Структурно-функциональный анализ каталитического антитела а.17. каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон.

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

_

на правах рукописи

Куркова Инна Николаевна

Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17.

Каталитический механизм деградации фосфорорганического

пестицида параоксон.

Специальность: 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Научные руководители:

доктор биологических наук Пономаренко Наталья Александровна кандидат химических наук Смирнов Иван Витальевич

Официальные оппоненты:

Деев Сергей Михайлович доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, заве дующий лабораторией молекулярной иммунологии Института биоорганиче ской химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ИБХ РАН) Демидкина Татьяна Викторовна доктор химических наук, профессор, заведующая лабораторией химиче ских основ биокатализа Института молекулярной биологии им. В. А. Энгель гардта (ИМБ РАН).

Ведущая организация: Учреждение Российской Академий Наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « » 2011 года в _ часов на заседании диссерта ционного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганиче ской химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу:

117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан «_» 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В.А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Поиск эффективного антидота, способного нейтрализо вать фосфорорганические токсины (ФОТ), остается актуальной проблемой молекуляр ной биологии и биотехнологии. Самыми многообещающими среди прочих в этой об ласти являются разработки препаратов на основе ферментов. Ферменты, участвующие в метаболизме ацетилхолина, являются основными мишенями ФОТ в организме человека.

На сегодняшний день бутерилхолинэстераза (BChE) считается перспективным средст вом антидотной профилактики и лечения отравлений ФОТ. Существующие в данный момент промышленные системы экспресии BChE дороги, недостаточно эффективны и требуют существенного улучшения. В настоящее время рекомбинантные антитела ши роко применяются как терапевтические агенты и имеют ряд преимуществ перед фер ментами в качестве лекарственных средств. Потенциальный антидот на основе катали тического антитела (абзима) будет сочетать в себе свойство фермента способность эффективно осуществлять катализ с низкой иммуногенностью, продолжительным пе риодом циркуляции в кровотоке и действенными механизмами выведения из организма в составе комплекса антиген-антитело, характерными для молекул иммуноглобулинов.

В связи с этим создание «каталитической» вакцины – каталитического антитела, спо собного нейтрализовать ФОТ, актуально. Кроме того, изучение механизма катализа подобных искусственных ферментов представляет собой самостоятельную, весьма ин тересную с точки зрения фундаментальной науки проблему.

Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в проведении структурно функционального анализа каталитического антитела А.17, полученного ранее в лабора тории биокатализа методом фагового дисплея. Вариабельные домены данного антитела были отобраны из полусинтетической библиотеки генов одноцепочечных антител по принципу «механизм-зависимого» связывания с п-нитрофенил 8-метил-8 азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (фосфонатом Х), аналогом ФОТ по механиз му действия на сериновые гидролазы. Кроме того, самостоятельной задачей представ ленной работы стало изучение каталитического механизма деградации ФОТ на примере фосфорорганического пестицида параоксон.

Научная новизна и практическая значимость работы. Полученные в ре зультате работы данные позволили существенно продвинуться в понимании структур ной организации активного центра искусственно полученного биокатализатора имму ноглобулиновой природы. Впервые разрешена структура как Fab фрагмента каталити ческого антитела А.17 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната Х. Комплекс ное физико-химическое исследование позволило предположить осуществление меха низма индуцированного соответствия при взаимодействии А.17 с фосфонатом Х. Изу чение функциональной активности абзима позволило выявить его способность уско рять гидролиз фосфорорганического пестицида параоксон. Было показано, что данное превращение осуществляется по пути ковалентного катализа. Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А.17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на 3-ей между народной конференции «Ранние события при патологиях человека» (Барбизон, Фран ция, 2010), 35-м конгрессе FEBS (Гетеборг, Швеция, 2010), 36-м конгрессе FEBS (Ту рин, Италия, 2011), 21-м IUBMB и 12-м FAOBMB Международном конгрессе Биохимии и Молекулярной биологии (Шанхай, Китай, 2009). По материалам работы вышли 3 ста тьи в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах ма шинописного текста и состоит из разделов введение, обзор литературы, эксперимен тальная часть, включающая разделы «результаты и их обсуждение» и «материалы и ме тоды», выводы, дополнительные материалы и список цитируемой литературы, содер жащий 149 ссылок. В работе содержится рисунка и таблиц.

Содержание работы Одноцепочечное антитело А.17 взаимодействует с фосфорорганиче ским пестицидом параоксон Каталитическое антитело А.17 было отобрано из фаг-дисплейной библиотеки генов одноцепочечных антител по способности связывать механизм-зависимый ингибитор сериновых гидролаз и ацетилхолинэстеразы фосфонат Х (Рис.1). Методом масс-спектрометрии было показано, что модификации подвергается MALDI аминокислотный остаток Tyr37 легкой цепи (Reshetnyak et al, J Am Chem Soc, 2007).

Представлялось значимым и интересным проверить связывание и каталитические функции данного антитела по отношению к ряду ФОТ. На первом этапе настоящей работы было показано, что реакция одноцепочечного антитела А.17 с биотинилированным производным фосфоната Х (Bt-X) ингибируется диизопропилфтор фосфатом бензилсульфонил фторидом (AЭБСФ) и (ДФФ), 4-(2-аминоэтил) инсектицидом параоксон (Рис. 1). Детекцию взаимодействия проводили с помощью Вестерн блот анализа, результаты приведены на рисунке 2.

Рис. 1. Химические структуры фосфорорга нических соединений, использованных в ра п-нитрофенил боте: 1 8метил-8 азабицикло[3.2.1]октил фенилфосфонат (R=H фосфонат X, R= биотин Bt-X), 2 дии зопропил фторфосфат (ДФФ), 3 4-(2 аминоэтил) бензилсульфонил фторид (АЭБСФ), 4 2-диэтоксифосфорилтиоэтил О,О триметиламмониум (экотиофат), диэтил О-(4-нитрофенил) фосфонат (пара оксон), 6 О-(4-нитрофенилфосфорил)холин.

Рис. 2. Вестерн блот анализ ингибирования связывания одноцепочечного антитела scFv А.17 с биотинилированным фосфонатом Х необратимыми ингибиторами. Во всех слу чаях концентрация активных центров анти тел составляла 1 мкМ, концентрация Bt-X 100 мкМ, концентрация ингибиторов 1 мМ, реакция проходила в течение часа при 37оС, объем реакционной смеси 20 мкл. Предин кубация осуществлялась при 37оС. Время прединкубации составляло 1 час для всех ингибиторов, кроме экотиофата и параоксо на. Для последних время прединкубации составляло 12 часов. Визуализацию кова лентного аддукта с Bt-X осуществляли ок рашиванием стрептавидином, конъюгиро ванным с пероксидазой хрена (Strept-HRP). Концентрация антител нормирована по сравни тельной окраске антителами, специфичными к с-myc эпитопу на аналогичной мембране.

