авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Выявление и идентификация мембранного антигена, ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс

На правах рукописи

ТЮРЯЕВА

Ирина Ивановна

ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА,

АССОЦИИРОВАННОГО С ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНЫМИ ОПУХОЛЯМИ КРЫС

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт- Петербург 2006

Работа выполнена в Лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель доктор биологических наук Вадим Александрович Иванов, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Виктор Михайлович Михельсон, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор медицинских наук, профессор Петр Григорьевич Назаров, Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. Н.Н. Петрова РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится «_» октября 2006 года в часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «_» сентября 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблемы дифференцировки, дисдифференцировки и про лиферации клеток, являющиеся одними из основных проблем современной биологии, осо бенно актуальны в области фундаментальной онкологии. При неопластической трансформа ции в клетке происходят значительные изменения, позволяющие ей приобрести такие свой ства, которые предопределяют ее возможность образовать злокачественную опухоль. К та ким свойствам относятся самодостаточность в пролиферативных сигналах, нечувствитель ность к рост-супрессирующим факторам, отсутствие репликативного старения (иммортали зация), ослабление индукции апоптоза, блокирование клеточной дифференцировки, генети ческая нестабильность, изменение морфологии и локомоции, стимуляция неоангиогенеза.

Эти события выражаются в становлении нового антигенного спектра малигнизированных клеток. Антигенные отличия злокачественно трансформированной клетки от нормальной – ключевой вопрос иммунологии опухолей. Исследования в этом направлении позволяют вы яснять не только механизмы малигнизации клетки, прогрессии опухоли и ускользания ее от иммунного надзора организма, но и вносят существенный вклад в клиническую онкологию.

Прежде всего, речь идет об иммунодиагностике опухолей, уже ставшей обязательным ком понентом клинической практики. Кроме того, активно развиваются еще две области онколо гии – иммунопрофилактика некоторых опухолей вирусной этиологии и иммунотерапия, на которую возлагаются большие надежды, и некоторые противоопухолевые вакцины уже про ходят клинические испытания.

Антигенные изменения трансформированных клеток выражаются с одной стороны в утрате или значительном снижении синтеза некоторых нормальных клеточных антигенов, а с другой стороны – в приобретении опухолеспецифических и опухолеассоциированных анти генов. Опухолеспецифические антигены есть результат либо изменения собственного нор мального белка (гликопротеина) в результате мутации или пост-трансляционных нарушений, либо являются белками (гликопротеинами) вируса, способствовавшего возникновению дан ной опухоли. Опухолеассоциированные антигены - это продукты нормального клеточного генома, гены которых были активированы «не в то время или не в том месте». К таким анти генам, например, относятся эмбриоспецифические антигены, в норме характерные только для эмбрионального периода развития, и гетероорганные антигены, т.е. нормальные клеточ ные антигены, являющиеся специфичными для тканей, негомологичных опухолевой (Фель, Швембергер, 1968). Гетероорганные антигены отражают феномен антигенной дивергенции опухолевых клеток, который был открыт в лаборатории цитологии опухолевого роста Ин ститута цитологии РАН (Фель и др., 1965) одновременно, но независимо, с зарубежными ис следователями (Day, 1965).

Так, в лаборатории цитологии опухолевого роста при исследовании гепатоцеллю лярных опухолей крыс иммунологическими методами было установлено наличие мембран ных опухолеассоциированных антигенов, не свойственных нормальным гепатоцитам, но ха рактерных для нормальных почек интактных крыс (выявлены в базальных мембранах изви тых канальцев и на апикальных частях клеток эпителия главных отделов нефрона) (Иванов и др., 1975). Эти гетероорганные антигены выявляются в печени уже в 1-е сут после однократ ного канцерогенного воздействия на крыс и регистрируются в печени крыс в течение 21- сут в зависимости от вида канцерогена (Иванов и др., 1979;

Ivanov, Fel, 1980). Антигены по чечной специфичности были выявлены в печени эмбрионов крыс и новорожденных крысят (Ivanov et al., 1986), а также обнаруживались в течение 12 сут пролиферативных процессов в печени крыс после операции частичной гепатэктомии (Иванов, Фель, 1979). Методом двой ной иммунодиффузии в агаре при использовании иммуносыворотки против «клеточных те ней» почек крысы было обнаружено, что один из опухолеассоциированных антигенов гепа томы Зайдела идентичен одному из органоспецифических антигенов почки. Поэтому целью настоящей работы стала идентификация ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухоля ми крыс гетероорганного антигена, обнаруживаемого на поверхности клеток гепатомы Зай дела крысы с помощью органоспецифической антипочечной иммуносыворотки.

Задачи исследования.

1. Получить специфические иммуносыворотки к исследуемым антигенам.

2. С помощью полученных иммуносывороток охарактеризовать опухолеассоцииро ванные антигены некоторых гепатоцеллюлярных опухолей и опухолей другого гистогенеза.

3. Выделить мембранный гетероорганный антиген почечной специфичности, обнару женный ранее на поверхности клеток гепатомы Зайдела крыс.

4. Идентифицировать выделенный опухолеассоциированный антиген.

5. Провести сравнительный анализ двух гепатоцеллюлярных опухолей крыс в отно шении исследуемого антигена.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Исследованные гепатоцеллюлярные опухоли крыс характеризуются появлением на клеточной поверхности опухолеассоциированного антигена, свойственного почечной ткани интактных крыс и причастного к процессу пролиферации гепатоцеллюлярных клеток.

2. Анализ опухолеассоциированного мембранного антигена клеток двух гепатоцеллю лярных опухолей крыс позволил идентифицировать его как белок внеклеточного матрикса – ламинин.

3. Ламинин, синтезируемый клетками гепатомы Зайдела крысы, связывается с кле точной мембраной посредством нескольких ламинин-связывающих белков, одним из кото рых, на основании данных масс-спектрометрии, является мембранный белок теплового шока GRP78.

