи исследования. Для достижения вышеозначенной цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать влияние солей тяжелых металлов на численность симбиотических микроорганизмов в эндосфере корней и ли стьев растений, а так же динамику ее изменения.
2. Исследовать влияние загрязнения почвы ТМ на интродуциро ванную популяцию R. planticola в системе почва-растение Изучить влияние бактерии Klebsiella (Raoultella) planticola на 3.
рост и развитие различных видов газонных трав в условиях за грязнения почвы смесями солей тяжелых металлов.
Исследовать протекторное действие R. planticola в условиях 4.
загрязнения несколькими тяжелыми металлами и сформулиро вать рекомендации по ее применению в составе биопрепара тов.
Научная новизна исследования. В работе впервые исследовано про текторное действие R. planticola на растения при загрязнении почвы смесью нескольких тяжелых металлов, характерных для выбросов автотранспорта.
Выявлено, что инокуляция в данных условиях оказывает заметное положи тельное воздействие на различные параметры растительных организмов. Так же отмечены различия в воздействии микроорганизмов на разные виды рас тений. Исследованы некоторые аспекты изменения численности микроорга низмов и динамики их миграции в ткани растения в зависимости от условий внешней среды (наличия или отсутствия ксенобиотика). Обнаружены разли чия в эффективности различных методов инокуляции. Отмечено увеличение накопления меди и цинка в тканях растений, инокулированных R. planticola.
Практическая значимость. Результаты данного исследования свиде тельствуют, что инокуляция R. planticola может в значительной степени ней трализовывать негативный эффект, оказываемый различными тяжелыми ме таллами на газонные травы. Таким образом, биопрепараты на основе R. plan ticola могут быть использованы для защиты растений от действия ТМ. Так же было показано, что инокуляция методом полива взвесью микроорганизмов эффективнее, чем инокуляция замачиванием семян. Это позволяет рекомен довать данный метод инокуляции для практического использования. Кроме того было обнаружено, что инокуляция овсяницы красной сорта “Золушка” R. planticola заметно усилила накопление ТМ в тканях растения. С одной стороны, это накладывает определенные ограничения на использование R.
planticola для защиты растений, используемых в пищу животных или челове ку. С другой — открывает широкие перспективы использования в фитореме диации почв, загрязненных тяжелыми металлами.
Апробация.
Результаты исследований были представлены на международной науч ной конференции молодых ученых РГАУ-МСХА (Москва, 2010), на II меж дународной заочной научно-практической конференции “Информационное пространство современной науки” (Чебоксары, 2010), а так же молодежном научном экологическом форуме “Экологические последствия засухи и пожа ров 2010 года” (Москва, 2011).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 3 работы, в том числе одна статья в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы;
описания объектов, методов и условий экспериментов;
ре зультатов экспериментов и их обсуждения;
выводов. Объём диссертацион ной работы составляет 110 с., из них 10 с. приложений.
Работа включает таблиц, 12 рисунков, список литературы из 200 наименований (в том числе 171 на иностранных языках).
Объекты и методы исследований Микроорганизмы В работе использовался ассоциативный азотфиксатор Raoultella planti cola, штамм ТСХА-91 AmpR, входящий в состав биопрепарата “Биоплант – К”. Штамм Raoultella planticola ТСХА-91 AmpR был выделен в лаборатории микробиологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева из ризопланы огурца (Емцев и др., 1995).
Растения В качестве модельных растений были использованы несколько видов овсяницы (Festuca rubra, F. rubra commutata, F. ovina), райграс пастбищный (Lolium perenne) и полевица собачья (Agrstis canna).
Загрязнители Смесь №1 — ZnSO4, CuSO4 и PbCO3 в количествах, соответствующих 2300 мг Zn на килограмм грунта, 300 мг/кг Cu и 3200 мг/кг Pb, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.
Смесь №2 — ZnSO4, CuSO4 и Pb(CH3COO)2 в количествах, соответст вующих 2300 мг Zn на килограмм грунта, 300 мг/кг Cu и 3200 мг/кг Pb, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.
Смесь №3 — Zn(CH3COO)2, Cu(CH3COO)2 и Pb(CH3COO)2 в количест вах, соответствующих 2300 мг Zn на килограмм грунта, 300 мг/кг Cu и мг/кг Pb, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.
Смесь №4 — NiSO4, Cd(CH3COO)2, CoCl2 в количествах, соответст вующих 400 мг Ni на килограмм грунта, 500 мг/кг Cd и 500 мг/кг Co, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.
Инсектицид “Фуфанон” — коммерческое название для O,O-Диметил S-(1,2-дикарбэтоксиэтил)дитиофосфата, он же малатион, карбофос. Доста точно эффективный и популярный фосфорорганический инсектицид, в на стоящее время несколько устаревший. Вносился в количестве 200 мг/кг грун та, что так же в 100 раз превосходит его ПДК.
Субстраты Для культивирования растений в опытах использовалось 3 типа суб стратов: дерново-подзолистая почва, речной песок и низинный торф.
Дерново-подзолистая тяжелосуглинистая почва, характерная для средней полосы России, отбиралась на опытном поле ГНУ ВИК имени В.Р.
Вильямса. Некоторые характеристики данной почвы приведены в таблице 1.
