Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии
На правах рукописи
Кондрашева Ирина Григорьевна
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛЕТОК
МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА К ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ
03.00.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2008
1
Диссертация выполнена в Государственном учреждении здравоохранения г.
Москвы "Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии" Департамента здравоохранения г. Москвы
Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Москалева Елизавета Юрьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Белушкина Наталья Николаевна доктор биологических наук, Берман Альберт Ефимович
Ведущая организация Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Защита состоится "11"_декабря 2008 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01. при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу:
119121, Москва, ул. Погодинская, д.10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН.
Автореферат разослан "_" 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Е.А. Карпова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.
Актуальность проблемы. Меланома – чрезвычайно злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов и характеризующаяся высокой природной устойчивостью к противоопухолевым препаратам, биохимические механизмы которой не известны (Serrone L. et al., 1999;
Helmbach H. et al., 2003).
Действие большей части противоопухолевых препаратов приводит к индукции апоптоза в опухолевых клетках в результате повреждения молекулы ДНК или других внутриклеточных мишеней (Zhivotovsky B. et al., 2003). Кроме того, важную роль при действии и химиотерапевтических средств и опухолеспецифических цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) играет Fas-зависимый путь индукции апоптоза (Friesen C. et al., 1999, Classen C. et al., 1999). В тоже время существуют метаболические системы, препятствующие повреждению клеток. Это процессы, формирующие уровень внутриклеточных антиоксидантов;
системы репарации ДНК;
генетические особенности, приводящие к блокированию индукции и ингибированию процессов апоптоза;
белки теплового шока, в частности Hsp70, и АТФ-зависимые транспортеры, обеспечивающие выброс токсических веществ из клеток, и тем самым препятствующие образованию их эффективных концентраций. В клетках меланомы обнаружены гены АВС транспортеров (АВС – ATP-binding cassette) ABCB1 (MDR1), ABCB5, АВСС1 (MRР1) и ABCG2 (BCRP), кодирующие белки, которые осуществляют АТФ-зависимый транспорт как гидрофобных, так и некоторых гидрофильных соединений из клеток в среду (Gottesman M.M. et.al., 2002;
Choi C.H., 2005;
Frank N.Y. et.al., 2005;
Monzani E. еt.al., 2007).
Вариабельность активности каждой из названных систем может приводить к формированию различных механизмов резистентности клеток меланомы к противоопухолевой терапии.
В связи с этим целью работы явилось исследование биохимических механизмов устойчивости клеток меланомы человека различных линий к действию противоопухолевых препаратов и новых подходов к ее снижению.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
- изучение чувствительности клеток меланомы человека различных линий к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия и к новому N1,N6-бис[2,2,6,6-тетракис(трифторметил)-3,6-дигидро-2H-1,3,5 препарату оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамину (БТОГ);
- изучение содержания белка MDR1 на мембране клеток разных линий меланомы человека и его связи с устойчивостью клеток к противоопухолевым препаратам;
- исследование накопления Rho-123 клетками меланомы и скорости его выхода для оценки функциональной активности АВС-транспортеров;
- изучение содержания белка Hsp70 в клетках меланомы человека как фактора устойчивости к противоопухолевым препаратам;
- анализ содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий и их связи с чувствительностью клеток меланомы к действию противоопухолевых препаратов и ЦТЛ;
- исследование влияния рекомбинантного белка MIS человека (rhMIS) на выживаемость клеток меланомы человека и их чувствительность к дакарбазину.
Научная новизна работы. Впервые показано, что новый препарат БТОГ обладает высокой противомеланомной активностью, которая не зависит от содержания белка MDR1 в опухолевых клетках.
Впервые обнаружено, что в клетках меланомы человека с фенотипом MDR1-происходит быстрое выведение Rho-123, чувствительное к верапамилу.
Впервые показано, что верапамил повышает чувствительность клеток меланомы человека с фенотипом MDR1- к действию доксорубицина, дакарбазина и препарата БТОГ.
Впервые показано, что все линии меланомы человека содержат значительную фракцию клеток, не включающих Rho-123, размер которой не зависит от действия верапамила (за исключением линии MDR1+) и возрастает при действии противоопухолевых препаратов.
Впервые показано, что обнаруженный в клетках меланомы человека высокий уровень содержания белка Hsp70 коррелирует с их устойчивостью к противоопухолевым препаратам.
Впервые показано, что rhMIS сенсибилизирует клетки меланомы человека к действию дакарбазина, а повторная обработка клеток белком rhMIS приводит к усилению его антипролиферативного и сенсибилизирующего действия.
Практическая значимость исследования. Обнаруженная высокая противомеланомная MDR1-независимая активность нового препарата N1,N6 бис[2,2,6,6-тетракис-(три-фторметил)-3,6-дигидро-2H-1,3,5-оксадиазин-4-ил] 1,6-гександиамина (БТОГ) позволяет рекомендовать этот препарат для проведения доклинических испытаний на животных.
Выявленное повышение чувствительности клеток меланомы человека к дакарбазину в присутствии верапамила может быть использовано в клинической практике при лечении меланомы.