Научная новизна. Впервые выявлен мембранный гетероорганный антиген почеч ной специфичности с мол. массой около 200 кДа, ассоциированный с гепатоцеллюлярными опухолями крыс. Впервые этот гетероорганный антиген удалось идентифицировать с помо щью метода масс-спектрометрии как ламинин, по составу субъединиц соответствующий ла минину-8/9. Показана причастность исследуемого антигена к процессу клеточной пролифе рации. Впервые исследован репертуар ламинин-связывающих мембранных белков клеток асцитной гепатомы Зайдела крыс. Впервые показано, что одним из ламинин-связывающих белков клеточной поверхности гепатомы Зайдела крыс является мембранно-локализованный белок теплового шока GRP78.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа имеет фундаментальную направленность. Результаты работы важны прежде всего для понимания процессов неопла стической трансформации клеток и обнаружения тех молекулярно-клеточных механизмов, которые при этом задействованы. Полученные результаты могут быть использованы для изучения механизмов регуляции экспрессии генов при дифференцировке и трансформации клеток. Выявлено одно из проявлений тканеспецифичского механизма неопластической трансформации гепатоцитов, заключающееся в экспрессии ими ламинина. Поскольку дан ный гетероорганный антиген выявляется в клетках уже в первые сутки после канцерогенного воздействия, задолго до появления опухоли, он может быть использован в качестве маркера дисдифференцировки и малигнизации гепатоцитов. Результаты работы закладывают основу для дальнейшего изучения роли отдельных белков клеточной поверхности, в частности ла минина и GRP78, в процессе неопластической трансформации гепатоцитов. Полученные ре зультаты, возможно, помогут дальнейшему развитию и использованию научно обоснованных методов борьбы со злокачественными новообразованиями.

Результаты работы используются в лекционном и практическом курсах Кафедры общей и клинической токсикологии Медицинской академии постдипломного образования.

Кроме того, результаты работы включены в курс лекций по цитологии для студентов биоло го-почвенного факультета СПбГУ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1996, 1998);

7- й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2003);

I Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003);

I Всероссийской конференции «Фи зиология иммунной системы» и I Всероссийской конференции по иммунотерапии (Сочи, 2003);

Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, ре генерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004);

II Международном семинаре-школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, 2004), Рос сийской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2005» (Санкт Петербург, 2005);

Международной школе по сравнительной иммунологии “Current trends in comparative immunology”, DAAD Summer School on St. Petersburg (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 статей в рецен зируемых журналах, а также тезисы 11 докладов на всероссийских и международных симпо зиумах, конференциях и школах.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Рос сийского фонда фундаментальных исследований (проекты 96-04-49733, 00-04-49387, 04-04 49186), Санкт-Петербургского научного центра РАН (конкурс персональных грантов для студентов, аспирантов, молодых ученых и специалистов в области гуманитарных, естествен ных, технических и медицинских наук, грант № МО3-2.6К-113) и Санкт-Петербургского На учного центра (грант 2005 г.) Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машино писного текста и состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Ре зультаты, Обсуждение, Выводы и Список цитируемой литературы (содержит 338 публика ции). Иллюстративный материал содержит 24 рисунка и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные, клеточные линии и перевиваемые опухоли. В ра боте использовали белых беспородных взрослых крыс-самцов массой 120 - 150 г и кроликов самцов массой 2 – 2.5 кг (питомник «Рапполово», РАМН). Клеточные культуры гепатомы НТС крысы, гепатомы 27 крысы, дифференцирующихся миогенных клеток крысы, фиброб ластов почек крысы и гепатомы BWTG3 мыши получены из Российской коллекции клеточ ных культур (Институт цитологии РАН). Из перевиваемых опухолей животных использова ли асцитную гепатому Зайдела крысы, рабдомиосаркому РА-2 крысы и гепатому 22а мыши.

Иммунизация кроликов и получение специфических иммуносывороток. Органос пецифическую антипочечную и опухолеспецифическую (антиопухолевую) иммуносыворот ки получали путем иммунизации кроликов препаратами «клеточных теней» почек крыс или препаратами плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела крыс, соответственно, в смеси с адъювантом Фрейнда, с последующим истощением иммуносывороток гомогенатом печени крысы и выделением фракции иммуноглобулинов G методом аффинной хроматогра фии на колонке белок А-агароза. (Иванов, 1982, Терюкова, Иванов, 1993). В качестве кон троля таким же образом была очищена фракция IgG из нормальной сыворотки интактного кролика. По аналогичной схеме получали антитела против ламинина-1 (за исключением ис тощения иммуносыворотки гомогенатом печени крысы). Специфичность полученных поли клональных антител оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа. В дальнейшем все полученные препараты антител (фракции IgG) будем называть иммуносы воротками.

Приготовление препаратов клеточных мембран и экстрактов периферических белков плазматических мембран клеток. Препараты клеточных мембран почки («клеточ ные тени») были получены в соответствии с рекомендациями Белошапкиной и Абелева (Be loshapkina, Abelev, 1965). Фракцию плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела и ге патоцитов крыс получали по методу Хеффнера и соавторов (Haeffner et al., 1980) с модифи кацией, заключавшейся в том, что на последнем этапе фракционирование клеточных мем бран проводили в градиенте перколла, а не сахарозы. Экстракцию периферических белков клеток проводили в буферном растворе 3М KCl (Zak-Nejmark et al., 1978).

Определение концентрации белка. Концентрацию мембранно-связанного белка и белка в растворе детергента определяли по методу Марквелла с соавторами (Markwell et al., 1978). Концентрацию белка, экстрагированного 3 М KCl, и белка во фракциях IgG определя ли по методу Лоури с соавторами (Lowry et al., 1951).

Твердофазный иммуноферментный анализ. Специфичность полученных иммуносы вороток против «клеточных теней» почек крыс и препаратов плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела, а также количественные показатели взаимодействия указанных иммуно сывороток с мембранными антигенами клеток, уровень сывороточного ламинина и уровень антител в сыворотках и асцитах определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода (Терюкова, Иванов, 1993), проводимого в плоскодонных 96-луночных планшетах для микротитрования (Linbro, США). В качестве вторых антител использовали козьи антитела против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена. После достаточного развития цветной реакции процесс останавливали внесением в лунки по 20 мкл 2.5 М HCl и оценивали интенсивность окрашивания по оптической плотности растворов в лунках с помощью фото метра с вертикальным лучом (Titertek Multiscan, Финляндия) при длине волны 492 нм. В ряде случаев для оценки результатов иммуноферментного анализа был использован индекс взаи модействия иммуносыворотки, который вычисляли как отношение показателя оптической плотности раствора в опытных лунках (при взаимодействии антигенов с иммуносывороткой) к показателю оптической плотности раствора в контрольных лунках (при взаимодействии антигенов с сывороткой интактного кролика).

Иммунофлуоресцентный анализ. Исследование белков клеточной поверхности про водили методом непрямой иммунофлуоресценции. Для этого клетки либо культивировали на покровных стеклах в течение 2 сут в среде ДМЕМ с 10 % сыворотки плодов коровы;

либо наносили каплю суспензии, содержащую клетки в концентрации 4-5 млн/мл на предметное стекло и оставляли во влажной камере на 30 мин для прикрепления клеток на стекло с после дующим фиксированием клеток 2 %-ным формальдегидом и обработкой иммуносыворотка ми. В качестве вторых антител использовали ослиную иммуносыворотку против иммуногло булинов кролика, меченную изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ). Клетки перевиваемых опухолей и гепатоциты обрабатывали в суспензии согласно методике Лежневой (Лежнева, 1968).