Таблица 1. Характеристики дерново-подзолистой почвы, использован ной в опытах Содержание рН KCl Hг, мг-экв. на N общ., % Подвижно- Калий гумуса по 100 г почвы го P, мг на мг/кг почвы Тюрину, % кг почвы 1,68 4,88 2,68 0,156 427,4 148, Речной песок В данный тип грунта для улучшения питания растений была добавлена доломитовая мука, а так же смесь Прянишникова.
Таблица 2. Характеристики речного песка, использованного в опытах Общий угле- рН KCl Hг (мг-экв. на N общ., % Фосфор Калий род, % 100 г почвы мг/100 г Мг/100 г почвы почвы 0,37 7,93 0,23 0,114 27,40 9, Низинный торф — часто применяется при создании газонов и озеле нении территории.
Таблица 3. Характеристики низинного торфа, использованного в опы тах Общий угле- рН KCl Hг (мг-экв. на N общ., % Фосфор Калий род, % 100 г почвы мг/100 г Мг/100 г почвы почвы 11,14 6,05 3,82 0,495 2,34 6, Методика проведения вегетационных опытов Использованные методики и технологии Обработка растений бактериями R. planticola осуществлялась двумя способами. При инокуляции первым способом (инокуляция замачиванием семян) семена растений замачивались непосредственно перед высевом в сус пензии суточной культуры R. planticola на среде К2, разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:50 в течение 30 минут (как по казали исследования, это оптимальный режим инокуляции замачиванием).
При инокуляции вторым способом (инокуляция поливом) семена высе вались в почву, а сразу после их прорастания производился полив растений суспензией суточной культуры R. planticola на среде К2, разведенной сте рильным физиологическим раствором в соотношении 1:50 (60 мл на сосуд емкостью 0,5 л).
Для оценки состояния растений производился учет их основных био метрических параметров. В частности определялась средняя длина листьев, проективное покрытие (визуально, с шагом 10%) (Методические указания по проведению полевых опытов с кормовыми культурами). Так же определялась сырая масса листьев и корней — для этого растения извлекались из почвы, листья и корни отделялись, отмывались, высушивались и взвешивались.
Для осуществления микробиологического исследования корни и листья извлеченные из почвы, тщательно промывались, их поверхность дезинфици ровалась раствором гипохлорита натрия в течение 3 минут для уничтожения эпифитных микроорганизмов. После этого они растирались в ступке, а полу ченная суспензия разбавлялась стерильным физиологическим раствором.
Разведения полученного материала высевались в трех повторностях до 12-го разведения на полужидкую среду Федорова-Калиниской (Калининская и др., 1981) с сахарозой для определения общей численности азотфиксирующих микроорганизмов в тканях растений. Точная численность определялась ме тодом предельных разведений по таблицам Мак-Креди. Численность ампи циллинрезистентной R. planticola, штамм ТСХА-91 определялась путем по сева на плотную питательную среду LB (Миллер, 1976) с ампициллином ( мкг/мл).
Для исследования растительной массы на содержание тяжелых металлов листья и корни тщательно промывались, высушивались до воздушно-сухого состояния и озолялись по методу мокрого озоления в серной кислоте. После этого в полученных вытяжках атомно-адсорбционным методом при помощи спектрофотометра Спектр 5 определялась концентрация тяжелых металлов (меди и цинка).
С целью изучения воздействия ТМ на почвенную микрофлору определя лась интенсивность базального и субстратиндуцированного дыхания. Для этого из каждого сосуда отбиралось по 200 граммов почвы, проводилось ее увлажнение и прединкубация в течение 5–7 суток при температуре 22оС.
При определении СИД навеска в 2 грамма почвы помещалась во флако ны известного объема в 4-х кратной повторности и вносили раствор глюкозы из расчета 10 мг на 1 г. почвы. После этого флаконы герметизировали и, по сле 3,5 часов инкубации при 22оС измеряли на хроматографе Кристалл количество выделившегося CO2.
При определении базального дыхания во флаконы вносилось 2 грамма почвы и 0,1 мл воды, после чего они герметизировались и инкубировались при 22оС в течение суток. После инкубации производилось измерение кон центрации CO2 во флаконе при помощи хроматографа.
Схемы опытов Опыт № 1. Первый вегетационный опыт был поставлен в 2008 году и завершен в 2010. Его целью было установить влияние инокуляции растений овсяницы различных видов культурой R. planticola штамм ТСХА 91, а так же выяснить, как влияют на взаимодействие растения и микроорганизма различ ные дополнительные условия. В опыте использовались 2 типа растений — травосмесь и овсяница сорта “Золушка”. Использовались три разных суб страта — торф, речной песок и дерново-подзолистая почва. В качестве за грязнителя использовалась смесь солей тяжелых металлов №1. Инокуляция производилась методом замачивания семян.
Исследуемые растения высевались на каждый тип субстрата по следую щей схеме (повторность шестикратная):
1. Почва без ксенобиотиков + растения без инокуляции.
2. Почва без ксенобиотиков + инокулированные растения.
3. Загрязненная почва + растения без инокуляции.
4. Загрязненная почва + инокулированные растения.
Через 20 дней, 40 дней и 9 месяцев после прорастания семян проводи лись биометрическое и микробиологическое исследования — определялась длина листьев и проективное покрытие, а так же численность R. planticiola (на 20-й и 40-й день) и общая численность азотфиксаторов (на 9-й месяц).