Обнаруженное снижение выживаемости клеток меланомы человека в присутствии белка rhMIS, и его способность сенсибилизировать клетки меланомы к действию дакарбазина, позволяют рекомендовать этот белок для клинических исследований.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт Петербурге " (2004 г., Санкт-Петербург), II Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (2004 г., Москва), XIV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (2007 г., Москва), XI Российском Онкологическом конгрессе с международным участием (2007 г., Москва), Российской конференции по меланоме совместно со Всемирной рабочей группой по меланоме и Европейской школой онкологии (2008 г., Москва).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ: статьи, из них 3 опубликованы в журналах, состоящих в перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК и публикаций представленных материалами конференций.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машино писного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, включающий 189 источников.
Работа иллюстрирована 27 рисунками и таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Культивирование клеток меланомы человека. Клетки перевиваемых линий меланомы человека Bro-B19 и MS культивировали в среде DMEM, а Mel-3 - Mel-10 - в полной культуральной среде, cостоящей из смеси сред RPMI-1640 и DMEM в соотношении 1:1, содержащей 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (СПК) и 50 мкг/мл гентамицина в пластиковых культуральных флаконах в СО2-инкубаторе при +37оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2.
2. Определение цитотоксической активности различных препаратов in vitro. Выживаемость клеток после инкубации с исследуемыми соединениями в различных концентрациях в течение 72 часов в 96-луночных планшетах определяли с помощью МТТ-теста по методу Mossman (1983). Для этого за часа до окончания инкубации в каждую лунку добавляли раствор МТТ (3 [4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетрозолий бромид). Затем среду удаляли, кристаллы формазана растворяли в ДМСО и измеряли интенсивность окраски. Выживаемость клеток оценивали в процентах от соответствующего контроля и по кривым выживаемости рассчитывали IC – концентрацию препарата, при которой наблюдается гибель 50% клеток.
3. Исследование содержания белка MDR1 на мембране клеток проводили с использованием моноклональных антител (МкАт) к белку MDR1, меченных фикоэритрином (клон UIC2), в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Анализировали интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL и определяли значение средней интенсивности флуоресценции (MFI).
4. Исследование накопления флуоресцентного красителя Rho- клетками меланомы человека и скорости его выхода из клеток. К суспензии клеток в бессывороточной среде добавляли Rho-123 (0,1 мкг/мл), и инкубировали их 60 мин при +37°С. Для исключения погибших клеток, в пробу добавляли раствор йодистого пропидия (2 мкг/мл) непосредственно перед цитофлуориметрией. Флуоресценцию клеток измеряли с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL в красной и зеленой области спектра при длине волны возбуждения 488 нм и полосой пропускания для зеленой области спектра – 525 нм (FL1), а для красной – 620 нм (FL3).
Анализировали 50 000 тыс. клеток.
5. Внутриклеточное окрашивание клеток МкАт к Hsp70. Клетки меланомы промывали ФСБ с 1% БСА и 0,1% NaN3 и фиксировали в 2% параформальдегиде. Клетки пермеабилизировали в течение 5 минут при комнатной температуре в буфере для пермеабилизации (отмывочный буфер, содержащий 0,5% сапонина и 1% инактивированной сыворотки человека).
Пробы инкубировали с ФИТЦ-меченными МкАт к Hsp70 клон 3А (“HyTest”, Финляндия) в течение 1 часа при +40С, отмывали, фиксировали 2% параформальдегидом и измеряли их флуоресценцию на цитофлуориметре EPICS-XL (“Coulter Electronics”, США).
6. Иммуноблотинг проводили по стандартному протоколу Towbin et al.
(1979). После фракционирования лизатов клеток с помощью Ds-Na-ПААГ электрофореза по Laemmli, переносили белки на мембрану с использованием установки для электропереноса (Hoefer TE 70 series, “Amersham Pharmacia Biotech”). Мембрану инкубировали с первичными МкАт к Hsp70 (клон 3А3) и к -актину, после чего проводили инкубацию со вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена. Иммунные комплексы на мембране проявляли, используя субстрат, содержащий 3,3-диаминобензидин, хлорнафтол и Н2О2.
7. Исследование содержания белков Fas и FasL в опухолевых клетках проводили с помощью иммуноцитохимического метода при окрашивании клеток, фиксированных на стеклах 4% параформальдегидом, с использованием непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода.
Использовали антитела к Fas клон UT2 ("Сорбент") и к FasL клон G247- ("Pharmingen") при визуализации специфического связывания с помощью световой микроскопии и цифровой камеры DXM 1200 ("NIKON").
8. Приготовление лимфоцитов и дендритных клеток (ДК). Лимфоциты выделяли из фракции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови после отделения моноцитов с помощью адгезии. ДК получали из моноцитов с использованием цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4, нагружали лизатом опухолевых клеток и индуцировали созревание ДК, добавляя "Лейкинферон" и ФНОальфа. Опухолевые клетки лизировали при замораживании оттаивании суспензии клеток в фосфатно-солевом буфере (ФСБ).