Оценка пролиферации по включению С-тимидина. Клетки гепатомы НТС в кон центрации 120 103 клеток/мл, находящиеся в среде Игла с 10 % сыворотки плодов коровы, инкубировали в СО2-термостате в течение 20 ч при 37 0С с добавлением либо органоспеци фической антипочечной иммуносыворотки, либо сыворотки интактного кролика. Затем клет ки отмывали средой Игла без сыворотки и инкубировали в среде, содержащей С-тимидин (37 кБк/мл) 1 ч при 37 0С, после обрабатывали 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты и лизировали в 0.1 н NaOH. Радиоактивность полученной кислотонерастворимой фракции измеряли в сцинтилляционном счетчике фирмы Beckman. Во всех сериях опытов для оценки каждого варианта снимали показания для 3 лунок. Значение включения метки в ДНК клеток, культивируемых в присутствии сыворотки интактного кролика, было принято за 100 %.

Исследование однократного воздействия на крыс гепатоканцерогена. Гепатокан цероген N-диэтилнитрозамин (ДЭНА) растворяли в изотоническом растворе NaCl и вводили крысам внутрибрюшинно из расчета 200 мг на 1 кг массы животного в объеме 1 мл. Кон трольным животным вводили внутрибрюшинно по 1 мл 0.15 М NaCl. Гепатоциты выделяли согласно методике (Гринчишин и др., 1981) спустя 4 сут после введения гепатоканцерогена.

Электрофоретическое разделение белков и иммуноблотинг. Белки плазматических мембран или белки, выделенные хроматографическими методами, были подвергнуты элек трофорезу в 10 или 5 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфа та натрия (ДСН) (Laemmli, 1970). В качестве маркеров молекулярной массы использовали либо препарат миофибрилл кролика, либо набор маркеров молекулярной массы (Sigmа, США). После окончания фореза гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану с разме ром пор 0.45 микрон (Amersham, Швеция) и осуществляли перенос белков в течение 2 ч при напряжении 100-300 В и силе тока 500 мА. Для визуализации белковых полос нитроцеллю лозную мембрану окрашивали Понсо С. Места неспецифического связывания белков нитро целлюлозой блокировали 3%-ным сухим молоком на 20 мМ Трис буфере с 150 мМ NaCl, рН 7. Далее мембрану инкубировали с иммуносыворотками, в качестве вторых антител исполь зовали козьи антитела против кроличьих IgG, конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma, США).

Масс-спектрометрический анализ. Белковые полосы, разделенные в 5%-ном ПААГ, были визуализированы окрашиванием Coomassie Brilliant Blue R250, вырезаны из геля и под готовлены для масс-спектрометрического анализа по методу Шевченко и соавторов (Shevchenko et al., 1996). Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре MALDI TOF Bruker reflex IV в режиме положительных ионов с использованием рефлектро на. Полученные пептидные спектры обрабатывали с использованием поисковой базы SwissPROT (http://prospector.ucsf.edu).

Аффинная хроматография. Для приготовления аффинной колонки 1.7 г подготов ленной CNBr-сефарозы (Sigma) соединяли с 2.1 мг ламинина-1, любезно предоставленного д.б.н., проф. Г.П. Пинаевым (Отдел клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт Петербург). Белки плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела лизировали с исполь зованием буферного раствора, содержащего 1 % Тритона Х-100 и протеазы. Связывание мембранных белков с ламинин-сефарозой проводили в объеме (batch method). Связавшиеся с ламинином белки элюировали либо 0.1 М глицином, рН 2.4 с немедленной нейтрализацией фракций 0.5 М NaOH, либо буферным раствором с добавлением 20 мМ ЭДТА.

Статистическая обработка. Для статистической обработки данных была использо ваны программы Microcal Origin 6.0 и Statistica 6.0. Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ Характеристика полученных иммуносывороток. Для проведения работы были получены 2 вида поликлональных иммуносывороток – органоспецифическая иммуносыво ротка против «клеточных теней» почек крыс и антиопухолевая иммуносыворотка против плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела крыс. Обе иммуносыворотки были истощены гомогенатом печени крысы и их специфичность тестировали методом твер дофазного иммуноферментного анализа. Так, антипочечная иммуносыворотка, значительно утратив после истощения способность реагировать с гепатоцитами (приближается к кон трольному уровню значений для сыворотки интактного кролика), сохранила при этом высо кий уровень взаимодействия с клетками гепатомы, что говорит о наличии на опухолевых клетках антигенов, свойственных нормальным почкам крысы (рис. 1) (Тюряева и др., 2005а).

Оптическая плотность при 492 нм Рис. 1. Характеристика специфич ности истощенной гомогенатом печени крысы антипочечной сыворотки в отноше 1500 нии плазматических мембран клеток кры сы.

1 – почка, 2 – гепатома Зайдела, 3 – гепа тоциты;

4 - 6 – гепатоциты, гепатома Зай дела и почка соответственно с сывороткой интактного кролика.

20 100 Обратные разведения сыворотки Иммуносыворотка против препарата плазматических мембран клеток гепатомы Зай дела, истощенная гомогенатом печени, реагировала с гепатоцитами лишь на небольших раз ведениях иммуносыворотки, тогда как с клетками гепатомы реакция наблюдалась и при раз ведении 1 : 1280 (рис. 2) (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

Оптическая плотность при 492 нм Рис. 2. Характеристика спе цифичности антиопухолевой имму носыворотки в отношении плазмати ческих мембран клеток гепатомы Зайдела (1) и клеточных мембран ге патоцитов (2) крыс.

200 10 100 Обратные разведения сыворотки Полученные данные позволили заключить, что сыворотки, имеющиеся в нашем рас поряжении, являются специфичными: одна – в отношении компонентов клеточных мембран почек крысы, т.е. органоспецифической антипочечной, а вторая – в отношении мембранных антигенов, ассоциированных с клетками гепатомы Зайдела, т.е. опухолеспецифической.