Через 10 месяцев после прорастания семян было так же исследовано со стояние почвенной микрофлоры. Для этого была определена интенсивность базального и субстратиндуцированного дыхания почвы, после чего на осно вании этих данных так же была рассчитана общая микробная биомасса и микробный коэффициент.
Опыт № 2. Данный опыт был поставлен в 2009 году. Его целью было подтвердить данные, полученные в первом опыте, выяснить, как влияют на растения различные методы инокуляции микроорганизмами, а также иссле довать влияние на систему микроорганизм — растение органического ксено биотика. Кроме того, было изучено влияние инокуляции на накопление тя желых металлов в ткани растения. В опыте использовался только один тип субстрата (дерново-подзолистая почва), для ее загрязнения применялась смесь солей тяжелых металлов №2 и инсектицид фуфанон в количестве, в 100 раз превосходящем ПДК. Так же использовалось 2 способа инокуляции:
замачиванием семян и поливом. Схема опыта приведена в таблице 4.
Таблица 4. Схема опыта Способ обработки Ксенобиотик Без инокуляции Инокуляция Инокуляция (БИ) семян (ИС) поливом (ИП) Без ксенобиотика БИ+БК ИС+БК ИП+БК (БК) Тяжелые метал- БИ+ТМ ИС+ТМ ИП+ТМ лы (ТМ) Инсектицид (И) БИ+И ИС+И ИП+И Через 40 дней после прорастания семян проводилось микробиологиче ское и биометрическое исследование. Измерялось проективное покрытие, длина листьев, а так же масса листьев и корней. Кроме того, проводилось ис следование растительной массы на содержание в ней тяжелых металлов атомно-адсорбционным методом.
Опыт № 3 был поставлен в 2011 году. Его целью было подтвердить полученные ранее данные, а так же выяснить, как влияет инокуляция на ус тойчивость различных видов растений к тяжелым металлам. Так же планиро валось использовать различные типы смесей ТМ. В опыте использовалась дерново-подзолистая почва и 3 вида растений: райграс пастбищный, овсяни ца красная (сорт “Сигма”) и полевица собачья. Для загрязнения почвы ис пользовалось 2 смеси солей тяжелых металлов — смеси № 3 и № 4. Исполь зовалось 2 метода инокуляции – инокуляция замачиванием семян и инокуля ция поливом всходов. Схема загрязнения почвы и инокуляции, применяв шаяся для каждого растения, приведена в таблице 5. Каждый вариант приме нялся в шестикратной повторности для райграса и овсяницы и в трехкратной для полевицы собачьей (в связи с нехваткой посевного материала) Таблица 5. Схема опыта Способ обработки Ксенобиотик Без инокуляции Инокуляция Инокуляция (БИ) семян поливом (ИП) (ИС) Без ксенобиотика БИ+БК ИС+БК ИП+БК (БК) Тяжелые метал- БИ+ ТМ3 ИС+ ТМ3 ИП+ ТМ лы, смесь № (ТМ3) Тяжелые метал- БИ+ ТМ4 ИС+ ТМ4 ИП+ ТМ лы, смесь № (ТМ4) Отмечалось время прорастания семян в различных вариантах опыта и динамика развития растений. На 60-й день после прорастания выжившие растения были извлечены из почвы, листья и корни отделены и взвешены, после чего тщательно вымыты. Большая часть биомассы была подготовлена для озоления и исследования с помощью атомно-абсорбционного анализа, меньшая отделена и отобрана для выделения ДНК и выполнения ПЦР анализа с целью подтвердить наличие R. planticola.
Результаты и обсуждение 1 Изучение воздействия различных факторов на колонизацию растений бактериями Raoultella planticola и почвенную микрофлору Целью наших исследований являлось изучение влияния тяжелых ме таллов на взаимодействие растений и интродуцированных микроороганиз мов. Для решения поставленной задачи мы исследовали динамику и интен сивность колонизации корней и листьев растений бактериями R. planticola и влияния на нее различных факторов, таких как разные типы субстратов, за грязнение тяжелыми металлами и ксенобиотиками.
1.1 Воздействие загрязнения грунта тяжелыми металлами на колониза цию растений бактериями Данные о численности R. planticola, полученные в первом вегетацион ном опыте, приведены в таблицах 6,7 и 8.
Таблица 6. Динамика численности бактерий R. planticola штамм ТСХА 91 AmpR в корнях и листьях растений травосмеси на речном песке (КОЕ/г сырой биомассы) Вариант 20 дней 40 дней ризоплана филлосфера ризоплана Филлосфера Контроль 0 0 0 1,8*105 1*104 5.5* бактеризация тяжелые метал- 0 0 0 лы 2*104 2.5* бактеризация + 0 ТМ Таблица 7. Динамика численности бактерий R. planticola штамм ТСХА 91 AmpR в корнях и листьях растений травосмеси на дерново-подзолистой почве (КОЕ/г сырой биомассы) Вариант 20 дней 40 дней ризоплана Филлосфера ризоплана филлосфера Контроль 0 0 0 6*104 1*104 1.5* бактеризация тяжелые метал- 0 0 0 лы 5,5* бактеризация + 0 0 ТМ Таблица 8. Динамика численности бактерий R. planticola штамм ТСХА 91 AmpR в корнях и листьях растений травосмеси на низинном торфе (КОЕ/г сырой биомассы) Вариант 20 дней 40 дней ризоплана филлосфера ризоплана филлосфера контроль 0 0 0 1,9*105 2*104 1.5* бактеризация тяжелые метал- 0 0 0 лы 7*104 1,5*104 1* бактеризация + ТМ Были исследованы пробы, взятые на 20-й и 40-й день после прораста ния семян. Исследования образцов, отобранных на 20-й день, показали нали чие бактерий в корнях инокулированных растений во всех вариантах опыта.