9. Индукция меланомаспецифических ЦТЛ с помощью ДК. Для индукции ЦТЛ 2х106 лимфоцитов и 100х105 ДК, обработанных опухолевыми антигенами, инкубировали в питательной среде IMDM с 10% СПК в 24 луночных платах. На следующий день и дважды в неделю в последующем к культурам добавляли 30 ед/мл ИЛ-2. Раз в неделю культуры рестимулировали нагруженными лизатом ДК. После двух рестимуляций лимфоциты использовали для анализа цитотоксической активности (ЦТА).
10. Определение ЦТА лимфоцитов человека. К опухолевым клеткам мишеням в 96-луночном планшете добавляли суспензию лимфоцитов в соотношении клетки-мишени:клетки-эффекторы, равном от 1:1 до 1:40.
Через 72 ч инкубации лимфоциты отмывали, опухолевые клетки окрашивали МТТ по методу Mossman (1983) и измеряли количество выживших клеток.
ЦТА лимфоцитов расчитывали по формуле: ЦТА = [Амишень - Амишень+эффектор]:
Амишеньx100%, где А(мишень+эффектор) и А(мишень) – оптическая плотность проб, где инкубировались опухолевые клетки-мишени с клетками-эффекторами и только клетки-мишени, соответственно.
11. Исследование связывания rhMIS с поверхностной мембраной клеток проводили с использованием rhMIS-ФИТЦ при его инкубации с клетками при +4оС в течение 1 часа. После отмывания клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Выявление MIS-связывающего белка внутри клеток проводили, как описано в п.8 при внутриклеточном окрашивании МкАт к Hsp70. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL.
12. Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов по методу Стьюдента и корреляционный анализ проводили с использованием компьютерной программы "Origin".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Исследование чувствительности клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам с различным механизмом действия и N1,N6-бис[2,2,6,6-тетракис- (трифторметил)-3,6-дигидро-2H-1,3,5-оксади азин-4-ил]-1,6-гександиамину (БТОГ).
Исследование проведено при использовании двух известных перевиваемых линий меланомы человека из международных коллекций - MS и Bro-B19 и восьми новых линий, полученных из фрагментов опухолей. Значения IC дакарбазина, паклитакселя, доксорубицина и БТОГ определяли в параллельных экспериментах (табл.1). Непролиферирующие (нестимули рованные) лимфоциты человека были достаточно устойчивы к исследованным препаратам, но среди меланом 1 из 10 линий была более устойчива к дакарбазину, чем лимфоциты (Mel-7), 1 из 10 – к доксорубицину (Mel-8) и 1 из 10 к паклитакселю (Mel-7). При сравнении меланом с пролиферирующими лимфоцитами обнаружено, что из 10 линий 5 были более устойчивы, чем лимфоциты к дакарбазину, 8 – к доксорубицину и 5 к паклитакселю. Таким образом, клетки меланомы человека различных линий устойчивы к действию противоопухолевых препаратов по сравнению с пролиферирующими и даже покоящимися нормальными клетками человека и чувствительность отдельных линий значительно варьирует.
При исследовании нового препарата БТОГ обнаружено, что 2 из линий меланом более устойчивы к этому препарату, чем покоящиеся лимфоциты и 4 из 10 линий меланом более устойчивы, чем стимулированные конканавалином А лимфоциты. Препарат БТОГ, так же как и дакарбазин, в отличие от доксорубицина и паклитакселя, был высоко активен как Таблица 1. Чувствительность клеток различных линий меланомы и лимфоцитов человека к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия.
Линия клеток Дакарбазин Доксорубицин Паклитаксель БТОГ IC50, мМ IC50, мкМ Bro-B19 0,14±0,08 0,08±0,01 0,04±0,02 0,38±0, MS 0,12±0,01 0,08±0,02 0,05±0,01 0,50±0, Mel-3 2,07±0,19 0,13±0,01 0,3±0,12 0,76±0, Mel-4 0,12±0,02 0,63±0,15 3,64±0,09 0,51±0, Mel-5 0,15±0,05 0,15±0,07 5,65±0,35 0,70±0, Mel-6 2,30±0,15 0,14±0,03 56,30±0,41 1,28±0, Mel-7 5,90±0,24 0,64±0,08 150 3,64±0, Mel-8 0,12±0,07 4,53±0,30 2,76±0,02 0,67±0, Mel-9 2,30±0,18 2,80±0,25 0,17±0,01 4,25±0, Mel-10 1,37±0,45 0,39±0,01 0,05±0,01 1,40±0, Нестимулирован ные лимфоциты 3,47±0,32 2,90±0,28 100 1,82±0, Стимулированные КонА лимфоциты 0,32±0,03 0,10±0,01 1,58±0,21 0,68±0, А Б Доксорубицин Паклитаксель 1 - IC50 = 0,07 мкг/мл = 0,08 мкМ 1 - IC50 = 0,09мкг/мл = 0,15 мкМ 100 100 2 - IC50 = 4,00 мкг/мл = 4,60 мкМ 2 - IC50 = 2,17мкг/мл = 3,67 мкМ Выживаемость,% 80 Выживаемость,% 60 40 20 20 0 0.1 1 0.1 Концентрация, мкг/мл Концентрация, мкг/мл Г В Дакарбазин БТОГ 100 1 - IC50 = 280 мкг/мл = 1600 мкМ 1 - IC50 = 0,26 мкг/мл = 0,30 мкМ 2 - IC50 = 50 мкг/мл = 260 мкМ 2 - IC50 = 0,41 мкг/мл = 0,48 мкМ 80 Выживаемость,% Выживаемость,% 60 40 40 20 0 0.1 1 10 0.01 0.1 Концентрация, мкг/мл Концентрация, мг/мл Рис.1. Чувствительность клеток исходной (1) и резистентной MDR1+ (2) линии хронической миелогенной лейкемии человека К562 к противоопухолевым препаратам.
