Биохимические и иммунологические свойства белков семейства rpf – факторов роста micrococcus luteus и mycobacterium tuberculosis
На правах рукописи
Казарьян
Константин Александрович
Биохимические и иммунологические свойства белков
семейства Rpf – факторов роста Micrococcus luteus и
Mycobacterium tuberculosis
03.00.04 – Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2004 2
Работа выполнена в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Института Биохимии им. А.Н. Баха РАН.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Капрельянц А.С.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Воробьева Л.И.
кандидат биологических наук Жердев А.В.
Ведущая организация – Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино.
Защита состоится « 25 » мая 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте Биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т. д. к.2.
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т. д. 33 к.2..
Автореферат разослан « » _ 2004г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский А.Ф.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы Хорошо известно, что адаптация бактерий к неблагоприятным условиям, в ряде случаев приводит к образованию специализированных покоящихся форм, таких как споры или цисты. Однако, как стало ясно в последнее время, некоторые неспорулирующие бактерии так же могут образовывать подобные покоящиеся (дормантные) формы. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Такие покоящиеся клетки, как правило, характеризуются измененной формой, утолщенной клеточной стенкой и некультивируемостью на твердых и (или) жидких питательных средах. Такие формы требуют специальной процедуры – оживления для восстановления способности к делению.
Дормантные формы микроорганизмов часто являются причиной реактивации инфекционных заболеваний, таких как туберкулез и некоторые другие тяжелые инфекции.
Полагают, что из-за малой метаболической активности покоящаяся форма клеток Mycobacterium tuberculosis устойчива к антибиотикам и может являться резервуаром для хронической туберкулезной инфекции в организме.
Механизмы, позволяющие бактериям переходить в дормантное состояние и выходить из него, пока недостаточно хорошо изучены. При исследовании условий оживления покоящейся культуры Micrococcus luteus было установлено, что компоненты культуральной жидкости активно растущей культуры этого микроорганизма способны стимулировать пробуждение покоящихся клеток. Фракционирование и дальнейшая очистка культуральной жидкости выявили, что "оживляющей" покоящиеся клетки активностью обладает секретируемый M. luteus в среду белок, названный Rpf (от английского resuscitation promoting factor). Гены, гомологичные rpf, обнаружены во многих грам-положительных микроорганизмах, объединяемых в группу Г-Ц богатых бактерий. Согласно базам данных гомологичные гены представлены в таких бактериях, как Mycobacterium tuberculosis (пять генов) и Mycobacterium leprae (два гена), а также в некоторых других микроорганизмах, а именно Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis (БЦЖ), Corynobacterium glutamicum, нескольких видах Streptomyces, и прочих.
Предполагается, что все белки семейства Rpf в своем составе имеют домен с высокой степенью гомологии, а также вариабельный домен (Рис 1) Можно предположить, что белки, кодируемые генами гомологичными rpf у других микроорганизмов, могут иметь схожую с Rpf биологическую активность и обладать пробуждающими свойствами. В связи с этим большую практическую важность приобретает изучение гомологов Rpf из M. tuberculosis, поскольку латентные микобактерии обнаруживаются у 30 % населения Земли и именно они являются причиной реактивационного туберкулеза. Белки семейства Rpf из M. tuberculosis (Rv2450c – Rpf t1, Rv2389c – Rpf t2, Rv1884c – Rpf t3, Rv0867 – Rpf t4, Rv1009 – Rpf t5) могут оказаться перспективными кандидатами для включения в состав комплексной субъединичной вакцины, которая наряду с обычным туберкулезом могла бы быть протективной в случае реактивации этой тяжелой инфекции.
MW 36, (Rv0867c)t 14, (Rv2450c)t (Rv2389c)t2 10, 11, (Rv1884c)t (Rv1009)t5 35, 0 100 200 300 400 500 остаток Signal Сигнальная последовательность Rpf domain Консервативный Rpf-домен Papa Сегмент с высоким содержением пролина Рис.1. Схема строения белков семейства Rpf из Mycobacterium tuberculosis На момент начала данной работы сведения о том, к какому классу белков ( сигнальных, структурных или ферментов) относятся белки Rpf отсутствовали, также как и какие-либо сведения об их структуре. Поэтому чрезвычайно важным представляется изучение белков семейства Rpf, их структуры и свойств: биохимических и иммунологических, так как это поможет разобраться в механизмах образования покоящихся форм, что представляет интерес как для фундаментальной микробиологии, так и для прикладной науки, в связи с изучением механизмов ряда инфекционных заболеваний.