Однако в листьях R. planticola при этом обнаружена не была. Аналогичное исследование, выполненное через 40 дней после прорастания семян, показа ло, что бактерии начинают обнаруживаться как в корнях, так и в листьях.
При этом их количество в корнях заметно снизилось (в некоторых вариантах почти на порядок), на низинном торфе и речном песке в вариантах с внесени ем тяжелых металлов они совсем перестали обнаруживаться.
Таким образом, можно сделать вывод, что скорость распространения бактерий в растительном организме достаточно невелика. Кроме того, доста точно невелико количество клеток микроорганизмов, переносимых из корней в листья. При этом на загрязненных ТМ грунтах миграция микроорганизмов в эндосферу корней заметно замедляется.
Полученные во втором опыте данные по численности микроорганиз мов представлены на рис. 1. Как видно, численность азотфиксаторов в листь ях (рис. 1, А), как и в первом опыте, значительно (на 1 - 2 порядка) меньше, чем в корнях (рис. 1, Б). В тканях растений, культивировавшихся на почве, в Рисунок 1. Влияние различных ксенобиотиков и разных методов иноку ляции на обсемененность тканей корней и листьев овсяницы сорта “Зо лушка” ассоциативными азотфиксирующими микроорганизмами. Дер ново-подзолистая почва. А – листья;
Б – корни (КОЕ/г сырой биомассы).
которую были внесены соли ТМ, количество микроорганизмов было заметно большим, чем в контрольных вариантах без загрязнения. Несколько менее ярко это проявилось на почве, загрязненной пестицидом (обсемененность корней инокулированных растений относительно контроля при загрязнении тяжелыми металлами была в 100 раз больше, чем без загрязнения).
После девяти месяцев культивирования в первом вегетационном опыте было выполнено повторное исследование растений, с целью определить общее со держание ассоциативных азотфиксаторов в тканях. Полученные данные по казали, что различия в микробной обсемененности тканей растений между вариантами с различной обработкой грунта и растений в значительной степе ни сгладились, однако основные тенденции, выявленные при первых измере ниях, сохранились. Так же сохранился значительный разрыв в численности азотфиксирующих микроорганизмов между корнями и листьями растений (в некоторых случаях более чем на два порядка).
Таким образом, загрязнение почвы тяжелыми металлами привело к за метному увеличению численности ассоциативных диазотрофов в тканях рас тений по сравнению с контрольными вариантами без загрязнения.
Возможно, это объясняется тем, что загрязнение грунта ТМ или орга ническими ксенобиотиками делает его менее благоприятным для развития почвенных микроорганизмов, что, в свою очередь, стимулирует их миграцию из почвы в растения. Значительно большая численность диазотрофов в тка нях инокулированных растений на загрязненной почве, вероятно, объясняет ся тем, что инокуляция оказывает значительный ростостимулирующий эф фект, особенно на корневую систему, что в свою очередь стимулирует разви тие микрофлоры корней и почвы.
Для точного определения наличия R. planticola в корнях растений в третьем опыте был использован метод ПЦР. При этом разведения растертых корней райграса и овсяницы красной высевались на среду LB с ампицилли ном, после чего колонии, имеющие признаки, характерные для R. planticola, исследовались методом ПЦР с помощью праймера PAR-C1. В результате бы ло подтверждено, что данные колонии образованы бактериями R. planticola.
1.2 Влияние типа грунта, метода инокуляции и органических ксе нобиотиков на колонизацию растений микроорганизмами Кроме загрязнения ТМ в поставленных опытах имелись и другие фак торы, которые могли оказать некоторое влияние на интенсивность колониза ции тканей растений микроорганизмами. Это, в частности, разные типы грунта, на которых в первом опыте выращивались растения, использованные во втором опыте разные методы инокуляции, а так же дополнительный за грязнитель — фосфорорганический пестицид (фуфанон).
Тип грунта Результаты, полученные в первом опыте, позволяют сделать вывод, что количество микроорганизмов в эндосфере корней растений культивировав шихся на разных типах грунтов, может заметно различаться. Как видно из табл. 6 и 8, численность R. planticola в корнях растений овсяницы, культиви руемых на торфе и речном песке, изменяется сходным образом — внесение ТМ вызывает значительное падение численности микроорганизмов в корнях.
Данные об общей численности диазотрофов в эндосфере корней после 9 месяцев культивирования, демонстрируют иную закономерность. На реч ном песке и торфе количество симбиотических азотфиксаторов в корнях рас тений, выращенных на загрязненной почве выше, чем в незагрязненной. В то же время, в корнях растений, выращенных на загрязненной ТМ дерново подзолистой почве, численность диазотрофов оказалась в 7 раз ниже, чем на незагрязненной.
Возможно, это связано с тем, что дерново-подзолистая почва богата глинистыми частицами и имеет в связи с этим большую обменную емкость, что смазывает эффект, оказываемый ТМ.
Органический ксенобиотик.