в отношении исходных клеток линии К562, так и в отношении резистентных клеток К562Adr с высоким уровнем белка MDR1 (рис.1).
Таким образом, препарат БТОГ обладает высокой противомеланомной активностью и обращает множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную MDR1.
2. Исследование содержания белка MDR1 в клетках разных линий меланомы человека и его связь с устойчивостью клеток к противоопухолевым препаратам.
Данные, полученные при исследовании содержания белка MDR1 на поверхностной мембране клеток, позволили разделить изученные линии на две группы: с фенотипом MDR1- и MDR1+. Группу MDR1- составили клетки 6 из 10 линий, в которых присутствовало от 0,2 до 3,3% MDR1+ клеток с очень низким содержанием этого белка. Группу MDR1+ составили 4 из линий клеток, в которых доля MDR1+ клеток составляла от 17,8 до 72,5% с высоким содержанием белка MDR1. Значение MFI для клеток этих линий меланомы составляло от 2,3 до 9,0 усл. ед. Результаты исследования чувствительности линий меланом человека с фенотипом MDR1- и MDR1+ к различным противоопухолевым препаратам представлены в таблице 2.
Таблица 2. Чувствительность MDR1- и MDR1+ линий меланом человека к различным противоопухолевым препаратам.
IC50, мкМ MDR1+ Название MDR препарата Bro-B19, MS, Mel-5 - 7, -10 Mel-3, -4, -8, - Дакарбазин 1460±950 1150± Доксорубицин 0,24±0,09 2,65±1,01* БТОГ 1,32±0,49 1,54±0, *р0, Полученные результаты свидетельствуют о том, что цитотоксическое действие дакарбазина и препарата БТОГ не зависит от присутствия MDR1 на клеточной мембране меланом. По данным табл.1 можно заключить, что MDR1+ линии меланом были более устойчивы и к паклитакселю, но чувствительность отдельных линий клеток к паклитакселю сильно варьировала, что не позволило использовать средние значения IC50 для сравнения чувствительности MDR1- и MDR1+ линий.
Присутствие даже небольшой доли MDR1+-клеток среди клеток меланом отдельных линий свидетельствует о том, что при химиотерапии препаратами аналогичными доксорубицину существует высокая вероятность быстрого развития множественной лекарственной устойчивости меланом и что природная устойчивость клеток меланом различных линий к химиотерапевтическим препаратам обусловлена иными механизмами, не связанными с функционированием белка MDR1.
3. Исследование накопления родамина-123 и скорости его выхода из клеток меланом человека с фенотипом MDR1- и MDR1+.
Накопление Rho-123 клетками меланом разных линий и скорости его выхода для оценки функциональной активности белков-транспортеров исследовали с использованием проточной цитофлуориметрии. Для регистрации накопления Rho-123 флуоресценцию измеряли одновременно в зеленой (525 нм) и красной (620 нм) области спектра (рис.2А, Б) или только в зеленой области (рис.2В, Г). При изучении клеток меланом человека разных линий оказалось, что все проанализированные линии содержали как клетки, активно накапливающие Rho-123, так и клетки, не накапливающие Rho-123 и образующие по этому признаку побочную популяцию – side population – SP (рис.2, табл.3, 4).
Клетки разных линий значительно отличались по способности накапливать Rho-123 (табл.3). Накопление красителя клетками MDR1- было достоверно и существенно более высоким, чем накопление Rho-123 клетками MDR1+, что свидетельствует об активном участии белка MDR1 в выбросе красителя из таких клеток. Обработка клеток ингибитором белка MDR верапамилом приводила к классическому увеличению накопления красителя только в линии Mel-8 с высоким уровнем MDR1. В остальных линиях клеток воздействие VP вызывало даже снижение накопления Rho-123 (табл.3).
Для анализа скорости выхода Rho-123 клетки после инкубации с красителем отмывали и инкубировали в растворе Хенкса в присутствии и без VP в течение 60 мин и измеряли интенсивность флуоресценции клеток.
Рис.2. Исследование накопле ния Rho-123 клетками мелано мы человека линии Bro-B19 с помощью проточной цитофлуо риметрии при анализе флуорес ценции в красной и в зеленой области спектра (А, Б) или только в зеленой области (В, Г).
А, В - аутофлуоресценция клеток, Б, Г – флуоресценция клеток после инкубации с Rho 123. А, Б - по оси абсцисс интенсивность зеленой флуорес ценции, по оси ординат – крас ной флуоресценции, усл.ед;
В, Г – по оси абсцисс – интенсивность зеленой флуоресценции, усл.ед, по оси ординат – количество клеток, усл.ед., 1 – аутофлуорес ценция клеток, 2 – клетки, накап ливающие Rho-123, 3 - клетки, не накапливающие Rho-123 (SP).