Цель и задачи исследования Основной целью настоящего исследования было выявление механизмов, которые лежат в основе действия Rpf на бактериальную клетку. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1) Разработка процедуры выделения и оптимизация условий экспрессии рекомбинантных белков семейства Rpf.
2) Изучение физико-химических свойств молекулы Rpf.
3) Анализ экспрессии Rpf на разных стадиях роста культуры M. luteus.
4) Исследование предполагаемого механизма действия Rpf на бактериальную клетку.
5) Изучение иммуномодулирующих свойств белков семейства Rpf в качестве компонентов субъединичных вакцин против туберкулеза.
Научная новизна Разработан метод получения рекомбинантных белков семейства Rpf и впервые получены рекомбинантные белки семейства Rpf из M. tuberculosis высокой чистоты.
Впервые изучена динамика накопления Rpf в культуральной жидкости M. luteus.
Выявлено наличие у Rpf гидролитической активности в отношении компонентов клеточной стенки микрококка, что позволяет отнести белки семейства Rpf к муреин гидролазам. Впервые получены данные, свидетельствующие о протективных свойствах белков семейства Rpf против туберкулеза в моделях на мышах.
Практическая значимость Разработаны методики выделения рекомбинантных белков семейства Rpf. Получены данные, позволяющие рассматривать белки семейства Rpf в качестве потенциальных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.
Апробация работы Результаты исследований были доложены на: конференции «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2000), конференции «First international conference bacterial and viral virulence factors» (Смоленица, 2000), 1 международном конгрессе «Biotechnology – state of art & prospects of development» (Москва, 2002), конгрессе «11 international congress of immunology» (Стокгольм, 2001), конференции «TB vaccines for the world» (Монреаль, 2003).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура диссертации Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследования, Результаты и обсуждение, Выводы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 3 таблицы, список литературы включает в себя 121 наименование.
Mатериалы и методы Микрооорганизмы и среды выращивания В работе использовали Micrococcus luteus NCIMB 13267, Escherichia coli HMS174(DE3), Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Компетентные клетки E.coli готовили по стандартной методике (Janssen & Irvin, 2001, Molecular cloning). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор Promega Wizard Plus SV Minipreps (Promega). Для выделения РНК M.
luteus использовался набор фирмы Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen). Для выращивания E.сoli и M.luteus использовали богатую среду LabM, BrothE. M.luteus выращивали также на бедной, минимальной среде, содержащей лактат и аммоний (ЛММ). Культуру M.tuberculosis выращивали на жидкой среде Мидельбрука. Все культуры выращивали при 37 С ( кроме M.luteus – при 30 С) в условиях аэрации.
ОТ-ПЦР(RT-PCR) Для полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией использовали набор AMV Reverse Transcriptase (Promega).
Праймеры для обратной транскрипции и амплификации кДНК:
(R) 5’-TTCATGTCCCAGGTGCCGTT-3’ (F) 5’-GAGGACTCGCCATGGACACC-3’ Выделение рекомбинантного белка Rpf-HisTag Micrococcus luteus (и его аналогов из M.tuberculosis) из штамма E.coli HMS174(DE3), содержащего плазмиду HisTag/pET19b Трансформированные клетки выращивали в среде Broth E в присутствии ампицеллина (100 мкг в мл) до OD600 = 0,7-0,9. Затем к культуре добавляли изопропил -D тиогалактопиранозид до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали культуру 3 часа при 37 С. Клетки разрушали ультразвуком на ледяной бане 10 раз по 15 секунд.
Хроматография на Ni2+chelation Sepharose 6B column Все этапы проводили при +4 градусах. Полученный лизат клеток центрифугировали на холоду при 13000g 25 минут, супернатант разводили в 4 раза буфером для нанесения ( mM имидазола, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 6 M мочевины) и наносили на аффинную колонку Iminodiacetic acid immobilized on Sepharose (Sigma) с предварительно обработанной NiSO4. После нанесения супернатанта колонку промывали 20 объемами буфера, с 50 мМ имидазолом. Затем колонку промывали 5 объемами буфера, содержащего 100 мМ имидазола и элюировали 3-мя объемами буфера, содержащего 500 мМ имидазола.
