Геномный полиморфизм streptococcus pyogenes различных emm-генотипов
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
ПОЛЯКОВА
Екатерина Михайловна
ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ STREPTOCOCCUS PYOGENES
РАЗЛИЧНЫХ EMM-ГЕНОТИПОВ
03.02.03 - Микробиология
03.02.07 - Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург - 2012 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо Западного отделения Российской академии медицинских наук (Санкт Петербург).
доктор биологических наук
Научный руководитель:
Дмитриев Александр Валентинович доктор биологических наук
Официальные оппоненты Падкина Марина Владимировна (Санкт-Петербургский государственный университет) доктор биологических наук, профессор Бойцов Алексей Геннадиевич (Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова) НИИ эпидемиологии и микробиологии
Ведущая организация:
им. Пастера
Защита состоится “……” …………..2012 г. в “……” ч на заседании объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого почвенный факультет, аудитория ……
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М.Горького Санкт Петербургского государственного университета.
Автореферат разослан «_»2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Е.И.Шарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Streptococcus pyogenes – патогенный для человека микроорганизм, вызывающий различные формы гнойно-септической инфекции, тонзиллит, рожистое воспаление, скарлатину, синдром токсического шока и др. (Белькова Ю.А., 2005;
Kumar R. et.al 2009;
Scaber J., 2010). После перенесенных инфекций, вызванных S. pyogenes, возможно развитие таких осложнений, как сепсис, пневмония (Martic J. et.al., 2010;
Mehta S. et.al., 2006;
Zakikhany K. et.al., 2011), ревматизм и гломерулонефрит, способных привести к летальному исходу или инвалидизации пациентов (Белов Б.С. 2003;
Наумова В.И. и др., 1996;
Paula J.S. et.al., 2008).
Все штаммы S. pyogenes разделяют на М-серотипы или emm-генотипы, в зависимости от антигенной специфичности белка М или нуклеотидной последовательности 5'-конца кодирующего его гена emm соответственно (Facklam R.F. et.al., 2002). Определенные М-серотипы (или emm-генотипы) S.
pyogenes нередко ассоциируются с развитием того или иного осложнения, в зависимости от характера которого штаммы S. pyogenes условно подразделяют на ревматогенные и нефритогенные. Так, развитие ревматизма часто связано с инфицированием человека штаммами серотипов М5, М6 и М18, а развитие гломерулонефрита – штаммами серотипов М1, М2, М4, М12, М25, М42, М49, М56, М57 и М60 (Facklam R.F. et.al., 2002).
Геномы штаммов S. pyogenes содержат большое количество мобильных генетических элементов, различия в составе и последовательностях которых в значительной мере обуславливают генетическое разнообразие вида. Так, суммарный размер ДНК умеренных бактериофагов может достигать 12% от общего размера генома S. pyogenes (Ferretti J.J. et.al., 2001;
Beres S.B. et.al., 2002). Мобильные генетические элементы, в частности, профаги и транспозоны, могут содержать гены вирулентности и гены устойчивости к антимикробным препаратам (Brenciani A. et.al., 2004;
Clermont D. et.al., 1997, Giovanetti E. et.al., 2005). Приобретение таких мобильных генетических элементов штаммами-возбудителями может привести к изменению их фенотипических свойств и, как следствие, к осложнению течения заболевания и/или снижению эффективности антибиотикотерапии. В последние годы наблюдается увеличение числа штаммов S. pyogenes, в том числе, штаммов генотипов emm1 и emm12, устойчивых к действию практически всех групп антибиотиков, за исключением бета-лактамных (Ardanuy C. et.al., 2010;
Del Grosso M. et.al., 2011). Поэтому, важными задачами современной микробиологии являются изучение механизмов возникновения и быстрого распространения антибиотикоустойчивых штаммов S. pyogenes в микробной популяции и изучение роли горизонтального переноса мобильных генетических элементов в изменчивости S. pyogenes.
Таким образом, актуальным является изучение геномного полиморфизма S. pyogenes, в частности, опосредованного мобильными генетическими элементами.
Цель исследования.
Изучить генетическое разнообразие штаммов Streptococcus pyogenes, выделенных в различных географических регионах.