Таблица 3. Накопление Rho-123 клетками различных линий меланомы человека без и в присутствии ингибитора активности MDR1 верапамила (VP). Приведены средние значения трех независимых экспериментов или данные отдельных экспериментов. MFI – средняя интенсивность флуоресценции окрашенных Rho-123 клеток.
Линия Фенотип MFI, усл. ед.
клеток MDR1 Без VP В присутствии VP Bro-B19 69,6±19,4 27,3±2, MDR1 MS 28,4 21, Меl-5 90,8 79, Меl-10 61,6±13,5 39,3±4, MDR1+ Меl-8 4,5±0,1* 18,4±6,0** *р0,005 для клеток линий с фенотипом MDR1+ и MDR1-;
** р0,005 для клеток одной линии без и с верапамилом.
Показано, что клетки меланом различных линий существенно различались по способности выбрасывать Rho-123 и по чувствительности этого процесса к VP. Так скорость выхода составила 3,5;
20,4;
22,0;
39,0 и 19,4 % от исходного уровня Rho-123 за час, а степень ингибирования выхода Rho-123 в присутствии VP составила 60,0;
50,1;
61,8;
78,7 и 27,3% для линий Bro-B19, MS, Mel-5, Mel-8 и Mel-10, соответственно.
Белок MDR1 в линиях с фенотипом MDR1- может присутствовать в следовых количествах, но, как следует из данных по накоплению Rho-123 в присутствии VP (табл.3), VP не влияет на накопление красителя в таких клетках. В то же время, как сказано выше, VP ингибировал выход Rho-123 из клеток меланом всех MDR1- линий. Это позволяет предположить, что в клетках меланом присутствует другой транспортер, способный активно выводить Rho-123 из клеток, и также как MDR1 чувствительный к VP.
Для определения вклада в устойчивость клеток меланомы с фенотипом MDR1- процессов, чувствительных к VP, на примере линии Mel- исследовали чувствительность клеток данной линии к противоопухолевым препаратам в присутствии VP.
Обнаружено, что в присутствии VP чувствительность клеток повышается ко всем исследованным препаратам. В случае совместного действия доксорубицина и VP чувствительность возрастает почти в 4 раза (IC50 снижается с 0,3 до 0,08 мкМ);
в случае дакарбазина – почти в 3 раза (IC50 снижается с 2,0 до 0,7 мМ) и в 1,5 раза при действии БТОГ (IC снижается с 3,0 до 2,1 мкМ).
В предыдущих экспериментах было показано (табл.2), что цитотоксическое действие препаратов дакарбазин и БТОГ не зависит от присутствия белка MDR1. Однако, полученные данные по сенсибилизирующему действию VP для этих препаратов в линии с фенотипом MDR1-, подтверждают предположение о присутствии в клетках меланомы линии Mel-10 другого переносчика, отличного от MDR1, но также чувствительного к специфическому для MDR1 ингибитору VP. Для такого переносчика(ов), по-видимому, субстратом является не только доксорубицин, но и дакарбазин и этот переносчик также обуславливает устойчивость клеток не только к доксорубицину, но и к дакарбазину.
Величина SP в разных линиях колебалась от 0,9% (Mel-10) до 2,7% (MS), а в линии Mel-8 достигала 65,1% (табл.4). При анализе влияния VP на размер SP оказалось, что ее снижение в присутствии ингибитора обнаруживается только для клеток линии Mel-8 с высоким уровнем белка MDR1. Полученные результаты позволяют однозначно считать, что если белок MDR присутствует в значительном количестве на плазматической мембране клеток, то он имеет определяющее значение в формировании SP, как в случае линии Mel-8. После ингибирования MDR1 верапамилом в этой линии SP сохраняется, но ее размер снижается в среднем до 4%, что свидетельствует о присутствии и участии в формировании SP и других транспортеров, отличных от MDR1. В остальных исследованных линиях размер SP не зависел от присутствия MDR1, т.к. обработка VP клеток других линий меланомы с фенотипом MDR1- не влияла на размер SP (табл.4).
Чтобы оценить влияние на размер SP обработки клеток меланомы противоопухолевыми препаратами, были поставлены эксперименты с клетками линий MDR1- и MDR1+, которые обрабатывали препаратами в концентрации IC50 и через 72 часа исследовали размер SP.
Таблица 4. Размер SP в различных линиях меланомы человека после инкубации с Rho-123 без и в присутствии ингибитора активности MDR верапамила (VP).
Линия Фенотип Доля неокрашенных клеток (SP), % клеток MDR1 Без VP В присутствии VP Bro-B19 1,5±0,6 2,5±0, MDR1 MS 2,7±0,2 2,3±0, Меl-5 2,0±1,2 0,5• 0,6• Меl-10 0,9±0,3 0,9±0, MDR1+ Меl-8 65,1±4,0 4,1±1,1* *- p0,005 при действии VP;
• - данные одного эксперимента.
Показано, что в MDR1- клетках в указанных условиях наблюдали увеличение SP при действии доксорубицина во всех трех исследованных линиях, а при действии дакарбазина - только в двух, а в линии Mel- наблюдали снижение размера SP (рис.3А).