Выявление опухолеассоциированных мембранных антигенов гепатомы Зайдела крысы. С помощью опухолеспецифической иммуносыворотки против плазматических мем бран клеток гепатомы Зайдела после электрофоретического разделения мембранных белков в 10 %-ном ПААГ и последующего иммуноблотинга было обнаружено, что клетки гепатомы Зайдела характеризуются наличием по крайней мере 10 опухолеассоциированных антигенов с мол. массами около 180, 96, 65, 56, 46, 42, 33, 31, 25 и 22 кДа, при отсутствии взаимодейст вия иммуносыворотки с белками гепатоцитов интактных крыс (Терюкова, Тюряева и др., 1997). Надо отметить, что наибольшая мол. масса маркера, применяемого в данном исследо вании, составляла 94 кДа (фосфорилаза б), поэтому определенная нами мол. масса первого компонента (около 180 кДа) может иметь достаточно большую погрешность.

На рис. 3 показана количественная оценка взаимодействия антиопухолевой иммуно сыворотки с препаратами клеточных мембран. Выраженная реакция этой иммуносыворотки с препаратами клеточных мембран почки крысы представила дополнительное доказательство наличия среди опухолеассоциированных антигенов клеток гепатомы Зайдела компонентов, присущих почке крысы (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

иммуносыворотки, усл. ед.

Индекс взаимодействия Рис. 3. Количественная оценка взаимодействия опухолеспецифической иммуносыворотки с препаратами плаз матических мембран гепатоцитов (1), почки («клеточные тени»;

2) и гепатомы Зайдела (3) крыс. Вертикальные отрезки – ошибка среднего.

1 2 Путем KCl-экстракции были выделены периферические белки клеточных мембран ряда клеток. Исследование взаимодействия антиопухолевой иммуносыворотки с препарата ми периферических белков (рис. 4) позволило сделать следующие выводы: 1) антигенный спектр клеток гепатомы Зайдела крысы по сравнению с гепатоцитами интактных крыс обо гащен рядом опухолеассоциированных компонентов, среди которых есть антигены, прису щие почкам крыс и являющиеся периферическими белками плазматических мембран клеток;

2) три гепатоцеллюлярные опухоли крысы - гепатома Зайдела, гепатома НТС и гепатома 27 характеризуются некими общими опухолевыми антигенами;

3) взаимодействие опухолеспе цифической сыворотки с препаратами периферических белков культивируемых миогенных клеток крысы, которые являются активно пролиферирующими, но не опухолевыми, предпо лагает возможную причастность некоторых опухолеассоциированных компонентов к про цессу клеточной пролиферации (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

Рис. 4. Количественная оценка взаимодействия опухолеспецифической иммуносыворотки, усл. ед.

Индекс взаимодействия иммуносыворотки с антигенами клеток крыс, экстрагированными 3 М KCl.

1 – гепатоциты;

2 – гепатома Зайдела;

– гепатома НТС, 4 – гепатома 27;

5 фибробласты почки;

6 – миогенные клетки. Вертикальные отрезки – ошибка 1 2 3 4 5 среднего.

Специфическое свечение, обнаруженное нами методом непрямой иммунофлуорес ценции с помощью опухолеспецифической иммуносыворотки на поверхности культивируе мых клеток гепатомы НТС и 27, а также миогенных клеток крысы, подтверждает локализа цию исследуемых опухолеассоциированных антигенов на наружной мембране клеток (рис.

5). При обработке всех исследуемых клеток сывороткой интактного кролика или только ос линой сывороткой против иммуноглобулинов кролика, меченой ФИТЦ, специфического све чения клеточных мембран не наблюдалось (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

в а г б Рис. 5. Выявление антигенов, ассоциированных с гепатомой Зайдела крыс, на поверх ности культивируемых клеток гепатомы НТС (б), гепатомы 27 (в) и миогенных клеток (г) крысы методом непрямой иммунофлуоресценции. а – контроль (клетки НТС с сывороткой интактного кролика).

Таким образом, антигенный спектр клеток гепатомы Зайдела по сравнению с гепато цитами крыс обогащен рядом опухолеассоциированных компонентов, среди которых есть антигены, присущие почкам крыс и являющиеся периферическими белками плазматических мембран клеток. Кроме того, гепатомы НТС и 27 крысы характеризуются наличием опухоле ассоциированных антигенов, иммунологически сходных с гепатомой Зайдела.

Выявление гетероорганных антигенов на поверхности культивируемых клеток и их связь с пролиферативной активностью клеток. Для того чтобы выяснить, являются ли мембранные опухолеассоциированные антигены, присущие почечной ткани, характерной особенностью лишь асцитной гепатомы Зайдела крысы или также присутствуют в других гепатоцеллюлярных опухолях и в опухолях другого гистогенеза, мы тестировали ряд культи вируемых клеток с помощью органоспецифической антипочечной сыворотки (Терюкова, Тюряева и др., 1996). На рис. 6 представлены результаты иммунофлуоресцентного анализа, демонстрирующие наличие антигенов почечной специфичности на поверхности трех иссле дуемых гепатоцеллюлярных опухолей крыс, двух гепатоцеллюлярных опухолей ксеногенно го вида животного – мышей, а также на поверхности культивируемых миогенных клеток крыс и опухолевых миогенных клеток – рабдомиосаркомы РА-2 крысы.

г а б в ж е д з Рис. 6. Выявление мембранных гетероорганных антигенов, ассоциированных с клет ками гепатомы Зайдела, на поверхности культивируемых клеток методом непрямой имму нофлуоресценции.

а – гепатоциты интактных крыс;

б – гепатома НТС крысы;

в – гепатома 27 крысы;

г – гепатома Зайдела крысы;

д – миогенные клетки крысы;

е - рабдомиосаркома РА-2 крысы;

ж– гепатома BWTG3 мыши;

з – гепатома 22а мыши.

Для того чтобы выяснить возможную связь выявляемых антигенов с пролифератив ной активностью клеток, было исследовано влияние органоспецифической антипочечной иммуносыворотки на синтез ДНК в культивируемых клетках гепатомы НТС, регистрируемо го по включению С-тимидина в клетки, обработанные либо специфической иммуносыво роткой, либо сывороткой интактного кролика (Teryukova, Blinova, Tyuryaeva et al., 1999). До бавление в культуральную среду 390 мкг/мл антипочечной сывороткой снижало синтез ДНК в одном опыте на 23 %, а в другом – на 62 % по сравнению с количеством метки, включив шейся при инкубации клеток с нормальной сывороткой кролика, а добавление 520 мкг/мл антипочечной иммуносыворотки приводило к снижению синтеза ДНК на 29 %. Несмотря на неоднородность полученных результатов, снижение синтеза ДНК в клетках в присутствии антипочечной иммуносыворотки может указывать на вовлечение этих антигенов в процесс клеточной пролиферации.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в состав плазматических мембран тестируемых гепатоцеллюлярных опухолей включены антигены, являющиеся органоспецифическими для почки крысы. Появление таких гетероорганных ан тигенов в составе клеточных мембран опухолей, различающихся по своему гистогенезу и этиологии, указывает на закономерный характер этого явления.