Хроматография белков на DEAE-Sepharose Использовали DEAE-Sepharose Fast Flow (Sigma), DFF-100. Последовательно промывали колонку водой, затем 10 мМ трис-HCl pH 7.4. После нанесения образца промывали колонку 10 мМ трис-HCl pH 7.4 + 100 мМ NaCl. Элюировали 3мл 10 мМ трис HCl pH 7.4 + 330 мМ NaCl.
SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле (по Лэммли) Электрофорез проводили в приборе BioRad, размер пластин 8х10 см, 12% акриламида в геле. Электрофорез проводили на холоду при 30 mA на 1 пластину. 5х электродный буфер: 0,25 М трис, 2 M глицин, 0,5 M SDS pH 8,8. 8х буфер для разделяющего геля :3 М трис-HCl pH 8,8. 4х буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис-HCl pH 6,8.
Градиентный неденатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле.
Электрофорез проводили по стандартной методике (J.M.Walker, Methods in Molecular Biology, v.32, 1994).
Иммуноблоттинг рекомбинантных белков.
Иммуноблоттинг рекомбинантных белков осуществляли по стандартной схеме ( Каталог “Sigma 1999”, стр.1490-1491):
Первичные антитела ( АТ) (поликлональные кроличьи АТ против Rpf:0,5 мкл препарата АТ в TBS: 20 мМ трис-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl). Вторичные АТ (AntiRabbit AT conjugate with Alcalic Phosphatase (Sigma)) использовали в разведении 1:5000. Мембрану промывали TBS+Tween 80 (0,05%) при 37оС, окрашивали SIGMA FAST BCIP/NBT Alcaline Phosphatase Substrate (Sigma) при комнатной температуре.
Пролиферативный тест.
Для постановки пролиферативного теста мышей иммунизировали белками семейства Rpf подкожно в подушечку задней лапы 10 мкг соответствующего белка в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ), разведенном в 2 раза физиологическим раствором, и через недели исследовали пролиферацию клеток подколенных лимфоузлов in vitro в присутствии белков семейства Rpf. Суспензию клеток лимфоузлов (2х105 клеток/лунку) культивировали в 96-луночном планшете (фирма Costar, США) в присутствии 10 мкг/мл Rpf-белков при 370.С в атмосфере, содержащей 5% СО2 в течение 72 ч. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов оценивали по включению 3Н-тимидина. Для этого за 18 ч до окончания инкубации в лунки добавляли по 0,5 µCi 3Н-тимидина. По окончании инкубации клетки переносили на фильтры и определяли уровень включения радиоактивной метки в ДНК с помощью сцинтиляционного счетчика.
Иммунизация.
В качестве подопытных животных были использованы мыши обоего пола линии C57BL/6JCit (В6) из питомника ЦНИИ Туберкулеза РАМН, массой 22-24 г.
Мышей иммунизировали 10 мкг белка в НАФ под кожу спины 3-кратно с 2-недельным интервалом. Через 10 суток после последней инъекции у подопытных животных из ретроорбитального синуса брали кровь для определения в сыворотке титра специфических антител класса IgG с помощью иммуноферментного теста (ELISA).
Определение количества антител и белков методом ИФА.
Количество антител к белкам Rpf в сывовротках животных определяли в соответствии с рекомендациями фирмы Pharmingen (США) с использованием меченных пероксидазой анти-IgG антител. Результаты представлены в виде показателей оптической плотности при разведении сывороток 1:500. Количество Rpf в супернатантах M.luteus определяли методом прямого ИФА по стандартной схеме по рекомендациям фирмы “Sigma, в качестве вторичных антител использовали AntiRabbit AT conjugate with Alcalic Phosphatase (Sigma) использовали в разведении 1:5000.
Заражение мышей.
Через 6 недель после последней иммунизации мышей внутривенно заражали M.
tuberculosis H37Rv в летальной дозе 2х107 КОЕ.
Протективный эффект Rpf белков оценивали по высеваемости микобактерий (число КОЕ на среде Мидельбрука) из легких и селезенки зараженных мышей, а также по длительности выживания иммунизированных и контрольных мышей.