В клетках линии Mel-8 MDR1+, как следует из рис.3Б, ни один из двух исследованных препаратов не снижал размер SP, более того, при действии всех препаратов отмечено увеличение размера SP. При измерении SP в обработанных доксорубицином клетках линии Mel-8 в присутствии VP обнаружено, что размер SP возрастал с 2,7% в контроле до 50,1%. При измерении SP в тех же условиях после действия дакарбазина наблюдали снижение размера SP по сравнению с размером SP контрольных клеток, обработанных VP, с 2,7 до 1,5%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что после обработки клеток доксорубицином, но не дакарбазином, в составе SP возрастает доля клеток, устойчивых к действию VР, что может быть связано с индукцией в этих условиях других АВС-транспортеров, отличных от MDR1.
А Б Контроль 12, 14 97, Доксорубицин Дакарбазин 12 82, 77, Доля SP, % Доля SP, % 10 6, 8 50, 3, 3, 3, 2,0 2 0, 0,4 2, 0,3 1, VP- VP+ VP- VP+ VP- VP+ Bro-B19 Mel-5 Mel- Контроль Доксорубицин Дакарбазин Рис.3. Содержание SP в линиях меланомы человека с фенотипом MDR1- (А) и в линии Mel-8 с фенотипом MDR1+ (Б) через 72 часа после обработки противоопухолевыми препаратами в концентрации IC50. Размер SP исследовали: А без VP, Б – без VP (VР-) и в присутствии VP (VР+).
Таким образом, все исследованные линии меланом человека содержат SP, размер которой составляет в линиях MDR1- от 0,9 до 2,7% и не изменяется при исследовании накопления Rho-123 в присутствии ингибитора активности белка MDR1 верапамила. Формирование SP в этих клетках определяется транспортерами, отличными от MDR1. При высоком содер жании и активности этого белка размер SP может достигать 65% (Mel-8).
Присутствие в меланомах фракции высоко резистентных клеток, образующих SP, свидетельствует о том, что именно они могут сохраняться при химиотерапии и определять рецидивирование опухоли и развитие множественной лекарственной устойчивости благодаря высокой активности как белка MDR1, так и белков-транспортеров, отличных от MDR1, природу которых предстоит выяснить.
4. Содержание белка Hsp70 в клетках меланомы человека как фактор устойчивости к противоопухолевым препаратам.
В клетках меланомы человека различных линий исследовали содержание белка Hsp70 в стандартных условиях (Hsp70) и после индукции при тепловом стрессе при прогревании до +420С в течение 1 часа и последующего культивирования в стандартных условиях (Hsp70t). На рис.4 приведены гистограммы интенсивности флуоресценции клеток меланомы различных линий после внутриклеточного иммунофлуоресцентного окрашивания Hsp ФИТЦ-меченными МкАт. Из приведенных данных видно, что белок Hsp был обнаружен во всех линиях меланом, но содержание этого белка значительно варьировало в клетках различных линий. Необходимо отметить, что среди клеток некоторых линий (Mel-4, Mel-6) обнаруживается высокая гетерогенность клеток по содержанию Hsp70.
Динамика изменения уровня Hsp70t после воздействия теплового шока отличалась в клетках меланом различных линий: у линий с низким исходным уровнем Hsp70 (MS и Bro-B19) уровень Hsp70t возрастал только через часа после теплового шока. В клетках линии Mel-6 с наиболее высоким исходным уровнем Hsp70 уровень Hsp70t незначительно повышался через часов и возвращался к исходному значению через 24 часа. Высокое содержание этого белка в клетках меланомы человека может быть отражением стрессового состояния этих клеток. Действительно, при индукции Hsp70 с помощью теплового шока дополнительное повышение его содержания было незначительным. Для оценки вклада Hsp70 в развитие устойчивости клеток меланомы человека анализировали связь между содержанием Hsp70 и чувствительностью опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. При анализе корреляции устойчивости клеток меланомы к препаратам паклитаксель, доксорубицин, БТОГ и дакарбазин с уровнем Hsp70 обнаружена прямая корреляция между устойчивостью клеток меланомы человека к дакарбазину (R=0,77), паклитакселю (R=0,83) и БТОГ (R=0,89). В случае паклитакселя и БТОГ корреляция была статисти чески значимой (р0,05).
Корреляции между уровнем Hsp70 и устойчивостью клеток меланомы к доксору бицину не выявлено, но клетки с низким содержа нием Hsp70 (линии Bro-B и MS) были достоверно бо лее чувствительны к доксо рубицину, чем линии с его высоким содержанием.
Рис.4. Hsp70 в клетках меланом при внутриклеточном окра шивании ФИТЦ-меченными антителами к Hsp70.
Левый пик – аутофлуоресценция клеток;
правый – флуоресценция при внутриклеточном окра шивании. По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции, усл.ед.;
по оси ординат – количество клеток, усл.ед.
Полученные результаты позволяют заключить, что уровень Hsp70 в клетках меланомы вносит значительный вклад в их устойчивость к противоопухолевым препаратам.
5. Исследование содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий: связь с чувствительностью к противоопухолевым препаратам и к действию ЦТЛ.