А.17Y-L37F отрицательный контроль – мутантное одноцепочечное антитело.

Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А. Для одноцепочечных антител известны проблемы экспрессии, протеолитической лабильности и фолдинга (в том числе склонность к агрегации). Полноразмерное антитело предпочтительнее использовать в качестве терапевтического агента в связи с большим периодом его циркуляции в кровотоке и его способностью запускать гуморальные и клеточные эффекторные механизмы выведения комплексов с антигеном.

При перестановке конструкций одноцепочечных антител в полноразмерные иммуноглобулины класса G специфичность антиген связывающего центра обычно сохраняется, а аффинность может возрастает благодаря бивалентной природе IgG.

В продолжение работы вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей А.17 бы ли переклонированы в вектора для экспрессии в виде полноразмерных легкой и тяже лой цепей в эукариотической системе.

При этом вариабельный фрагмент легкой цепи А.17 был переклонирован для экс прессии в виде полноразмерной каппа 1 цепи иммуноглобулина человека под контро лем иммуноглобулинового промотера.

Экспрессионный вектор с сайтами клонирования вариабельного фрагмента легкой цепи антитела (pSV40/Zeo2 Lch) был получен модификацией вектора pSV40/Zeo (Invitrogen). Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность лидерного пептида для легких цепей антитела (L prom leader MVSTPQFLVFLLFWIPASRG), был синтезиро ван методом ПЦР с использованием трех олигонуклеотидов с перекрывающимися по следовательностями. Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность константного региона каппа 1легкой цепи иммуноглобулина человека (kappa chain), был получен ам плификацией с помощью ПЦР, используя геномную ДНК человека в качестве матрицы и пару специфических праймеров. Участок ДНК, кодирующий вариабельный фрагмент легкой цепи антитела А.17 (Vl A.17), амплифицировали с помощью ПЦР с использова нием плазмиды pHEN2, несущей нуклеотидную последовательность, кодирующую scFvА.17 (pHEN2A.17), в качестве матрицы и пары специфических праймеров.

В свою очередь, вариабельный фрагмент тяжелой цепи А.17 был переклонирован для экспрессии в виде полноразмерной гамма 1 цепи иммуноглобулина человека также под контролем иммуноглобулинового промотера.

Экспрессионный вектор с сайтами клонирования вариабельного фрагмента легкой цепи антитела (pcDNA.1.3.HygroНch) был получен модификацией вектора pcDNA.1.3.Hygro (Invitrogen). Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность лидер ного пептида для тяжелых цепей антитела (H prom leader MERHWIFLSLLSVIAGVHS), был синтезирован методом ПЦР с использованием трех олигонуклеотидов с перекрывающимися последовательностями. Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность константного региона гамма 1 тяжелой цепи имму ноглобулина человека (gamma chain), был амплифицирован с помощью ПЦР, исполь зуя в качестве матрицы геномную ДНК человека и две пары специфических праймеров.

ПЦР-амплификацию фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела А.17 (Vh A.17), осуществляли с использованием в качестве матрицы pHEN2A.17 и специфических праймеров.

Схема полученных генетических конструкций А.17 и pSV40/Zeo2 Lch pcDNA.1.3Hygro Нch А.17 представлена на рис.3.

Vl A.17 L prom leader BGH polyA SV40 promoter gamma chain SV40 promoter EM7 promoter Zeocin kappa chain Hygromycin pSV40/Zeo2 Lch A.17 pcDNA3.1Hygro Hch A SV40polyA 59 04 bp 7213 bp kappa exon VhA. Hprom leader SV40 polyA pUC ori Amp ampicillin pUC ori Рис. 3. Схема генетических конструкций для экспрессии полноразмерных легкой и тяжелой цепей антитела А.17 в эукариотической системе.

Полученными генетическими конструкциями была проведена ко-трансфекция кле точных линий CHO-К1 и миеломы NSObcl2. В результате селекции с использованием антибиотиков зеоцин и гигромицин были получены 5 стабильно продуцирующих кло нов трансфектом. Уровень продукции рекомбинантных антител оценивали методом ИФА по схеме sandwich ELISA. Для каждого клона были подобраны оптимальные ус ловия экспрессии. Для лучшего клона 2В5 из трансфектом клеток линии СНО-К1 среда DMEM, содержащая 2% фетальной сыворотки, и среда Pro-CHO4 (Lonza) являются оп тимальными, концентрация человеческих антител в культуральной среде достигает максимума на 8 день и составляет 10 мг/мл. Для лучшего клона 2G3 из трансфектом клеток линии NSO-bcl2 оптимальной является среда DMEM-RPMI (Gibco) 50% на 50%, содержащая 2% фетальной сыворотки. Концентрация человеческих антител в этой культуральной среде достигает 18 мг/мл на 8 день.

Затем была разработана система экспрессии антитела А.17 в препаративных коли чествах. Для этого были использованы культуральные флаконы большой площади ( и 225 см2), роллеры (1700 см2) и спиннеры с микроносителями. Оптимальной по соот ношению «выход целевого белка затраты» и чистоте финального продукта была при знана экспрессия в культуральных флаконах площадью 225 см2 на бессывороточной среде Pro-CHO4, в процессе культивирования удалось добиться уровня экспрессии мг антитела с литра для клона 2В5 клеточной линии CHO.

Культуральную среду собирали, центрифугировали, супернатант фильтровали че рез бумажные фильтры. Осветленную культуральную среду подвергали ультрафильт рации на приборе Pellicon (Millipore) на мембранах 300 кДа. При этом отделяли остатки клеточного дебриса и высокомолекулярные соединения. Далее фильтрат концентриро вали на мембранах 30 кДа в 10 20 раз по объему и переводили под буферный раствор PBS. Полученный концентрат был последовательно очищен методом аффинной хрома тографии на колонках с иммобилизованным белком А и иммобилизованными антите лами козы, специфичными к иммуноглобулинам человека, после чего осуществляли гель-фильтрацию на колонке Superdex 200 (Amersham). Выход целевого белка оцени вался методом ИФА и составил 70%. Чистоту полученного продукта оценивали с ис пользованием денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ в восстанавливающих ус ловиях с последующей окраской Кумассии синим R250, чистота достигала 95% (Рис.

4).