Результаты и обсуждение Выделение рекомбинантных белков Совместно с британскими коллегами из лаборатории М. Янга (Абериствизский университет, Великобритания) в нашей лаборатории были получены генно-инженерные конструкции, позволяющие экспрессировать, все пять микобактериальных гомологов Rpf в кишечной палочке. Однако для того чтобы получить большие количества рекомбинантных белков высокой чистоты, необходимо было провести оптимизацию методов стимуляции экспрессирующих клонов и выделения рекомбинантных белков семейства Rpf. В качестве основы для выделения рекомбинантных белков, мы использовали рекомендации фирмы Novagen, разработавшей векторы серии pET и сответствующую систему экспрессии, и вносили изменения по ходу работы.
Одновременно с этим мы оптимизировали и процедуры хроматографии на аффинной «никелевой» колонке для того, чтобы выработать оптимальный алгоритм выделения и сделать выход рекомбинантных белков максимальным при максимальной же чистоте препарата (Рис. 1). В результате этих исследований был разработан протокол, позволяющий получать миллиграммовые количества белков семейства Rpf высокой чистоты.
Стимулированная культура E.coli 5 000g, 15 мин.
Осадок клеток Супернатант осадок, ресуспендированный в буфере с 6М мочевины ультразвук, 10 раз по 15 сек., t +2C 13 000g, 25 мин.
Супернатант Осадок супернатант, разведенный буфером в 4 раза, при +4С наносили на колонку Ni2+chelation Sepharose 6B последовательные промывки 20 объемов буфера 20 объемов буфера + 50мМ имидазола 5 объемов буфера + 100мМ имидазола 2 объема буфера + 500мМ имидазола диализ 10мМ ТРИС-НСl, рН 7,4.
20часов Таблица 1. Схема выделения рекомбинантных белков семейства Rpf.
68кДа 42кДа 25кДа 14кДа 1 2 3 4 5 6 Рис. 1. SD S-электрофореграмма, характеризую щ ая полученные рекомбинантные белки семейства R pf. 1- маркеры молекулярной массы, 2 – R pf t5, 3 – R pf t4, 4 – R pf t3, 5 – R pf t2, 6 – R pf t1, 7 – R pf(M.luteus).
Динамика изменения количества Rpf в культуре M. luteus Чтобы ответить на вопрос о биохимических свойствах Rpf и о механизме его действия на бактериальную клетку и культуру в целом, необходимо было решить ряд задач, одной из которых было изучение того, сколько белка и на каких стадиях роста M. luteus продуцируется в среду.
Для оценки количества Rpf в культуральной жидкости мы использовали ряд биохимических и молекулярно-биологических методов: иммуноферментный анализ с поликлональными антителами против Rpf, иммуноблоттинг с теми же антителами и ОТ ПЦР (RT-PCR) для оценки наличия в клетках мРНК, специфической для Rpf.
Как видно из рис. 2, при выращивании M.luteus на богатой среде количество секретируемого Rpf достигает детектируемого уровня через 5 часов после засева инокулята. Максимум количества белка приходится на позднюю логарифмическую фазу роста культуры, в стационарной фазе количество белка быстро падает, приближаясь к нулю в районе 50 часов. В случае выращивания клеток на бедной среде ( ЛММ), количество Rpf начинает расти при переходе культуры от лаг-фазы к логарифмическому делению и так же, как и в случае богатой среды, быстро падает до практически недетектируемых значений после наступления стационарной фазы. При этом при росте на богатой среде количество Rpf в максимуме достигает не менее 1-2 мг белка на литр культуры. Однако, если оценивать количество Rpf на единицу клеток, выясняется, что на начальных стадиях роста удельный синтез Rpf максимален.
А Rpf 1 OD отн.
OD600 Rpf ед.
0. 0.01 0 20 40 время, ч 10 ОD OD600 Rpf Rpf В отн.
2 ед.
0. 0.01 0 40 80 120 160 200 240 время, ч Рис. 2. Динамика накопления Rpf, определяемая при помощи ИФА в супернатантах культур M. luteus. А – богатая среда Broth E, B – среда LMM (лактатная минимальная среда).