Определение молекулярной массы опухолеассоциированного мембранного антиге на клеток гепатомы Зайдела, реагирующего с антипочечной иммуносывороткой, и его идентификация (Тюряева и др., 2005а). Мембранные белки клеток гепатомы Зайдела, гепа тоцитов крыс и почек крыс были разделены электрофоретически в 5%-ном полиакриламид ном геле и перенесены на нитроцеллюлозную мембрану для иммуноблотинга. Антипочечные антитела выявили в составе плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела компонент или два близко расположенных компонента в районе 200 кДа (рис. 7).

Рис. 7. Выявление гетероорганных антигенов в лизатах мембранных белков клеток асцитной гепатомы Зайдела методом иммуноблотинга с помощью антипочечной им муносыворотки.

1 – мембранные белки почки крысы;

2 – мембранные белки гепатоцитов крысы;

3 – мембранные белки клеток гепатомы Зайдела крысы.

В клеточных мембранах почек несколько белков реагируют с антипочечной сыворот кой, тогда как реакции с плазматическими мембранами печени не выявлено. Таким образом, в составе плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела был выявлен компонент, отсут ствующий в нормальных плазматических мембранах гепатоцитов, но присущий клеточным мембранам почки крысы. По всей видимости, именно этот компонент обуславливает взаимо действие антипочечной сыворотки с плазматическими мембранами клеток гепатомы Зайде ла.

Идентифицикация выявленного компонента была проведена методом масс спектрометрии. Для этого белки плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела были разделены в 5 %-ном полиакриламидном геле, визуализованы окрашиванием Кумасси и две белковые полосы, располагающиеся в районе 200 кДа и обозначенные нами номерами I и II (рис. 8), были вырезаны и подвергнуты расщеплению трипсином.

Рис. 8. Электрофоретическое разделение белков фракции плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела.

В увеличенном фрагменте рисунка показаны две белковые полосы, подвергнутые масс-спектрометричес кому анализу и обозначенные нами номерами I и II.

Полученные пептиды анализировали методом масс-спектрометрии. Массы пептидов были использованы для идентификации белков в поисковой базе данных SwissPROT. Анализ результатов позволил сделать вывод, что белковая полоса I содержит пептиды 1, 2 и цепи ламинина (табл.1), а белковая полоса II - пептиды 1 цепи ламинина (табл. 2).

Таблица Результаты масс-спектрометрического исследования белков, содержащихся в образце I.

Число найден- Перекрывание Название белка Мол. масса*, № по Swiss ных триптиче- последователь по Swiss-Prot Да Prot ских пептидов ности белка, % CHAIN 1: Laminin beta- 196476 P15800 85 chain. – Rattus norvegicus (Rat) CHAIN 1: Laminin beta- 196355 Q61292 74 chain. – Mus musculus (Mouse) CHAIN 1: Laminin beta- 196907 P02469 67 chain. – Mus musculus (Mouse) CHAIN 1: Laminin alpha- 201821 P97927 48 chain. – Mus musculus (Mouse) * - Указана мол. масса для непроцессированного предшественника Таблица Результаты масс-спектрометрического исследования белка, содержащегося в образце II.

Число найден- Перекрывание Название белка Мол. масса*, № по Swiss ных триптиче- последователь по Swiss-Prot Да Prot ских пептидов ности белка, % CHAIN 1: Laminin gamma 1 chain. -Mus musculus 177300 P02468 66 (Mouse) *- Указана мол. масса для непроцессированного предшественника Как видно из данных, приведенных в таблицах 1 и 2, большинство найденных в базе белков принадлежит мыши, потому что именно для этого животного среди грызунов опреде лены пептидные карты для всех известных цепей ламинина, тогда как для крысы определены пептидные карты только для 2 цепи ламинина (база Swiss-Prot) и нескольких фрагментов ламинина (база TrEMBL), но гомология ламининов очень высока, поэтому результаты поис ка можно экстраполировать и на другие виды животных. Также следует отметить высокий процент перекрывания выявленными в масс-спектре пептидами аминокислотных последова тельностей указанных цепей ламинина. Обычно для уверенной идентификации белка мето дом MALDI-TOF масс-спектрометрии достаточно 20 %-ного перекрывания его аминокис лотной последовательности.

Для подтверждения масс-спектрометрических данных была получена иммуносыво ротка против препарата ламинина-1. Результаты иммуноблотинга (рис.9) подтвердили дан ные масс-спектрометрии.

Рис. Иммуноблотинг белков 9.

плазматических мембран и препарата ла минина-1 с антиламининовой иммуносы вороткой.

1 – мембранные белки клеток гепатомы Зайдела;

2 – мембранные белки почек кры сы;

3 – мембранные белки гепатоцитов;

4 – ламинин-1.

Полученные антитела реагировали с ламинином-1: 1 цепью, имеющей мол. массу 400 кДа, с 11 цепями, которые сомигрировали, образуя широкую полосу на уровне кДа, а также с белком, выделяемым вместе с ламинином-1, – нидогеном с мол. массой кДа. Субъединицы ламинина обнаруживались и в почечных мембранах, но не мембранах ге патоцитов. В составе плазматических мембран гепатомы Зайдела обнаруживалось взаимо действие антиламининовой иммуносыворотки с белковой полосой на уровне 200 кДа, под тверждающее наличие в ней субъединиц ламинина.

Наличие и локализация исследуемого антигена на поверхности клеток гепатомы Зай дела подтверждены иммунофлуоресцентным методом, обнаруживающим аналогичное све чение поверхности клеток как при обработке антипочечной иммуносывороткой, так и при обработке антиламининовой сывороткой (рис. 10).

а б в в б Рис. 10. Иммунофлуоресцентный анализ клеток гепатомы Зайдела.

а – нормальная сыворотка;

б – антипочечная сыворотка;

в - антиламининовая сыво ротка.

Тот факт, что антипочечная сыворотка содержит антитела к ламинину, был дополни тельно подтвержден электрофоретическим разделением субъединиц ламинина-1 в 5 %-ном полиакриламидном геле с последующим иммуноблотингом, результаты которого показаны на рис. 11. Антипочечная сыворотка выявляет субъединицы ламинина.

Рис. 11. Органоспецифическая антипочечная им муносыворотка взаимодействует в иммуноблоте с лами нином.

1 – белки клеточных мембран почки крысы;

2 – препарат ламинина.