Рис. 4. Электрофореграмма денатурирующего 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Ку массии синим R250 (А) и Вестерн-блот анализ (Б) очищен ного препарата полноразмерного рекомбинантного антите ла А.17 из среды культивирования трансфектомы 2В5 кле точной линии СНО. Визуализацию осуществляли с исполь зованием антител козы, специфичных к Fc фрагменту (верхняя панель) и каппа цепи (нижняя панель) антител человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. М мар кер молекулярных весов.

Сравнение функциональной активности одноцепочечного и пол норазмерного антитела А. Анализ реакционной способности показал, что вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей А.17, экспрессированные в составе полноразмерного антитела человека, сохранили способность взаимодействовать с небиотинилированным фосфонатом Х.

Оценка кинетических параметров этого взаимодействия с использованием схемы Кит ца-Вилсона показала, что реакционная способность полноразмерного антитела значи тельно выше по сравнению с опубликованными ранее данными для одноцепочечного антитела (таблица 1).

Таблица 1. Кинетические параметры реакции одноцепочечного и полноразмерного антитела A.17 с фосфонатом Х (по схеме Китца-Вилсона). Измерение проводили при 37оС, концентрация активных центров A.17 1 мкМ, концентрацию фосфоната Х варьировали от 10 до 100 мкM.

-1 - k2/KДис, мин M - Абзим k2, мин KДис, мкМ - x 0.32± 0.05 151± 21 0.21± 0. scFv A. 0.25 ± 0.02 6.2 ± 0.4 4.0 ± 0. A.17 IgG При этом эффективность модификации полноразмерного антитела увеличилась более чем в 10 раз по сравнению с одноцепочечным А.17. Такое увеличиние эффектив ности модификации достигается за счет образования более прочного нековалентного комплекса антитела с фосфонатом Х, что, по всей видимости, связано с лучшей стаби лизацией антиген-связывающего участка полноразмерного антитела. Незначительное снижение к2, т.е. скорости перехода обратимого комплекса с ингибитором в ковалент ный, возможно связано с тем, что константные участки легких и тяжелых цепей ограни чивают подвижность вариабельных участков молекулы в активном центре.

Методом масс-спектрометрии MALDI было установлено, что ковалентная модифи кация полноразмерного антитела А.17 фосфонатом Х происходит по тому же пептид ному участку легкой цепи иммуноглобулина, что и в случае одноцепочечного антитела.

Было показано, что полноразмерное антитело сохранило способность взаимодейст вия с биотинилированным производным фосфоната Х и субстратную специфичность по отношению к аналогам ФОТ, сравнимую с одноцепочечным А.17. В обоих случаях модификация фосфонатом Bt-X ингибируется ДФФ, АЭБСФ и параоксоном, тогда как ингибирование отсутствует в случае экотиофата (Рис.5). Интересно, что химические структуры экотиофата и параоксона довольно схожи. Отсутствие взаимодействия с экотиофатом может быть объяснено различными свойствами химических связей P-S и P-O. По-видимому, нуклеофильная атака со стороны гидроксила боковой группы Tyr легкой цепи антитела оказывается более эффективной в случае более поляризованной связи Р-О. Возможно также, что продуктивному позиционированию молекулы экотио фата в активном центре А.17 мешает его заряженная боковая группа. Полученные дан ные демонстрируют субстратную селективность активного центра изучаемого искусст венного биокатализатора.

Рис. 5. Вестерн блот анализ ингибирования свя зывания одноцепочечного (scFvА.17) и полно размерного антитела А.17 с биотинилированным фосфонатом Х необратимыми ингибиторами. Во всех случаях концентрация активных центров ан тител составляла 1 мкМ, концентрация Bt-X мкМ, концентрация ингибиторов о мМ, реакцию проводили в течение часа при 37 С, объем реак ционной смеси 20 мкл. Прединкубация осуществ лялась при 37оС. Время прединкубации составля ло 1 час для всех ингибиторов, кроме экотиофата и параоксона. Для последних время прединкуба ции составляло 12 часов. А.17Y-L37F отрица тельный контроль – мутантное одноцепочечное антитело. Визуализацию ковалентного аддукта с Bt-X осуществляли окраской стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена. Концен трацию антител нормировали по сравнительной окраске антителами, специфичными к с-myc эпи топу, на аналогичной мембране в случае scFv и антителами, специфическими к Fc фрагменту тя желой цепи антитела человека, на той же мем бране в случае полноразмерного антитела.

Для изучения молекулярных основ механизма катализа абзима перспективным представлялось проведение рентгеноструктурного анализа Fab фрагмента этого анти тела.

Структурный анализ антитела А. Кристаллизация осуществлялась в лаборатории П. Массона в Гренобле, Франция.

Детальный анализ структуры был произведен в сотрудничестве с профессором А. Тра монтано (Дэвис, Калифорния), профессором А. Фрибуле (Компьень, Франция) и лабо раторией профессора А.Г. Габибова в рамках проекта НАТО «Наука для мира». Струк туры Fab фрагмента антитела А.17 и его аддукта с остатком фосфоната Х были установ лены с разрешением 1.5 и 1.36 соответственно. Координаты атомов и эксперимен тальные структурные факторы депонированы в Банк белковых структур (Protein Data Bank) с идентификационным кодом 2XZA и 2XZC.

Пространственная структура Fab фрагмента антитела А. Антигенсвязывающий центр антитела образован тремя -тяжами вариабельного фрагмента легкой и четырьмя -тяжами вариабельного фрагмента тяжелой цепи. Со вместно они образуют глубокую полость, в формировании стенки которой так же участ вует петля Leu99-Gly110 тяжелой цепи. Полость пространственно разделена на две «камеры» (Рис.6А-В). В составе верхней камеры выделяется группа ароматических аминокислотных остатков, в том числе пять тирозинов (Tyr-H33, 53, 59;

Tyr-L33, 50) и триптофан Trp-L92. Подобные кластеры тирозиновых аминокислотных остатков явля ются характерной чертой антител, специфичных к ДНК и другим фосфорным эфирам.

Нижняя камера содержит ароматические аминокислотные остатки Phe-L100, Trp-H48 и Trp-H109, формирующие гидрофобный карман, и Tyr-L37, находящийся на дне полости (Рис.6Г). Боковая цепь Tyr-L37 ориентирована в сторону CDR3 тяжелой цепи. Такое глубинное, скрытое от растворителя, расположение реакционного тирозина согласуется с его повышенной нуклеофильностью. Суммарная глубина антигенсвязывающего кар мана составляет 15. Столь глубокий активный центр нетипичен для каталитических антител и более характерен для каталитических центров холинэстераз, в частности бу тирилхолинэстеразы (Рис. 7).