Для подтверждения полученных данных мы использовали метод RT-PCR, позволяющий оценивать количество специфической для данного белка мРНК. Для этого выделяли тотальную РНК из выровненных количеств клеток M. Luteus, взятых на разных стадиях роста культуры, и при помощи специфических праймеров получали к-ДНК в реакции обратной траскрипции. Полученный фрагмент ДНК в дальнейшем амплифицировали в ходе полимеразной цепной реакции и конечный продукт выявляли с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 3).
1 2 3 4 Рис.3. Уровень экспрессии Rpf на разных стадиях роста культуры M. Luteus методом RT PCR. 1 – ОD = 0, 046 начало логарифмической фазы, 2 – ОD = 0,82 ранняя логарифмическая фаза, 3 – ОD = 4,4 поздняя логарифмическая фаза, 4 – ОD = 3, стационарная фаза, 5 – ОD = 3,6 поздняя стационарная фаза. Стрелкой указан интересующий нас фрагмент к-ДНК, рядом с каждой дорожкой присутствует контроль ( система без обратной транскриптазы).
Как видно из представленного рисунка мРНК Rpf присутствует на всех стадиях роста культуры за исключением стационарной фазы, когда синтез мРНК полностью прекращается. Причем в поздней логарифмической фазе, когда количество белка существенно в супернатанте, синтез его мРНК уже начинает снижаться. В целом, данные RT-PCR подтверждают картину, получаемую при помощи других методов.
Наряду с оценкой количества Rpf в культуральной жидкости оценивали и то, в каком виде пребывает белок в среде. Для этого супернатант культуры микрококка подвергался HPLC ( ВЖХ) гель-фильтрации на колонке Biosep 2000. В элюируемых фракциях наличие Rpf выявляли с помощью ИФА. На профиле элюции, представленном на рис. присутствуют два максимума, соответствующие Rpf. При расчете молекулярной массы можно предположить, что обнаруженные максимумы соответствуют димерной и мономерной формам белка ( 50 и 22 кДа).
1 mV 2 4 6 8 10 12 14 16 18 22 24 26 28 30 32 34 36 мин Рис.4. Профиль элюции супернатанта культуры M. luteus, выращенной на диализованной среде Broth E до OD600 = 2.7. В зоне, обозначенной подчеркиванием, при помощи ИФА, был выявлен Rpf. HPLC гель-фильтрация на препаративной колонке BioSep 2000.
В целом, этот этап работы позволил установить, что накопление Rpf в среде происходит на протяжении всего активного роста культуры, начиная с самых ранних его стадий.
Однако в стационарной фазе синтез Rpf полностью прекращается и белок исчезает из среды. В свою очередь это может означать, что белок Rpf каким-то образом связан с делением клеток и, возможно, принимает непосредственное участие в этом процессе. Так же установлено, что в среде Rpf присутствует в двух формах: мономерной и димерной.
Выявление ферментативной активности Rpf Данные, приведенные выше, свидетельствуют о том, что количество Rpf в культуральной жидкости у M.luteus достигает миллиграммов на литр, что скорее характерно для ферментов, а не для белков-регуляторов.
При предсказании третичной структуры консервативного домена Rpf на основании его аминокислотной последовательности при помощи специальных компьютерных программ, можно обнаружить некоторое структурное сходство консервативного домена Rpf с доменом активного центра лизоцима (наличие так называемого лизоцимо-подобного фолд в молекуле Rpf). Это сходство хорошо иллюстрирует компьютерная модель третичной струкруры консервативного домена Rpf, рассчитанная А. Мурзиным (частное сообщение) (рис. 5).
Рис. 5. Компьютерные модели структур куриного лизоцима (слева) и консервативного домена Rpf (предсказание) (справа). В нижней части рисунка, изображающего лизоцим хорошо видны три -спирали, являющиеся характерными для этого белка. Справа – на рисунке представлен консервативный домен Rpf, где так же видны три -спирали, взаимное расположение которых напоминает фрагмент лизоцима.
Наличие этой структуры, а так же присутствие в структуре белка в вариабельном домене так называемого Lys-M фрагмента, служащего для тесного взаимодействия белков с компонентами клеточной стенки, привело нас к предположению о том, что Rpf может быть ферментом, связанным с гидролитической модификацией клеточной стенки, сходно с лизоцимом, являющимся мурамидазой.