Совокупная численность азотфиксирующих микроорганизмов в корнях растений, выросших на дерново-подзолистой почве, в которую был внесен фуфанон, возросла в 10 раз относительно незагрязненного контроля при ино куляции замачиванием семян, однако осталась неизменной при инокуляции поливом. Эти результаты заметно отличаются от полученных на почве с ТМ, хотя основные закономерности и сохраняются. Прирост численности азот фиксаторов при инокуляции замачиванием При этом, однако, численность микроорганизмов в тканях листьев при инокуляции замачиванием отличается от контроля сравнительно слабо, а при инокуляции поливом резко уменьша ется.
Разные методы инокуляции.
Во втором опыте были применены разные методы инокуляции (при помощи замачивания семян в бактериальной суспензии перед посевом и по лива этой суспензией всходов сразу после прорастания семян). Последующие исследования показали, что влияние этих методов на микробную обсеменен ность тканей растений заметно различалось.
Как видно из графика (рис. 1), при выращивании на незагрязненной почве численность азотфиксаторов в тканях растений, инокулированных по ливом, была значительно больше, чем в тканях растений, инокулированных замачиванием.
Достаточно примечательными оказались результаты на почве, загряз ненной смесью солей ТМ. Так, численность микроорганизмов в растениях, инокулированных путем полива всходов бактериальной суспензией была за метно меньше, чем путем замачивания семян. Это особенно интересно, если учесть, что, судя по характеру роста и развития растений, инокуляция поли вом значительно эффективнее.
Таким образом, исследования показали, что интенсивность колониза ции растений бактериями зависит в том числе от способа их внесения.
1.3. Исследование воздействия бактеризации растений на микро флору загрязненной ТМ дерново-подзолистой почвы Изучение состояния почвенной микрофлоры при загрязнении и иноку ляции весьма важно для более полного понимания функционирования систе мы почва-микроорганизмы-растение в условиях загрязнения и при внесении ксенобиотиков.
В первом опыте, на 10-м месяце культивирования были исследованы некоторые показатели, характеризующие состояние микробного сообщества почвы, такие как базальное и субстратиндуцированное дыхание (БД и СИД).
Кроме того, на основании этих данных были рассчитаны общая биомасса микроорганизмов (Смик) и микробный коэффициент. Исследовались только варианты, в которых применялась дерново-подзолистая почва.
Полученные при исследовании БД и СИД данные приведены в табл. 9.
Интенсивность дыхания почвы, в которую были внесены соли ТМ, оказалась заметно ниже контрольной. При этом интенсивность БД упала гораздо силь нее, чем СИД. Инокуляция растений, высаживаемых в загрязненную почву, заметно улучшила оба этих показателя. При этом, однако, бактеризация рас тений на незагрязненной почве привела к некоторому снижению показателей микробной активности, хотя и значительно меньшему, чем вызванное ТМ.
Таким образом, внесение ТМ в почву значительно снижает интенсив ность дыхания почвенной микрофлоры, а инокуляция культивируемых рас тений R. planticola — увеличивает.
Данные, полученные при измерении общей микробной биомассы пред ставлены в таблице 10.
Таблица 9.
Влияние внесения тяжелых металлов и инокуляции растений травосмеси на базальное и субстратиндуцированное дыхание дерново-подзолистой почвы Вариант обработки БД, мкгСО2/г*час СИД, мкгСО2/г*час Контроль 0,242 ± 0,023 4,215 ± 0, незагрязненная почва + 0,140 ± 0,037 3,884 ± 0, бактерии загрязненная почва 0,003 ± 0,0001 2,081 ± 0, загрязненная почва + бак 0,153 ± 0,002 2,672 ± 0, терии Как видно, загрязнение почвы солями тяжелых металлов привело к значительному снижению микробной биомассы, а выращивание инокулиро ванных растений при этом несколько увеличило общую биомассу микроор ганизмов.
Таким образом, загрязнение почвы ТМ приводит к снижению общей микробной биомассы, а выращивание на ней растений, инокулированных R.
planticola позволяет в некоторой степени компенсировать это снижение.
Таблица 10.
Влияние внесения тяжелых металлов и инокуляции растений травосмеси на общую микробную биомассу (Смик) в дерново-подзолистой почве.
Вариант Смик, мкг/гпочвы контроль 380,22 ± 37, почва + тяжелые металлы 153,11 ± 51, почва + биопрепарат 285,47 ± 28, почва + тяжелые металлы + био 196,53 ± 15, препарат На основании приведенных выше данных был рассчитан микробный метаболический коэффициент. Высокие значения микробного метаболиче ского коэффициента характерны для молодых или сильно нарушенных эко систем, более низкие — для старых или стабильных. Его значения приведены в таблице 11. Как видно из таблицы, максимальные значение микробного ме таболического коэффициента наблюдаются в варианте с загрязнением почвы, но без инокуляции растений, несколько меньшие — в варианте с тяжелыми металлами и инокуляцией, еще меньше — в контрольном варианте без за грязнения и инокуляции. Наконец, самое маленькое значение микробного метаболического коэффициента наблюдается в варианте, в котором на неза грязненной почве культивировались инокулированные растения.