Задачи работы:
1. Изучение геномного полиморфизма S. pyogenes, обусловленного умеренными бактериофагами, и его влияния на фенотипические свойства S.
pyogenes;
2. Изучение рестрикционного полиморфизма геномной ДНК штаммов S.
pyogenes методом PFGE;
3. Сравнительный анализ штаммов S. pyogenes методом RAPD;
4. Выявление мобильных генетических элементов у штаммов S. pyogenes.
Научная новизна.
- впервые выявлено выраженное генетическое разнообразие штаммов S.
pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт-Петербурге (Россия) и в Пекине (КНР), обусловленное умеренными бактериофагами;
- показано, что среди штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm наиболее распространенными являются гены бактериофагов speA, speH, speС, ssa, кодирующие токсины, и гены int4 и int7, кодирующие интегразы бактериофагов;
- предложен комплексный подход к анализу генетической неоднородности штаммов S. pyogenes на основании сравнения профилей фаговых генов, паттернов RAPD и PFGE;
- показана возможность применения стандартизованного метода RAPD для обнаружения мобильных генетических элементов S. pyogenes;
- у штаммов S. pyogenes выявлен ранее не обнаруженный транспозон, содержащий ген устойчивости к тетрациклину tetM, и установлена его геномная локализация;
- доказано, что наличие профага NZ131.2 в геноме S. pyogenes NZ влияет на культуральные свойства штамма.
Научно-теоретическая и практическая значимость исследования.
Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о генетическом разнообразии штаммов S. pyogenes, циркулирующих в разных географических регионах, таких как Санкт-Петербург и Пекин, и могут быть использованы для дальнейших исследований с целью оценки эпидемиологической ситуации по стрептококковой заболеваемости и для прогнозирования ее развития в Санкт-Петербурге. Показана возможность применения метода RAPD в целях изучения генетической неоднородности и обнаружения мобильных генетических элементов штаммов S. pyogenes.
Разработанный комплексный подход к исследованию геномного полиморфизма может быть использован для дальнейших исследований штаммов S. pyogenes с целью их эффективной дифференциации. Данные по транспозону, впервые обнаруженному у S. pyogenes и содержащему ген устойчивости к тетрациклину, могут послужить основой для дальнейших исследований, направленных на оценку эффективности и целесообразности применения данного антибиотика при лечении стрептококковой инфекции. Нуклеотидные последовательности ДНК, определенные в настоящей работе, депонированы в базу данных GenBank под номерами JN799842, JN799843, JN799844 и JQ001862, и могут быть использованы для дальнейших научных исследований.
Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 10 научных работах (из них 4 статьи и 6 тезисов). По материалам диссертации был сделан постерный доклад на международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Греция, 2008 г.). Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (2009, 2010 гг.) и на семинаре лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского детского госпиталя (2010 г.).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 30 рисунками, указатель литературы содержит 158 источников, в том числе отечественных и 148 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В работе использовали 86 штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине от носителей и больных с заболеваниями стрептококковой этиологии, и 2 штамма S. pyogenes генотипа emm49 (штамм NZ131, выделенный в Новой Зеландии от больного с острым гломерулонефритом, и его лабораторный вариант - NZ131var). Для отработки метода выявления фаговых генов в геноме S. pyogenes использовали штаммов генотипа emm49, выделенных в различных географических регионах.
Штаммы были получены из коллекций ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН и Пекинского детского госпиталя (Пекин, КНР).
Культивирование S. pyogenes осуществляли в жидкой питательной среде Todd-Hewitt Broth (THB) (Hi-Media, Индия) и на 1,5% агаризованных средах при температуре 37оС. Для оценки гемолитической активности штаммов в агаризованную среду добавляли эритроцитарную массу до конечной концентрации 5%. Питательные среды готовили в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией.
Выделение хромосомной ДНК осуществляли методом фенол/хлороформенной экстракции. Выделение ДНК из агарозного геля проводили с использованием коммерческого препарата GeneJETTM (Fermentas, Литва) согласно прилагаемой инструкции.
Амплификацию фрагментов ДНК осуществляли методом ПЦР с использованием специфических праймеров. Для анализа штаммов методом ПЦР со «случайной» затравкой (RAPD) использовали праймер 5' CCTCCCGCCACC-3'. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле.