Для проверки этого предположения были проведены эксперименты с целью выясненеия возможного воздействия Rpf на препарат лиофилизированных клеток микрококка. Для этого была измеряна во времени оптическая плотность препарата клеток микрококка после добавления к ним Rpf. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 6.
Динамика изменения оптической плотности препарата лиофилизированных клеток M.luteus при инкубации с Rpf OD600, % от контроля контроль 60 эл.DEAE эл.pET мут.ES мут.2Cys Rpf рек. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 время, ч Рис. 6. Изменение оптической плотности препарата лиофилизированных клеток M. luteus в трис-буфере pH8 под дейстием препарата рекомбинантного Rpf, а так же рекомбинантных Rpf белков, подвергнутых сайт-направленному мутагенезу. Эл.DEAE элюат,содержит нативный Rpf, выделенный на колонкеDEAE). Эл.pET – контрольное выделение рекомбинантного Rpf из штамма E. coli, содержащего пустой вектор без гена Rpf. Мут.ES – рекомбинантный Rpf с заменой глутамина в ES- фрагменте на глутаминовую к-ту. Мут.Cys – Rpf с заменой обоих цистеинов в консервативном домене.
Концентрации рекомбинантного Rpf – 15 мкг/мл. Препараты Rpf с замененными аминокислотами были любезно предоставлены Г.Мукамоловой.
Из рис. 6 видно, что при добавлении рекомбинантного Rpf к препарату клеток микрококка происходит падение оптической плотности, в конечном итоге приводящее к уменьшению оптической плотности примерно до 60% от начальной. Мы предполагаем, что данный эффект является отражением гидролитической активности, присущей Rpf. Столь медленное падение оптической плотности, скорее всего, связано со специфичностью Rpf.
Вероятно, он гидролизует какие-то связи, расщепление которых не приводит к глобальным изменениям в структуре крупных частиц клеточной стенки, ведущим к их полному распаду, что могло бы привести к существенному и быстрому падению оптической плотности, как это происходит под действием лизоцима.
Существует несколько типов ферментов, для которых характерна подобная литическая активность по отношению к бактериальным стенкам: лизоцимы (мурамидазы), эндопептидазы, амидазы, карбоксипептидазы и литические трансгликозилазы. На приведенном рисунке представлена схема пептидогликана клеточной стенки E. coli и ферменты, гидролизующие различные связи этого полимера (рис. 7).
Рис.7. Ферменты клеточной стенки у E. coli и их действие на муреин (по Holtje, 1995).
GlcNAc – N-ацетилглюкозамин, MurNAc – N-ацетилмурамовая кислота, MurNAc-anh (16)ангидромурамовая кислота. Связи, гидролизуемые соответствующим ферментом: – N-ацетилглюкозаминидазы, 2 – литические трансгликозилазы, 3 – N-ацетилмурамил-L аланин амидаза, 3 - N-ацетилдегидромурамил-L-аланин амидаза, 4 – DD эндопептидаза, – LD карбоксипептидаза, 6 – DD карбоксипептидаза.
На основании полученных данных однозначно определить, к какому типу ферментов относится Rpf довольно сложно. Представляется, что Rpf вряд ли можно отнести к лизоцимам, несмотря на его третичную структуру, так как M. luteus - микроорганизм чрезвычайно чувствительный к действию лизоцима и малейшее его добавление в среду приводит к полному лизису клеток. Не существует также каких-либо указаний на то, что Rpf является амидазой, так как анализ его последовательности не выявляет сходства с этим типом ферментов.
В то же время, лизоцимоподобный фолд характерен для родственного лизоциму семейства белков: литических трансгликозилаз (рис.8), ферментов, моделирующих за счет гидролиза клеточную стенку микроорганизмов. Эти белки являются бактериальными мурамидазами, задействованными в метаболизме бактериальной клеточной стенки во время роста и деления, а также в процессах связанных с вирулентностью. Под действием литических трансгликозилаз бактериальная клеточная стенка не разрушается полностью (как в случае с лизоцимом), а становится более рыхлой и проницаемой. Вследствие этого кинетика разрушения препаратов стенок под действием литических трансгликозилаз замедленна, что действительно наблюдается в эксперименте, представленном на рис.6.