Таблица 11. Влияние загрязнения ТМ и инокулированных растений травосмеси на микробный метаболический коэффициент дерново подзолистой почвы.
qCO2, Вариант QR мкг/мгС*час контроль без биопрепарата и 0,628 ± 0,190 0,058 ± 0, загрязнения почва + тяжелые металлы 0,841 ± 0,069 0,002 ± почва + биопрепарат 0,491 ± 0,106 0,038 ± 0, почва + тяжелые металлы + 0,780 ± 0,062 0,061 ± 0, биопрепарат Таким образом, можно сделать вывод, что выращивание инокулиро ванных растений позволяет несколько увеличить биомассу микроорганизмов в почве и интенсифицировать их метаболизм. Вероятно, инокуляция при этом действует опосредованно, через растения. Бактерии R. planticola стиму лируют развитие растений, в особенности корневой системы, что, в свою очередь, оказывает положительное воздействие на ассоциированных с расте ниями микроорганизмов.
2 Изучение влияния инокуляции на рост и развитие растений овсяницы различных видов на разных субстратах в условиях загрязнения почвы ТМ С целью изучения результатов взаимодействия микроорганизмов и рас тений в различных условиях нами был поставлен ряд опытов. В их ходе было изучено воздействие инокуляции на развитие растений на почвах, загрязнен ных тяжелыми металлами и органическими ксенобиотиками. Для этого изме рялись такие параметры, как длина, проективное покрытие и биомасса листь ев и биомасса корней. Влияние на эти параметры инокуляции разными мето дами на фоне загрязнения разных типов почв различными ксенобиотиками рассмотрено ниже.
2.1 Изучение развития растений при инокуляции R. planticola и загряз нении грунтов тяжелыми металлами Рисунок 2. Влияние типа грунта, наличия ксенобиотика (смесь солей ТМ №1) и инокуляции R.
Planticola на развитие смеси растений овсяницы трех сортов (травосмесь). А – проективное по крытие (%);
Б – длинна листьев (см).
На рис. 2 показаны результаты измерения основных параметров расте ний травосмеси в первом опыте, после 9 месяцев культивирования. Как вид но из графиков, инокуляция растений, высаженных в загрязненную почву, в большинстве случаев оказала на них заметное положительное воздействие. В большинстве вариантов на загрязненной ТМ почве увеличилось проективное покрытие (рис. 2, Б). Несколько меньшее влияние оказала инокуляция на длину растений (рис. 2, А). Следует так же отметить значительное положи тельное влияние инокуляции на развитие корневой системы.
Во втором опыте были проведены аналогичные замеры после 40 дней культивирования. При этом в опыте использовалась только дерново подзолистая почва и овсяница сорта “Золушка”. Полученные данные в целом аналогичны приведенным выше результатам первого опыта.
Как видно из рис. 3, на загрязненной ТМ почве инокуляция сравни тельно слабо повлияла на длину листьев (рис. 3, А). Значительно большее влияние она оказала на проективное покрытие (рис. 3, Б). Биомасса листьев (рис. 4, А) практически не изменилась и даже несколько уменьшилась. От дельно следует отметить влияние инокуляции на биомассу корней (рис. 4, Б) — на загрязненной почве при инокуляции замачиванием ее рост относитель но неинокулированного контрольного растения составил более 300 процен тов.
Таким образом, инокуляция бактериями R. planticola положительно сказывается на росте и развитии растений, культивируемых на субстратах, загрязненных солями тяжелых металлов. У инокулированных растений по сравнению с неинокулированными увеличивается биомасса корней, проек тивное покрытие и, в отдельных случаях, длина листьев. При этом макси мальное положительное воздействие инокуляция оказывает именно на кор невую систему (ее масса может увеличиваться в разы), и именно в грунтах с внесенными ТМ (прирост биомассы превосходит таковой при инокуляции растений в незагрязненном грунте).
2.2 Сравнение эффективности различных методов инокуляции Очевидно, что методы инокуляции замачиванием семян и поливом всходов отличаются друг от друга коренным образом. В первом случае срав нительно небольшое количество бактерий попадает в почву непосредственно с семенами растений. При этом взаимодействие растений и микроорганизмов начинается фактически еще до прорастания семян. Во втором же значительно большее количество микроорганизмов вносится в почву, в которой уже нахо дятся сформировавшиеся растения, причем они достаточно равномерно рас пределяются по всему объему корнеобитаемого слоя.
Не удивительно, что такие разные методы инокуляции продемонстри ровали достаточно большие различия в воздействии на растения. Наблюде ния, проведенные нами во втором опыте, показали, что влияние различных методов инокуляции на рост и развитие растений существенно отличается.
По полученным нами данным, инокуляция поливом всходов дала за метно лучшие результаты. На почве, загрязненной Рисунок 3. Воздействие различных методов инокуляции и загрязнителей на длину листьев и про ективное покрытие растений овсяницы сорта “Золушка”. А - средняя длина листьев (см);
Б - про ективное покрытие (%).
Рисунок 4. Воздействие различных методов инокуляции и загрязнителей на биомассу листьев и корней растений овсяницы сорта “Золушка”. А - биомасса листьев (г);
Б - биомасса корней (г).
как тяжелыми металлами, так и органическим ксенобиотиком, обрабо танные таким образом растения демонстрируют заметное увеличение всех измеренных параметров параметров как по сравнению с контрольными не инокулированными растениями, так и по сравнению с растениями, инокули рованными замачиванием семян.. В частности, на грунте, в который были внесены ТМ, прирост длины по сравнению с растениями, инокулированными замачиванием, составил 13%, проективного покрытия — 50%, а биомассы корней почти 200% (что в абсолютных цифрах является максимальным зна чением среди всех вариантов, в том числе и на почве без ТМ). Стоит так же отметить, что инокуляция поливом, в отличие от инокуляции замачиванием, не приводит к ухудшению развития листьев у растений на незагрязненной почве. Так, в варианте без загрязнителя, при инокуляции замачиванием длина листьев овсяницы упала на 21% относительно неинокулированного контроля, а проективное покрытие снизилось на 17%. В то же время, при инокуляции замачиванием на том же субстрате длина листьев растений увеличилась на 15% относительно контроля, а их проективное покрытие — на 17%.