Гидролиз ДНК рестриктазой HindIII (Takara, Япония) осуществляли согласно протоколу производителя. Лигирование HindIII фрагментов хромосомной ДНК с коммерческим препаратом pUC118 HindIII/BAP (Takara) проводили при помощи Т4 ДНК-лигазы (Takara) согласно прилагаемой инструкции при температуре 16оС в течение ночи.
Секвенирующую ПЦР проводили с использованием набора «GenomeLab Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit» (Beckman Coulter Inc., США). Секвенирование ДНК осуществляли с использованием секвенатора Beckman Coulter CEQTM 8000 (Beckman Coulter Inc.).
Анализ штаммов методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле (PFGE) проводили согласно модифицированному протоколу Elliot J.A.
et.al., 1998. Электрофорез проводили в аппарате CHEF-DR-III (Bio-Rad, США) в 1% агарозном геле в течение 24 часов при напряжении 6В/см2 и температуре 14оС. Продолжительности пульсов составили от 4,5 сек до 45 сек, и от 0,5 сек до 5 сек в зависимости от величины разделяемых фрагментов ДНК. Оценку подвижности рестрикционных фрагментов проводили по сравнению с конкатамерами ДНК фага лямбда (Lambda Ladder PFG Marker, New England Biolabs, США) и хромосомными ДНК Saсcharomyces cerevisiae (Yeast Chromosome PFG Marker, New England Biolabs). Для визуализации ДНК в УФ свете гель после электрофореза окрашивали раствором бромистого этидия (0, мкг/мл) в электродном буфере в течение 30 минут.
Динамику роста штаммов оценивали по изменению оптической плотности при длине волны 600 нм в бульоне Todd-Hewitt с использованием спектрофотометра SmartSpec3000 (BioRad).
Оценку чувствительности штаммов к тетрациклину проводили при помощи дискодиффузионного метода с использованием бумажных дисков, пропитанных тетрациклином (НИЦФ, РФ), согласно соответствующим методическим указаниям (МУК 4.2.1890-04 Министерства здравоохранения и социального развития РФ).
Оценку выживаемости штаммов NZ131 и NZ131var в человеческой крови проводили согласно модифицированному протоколу Kwinn L.A. et.al, 2006.
Для оценки адгезивной способности штаммов S. pyogenes клетки вагинального эпителия человека суспендировали в PBS до концентрации 1х клеток/мл. Полученную суспензию разливали по двум пробиркам, одна из которых служила контролем, и отмывали при помощи PBS. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл PBS. К полученной суспензии эпителиальных клеток добавляли суспензию клеток S. pyogenes в концентрации 1х107 КОЕ/мл, перемешивали и инкубировали при температуре 37оС в течение 30 мин при покачивании. После инкубации суспензию промывали при помощи PBS, осадок ресуспендировали в 100 мкл PBS, наносили на предметное стекло и подсушивали при 65оС до полного высыхания (10-15 мин). Фиксацию препарата осуществляли 96% этанолом в течение 10 мин. Препарат последовательно окрашивали эозином (10 мин) и азуром (10 мин), промывали водой и подсушивали. Микроскопию эпителиальных и адгезировавших к ним бактериальных клеток проводили при 1000-кратном увеличении на микроскопе Leica DM500 (Германия).
Вирулентные свойства штаммов S. pyogenes определяли при помощи внутрибрюшинного заражения лабораторных животных (беспородные мыши, самцы, вес 16-18 г.). Исследуемые штаммы S. pyogenes выращивали в течение ночи при температуре 37оС в 100 мл ТНВ, клетки центрифугировали и отмывали при помощи PBS. Отмытые клетки ресупендировали в 2 мл PBS, затем вводили мышам внутрибрюшинно 1x108 КОЕ/животное в объеме 0,5 мл.
Животным контрольной группы вводили по 0,5 мл PBS. Для каждого исследуемого штамма использовали группы по 10 мышей. Наблюдение вели в течение 10 дней после заражения и эксперимент для каждого штамма проводили дважды.
Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК проводили при помощи программ “Restriction Mapper Version 3”, “BLAST” и “Chromas 2.3”.