Петля Leu99 Gly110 тяжелой цепи, содержащая остатки His-H104, Asn-H105 и 50 2, в Trp-H109, представляет собой неупорядоченную структуру с В-фактором сравнении со средним В-фактрором 19 2. Низкий уровень упорядоченности, по видимому, связан со слабым взаимодействием аминокислотных остатков этой петли с коровыми структурами.

Рис. 6. Структурный анализ Fab А.17. Активный центр антитела состоит из двух камер. Изображение -цепи, на фоне которой выделены верхняя (А) и нижняя (Б) камеры и образованный ими совместно сигмовидный карман (В). Легкая цепь показана голу бым, тяжелая зеленым цветом (А-В). Вид сверху с отображением ароматических аминокислотных ос татков, формирующих стены верхней и нижней ка мер, а так же тирозина 37 легкой цепи в Fab фрагменте А.17 (Г). Легкая цепь показана серым, тяжелая цепь сиреневым, петля 3CDR тяжелой це пи малиновым.

Рис.7. Сравнение глубин полостей активных центров биокатализаторов различной природы.

TEPC-15 и 49G7 эстеролитических антител, 33F12 альдолазное антитело, AChE и BChE ацетил- и бутерил- холин эстеразы. В каждом случае глубина активного центра соответствует высоте пирамиды, вписанной в полость активного центра таким образом, что ее вершина сов падает с реакционным остатком, а основание лежит в плоскости, проведенной через три ами нокислотных остатка ближайших ко входу в активный центр биокатализатора.

Пространственная структура Fab фрагмента антитела А.17, модифи цированного фосфонатом Х При анализе структуры ковалентного аддукта Fab фрагмента антитела А.17 с ос татком фосфоната Х было установлено, что длина связи Р-О составяет 1.6. Фенильная группа фосфоната направлена к поверхности вариабельного участка легкой цепи, в то время как его тропинольная группа обращена к поверхности вариабельного участка тя желой цепи. Абсолютная конфигурация аддукта Р(S). Учитывая, что фосфонилирование может осуществляться только в одном направлении (подход фосфоната Х к реакцион ному тирозину возможен только в единственной пространственной ориентации из-за конфигурации активного центра), каталитическое антитело обладает стереоспецифич ностью по отношению к его Р(R) энантиомеру. Таким образом, вероятнее всего при взаимодействии А.17 с фосфонатом Х реализуется SN2 механизм реакции. Фенольное кольцо фосфоната в составе ковалентного аддукта погружено в карман, образованный основной цепью Gly-L90 Thr-L91 и боковыми цепями Ser-L35, Trp-L92, Pro-L98, Phe L100, и при этом осуществляет Т-стэккинг взаимодействие с Trp-L92 и Phe-L100 (Рис.

8А). Одновременно с модификацией тирозина индуцируется вращение фенильной груп пы фосфоната на угол 2 равный 20°, сдвиг Trp-L92 на 0.4 и вращение вокруг Phe L100C на 10°. Благодаря этим изменениям угол, образованный C-C-C боковой цепи Tyr-L37, уменьшается на 5° по сравнению с исходной позицией. Высвобождение этого напряжения может являться движущей силой при дефосфорилировании Tyr-L37.

Атом азота тропинольного кольца фосфоната формирует сильную водородную связь (2.79 ) с атомом кислорода основной цепи аминокислотного остатка Asn-H (Рис. 8А). За счет этого сильного взаимодействия петля CDR3 варибельного участка тя желой цепи стабилизируется в уникальной конформации, В-фактор становиться равным 25 2. Атом кислорода связи Р-О прочно соединен водородной связью с молекулой воды w614 (2.55 ). Таким образом, связь Р-О оказывается сильно поляризованной, следствием чего является повышенная электрофильность атома фосфора. Сгусток элек тронной плотности непосредственно за фосфонилированным тирозином смоделирован как кластер молекул воды. Этот кластер располагается на расстоянии меньшем, чем от атома фосфора, и представляется потенциальным участником возможной гидролити ческой атаки аддукта тирозина. Tyr-Н34 так же может играть значительную роль при фосфорилировании за счет стекинг-взаимодействия между его ароматическим кольцом и п-нитрофенольной уходящей группой.

Сайт-направленный мутагенез антитела А.17. Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов Основываясь на данных, полученных в результате структурного анализа, был проведен рациональный дизайн вариантов мутагенеза абзима с целью детализации осо бенностей его каталитического механизма.

Рис.8. (А) Наложение активных центров Fab A.17 (зеленый цвет) и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната Х (синий), иллюстрирующее изменения в положении аминокислотных ос татков Tyr-L37, Trp-L92, Phe-L100 и петли CDR3 тяжелой цепи (His-H104, Asn-H105, Ala-H107 и Trp-H109). Остаток фосфоната показан красным. (Б) Кластер молекул воды в активном центре фосфонилированного Fab A.17. Молекула воды w614 образует прочную Н-связь с кислородом Р=О фосфонила. В свою очередь Tyr-H34 стабилизирует группу из 6 молекул воды, форми рующих сеть Н-связей. Легкая цепь антитела показана серым цветом, тяжелая голубым, ос таток фосфоната – зеленым. Водородные связи обозначены пунктирными линиями.

Было предложено провести замену на аланин аминокислотных остатков петли CDR3 тяжелой цепи His-H104 и Asn-H105, участвующего в формировании Н-связи с азотом тропинольного кольца в структуре модифицированного фосфонатом Fab фрагмента. В данном случае стабилизация обеспечивается формированием водородной связи между основной цепью 105-го остатка и азотом тропинольного кольца, тем не ме нее, замена боковой цепи этого и соседнего аминокислотных остатков может опосредо ванно повлиять на стабилизации за счет вторичных взаимодействий. Мутагенез 33 и тирозинов легкой цепи антитела с заменой на фенилаланин для одноцепочечного анти тела был осуществлен ранее (Reshetnyak et al., J Am Chem Soc, 2007). Позиции для за мены были определены аминокислотными остатками, модифицирующимися фосфона том Х в реакционных клонах (Y-L33 – во всех клонах, кроме А.17, Y-L37 в клоне А.17), отобранных из библиотеки scFv. В настоящей работе эти мутантные варианты легких цепей А.17 были переклонированы в виде полноразмерных легких и тяжелых цепей для экспрессии в эукариотической системе.