Заметно отличалось так же влияние разных методов внесения микроор ганизмов на соотношение массы листьев и корней. Как уже отмечалось вы ше, инокуляция замачиванием семян, стимулируя развитие корневой систе мы, практически не затрагивала листья. Более того, биомасса листьев в ре зультате инокуляции даже несколько уменьшилась. За счет этого отношение массы листьев к массе корней в данном случае равнялось 0,03. Для сравне ния, то же соотношение для неинокулированных растений на загрязненной почве составляло 0,26.
Гораздо лучшие результаты были получены при внесении бактерий ме тодом полива всходов. Обработанные таким образом растения развивались значительно лучше как по абсолютным показателям, так и по соотношению листья/корни — в данном случае оно составило 0,49, в первую очередь за счет значительно лучшего развития листьев.
2.3 Изучение воздействия инокуляции R. planticola на развитие растений разных видов Взаимодействие растений и микроорганизмов — достаточно сложный процесс, особенности которого зависят от множества факторов, в том числе и от видовой принадлежности участвующих в нем организмов. Вероятно, именно с этим были связаны некоторые различия в результатах, полученных при инокуляции разных видов растений в одинаковых условиях.
Так, в наших опытах, в результате инокуляции длина листьев при куль тивировании на дерново-подзолистой почве падала вне зависимости от нали чия ТМ. Единственный вариант, в котором длина листьев “Золушки” при инокуляции увеличилась — незагрязненный речной песок. В то же время, при инокуляции травосмеси на песке и дерново-подзолистой почве наблюда лось увеличение длины листьев, падение отмечалось только на торфе. При этом оно было заметно меньше, чем у “Золушки”.
С проективным покрытием ситуация была иной. На торфе оба исследо ванных типа растений показали практически одинаковые результаты. Однако на дерново-подзолистой почве изменения, вызванные бактеризацией в разви тии растений “Золушки” и травосмеси, весьма различались.
Таким образом, можно заключить, что инокуляция несколько по разному влияет на различные виды растений, однако основные закономерно сти, такие как стимулирующее действие при загрязнении грунтов тяжелыми металлами, сохраняются.
2.4 Изменение реакции растений на инокуляцию в зависимости от типа субстрата На различных субстратах (почва, торф и песок), как загрязненных, так и нет, влияние инокуляции на растения заметно отличатся. В частности, длинна листьев инокулированных растений, выросших на низинном торфе, была меньше, чем у неинокулированных, как в вариантах с тяжелыми метал лами, так и без них. Для торфа так же было характерно очень сильное паде ние проективного покрытия при загрязнении ТМ, как для травосмеси, так и для “Золушки”.
Речной песок был единственным типом грунта, на котором инокуляция привела к росту длины листьев и увеличению проективного покрытия на субстрате без ТМ у всех растений, однако в целом он оказался самым небла гоприятным, растения на нем имели минимальную длину листьев и проек тивное покрытие, а так же наименее развитую корневую систему. Вероятно, причиной этого было малое количество нутриентов в песчаной почве, а так же низкая обменная емкость песка.
Данные по дерново-подзолистой почве оказались весьма неоднознач ными. С одной стороны, “Золушка” на данной почве отреагировала на ино куляцию некоторым падением длинны листьев и увеличила проективное по крытие. С другой — травосмесь на той же почве в результате инокуляции не сколько увеличила длину листьев, тогда как увеличение проективного по крытия отмечалось только в варианте без ТМ, причем весьма незначитель ное.
Таким образом, можно сделать вывод, что различные типы грунта, в которых выращиваются растения, так же влияют на последствия инокуляции.
При этом, однако, наблюдавшиеся ранее закономерности, как связанные с видовыми особенностями растений (например, падение длины листьев на торфе у травосмеси было меньше, чем у “Золушки”), так и с реакцией расте ний на внесение тяжелых металлов сохраняются.
3 Изучение влияния бактеризации на распределение ТМ в системе почва-растение Изучение влияния симбиотических микроорганизмов на поглощение и накопление тяжелых металлов растением весьма важно для практического применения микробных биопрепаратов. Имеющиеся в литературе данные достаточно противоречивы. Разные исследователи наблюдали в результате Рисунок 5. Влияние загрязнения почвы солями тяжелых металлов и инокуляции раз личными методами на содержание меди в растениях овсяницы красной сорта “Золуш ка”. А – концентрация меди в листьях (мкг/кг сухой массы);
Б – концентрация меди в корнях (мкг/кг сухой массы).
инокуляции симбиотическими микроорганизмами как увеличение (Weinstein, 1995), так и снижение накопления растениями ТМ (Malcova et al., 2003;
Al Garni, 2005). Относительно R. planticola имеются данные, свидетельствую щие, что она способна значительно снижать поступление кадмия в ткани рас тений (Емцев и др, патент;
Соколова, 2006). Для того, чтобы уточнить, как R.
planticola влияет на поступление других тяжелых металлов в растениях, нами было изучено влияние инокуляции на накопление меди и цинка в растениях овсяницы сорта “Золушка” на дерново-подзолистой почве.