Сравнительный анализ двух мембранных опухолеассоциированных гетероорган ных антигенов, выявляемых в районе 200 кДа, клеток гепатомы Зайдела и гепатомы НТС. Тестирование белков плазматических мембран клеток гепатомы НТС крысы с помо щью антиламининовой иммуносыворотки в иммуноблоте после их электрофоретического разделения (рис 12, А) также обнаружило проявление иммунологической реакции в районе 200 кДа (рис. 12, Б).

А Б Рис. 12. Электрофоретическое разделе ние мембранных белков клеток гепато мы Зайдела и гепатомы НТС крыс (А) и выявление в иммуноблоте субъединиц ламинина (Б).

дорожка 1- гепатома Зайдела;

дорожка 2 – гепатома НТС.

1 2 1 Методом масс-спектрометрии был проведен сравнительный анализ белковых полос в районе 200 кДа фракций плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела и гепатомы НТС. В данном случае мы анализировали фрагменты полиакриламидного геля, содержащие обе белковых полосы - I и II. Примеры полученных MALDI-TOF масс-спектров представле ны на рис. 13 и рис. 14.

Рис. 13. Масс-спектр продуктов трипсинолиза белковых полос, располагающихся в районе 200 кДа после электрофоретического разделения мембранных белков клеток гепато мы Зайдела.

4, 1, 2, 1 – отмечены пептиды 4, 1, 2 и 1 цепей ламинина;

* - отмечены не идентифицированные пептиды.

Рис. 14. Масс-спектр продуктов трипсинолиза белковых полос, располагающихся в районе 200 кДа после электрофоретического разделения мембранных белков клеток гепато мы НТС.

4, 1, 2, 1 – отмечены триптические пептиды 4, 1, 2 и 1 цепей ламинина;

* отмечены не идентифицированные пептиды.

Массы пептидов были использованы для идентификации белков в поисковой базе данных SwissPROT. Анализ результатов позволил сделать вывод, что, как и в образце мем бранных белков в районе 200 кДа клеток гепатомы Зайдела, аналогичный компонент гепато мы НТС содержит пептиды 4, 1, 2 и 1 цепей ламинина (табл. 3).

Надо отметить, что, несмотря на высокую межвидовую гомологию цепей ламинина, существуют пептиды, характерные именно для данного вида животного. Так, сравнение масс-спектров триптических фрагментов 2 цепи ламинина мыши и крысы обнаружило не которые различия. Например, пептиды с мол. массой (МН+) 968.49, 1001.53, 1184.59 принад лежат 2 цепи ламинина мыши, но не крысы. А пептиды с мол. массой (МН+) 974.51, 1063.48, 1456.64 принадлежат 2 цепи ламинина только крысы. Поэтому ряд не идентифици рованных пептидов может принадлежать соответствующим субъединицам ламинина не мы ши, а крысы, масс-спектрометрические данные для которой отсутствуют в базах данных.

Таким образом, несмотря на то, что эти две гепатоцеллюлярные опухоли индуцирова ны разными канцерогенами и по-разному культивируются (гепатома Зайдела – перевиваемая внутрибрюшинно асцитная опухоль, а гепатома НТС – клеточная культура), клетки обеих опухолей инициировали синтез одного и того же мембранного антигена – ламинина 8/9.

Таблица Результаты масс-спектрометрического исследования двух опухоле ассоциированных антигенов почечной специфичности Число найденных триптических Перекрывание последовательности Название белка пептидов белка, % по Swiss-Prot гепатома гепатома гепатома гепатома Зайдела НТС Зайдела НТС Laminin beta- 66 73 31 chain (Rat) Laminin beta- 62 71 31 chain (Mouse) Laminin beta- 43 56 20 chain (Mouse) Laminin alpha- 54 66 28 chain (Mouse) Laminin gamma 62 61 26 1 chain (Mouse) Идентификация ламинин-связывающих мембранных белков клеток гепатомы Зайдела. Поскольку ламинин является белком внеклеточного матрикса и находится в тесной ассоциации с плазматическими мембранами клеток посредством взаимодействия с интегри новыми и неинтегриновыми рецепторами, то задачей дальнейшего исследования стало опре деление тех ламинин-связывающих белков, которые принимают участие в организации ла минина на поверхности опухолевых клеток, в частности клеток гепатомы Зайдела (Тюряева и др., 2005б). Данная работа была выполнена методами аффинной хроматографии и масс спектрометрии.

Для выделения специфических мембранных компонентов, участвующих в присоеди нении ламинина к клеточной поверхности, лизат белков плазматических мембран клеток ге патомы Зайдела, был нанесен на колонку с CNBr-сефарозой, связанной с ламинином-1. Ос новными белками, элюированными с колонки 0.1 М глицином (рН 2.4), оказались компонен ты с мол. массами около 80, 67, 60, 55, 52, 48 и 43 кДа (рис 15, А). При выделении мембран ных белков на аффинной колонке в присутствии MnCl2 мы ожидали выявить интегриновые рецепторы к ламинину. Однако элюция раствором ЭДТА белков, связавшихся с ламинином, обнаружила лишь один основной компонент с мол. массой около 80 кДа (рис 15, Б, дорожка 1). В высокомолекулярной области, характерной для субъединиц интегринов, можно разли чить несколько белковых полос, но они слабо выражены. В последующей фракции белков, элюируемой c колонки 0.1 М глицином (рН 2.4), нами было выявлено несколько компонен тов с мол. массой около 80, 67, 55, 52, 43, 37 и 32 кДа (рис 15, Б, дорожка 2).

А Б Рис. 15. Выделение белков плазма тических мембран клеток гепатомы Зайдела методом аффинной хроматографии на ла минин-сефарозе.

А – белки, элюированные с колонки 0.1 М глицином, рН 2,4. Б – белки, выделенные в присутствии MnCl2: дорожка 1 – элюция с колонки раствором ЭДТА;

дорожка 2 – по следующая элюция 0.1 М глицином, рН 2. 1 Некоторые из этих компонентов были идентифицированы методом масс спектрометрии. Полученный пептидный спектр компонента с мол. массой около 80 кДа (рис.

16) соответствует 78 кДа glucose-regulated protein precursor (GRP78);

обнаруженные пептиды перекрывают 46 % последовательности белка.

Рис. 16. Масс-спектрометрический анализ белка плазматических мембран клеток ге патомы Зайдела с мол. массой около 80 кДа, выделенного на ламинин-сефарозе и идентифи цированного как GRP78. Цифрами отмечены сигналы для пептидов GRP78;

Ker – привне сенное в пробу загрязнение кератином человека.

Выделенный с помощью аффинной хроматографии компонент с мол. массой около кДа соответствует пептидной карте актина (бета или гамма актинам при одинаковых массах пептидов и одинаковом перекрывании последовательностей белков – 54 %). Пептидный спектр показан на рис. 17. Вероятно, что этот белок выделяется с аффинной колонки, будучи связанным с одним из трансмембранных компонентов, реагирующим с ламинином.