Мутагенез аминокислотных остатков петли CDR3 тяжелой цепи осуществляли, используя в качестве матрицы последовательность одноцепочечного антитела А.17 в фагемиде pHEN2. Фрагменты ДНК, содержащие замены аминокислотных остатков, по лучали методом удлинения перекрывающихся ПЦР-продуктов. Далее вариабельные фрагменты мутантных легких и тяжелых цепей были переклонированы в виде полно размерных легких и тяжелых цепей для экспрессии в эукариотической системе анало гично цепям дикого типа антитела А.17. Полученными генетическими конструкциями была проведена ко-трансфекция клеточной линии CHO-К1. Селекцию и отбор стабиль но продуцирующих клонов трансфектом осуществляли аналогично описанной выше процедуре для трансфектом, продуцирующих антитело А.17 дикого типа. Для каждого клона были подобраны оптимальные условия экспрессии. Уровень продукции рекомби нантных антител в культуральных флаконах площадью 225 см2 для лучших клонов, экс прессирующих А.17Н-Н104А, составил 6 мг с литра бессывороточной среды Pro-CHO на 8 день экспрессии, для А.17N-H105A 2 мг/литра, для А.17D-H106A 0,6 мг/литра, для А.17Y-L33F и А.17Y-L37F 6 и 8 мг/литра соответственно. Для очистки целевых белков использовали протокол, разработанный ранее для полноразмерного антитела А.17 дикого типа. Выход целевого белка варьировался в пределах 60-70%, чистота пре паратов мутантных полноразмерных антител составляла 95% (оценивали с использова нием денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумассии синим R250).

Результаты Вестерн блот анализа взаимодействия мутантных антител с BtХ и ин гибирования ковалентного мечения в присутствии ингибиторов демонстрируют сход ный характер модификации с абзимом дикого типа (Рис.9). Замена тирозина 37 легкой цепи на фенилаланин приводит к полной потере способности каталитического антитела ковалентно модифицироваться фосфонатом Х и его биотинилированным аналогом (Рис.9, таблица 2). Анализ кинетики взаимодействия мутантных антител с фосфонатом по схеме Китца-Вилсона (таблица 2) показал, что в случае мутанта А.17Н-Н104А, эф фективность модификации снизилась в два раза. При этом константа KДис практически не изменилась, т.е. замена боковой цепи 104 остатка практически не сказывается на ста дии формирования обратимого комплекса антитела с субстратом. В то же время k2 сни зилась почти в два раза. Следует отметить, что в немодифицированном активном центре боковая цепь His-H104 электростатически взаимодействует с боковой группой Asp H106 (расстояние 3.2, мостик через молекулу воды). Из анализа структурных данных известно, что в нативном Fab петля H-CDR3 находится в разупорядоченном состоянии, т.е. указанное взаимодействие не фиксирует положение петли в целом. После модифи кации индольное кольцо гистидина разворачивается, разрывая контакт со 106 остатком.

В то же время возникает новое взаимодействие с Thr-H100, которое, наряду с заякори ванием тропинольного кольца фосфоната основной цепью 105 остатка и стабилизацией фенильной группы за счет стэккинг-взаимодействий в гидрофобном кармане активного центра, вносит вклад в стабилизацию петли CDR3. Вероятно, невозможность формиро ваний этой связи в случае замены боковой цепи His на короткую алифатическую группу затрудняет переход обратимого комплекса в ковалентный по сравнению с диким типом.

Рис.9. Вестерн блот анализ ингибирования связывания полноразмерного антитела А.17 и его мутантов с биотинилированным фосфонатом Х необратимыми ингибитора ми. Во всех случаях концентрация актив ных центров антител составляла 1 мкМ, концентрация Bt-X 100 мкМ, концентрация ингибиторов 1 мМ, ореакцию проводили в течение часа при 37 С, объем реакционной смеси 20 мкл. Прединкубация осуществля лась при 37оС. Время прединкубации со ставляло 1 час для всех ингибиторов, кро ме экотиофата и параоксона. Для послед них время прединкубации составляло часов. Визуализацию ковалентного аддукта с Bt-X осуществляли окраской стрептави дином, конъюгированным с пероксидазой хрена. Концентрацию антител нормирова ли по сравнительной окраске антителами, специфичными к Fc фрагменту тяжелой цепи антитела человека, на той же мем бране.

Таблица 2. Кинетические параметры реакции A.17, его мутантов и BChE с фосфонатом Х (по схеме Китца-Вилсона).

k2/KДис, мин KДис, - Абзим/фермент k2, мин 1 -1 - мкМ M x 0.25 ± 0.02 6.2 ± 0.4 4.0 ± 0. A.17 wt Полностью неактивен A.17 Y-L37F 0.14 ± 0.01 8.5 ± 2.5 1.6 ± 0. A.17 H-H104A 0.32 ± 0.01 7.7 ± 1.8 4.2 ± 1. A.17 N-H105A 0.066 ± 0.006 24 ± 6 0.3 ± 0. BChE* полученные для BChE согласуются с ранее опубликованными (Tramontano A et al. Appl Biochem *Данные, Biotechnol. 2000).

Как отмечалось ранее, в стабилизации остатка фосфоната участвует основная цепь 105 аминокислотного остатка тяжелой цепи. При замене его боковой цепи на Ala KДис практически не изменилась, в то время как константа k2 возросла по сравнению с диким типом. Анализ структуры показал, что в немодифицированном активном центре боковая цепь Asp-H105 сетью водородных связей взаимодействует с реакционным Tyr L37. Разрыв этого взаимодействия должен облегчить перестановки, необходимые для позиционирования субстрата в активном центре абзима и формирования ковалентного комплекса. В активном центре мутантного А.17N-H105A такая сеть контактов отсутст вует. Кроме того, замена боковой цепи на метильную должна стерически облегчить пе рестройки, необходимые для формирования контакта основной цепи с тропинольным кольцом фосфоната.

Эффективность модификации А.17 фосфонатом Х на порядок выше таковой для BChE и сравнима с тем же параметром для других сериновых гидролаз. Этот факт весь ма примечателен, учитывая примитивность устройства активного центра искусственно го фермента в сравнении с каталитическим аппаратом сериновых гидролаз.

Анализируя данные структуры Fab A.17, можно предположить, что активный центр этого каталитического антитела должен обладать значительной степенью под вижности. Одним из подходов к изучению конформационных изменений при взаимо действии белковых молекул с лигандами различной природы является измерение тер модинамических характеристик исследуемого взаимодействия методом изотермальной микрокалориметрии (метод ITC Isothermal Titration Calorimetry). Измерения произво дились В.Миткевичем в институте молекулярной биологии им. Энгельгарта РАН, Мо сква на приборе MicroCal iTC200 (MicroCal, Northampton, MA) как описано (Mitkevich et al. Nucleic Acids Res. 2006).