При исследовании содержания белков Fas и FasL с помощью иммуноцитохимического анализа выявлены значительные различия в содержании этих белков в клетках различных линий меланомы человека. В двух линиях - Bro-B19 и Mel-4 - обнаружено отсутствие белка Fas, в трех линиях его содержание было низким, в четырех – высоким. Белок Fas обнаруживался в цитоплазме и на мембране клеток. FasL обнаружен во всех исследованных линиях, кроме Mel-7. В четырех линиях обнаружен высокий уровень белка FasL. FasL был выявлен на мембране и в перинуклеарной области клеток. В линиях Mel-5, Mel-8 и Mel-9 при этом одновременно отмечено присутствие и FasL и Fas, что позволяет предполагать существование дефектов в системе проведения сигнала индукции апоптоза через рецептор Fas в этих линиях, и, следовательно, устойчивость таких клеток к Fas-зависимому апоптозу.
При сравнении чувствительности клеток меланом к противоопухолевым препаратам с уровнем белков Fas и FasL статистически значимой связи между этими показателями не обнаружено.
Для исследования роли белка Fas в чувствительности клеток меланомы человека к действию меланомаспецифических ЦТЛ использовали ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК. Для нагрузки ДК опухолеспецифическими антигенами их инкубировали либо с лизатом клеток меланомы-мишени, либо со смесью лизатов нескольких меланом для использования одинаковых для всех линий опухолеспецифических антигенов. В этих экспериментах были использованы три линии клеток меланомы человека: MS и Mel-5 - Fas+ линии и Bro-В19 - Fas- линия. Результаты этих экспериментов, представленные на рис.5, свидетельствуют, о том, что исследованные клетки меланом различаются по чувствительности к ЦТЛ: высоко устойчивой оказалась линия Bro-B19, а чувствительными - линии MS и Mel-5. При этом линия Bro В19 была устойчива к действию ЦТЛ, индуцированных при нагрузке ДК как лизатом клеток линии Bro-B19, так и смесью лизатов трех меланом, т. е. при использовании общих антигенов для всех линий. Высокая устойчивость клеток Fas- линии Bro-В19 к действию меланомаспецифических ЦТЛ, подтверждает важную роль Fas-зависимого пути индукции апоптоза опухолевых клеток под действием ЦТЛ. Отсутствие этого белка в клетках меланомы может быть причиной их устойчивости к индукции апоптоза.
Приводить к устойчивости к действию ЦТЛ могут и дефекты в системе проведения сигнала индукции апоптоза, предполагаемые в клетках меланомы из-за одновременного присутствия белков Fas и FasL.
48,1 Рис.5. Чувствитель ность клеток Fas- и 45 Fas+ меланомы челове ка к меланомаспеци фическим ЦТЛ, инду цированным ДК, ЦТЛ нагруженными лиза 17 ЦТЛ 20 тами клеток мелано 15 мы-мишени (ЦТЛ 1) 10 или смесью лизатов 5 меланом (ЦТЛ 2).
0 Bro-B19/Fas- MS/Fas+ Mel-5/Fas+ Таким образом, в клетках меланомы различных линий содержание белков Fas и FasL не может служить маркером устойчивости этих клеток к действию противоопухолевых препаратов. В тоже время как отсутствие белка Fas, так и высокий уровень белка FasL свидетельствуют об устойчивости таких опухолевых клеток к действию опухолеспецифических ЦТЛ, а, следовательно, и об устойчивости таких опухолей ко многим методам клеточной иммунотерапии.
7. Исследование влияния рекомбинантного белка MIS человека на выживаемость клеток меланомы человека и их чувствительность к дакарбазину.
При изучении связывания ФИТЦ-меченного rhMIS с культивируемыми опухолевыми клетками меланомы различных линий показано, что rhMIS связывается с поверхностной мембраной опухолевых клеток (за исключением линии Mel-8), и что все опухолевые клетки содержат рецептор MIS внутри клеток. Содержание рецепторов MIS на клеточной мембране было пропорционально их количеству в клетке (r=0,74, p=0,05).
Показано, что выживаемость клеток в присутствии rhMIS снижалась в тех линиях клеток, где этот рецептор обнаруживался на клеточной мембране.
Повторное добавление rhMIS к опухолевым клеткам приводило к усилению их гибели. Показано, что однократная обработка клеток линии MS препаратом rhMIS за 30 мин до добавления дакарбазина повышала их чувствительность к действию этого противоопухолевого препарата, и значение IC50 снижалось с 0,61 до 0,40 мМ. Повторная обработка клеток меланомы rhMIS усиливала его сенсибилизирующее действие: значение IC снижалось до 0,24 мМ. Полученные результаты позволяют заключить, что белок rhMIS может служить эффективным модификатором биологического ответа клеток меланомы человека на дакарбазин – наиболее эффективный при этом заболевании противоопухолевый препарат.
ВЫВОДЫ.
1. Обнаружена высокая MDR1-независимая цитотоксическая активность нового препарата N1,N6-бис[2,2,6,6-тетракис(трифторметил)-3,6-дигидро-2H 1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамин (БТОГ) в отношении клеток меланомы человека.