На рис. 5 показано, как инокуляция влияет на концентрацию меди в корнях и листьях овсяницы, определенную при помощи атомно абсорбционного анализа. Как видно из рисунка, концентрация Cu в растениях на загрязненной почве оказалась более чем на порядок большей, чем на неза грязненной. Концентрация Cu в корнях, как на загрязненной, так и на неза грязненной почве так же оказалась выше, чем в листьях почти в 10 раз.
Однако при этом как в корнях, так и в листьях инокуляция в большин стве случаев привела не к уменьшению, а к увеличению количества накоп ленной в тканях растения меди. Как видно из графика (рис. 7, Б), как иноку ляция замачиванием, так и инокуляция поливом привели к весьма заметному увеличению концентрации меди в корнях. При этом и в том и в другом слу чае прирост был практически одинаков (+76,9% при инокуляции замачивани ем, +78,5% при инокуляции поливом). В то же время, динамика накопления Cu в листьях (рис. 7, А) оказалась не столь однозначной: инокуляция замачи ванием вызвала рост более чем на 100% относительно неинокулированного контрольного варианта, тогда как инокуляция замачиванием — снижение на 22%.
Аналогичные данные были получены и по концентрации цинка. Ино куляция растений привела к росту концентрации цинка в корнях, составив шему при инокуляции поливом 73 %.
Таким образом, инокуляция стабильно увеличивала концентрацию Cu и Zn в корнях, кроме того, инокуляция замачиванием увеличивала концен трацию этих металлов в листьях, тогда как инокуляция поливом снижала.
Возможно, полученные данные объясняются тем, что R. planticola, стимулируя общее развитие растительного организма, так же стимулирует работу некоторых его защитных систем, функционирование которых приво дит к накоплению ТМ в тканях и органах.
Выводы:
1. Установлено, что интродуцированные в ризосферу растений овся ницы различных видов, бактерии Raoultella planticola, штамм ТСХА-91 AmpR могут оказывать ростостимулирующее воздействие, компенсируя негативное влияние загрязнения почвы солями тяжелых металлов (Pb, Cu, Zn) на расте ния. При этом максимальное стимулирующее воздействие инокуляция ока зывает на корневую систему, ее масса на загрязненной почве может увели читься более чем в 4 раза по сравнению с неинокулированной. Проективное покрытие растений в результате интродукции бактерий так же заметно уве личивается (на 30 – 100%).
2. Показано, что внесение в почву тяжелых металлов снижает интен сивность миграции бактерий R. planticola в корни растений. В то же время, загрязнение тяжелыми металлами и ксенобиотиками стимулирует увеличе ние общей численности ассоциативных диазотрофов за исключением R. plan ticola в тканях корней и листьев растений.
3. Выявлено, что выращивание растений, инокулированных R. planti cola на загрязненной тяжелыми металлами почве, оказывает положительное влияние на почвенную микрофлору, увеличивая интенсивность дыхания (субстратиндуцированного дыхания – на 28% относительно варианта без инокуляции, базального — в 50 раз) и микробную биомассу (+ 28%), а так же нормализуя метаболический коэффициент.
4. Выявлено, что растения овсяницы красной сорта “Золушка”, иноку лированные R. planticola, накапливают в корнях больше меди и цинка, чем неинокулированные. Увеличение концентрации может достигать 73% при инокуляции по Zn и 78% по Cu.
5. Установлено, что основные эффекты бактеризации, такие как общее стимулирующее влияние на растения, культивируемые на загрязненной поч ве и значительно более сильное стимулирующее влияние на корневую систе му, сохраняются на разных типах грунта (песок, торф или почва), при воз действии разных типов загрязнителей (соли ТМ или фосфорорганический пестицид), а так же на растениях разных видов.
6. Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что инокуляция бактериями Raoultella planticola, штамм ТСХА-91 AmpR, может обеспечить повышение жизнеспособности газонных трав в условиях загрязнения грунта ТМ и органическими ксенобиотиками, характерного для современного города. При этом инокуляция методом полива всходов более эффективна, чем инокуляция при помощи замачивания семян. Следует, одна ко, учесть, что инокуляция приводит к повышению концентрации тяжелых металлов в тканях обработанных растений. Это несколько ограничивает при менение R. planticola для защиты кормовых и пищевых растений, однако де лает данный метод защиты растений весьма перспективным для фитореме диации почв.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Колесников О.В., Тимохина Т.П. Влияние бактеризации на устойчи вость растений к тяжелым металлам // Известия ТСХА, N4, –2011. C.
24 – 29.
2. Колесников О.В., Тимохина Т.П. Исследование протекторных свойств биопрепарата “Биоплант-К” на почвах, загрязненных тяжелыми метал лами // Информационное пространство современной науки. Материалы II международной заочной научно-практической конференции. 18 сен тября 2010 года. Отв. ред. Волкова М.В. Чебоксары, НИИ педагогики и психологии, –2010 г, с. 156 – 159.
3. Колесников О.В., Тимохина Т.П. Влияние инокуляции Klebsiella planti cola на устойчивость растений к ксенобиотикам // Сборник молодежно го научного экологического форума "Анализ причин и последствий за сухи и пожаров 2010 года: приоритетные проблемы и пути их реше ния", М. –2010, с. 10 – 12.