Нами была изучена термодинамика взаимодействия антитела А.17, двух его му тантов и BChE с фосфонатом Х. Реальная (для А.17 Y-L37F) и наблюдаемые (для всех прочих белков) KДис, а также стехиометрия взаимодействия и изменение энтальпии системы были установлены методом нелинейной регрессии. Экспериментальные дан ные наилучшим образом описываются моделью «один лиганд один лиганд связывающий центр». Расчеты производились с учетом того, что за время проведения эксперимента фосфонилирование проходит количественно. Термодинамические пара метры взаимодействия А.17 фосфонатом Х представлены в таблице 3.

Из приведенных данных видно, что реакция модификации антитела А.17 фосфо натом Х является термодинамически выгодной. Полученные значения термодинамиче ских параметров сопоставимы с соответствующими значениями, полученными методом ITC для связывания других антител с гаптенами. Кроме того, порядок величин совпада ет с кинетически рассчитанными значениями.

Таблица 3. Термодинамические параметры взаимодействия антитела А.17, его мутантов и BChE с фосфонатом Х, установленные методом ITC.

H, G, b c d e KДис, TS, T. C Абзим/фермент мкM ккал/моль ккал/моль ккал/моль A.17 wt 10 2.9 -0.91 6.26 -7. 15 3.5 -1.18 6.02 -7. 20 2.8 -1.45 6.00 -7. 25 2.3 -1.89 5.78 -7. 37 1.7 -2.78 5.43 -8. A.17 Y-L37F 10 1.4 -1.49 6.08 -7. 15 3.2 -1.37 5.88 -7. 25 1.0 -1.50 6.65 -8. 37 0.72 -1.35 7.28 -8. A.17 H-H104A 25 3.8 -3.6 3.72 -7. BChE 15 7.9 -2.40 4.29 -6. 37 6.1 -4.35 2.93 -7. Все измерения производились три-четыре раза в буфере PBS, pH 7.4;

bKДис – константа диссоциации для a комплекса A.17Y-L37F с фосфонатом Х и кажущаяся KДис для комплекса других белков с фосфонатом;

c H – изменение энтальпии;

стандартное отклонение не превышало 15%;

dTS – изменение энтропии;

рассчитано из уравнения G=H-TS;

eG – изменение свободной энергии;

рассчитано из уравнения G=RTlnKa.

Сравнение данных, полученных для полностью неактивного мутанта А.17Y L37F, с результатами для антитела дикого типа и BChE, обнаруживает сходство термо динамических параметров взаимодействия названных белков с фосфонатом Х. В связи с этим можно предположить, что вклад ковалентной стадии взаимодействия, отсутст вующей в случае А.17Y-L37F, в интегральную величину изменения энтальпии невысок.

Очень малое изменение энтальпии системы при фосфонилировании может объясняться тем, что энергия, необходимая для разрушения связи Р-ОАр, компенсируется энергией, высвобождающейся при образовании сходной по природе связи с остатком тирозина (серина 198 в случае BChE). При реакции модификации антитела А.17 фосфонатом вклад в изменение энергии системы так же вносят нековалентная стабилизация субстра та и энергия отхода уходящей группы. Последней составляющей можно пренебречь как незначительной, что было установлено в контрольных экспериментах измерения термо динамики связывания А.17 и его фосфонилированного фосфонатом Х производного с п-нитрофенолом. Таким образом, можно заключить, что наблюдаемые изменения тер модинамических параметров системы относятся в основном к нековалентной стадии взаимодействия абзим-фосфонат и отражают конформационные изменения абзима при первичном связывании с молекулой фосфоната, поддерживая гипотезу использования антителом А.17 механизма индуцированного соответствия.

Снижение температуры измерения от 37 до 10оС приводит к уменьшению вели чины изменения энтальпии реакции модификации А.17 фосфонатом Х в три раза. На основании анализа температурной зависимости H было рассчитано изменение тепло емкости Cp, равное -70 кал*моль-1 K-1. По изменению теплоемкости можно рассчитать изменение площади белковой поверхности, доступной растворителю, используя эмпи рическую формулу:

Cp = 0.27Aар + 0.4Aнеар, где Aар и Aнеар площади закрытых от растворителя гидрофобных и гидрофильных участков белковой молекулы, измеренные в 2.

260) 2 и совпа Полученное по формуле значение находиться в пределах ( дает с величиной, рассчитанной по кристаллической структуре (240 2).

В отличие от абзима дикого типа, изменение энтальпии при взаимодействии пол ностью неактивного мутанта А.17Y-L37F с фосфонатом Х не зависит от температуры.

Близкое к нулю значение Cp для реакции модификации мутантного абзима свидетель ствует о несущественных изменениях площади поверхности антитела, доступной рас творителю, что полностью согласуется с данными об отсутствии ковалентного взаимо действия А.17Y-L37F с фосфонатом Х.

Для мутанта А.17Н-Н104А наблюдаемая методом ITC KДис при взаимодействии с фосфонатом Х оказалась близкой по значению к той же величине для белка дикого типа (кинетические KДис также совпадают), однако, вклад Н отличается. В случае мутантно го антитела реакция модификации более энтальпийно выгодная. Как отмечалось ранее, боковая цепь H-H104 стабилизирована связью с D-H106 в немодифицированном актив ном центре и с Т-Н100 в фосфонилированном А.17 посредством Н-связей. При замене гистидина на аланин энергетический вклад этих связей отсутствует, что приводит к на блюдаемому эффекту.

Взаимодействие антитела А.17 с пестицидом параоксон Как отмечалось ранее, модификация антитела А.17 фосфонатом Х ингибируется в присутствии параоксона. Изучение взаимодействия с параоксоном представляется ин тересным, поскольку он является распространенным пестицидом и существует пробле ма профилактики отравлений этим соединением.

Наличие п-нитрофенольной уходящей группы в молекуле субстрата позволяет оценить кинетику взаимодействия антитела с параоксоном спектрофотометрически.

Было показано, что скорость реакции линейно зависит от количества добавленного аб зима (Рис. 10). Скорость реакция значительно ниже, чем в случае фосфоната Х. За время наблюдения (трое суток) не происходит выхода экспериментальной кривой на плато, и продукт образуется в количестве, превышающем число активных центров антитела, от титрованных в реакции с фосфонатом Х. Кроме того, скорость реакции антитела А.17 с параоксоном линейно возрастает с увеличением концентрации добавленного гидрокси ламина (Рис. 11). Гидроксиламин, обладая большей нуклеофильностью, конкурирует с водой на стадии дефосфорилирования. Приведенные факты свидетельствуют о том, что реакция А.17 с параоксоном является каталитической и проходит через стадию об разования ковалетного интермедиата.