Рис. 17. Масс-спектрометрический анализ белка плазматических мембран клеток ге патомы Зайдела с мол. массой около 43 кДа, выделенного на ламинин-сефарозе и идентифи цированного как цитоплазматический актин.

Цифрами отмечены сигналы для пептидов актина;

* – пептиды, полученные в резуль тате неспецифического расщепления актина;

Try – автогидролиз трипсина.

Пептидные карты белков с мол. массами около 67 кДа и 57 кДа отображают, по видимому, смесь нескольких компонентов. Так, например, в образце с мол. массой около кДа мы обнаружили часть пептидов, характерных для сывороточного альбумина, который, как показано (von der Mark, Risse, 1987;

Mecham, 1991), может загрязнять препараты мем бран клеток и быть сопутствующим белком, элюируемым с аффинной колонки ламинин сефароза. Также нами выявлены сигналы, характерные для рецептора ламинина с молеку лярной массой 67 кДа (67кДа ЛР), но они слабые по интенсивности относительно всего ос тального спектра – минорный компонент.

Подводя общий итог полученным результатам, можно сказать, что антигенный спектр клеток гепатоцеллюлярных опухолей по сравнению с гепатоцитами интактных крыс обога щен одним из белков внеклеточного матрикса – ламинином, который синтезируется клетка ми исследованных гепатом крыс, связывается с плазматической мембраной этих клеток по средством ряда мембранных компонентов и является необходимым, по-видимому, для про лиферативной активности клеток.

ВЫВОДЫ 1. На клетках гепатоцеллюлярных опухолей Зайдела, НТС и 27 крыс присутствуют мембранные антигены, характерные для почек крыс, не обнаруживаемые в гепато цитах интактных животных.

2. Обнаруженные мембранные опухолеассоциированные антигены являются пери ферическими белками и связаны с пролиферативной активностью культивируемых гепатомных клеток.

3. Выявлен мембранный опухолевый антиген почечной специфичности, ассоцииро ванный с гепатомами Зайдела и НТС крыс.

4. Выделенный антиген, ассоциированный с гепатомами Зайдела и НТС крыс, иден тифицирован как белок внеклеточного матрикса – ламинин (4, 1, 2 и 1 цепи ламинина, что соответствует ламинину 8/9).

5. Ламинин, синтезируемый клетками гепатомы Зайдела крысы, связывается с кле точной мембраной посредством нескольких ламинин-связывающих белков, один из которых идентифицирован как белок теплового шока GRP78.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Н.П. Терюкова, И.И. Тюряева, А.Б. Грандилевская, В.А. Иванов. 1996. Исследование мембранных антигенов опухолевых клеток крыс и гомологичных им дефинитивных тканей с помощью органоспецифической сыворотки против клеточных мембран почки. Материалы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре». Цитология. 38 (2): 284-285.

2. Н.П. Терюкова, И.И. Тюряева, А.Б. Грандилевская, В.А. Иванов. 1996. Мембранные гетероорганные антигены опухолей гепатоцеллюлярного и миогенного происхождения. Ци тология. 38 (10): 1092-1097.

3. Н.П. Терюкова, И.И. Тюряева, А.Б. Грандилевская, В.А. Иванов. 1997. Выявление мембранных опухолеассоциированных антигенов гепатомы Зайдела на поверхности культи вируемых клеток крыс. Цитология. 39 (7): 577-581.

4. N.P. Teryukova, G.I. Blinova, I.I. Tyuryaeva, V.A. Ivanov. 1999. Inhibitory Effect of Poly clonal Antibodies against Tumor-Associated Membranous Heteroorganic Antigen MA-50 on DNA Synthesis in Cultured Rat Cells. Experimental Oncology. 21 (2): 146-149.

5. Н.П. Терюкова, И.И. Тюряева, Ю.М. Розанов, Г.И. Блинова, А.Б. Грандилевская, В.А.

Иванов. 1999. Использование проточной цитофлуориметрии для количественной оценки свя зывания органоспецифической антипочеченой сыворотки с поверхностными антигенами не которых культивируемых клеток и гепатоцитов крысы. Материалы Всероссийского симпо зиума «Биология клетки в культуре». Цитология. 41 (3/4): 317-318.

6. И.И. Тюряева, О.А. Черепанова, В.А. Иванов. 2003. Антигенная дивергенция опухоле вых клеток: функциональное значение гетероорганных антигенов. В. сб. тезисов 7-й Пущин ской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века»: 383-384.

7. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2003. Идентификация гетероорганных опухолеассоцииро ванных антигенов гепатомы Зайдела крыс. I Съезд Общества клеточной биологии. Цитоло гия. 45 (9): 938.

8. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2003. Исследование мембранных гетероорганных опухо леассоциированных антигенов при канцерогенезе. Тезисы I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы» и I Всероссийской конференции по иммунотерапии. Inter national Journal on Immunorehabilitation. 5 (2): 225-226.

9. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2003. Исследование уровня сывороточного ламинина при опухолевом росте. Тезисы I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы»

и I Всероссийской конференции по иммунотерапии. International Journal on Immunorehabilita tion. 5 (2): 226.

10. И.И. Тюряева. 2003. Идентификация гетероорганных опухолеассоциированных анти генов гепатомы Зайдела крыс. 8-я Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и спе циалистов. В сб. аннотаций работ по грантам Санкт-Петербургского конкурса 2003 г. для студентов, аспирантов и молодых специалистов: 57.

11. Е.П. Подольская, И.И. Тюряева, А.В. Новиков, О.А. Миргородская. 2004. Исследова ние и идентификация опухолеассоциированных антигенов гепатомы Зайдела крысы методом масс-спектрометрии. Тезисы II Международного семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии»: 241.

12. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2004. Пролиферативные процессы в печени и ламинин.

Тезисы Международного симпозиума по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия». Цитология. 46 (10): 944.

13. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2005. Неопластическая трансформация гепатоцитов ас социирована с синтезом ламинина. Тезисы Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2005». Вопросы онкологии. 51 (1): 24-25.

14. И.И. Тюряева, О.А. Миргородская, О.А. Черепанова, Е.П. Подольская, А.В. Новиков, М.А. Ходорковский, В.А. Иванов. 2005. Выявление и идентификация ламинина в составе плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела крысы. Цитология. 47 (2): 150 162.

15. И.И. Тюряева, О.А. Миргородская, О.А. Черепанова, Е.П. Подольская, М.В. Серебря кова, В.А. Иванов. 2005. Взаимодействие ламинина с компонентами плазматических мем бран клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 47 (12): 1039-1047.