Рис.8. Третичная структура литической трансгликозилазы Slt 70 из E. coli. Стрелкой указан лизоцимоподобный фолд. Лизоцимоподобный фолд Rpf приведен для сравнения слева.
В пользу того, что Rpf является литической трансгликозилазой, указывает наличие в его последовательности так называемого ES-фрагмента, который высоко консервативен и у белков семейства Rpf других микроорганизмов, и который характерен для активного центра литических трансгликозилаз из семейства 1 (рис. 8А). Также для некоторых литических трансгликозилаз характерно наличие LysM домена, присутствующего и в структуре Rpf.
Литическая Последовательность трансгликозилаза LysG --ES-------------GLMQV Slt RQES-F-P-A-S--GAGLMQ MltC -TES-FNPYA-S---AGLMQV EmtA ATESGGNPNAVS-----GLMQ MltD IVESAF-P-A-S---A-GLWQ YfhD YQESHWNP-A-SPTGVRGLMM Рис.8А. Последовательности некоторых литических трансгликозилаз и белков семейства Rpf с указанием гомологичного ES-фрагмента (Blackburn & Clarke, 2000) Действительно, препараты Rpf, в которых были проведены замены в ES-фрагменте и по двум цистеинам, практически не оказывают литического действия на препараты клеток (Рис. 6).
При выращивании на бедных средах, таких как лактатная, бактерии микрококка склонны образовывать крупные агрегаты, что, скорее всего, является ответом на недостаток питательных веществ. Нами было отмечено, что при добавлении Rpf к культуре, пребывающей в подобном сильно агрегированном состоянии, происходила частичная дезагрегация клеток, и размеры агрегатов в целом уменьшались, что также может быть интерпретировано в пользу модификации клеточной стенки микрококка под действием Rpf.
В целом, можно предположить, что Rpf является пептидогликангидролазой, моделирующей состояние внешней стороны клеточной стенки M. luteus. По данным С.
Фостера среди белков, участвующих в модификации клеточной стенки спорулирующих бактерий, обязательной для прорастания спор, присутствуют и литические трансгликозилазы, очевидное сходство с которыми наблюдается у Rpf. Возможно, именно эта ферментативная активность обуславливает способность Rpf реактивировать покоящиеся клетки микрококка например способствуя локальному увеличению проницаемости клеточной стенки и приводящему к активации клеточного метаболизма и деления. С другой стороны роль Rpf в оживлении покоящихся клеток может состоять в диспергировании агрегатов клеток при их реактивации.
Иммунологические свойства белков семейства Rpf Одной из важных задач настоящего исследования было изучение иммунологических свойств белков семейства Rpf, в том числе аналогов Rpf из M. Tuberculosis. Эти исследования были проведены совместно с ЦНИИ Туберкулеза РАМН. В ходе работы были изучены параметры как гуморального, так и Т-клеточного иммунного ответа при иммунизации животных белками семейства Rpf. Была исследована продукция специфических антител и пролиферативный ответ клеток лимфоузлов на присутствие Rpf-белки в тесте in vitro (поскольку основную роль в протективном иммунном ответе на M. tuberculosis играют Т-лимфоциты).
В сыворотках с помощью иммуноферментного теста были исследованы уровни специфических антител класса IgG к белкам семейства Rpf (Рис.9). Эти исследования показали высокую иммуногенность всех белков за исключением Rpf t3. Также была обнаружена высокая степень перекрестной реактивности между белками семейства, что, очевидно, обусловлено частичной гомологичностью их структур.
0. 0. 0. t ОD 405nm t 0.3 t t Rpf 0. 0. t2 t3 t4 t5 Rpf None антиген Рис. 9. Количество антител класса IgG к гомологичным Rpf-антигенам в сыворотках иммунных и интактных мышей (оптическая плотность, разведение сывороток 1:500).
При изучении пролиферации Т-лимфоцитов иммунизированных мышей при добавлении к ним белков семейства Rpf в качестве антигенов, выяснилось, что иммунизация белками семейства Rpf приводит к появлению не только гуморального, но и Т-клеточного иммунного ответа. Все белки семейства оказались иммуногенны. Как и в случае антителами, исключением явился белок Т3, не обладающий иммуногенностью (рис.10).
t t CPM 15000 t t Rpf None t2 t3 t4 t5 Rpf sonic contr антиген Рис. 10. Оценка пролиферативного ответа клеток лимфоузлов иммунных и интактных мышей на гомологичные Rpf-антигены по включению 3Н-тимидина.