Рис.10. Кинетические кривые взаимодействия параоксона и фосфоната Х антителом А.17. (А) Различные концентрации антитела инкубировали с 200 мкМ параоксона. (Б) Одинаковая кон центрация антитела инкубировалась с 200 мкМ параоксона или фосфоната Х. Все реакции про водили в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4, содержащем 0,02% азида натрия, при 37оС. За хо дом реакций следили спектрофотометрически по высвобождению п-нитрофенола. Каждая кри вая построена за вычетом фонового распада субстрата в растворе того же состава, но без до бавления антитела. Количество п-нитрофенола, образующегося при инкубации антитела А. с параоксоном, превышает число активных центров антитела, оттитрованных в реакции с фос фонатом Х.

Общую схему катализы для абзима можно представить следующим образом 1. KДис 2. k2 3. k3 (Nu) Aт-Tyr + OPX [Aт-Tyr * OPX] Aт-Tyr-OP + X- Aт-Tyr-ОН + OP-Nu, где Ат - антитело, ОРХ - фосфорорганическая молекула, Х - уходящая группа, Nu – нуклеофил.

Элементарные константы взаимодействия антитела А.17 с параоксоном приведе ны на Рис. 11. Таким образом, стадия дефосфорилирования является скорость лимитирующей для всего процесса. Следовательно, ковалентный интермедиат должен накапливаться в процессе реакции. Присутствие ковалентного интермедиата, доказы вающее, что гидролиз параоксона антителом А.17 проходит по механизму ковалентного катализа, было подтверждено методом масс-спектрометрии (Рис.12). После инкубации антитела с параоксоном в течение 16 часов на масс-спектре полноразмерного антитела появлялся пик, разница массы которого с массой пика немодифицированного абзима составляет 135Да, что соответствует весу остатка параоксона. Интересно отметить, что дефосфонилирование антитела, модифицированного фосфонатом Х, при инкубации с гидроксиламином в тех же условиях не происходит.

Рис.11. Определение кинетических кон стант гидролиза пестицида параоксон ан тителом А.17 в присутствии гидроксила мина.

Рис. 12. ESI-FTICR-MS масс-спектр пол норазмерного антитела А.17, модифи цированного параоксоном. Молекуляр ная масса первого пика соответствуют нативному полноразмерному антителу.

Второй пик появляется после инкубации антитела с параоксоном в течение часов, разница его массы с массой пика нативного антитела составляет 135 Да, что соответствует весу остатка параок сона.

Рис.13. Кинетические кривые гидролиза параоксона антителом А.17wt, его кова лентным аддуктом с остатком фосфоната Х и неактивным мутантом А.17Y-L37F.

30 мкМ антитела инкубировали с мкМ параоксона в 0.1 М фосфатном бу фере, рН 7.4, содержащем 0,02% азида натрия, при 37оС. За ходом реакции во всех случаях следили спектрофотомет рически по высвобождению п нитрофенола. Каждая кривая построена за вычетом фонового распада субстрата в растворе того же состава, но без до бавления антитела.

Так же не удалось реактивировать фосфонилированное фосфонатом антитело в присутствии классического реактиватора холин эстераз моноизонитрозоацетона (MINA).

Несмотря на свою химическую схожесть, эти два фосфоэфира обладают различной стабильностью Р-О связи, причем активный центр А.17 способствует гидролизу только Tyr-OP производного параоксона. Антитело, нацело модифицированное фосфонатом Х, и неактивный по отношению к фосфонату мутант А.17Y-L37F не взаимодействуют с параоксонам (Рис.13), указывая на участие в катализе гидролиза параоксона того же ре акционного остатка, что и в случае фосфонилирования фосфонатом.

Таким образом, каталитическое антитело, полученное отбором по способности ковалентно связываться с одним фосфорорганическим веществом, фосфонатом Х, де монстрирует способность к каталитическому гидролизу другого, близкого к нему со единения, параоксона.

Детализация механизма катализа абзима А. Основываясь на данных структурного анализа и изучении термодинамики реак ции, можно предположить, что каталитическое антитело А.17 преимущественно ис пользует принцип индуцированного соответствия при взаимодействии с фосфонатом Х и другими фосфорорганическими веществами. В качестве альтернативной модели взаи модействия для большинства изученных каталитических антител доказан механизм вы бора одного из предсуществующих конформеров. Современный взгляд на проблему описания механизма взаимодействия белок-лиганд сводится к тому, что для подавляю щего большинства белков одновременно осуществляются обе модели, но с различными вкладами.

Для детализации каталитического механизма антитела А.17, наряду со стационар ной, была изучена предстационарная кинетика его взаимодействия с фосфонатом Х.

Измерения проводились Н. Кузнецовым в Институте химической биологии и фунда ментальной медицины Сибирской отделения РАН, Новосибирск на приборе SX.18MV (Applied Photophysics, Великобритания). Для детекции элементарных стадий взаимо действия абзима с субстратами использовали метод «остановленного потока». За реак цией следили по изменению внутренней флуоресценции триптофана в молекуле абзима при длинах волн ex280 нм и em330 нм. Количественную обработку результатов кине тических экспериментов осуществляли с помощью пакета программ DynaFit software (BioKin, США). Полученные данные представлены на рисунке 14.Во всех расчетах фосфонат Х рассматривался как полностью P(R) энантиомер.

Из представленных экспериментальных данных видно, что при взаимодействии антитело – фосфонат Х наблюдались значительные изменения внутренней флуоресцен ции абзима, которые могут быть оценены количественно как функция от времени (Рис.

14Б, В). Каждая экспериментальная кривая была независимо аппроксимирована к виду кривой с одной экспонентой для получения значения наблюдаемой константы скорости kнабл. Зависимость наблюдаемой константы скорости kнабл имела гиперболический вид и описывалась уравнением (1) соответствующим механизму индуцированного соответст вия:

KДис k Aт + OPX (Aт•OPX)1 (Aт•OPX)2.

k- уравнение kнабл = k-2 + KДис*[ОРХ]*k2 / (KДис*[ОРХ]+1), где ОРХ-лиганд.

Рис.14. Описание механизма модификации антитела А.17 фосфонатом Х. А - эксперимен тальные и расчетные кривые взаимодействия А.17 и фосфоната Х. Качество выбранной моде ли оценивалось статистически (врезки). Б – эксперимантальная кривая изменения триптофа новой флуоресценции антитела А.17 в зависимости от концентрации добавленного фосфона та Х, полученная в условиях предстационарной кинетики. В зависимость наблюдаемой кон станты взаимодействия А.17 с фосфонатом Х kobs от концентрации субстрата и элементарные константы взаимодействия.