16. I.I. Tyuryaeva. 2005. Hepatocarcinogenesis is associated with laminin synthesis. In abstract book: “Current trends in comparative immunology. DAAD Summer School on St. Petersburg”: 28.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Гринчишин В.П., Осипов Л.А., Винарчук М.П. 1981. Выделение гепатоцитов из печени интактных крыс, получавших канцероген. Экспериментальная онкология. 3 (1):

29-33. Иванов В.А. 1982. Антигенные перестройки клеточных структур как следствие первичного действия химических канцерогенов. В кн.: Цитологические аспекты первич ного действия химических канцерогенов. Л., Наука, 2358. Иванов В.А., Белишева Н.К., Якобидзе В.Э., Фель В.Я. 1979. К оценке изменений антигенной структуры печени крыс после однократного канцерогенного воздействия. Цитология. 21 (7): 836-842. Иванов В.А., Фель В.Я. 1979. Исследование мембранных гетероорганных антигенов регенери рующей печени крыс. Цитология. 21(1): 115-117. Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М.

1975. О мембранных антигенах клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 17 (1): 24 29. Лежнева О.М. 1968. Выявление поверхностных антигенов на живых клетках методом флюоресцирующих антител. В кн.: Иммунохимический анализ. М., Медицина, 189201.

Терюкова Н.П., Иванов В.А. 1993. Выделение и характеристика мембранных гетероор ганных антигенов почечной природы, ассоциированных с гепатомой Зайдела. Цитология.

36 (8): 5963. Терюкова Н.П., Тюряева И.И., Грандилевская А.Б., Иванов В.А. 1996.

Мембранные гетероорганные антигены опухолей гепатоцеллюлярного и миогенного происхождения. Цитология. 38 (10): 1092-1097. Терюкова Н.П., Тюряева И.И., Гранди левская А.Б., Иванов В.А. 1997. Выявление мембранных опухолеассоциированных анти генов гепатомы Зайдела на поверхности культивируемых клеток крыс. Цитология. 39 (7):

577-581. Тюряева И.И.,. Миргородская О.А, Черепанова О.А, Подольская Е.П., Новиков А.В., Ходорковский М.А., Иванов В.А. 2005а. Выявление и идентификация ламинина в составе плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела крысы. Цитология.

47 (2): 150-162. Тюряева И.И., Миргородская О.А., Черепанова О.А., Подольская Е.П., Серебрякова М.В., Иванов В.А. 2005б. Взаимодействие ламинина с компонентами плаз матических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 47 (12): 1039-1047.

Фель В.Я., Швембергер И.Н. 1968. Морфологическое и иммунологическое изучение ци тодифференцировки экспериментальных опухолей. Л., Наука, 208 с. Фель В.Я., Швем бергер И.Н., Иванов В.А. 1965. К исследованию специфических антигенов, вызванных у крыс введением N-нитроздиэтиламина. Цитология. 7 (3): 416-420. Arap M.A., Lahdenranta J., Mintz P.J., Hajitou A., Sarkis A.S., Arap W., Pasqalini R. 2004. Cell surface expression of the stress response chaperone GRP78 enables tumor targeting by circulating ligands. Cancer Cell. 6 : 275284. Beloshapkina T.D., Abelev G.I. Immunohistochemical characteristics of In soluble Mouse Liver Cell Antigens. 1965. J Folia Biologica. 11 : 472477. Day E.D. 1965.

Antigenic diversion in cancer. Proc. American Assoc. Cancer Res. 6: 13-17. Delpino A., Piselli P., Vismara D., Vendetti S., Colizzi V. 1998. Cell surface localization of the 78 kD glucose regulated protein (GRP 78) induced by thapsigargin. Mol Membr Biol. 15 : 2126. Haeffner E.W., Kolbe K., Schroeter D., Paweletz N. 1980. Isolation of a light and a heavy membrane fraction of the glucogen-free Ehrlich-Lettre substain. Biochem. Biophys. Acta. 603 : 3651.

Ivanov V.A., Kushner V.P., Fel V. Ja. 1986. Antigenic diversion of rat liver cells characteristic of hepatocellular tumors after a single carcinogenic treatment and partial hepatectomy. Acta.

Biol. Hudg. 36: 225-227. Ivanov V.A., Fel V. Ja. 1980. On some similarity between membrane antigens of the cell of Zajdela hepatoma and liver of rats subjected to a single 4 dimethylaminoazobenzene injection. Neoplasma. 27: 745-50. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. 227: 680685. Little E., Ramakrishnan M., Roy B., Gazit G., Lee A.S. 1994. The glucose-regulated proteins (GRP and GRP94): functions, gene regulation, and applications. Crit. Rev. Eukeryotic Gene Expres sion. 4: 118. Liu C., Bhattacharjee G., Boisvert W., Dilley R., Edgington T. 2003. In vivio in terrogation of the molecular display of atherosclerotic lesion surfaces. Amer. J. Path. 163 :

18591871. Lowry O.H., Rosobrough N.J., Farr A.L., Radall R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. Markwell M.A.K., Haas S.V., Bie ber L.L., Tolbert N.E. 1978. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples.Anal. Biochem. 87 : 206210. Mecham R.P. 1991. Receptors for laminin on mammalian cells. FASEB J. 5 : 25382546. Misra U.K., Gonzalez-Gronow M., Gawdi G., Pizzo S.V. 2005. The role of MTJ-1 in cell surface transloca tion of GRP78, a receptor for 2-macroglobulin-dependent signaling. J. Immunol. 174:

20922097. Munro S., Pelham H.R.B. 1986. An Hsp70-like protein in the ER: identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. Cell. 46 :

291300. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. 1996. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 : 850858. Shin B.K., Wang H., Yim A.M., Naour F.L., Brichory F., Jang J.H., Zhao R., Puravs E., Tra J., Michael C.W., Misek D.E., Hanash S.M. 2003. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abudance of proteins with chaperone function. J. Biol. Chem. 278 : 76077616. Triantafilou K., Fradelizi D., Wilson K., Triantafilou M. 2001. GRP78, a coreceptor for coxsackievirus A9, Interacts with major histocompatibility complex class I molecules which mediate virus inter nalization. J. Virology. 77: 27842788. Von der Mark K., Risse G. 1987. Izolation and Char acterization of Laminin Receptors. Metods in enzymology. 144 : 490507. Zak-Nejmark N., Stenden J., Radzikowski C. 1978. Mammary leukemia (ML) antigen isolated from L 1210 leu kemia cells. Int. J. Cancer. 21: 490-495.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.