Высокая иммуногенность белков Rpf in vitro указывала на возможность значительного протективного эффекта иммунизации против туберкулеза в модели in vivo. Для этого мышей линии B6 трижды иммунизировали 10 мкг соответствующего белка в неполном адъюванте Фройнда с интервалами в 2 недели, а затем их заражали летальной дозой микобактерий. Протективный эффект иммунизации оценивали по продолжительности жизни иммунизированных животных относительно контроля (Рис.11). Результаты опытов позволяют сделать вывод о том, что продолжительность жизни иммунизированных животных достоверно превышает таковую в контроле. В случае Rpf t2-t4 у 40% иммунизированных мышей время жизни после заражения увеличивалось более чем в два раза.
% живых животных 60 control t 40 t t 20 t Rpf 0 10 20 30 40 Дни после заражения Рис.11. Динамика гибели мышей вакцинированных белками Rpf после внутривенного заражения Mycobacterium tuberculosis.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что белки семейства Rpf обладают иммуногенными свойствами как in vitro, так и in vivo, что позволяет рассматривать эти белки в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.
Выводы:
1. Разработаны методики очистки рекомбинантных белков семейства Rpf:
Rv2450, Rv2389, Rv1884, Rv1009, Rv0867 (M.tuberculosis) и g3559933 (M.luteus).
2. Экспрессия Rpf в культуре M. luteus начинается на ранних стадиях роста и остается высокой на протяжении всего активного роста культуры;
в ранней стационарной фазе количество белка существенно уменьшается. В поздней стационарной фазе Rpf не экспрессируется и полностью исчезает из среды.
3. Rpf проявляет литическую активность по отношению к препарату лиофилизированных клеток M. luteus. В то же время замена в белке некоторых аминокислот приводила к потере этой активности. Сходство структуры Rpf с литическими трансгликозилазами и тип воздействия на клеточную стенку позволяет предположить принадлежность Rpf к этому семейству ферментов.
4. Белки семейства Rpf являются индукторами как гуморального, так и клеточного ответов, а иммунизация ими приводит к защите против туберкулеза.
Эти данные позволяют рассматривать белки семейства Rpf в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.
Публикации:
1. Ganina E.A., Telkov M. V., Kaprelyants A. S., Kazarian K. A., Potapov V. D., Biketov S. F. Effect of the bacterial cytocine of Rpf family of M. tuberculosis on morphogenesis of TB in mice. First international conference «Bacterial and viral virulence factors», Smolenice, Slovakia, 2000. р 2. Казарьян К. А., Телков М. В., Кондратьева Т. К., Еремеев В. В. Иммунологические свойства микобактериальных белков семейства Rpf. «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии». Том 2, стр. 62-67, Дубна 2001.
3. Yeremeev V.V., Kondratieva T.K., Rubakova E.I., Kazarian K.A., Telkov M.V., Kaprelyants A.S. Autocrine growth factors of Mycobacterium tuberculosis as components of new vaccine. Scandinavian journal of immunology, vol. 54, international congress of immunology, р Stockholm, 2001.
4. Kazarian K.A., Telkov M.V., Kondratieva T.K., Eremeev V.V. Immunological properties of the mycobacterial Rpf-family proteins. First international congress – Biotechnology – state of art & prospects of development. р 50. Moscow 5. Mukamolova G. V., Turapov O. A., Kazarian K. A., Telkov M.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young M. The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Molecular Microbiology (2002), vol. 46, 611-621.
6. Yeremeev V. V., Kondratieva T. K., Rubakova E. I., Petrovskaya S.N., Kazarian K. A., Telkov M.V., Biketov S. F., Kaprelyants A.S., Apt A. S. Proteins of the Rpf family:
Immune cell reactivity and vaccination efficacy against tuberculosis in mice. Infection and Immunity, (2003), vol.71, 4789-4794.
7. Kazarian K. A., Yeremeev V.V., Kondratieva T. K, Telkov M. V., Kaprelyants A. S., Apt A. S. Proteins of Rpf family as novel TB vaccine candidates. The first international conference on TB vaccines for the world. Poster session. Montreal 2003.