Представленная схема включает стадии связывания субстрата и перестройку ком плекса абзим/субстрат. Стадии образования ковалентного комплекса и отхода п нитрофенола по изменению флуоресценции триптофана разрешить не удалось. Для подтверждения правомерности выбранного механизма модель взаимодействия абзима с субстратом, представленная на схеме, была подвергнута статистической проверке, вы явившей, что представленная модель действительно содержит минимально возможное число стадий, и представленные кинетические данные не могут быть описаны более простой схемой.

Таким образом, анализ предстационарной кинетики взаимодействия А.17 с фос фонатом Х наряду с данными структурного анализа и изучением термодинамики про цесса указывает на реализацию антителом механизма индуцированного соответствия.

Тем не менее, полученные результаты не исключают возможности осуществления мо дификации абзима по альтернативному пути взаимодействия.

Пример каталитического антитела А.17 раскрывает альтернативный способ ре шения проблемы реорганизации белковой структуры для выполнения каталитической функции. В его структуре повышенная нуклеофильность остатка Y-L37 обеспечивается скрытым от растворителя положением в глубоком активном центре. Наличие длинной подвижной петли НCDR3 А.17 обеспечивает эффективные перестройки в полости ак тивного центра в непосредственной близости от боковой цепи реакционного тирозина.

Неупорядоченная структура этой петли, образуя своего рода гибкую стену кармана ак тивного центра, облегчает миграцию лиганда в нижнюю камеру.

Уникальные свойства примитивного активного центра антитела А.17, способно го к катализу, являются моделью сочетания белковой динамики и реактивности. Сама по себе иммуноглобулиновая структура абзима накладывает строгие границы подвиж ности его структуры. Однако принцип получения искусственного фермента может быть приложен сходным образом к любой другой белковой матрице.

Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А.17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.

Выводы На основе последовательностей вариабельных доменов одноцепочечного антитела 1.

А.17 создано и проэкспрессировано в клетках линии СНО-К1 полноразмерное ан титело. Показано, что полученное полноразмерное антитело способно ковалентно связываться с п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (Х) и гидролизовать пестицид параоксон.

Произведен структурный анализ Fab фрагмента каталитического антитела А.17 и 2.

его ковалентного аддукта с остатком фосфоната Х. Основываясь на структурных данных, был осуществлен мутагенез ряда аминокислотных остатков антитела с це лью выявления их роли в каталитической активности абзима. Показано, что замены аминокислотных остатков, участвующих в стабилизации CDR-H3, влияют на ско рость реакции фосфонилирования антитела фосфонатом Х и слабо сказываются на стадии связывания субстрата.

По совокупности данных структурного анализа, изучения термодинамики и быст 3.

рой кинетики показано, что взаимодействие А.17 с фосфонатом Х осуществляется по механизму индуцированного соответствия.

Установлено, что гидролиз пестицида параоксон антителом А.17 проходит через 4.

стадию образования фосфотирозинового ковалетного интермедиата с аминокис лотным остатком Y-L37. Показано, что стадия дефосфорилирования является ско рость-лимитирующей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Smirnov I*, Carletti E*, Kurkova I*, Nachon F, Nicolet Y, Mitkevich V, Dbat H, Avalle B, Belogurov A, Kuznetsov N, Reshetnyak A, Masson P, Tonevitsky A, Ponoma renko N, Makarov A, Friboulet A, Tramontano A, Gabibov A. Reactibodies generated by kinetic selection couple chemical reactivity with favorable protein dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A. Опубликовано онлайн Сентябрь 2011.

*авторы внесли равный вклад в работу Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В., Дронина М.А., Казначеева А.В., 2.

Куркова И.Н., Белогуров А.А., Фрибуле A., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Бо бик Т.В. Экспрессия каталитических антител в эукариотических системах. Молеку лярная биология (Моск), том 45, № 1, Январь-Февраль 2011, С. 86-95.

3. Куркова И.Н., Решетняк А.В., Дурова О.М., Кнорре В.Д., Трамонтано А., Фри буле А., Пономаренко Н.А., член-корр. РАН Габибов А.Г., Смирнов И.В.. Антите ла-антидоты для нейтрализации фосфорорганических соединений.

Доклады Академии Наук, том 425, № 4, Апрель 2009, С. 549-552.

Опубликованные материалы конференций и доклады 1. Kurkova I, Carletti E, Smirnov I, Fribulet A, Tramontano A, Gabibov A. A17 catalytic antibody converting P-O bonds. III International meeting "Early events in human patolo gies" 29 May-1 June 2010, Barbizone, France 2. Smirnov IV, Kurkova IN, Carletti E, Masson P, Belogurov AA Jr, Ponomarenko NA, Tramontano A, Friboulet A, Gabibov AG. Promiscuity of binding/catalysis of antibodies antidotes toward chemical weapons. 35th FEBS Congress June 26–July 1, 2010, Gteborg, Sweden 3. Smirnov I.V., Ilushin D.G., Durova O.M., Kurkova I.N., Masson P., Ponomarenko N.A.

and Gabibov A.G. Biological scavengers of organophosphorous poisons. 21st IUBMB and 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, July 30 August 7, 2009, Shanghai, China.

Методические аспекты работы рассмотрены в статьях 1. Belogurov AA, Kurkova IN, Friboulet A, Thomas D, Misikov VK, Zakharova MY, Such kov SV, Kotov SV, Alehin AI,.Avalle B, Morse HC 3d, Gabibov AG, Ponomarenko NA Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies:

novel biomarker for multiple sclerosis. J Immol. 2008 Jan 15;

180(2):1258-67.

2. Белогуров AA, Куркова ИН, Мисиков ВК, Сучков СВ, Телегин ГБ, Алехин АИ, Гончаров НГ, Кнорре ВД, Габибов АГ, Пономаренко НА. Субстратная специфич ность каталитических аутоантител при нейроденегеративных процессах. in neurode generative processes.

Доклады Академии Наук, том 425, № 2, Март 2009, С. 251-255.

3. Ponomarenko NA, Durova OM, Vorobiev II, Belogurov AA, Kurkova IN, Petrenko AG, Telegin GB, Suchkov SV, Kiselev SL, Lagarkova MA, Govorun VM, Serebryakova MV,.Avalle B,.Tornatore P,.Karavanov A, Morse HC 3d, Thomas D, Friboulet A, Gabi bov AG. Autoantibodies to myelin basic protein catalyze site-specific degradation of their antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jan 10;

103(2):281-6.