2. Белок MDR1 определяет природную устойчивость клеток меланомы человека только в отдельных случаях (в 4 из 10 линий) и только к доксорубицину, но не к дакарбазину и препарату БТОГ.
В клетках меланомы человека с фенотипом MDR1- обнаружено 3.
быстрое и чувствительное к верапамилу выведение Rho-123 и сенсибилизирующее действие верапамила в отношении не только доксорубицина, но и дакарбазина и препарата БТОГ.
4. Обнаружено, что все линии меланомы человека содержат значительную фракцию клеток, не включающих Rho-123, размер которой не зависит от действия верапамила (за исключением линий MDR1+) и возрастает при действии противоопухолевых препаратов.
5. В клетках меланомы человека обнаружен высокий уровень содержания белка Hsp70, который коррелирует с их устойчивостью к противоопухолевым препаратам.
6. В клетках меланомы человека различных линий обнаружены нарушения в системе Fas/FasL в виде отсутствия белка Fas и/или высокого уровня белка FasL. При отсутствии Fas обнаружена устойчивость клеток к действию опухолеспецифических ЦТЛ.
7. Белок rhMIS обладает антипролиферативной активностью в отношении клеток меланомы человека, имеющих рецепторы к этому белку, и сенсибилизирует их к действию дакарбазина. Повторная обработка клеток белком rhMIS приводит к усилению его противоопухолевого и сенсибилизирующего действия.
Рекомендации по практическому использованию результатов диссертации.
1. Целесообразно проведение доклинических испытаний нового препарата БТОГ на животных для изучения возможности его применения в клинической практике в качестве противомеланомного препарата.
2. Рекомендуется проведение доклинических испытаний сенсибилизирующего действия верапамила при использовании дакарбазина для лечения меланомы.
3. Рекомендуется проведение клинических исследований совместного действия белка rhMIS и дакарбазина для повышения эффективности химиотерапии при меланоме.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Кондрашева И.Г., Филатов А.В., Москалева Е.Ю., Попова О.Н., Северин Е.С., Северин С.Е. Характеристика моноклональных антител UT1 и UT2 к белку Fas и исследование экспрессии белков Fas и FasL и Fas-зависимого апоптоза в опухолевых клетках человека различных линий //Иммунология. - 2004. - Т. 2. – С. 68-72.
2. Кутняк О.В., Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Кешелава В.В., Корженевский Д.А., Коростелев С.А., Северин С.Е., Северин Е.С. Индукция меланомаспецифических ЦТЛ с помощью дендритных клеток, нагруженных смесью лизатов клеток различных линий меланомы человека//Материалы конференции "Дни иммунол.огии в Санкт-Петербурге-2004". - Медицинская иммунология. – Санкт-Петербург, 2004. – Т. 6(3-5). - С. 458-459.
3. Кондрашева И.Г., Хомякова А.В., Москалева Е.Ю. Индукция апоптоза лимфоцитов человека при их взаимодействии с опухолевыми клетками in vitro.//Тезисы II Всемирного конгресса по иммунопатологии и аллергии. - Аллергология и иммунология. – Москва, 2004. – Т. 5, №1. – С. 35.
4. Кутняк О.В., Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Кешелава В.В., Корженевский Д.А., Коростелев С.А., Северин С.Е., Северин Е.С. Сравнение эффективности индукции меланомаспецифических ЦТЛ с помощью дендритных клеток, нагруженных лизатом сингенных и смесью аллогенных опухолевых клеток//Физиология и патология иммунной системы. – 2005. №7. - С. 25-31.
5. Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Северин С.Е. Противомеланомная активность полифторсодержащего производного 1,3,5-оксадиазина//Материалы XIV Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство". – Москва, 2007. - С. 616.
6. Северин C.Е., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Посыпанова Г.А., Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Северин Е.С. Полифторсодержащие производные 1,3,5-оксадиазина как новый класс потенциальных противоопухолевых соединений//Материалы XI Российского Онкологического конгресса. – Москва, 2007. - С. 239-240.
7. Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Москалева Е.Ю., Попова О.Н., Макаров В.А., Морозова Н.С., Северин С.Е., Северин Е.С. Вклад белка gp170 и белка теплового шока Hsp70 в устойчивость клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам//Материалы XI Российского Онкологичес кого конгресса. – Москва, 2007. - С. 171-172.
8. Родина А.В., Гукасова Н.В., Макаров В.А., Кондрашева И.Г., Хомякова А.В., Попова О.Н., Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Антипролиферативная активность rhMIS человека и локализация его рецептора в различных линиях опухолевых клеток человека//Материалы XI Российского Онкологического конгресса. – Москва, 2007. - С. 239.
9. Родина А.В., Гукасова Н.В., Макаров В.А., Кондрашева И.Г., Хомякова А.В., Попова О.Н., Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Локализация рецепторов, связывающих MIS, в различных линиях опухолевых клеток человека//Биохимия. – 2008 – Т. 73. - Вып. 7. - С. 989-998.
10. Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Попова О.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. Чувствительность клеток меланомы человека к новому полифторсодержащему производному 1,3,5-оксадиазина в сравнении с известными химиотерапевтическими препаратами//Молеку лярная медицина. – 2008. - №2. - С. 28-33.