Последовательности праймеров для ПЦР были сконструированы при помощи программ “OLIGO” и “Primer BLAST” на основании соответствующих нуклеотидных последовательностей, доступных в базе данных GenBank.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием критерия распределения Стьюдента и программного обеспечения Microsoft Office Excel 2003.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Геномный полиморфизм S. pyogenes, обусловленный умеренными бактериофагами, и его влияние на фенотипические свойства S. pyogenes Распространенность генов бактериофагов среди штаммов S. pyogenes С целью изучения распространенности генов бактериофагов у S. pyogenes был проведен ПЦР-анализ 86 штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине. Штаммы были проанализированы на присутствие в их геноме 9 генов, кодирующих функциональный белок бактериофага – интегразу (гены int1-int9), а также на присутствие 8 генов вирулентности (гены разных типов стрептококковых токсинов – spe, ген фосфолипазы А2 – sla и ген стрептококкового суперантигена - ssa). При анализе штаммов, выделенных в Санкт-Петербурге, оказалось, что среди штаммов генотипа emm1 наиболее распространены были гены speA (100%), speCJ (100%), int4 (100%) и int7 (100%), а среди штаммов генотипа emm12 – гены speI (94,4%), speH (94,4%), speС (88,9%), int3 (77,8%) и int5 (94,4%) (рис.
1). Анализ распространенности фаговых генов среди штаммов генотипов emm и emm12, выделенных в Пекине, показал, что среди штаммов генотипа emm наиболее распространены были гены ssa (96,7%), speC (96,7%), speA (93,3%), speСJ (76,7%), int4 (100%) и int7 (93,3%), а среди штаммов генотипа emm12 – гены ssa (100%), speH (100%), speC (100%), speI (57,1%) и int4 (81,0%) (рис. 1).
распространенность (%) J eH eС eI t t t t t t t t t eA eL sla a eC ss sp in in in in in in in in in sp sp sp sp sp гены emm1, Пет ербург emm12, Пет ербург emm1, Пекин emm12, Пекин Рисунок 1.
Распространенность генов бактериофагов среди штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине.
Таким образом, для штаммов генотипа emm1 независимо от географического региона их выделения характерно наличие генов speA, speСJ и int7, а для штаммов генотипа emm12 - генов speH и speI, что соответствует данным литературы в отношении штаммов генотипов emm1 и emm12, выделенных в различных странах Европы (Ekelund K. et.al., 2005;
Maripuu L.
et.al., 2008;
Schmitz FJ. et.al., 2003).
Независимо от генотипа, для штаммов, выделенных в Санкт-Петербурге, было характерно наличие гена int3 (65,7%), а для штаммов, выделенных в Пекине, - гена ssa (98,0%). Столь высокая распространенность гена ssa среди штаммов S. pyogenes характерна в основном для штаммов, выделенных в КНР, по сравнению со штаммами, выделенными в Европейских странах (Jing HB.
et.al., 2006;
Maripuu L. et.al., 2008;
Schmitz FJ. et.al., 2003;
Jing HB. et.al., 2006).
В целом, среди всех исследуемых групп штаммов, независимо от emm генотипа или географического региона выделения штаммов, наиболее распространены были гены speA (58,1%), speH (62,8%), speС (75,0%), ssa (64,0%), int4 (68,0%) и int7 (59,3%) (рис. 1). Данный факт свидетельствует о том, что фаговые ДНК, содержащие гены speA, speH, speС, ssa, int4 и int7, интегрировали в геном S. pyogenes достаточно давно, предоставив штаммам-реципиентам определенные селективные преимущества, что позволило им широко распространиться в человеческой популяции.
Генетическая неоднородность штаммов S. pyogenes по профилям фаговых генов Для оценки геномного полиморфизма штаммов S. pyogenes, обусловленного умеренными бактериофагами, был проведен сравнительный анализ профилей фаговых генов, т.е., наборов фаговых генов, содержащихся в геноме каждого из штаммов. В целом, при анализе 86 штаммов S. pyogenes на наличие 17 генов бактериофагов было выявлено 25 профилей фаговых генов.
Так, среди штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт Петербурге, было обнаружено 5 и 8 профилей фаговых генов соответственно (табл. 1), а среди штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Пекине, - 7 и 8 профилей фаговых генов соответственно.
Таблица 1. Профили фаговых генов штаммов S. pyogenes генотипа emm1, выделенных в Санкт-Петербурге Название профиля A1 A2 A3 A4 A Ген Число штаммов 6 1 1 8 + + + + + speA - - - - speI - - - - speH - - - - speL + + + + + speCJ - + + - ssa - - + + + speС - + - - sla - + - - + int - + - - + int - - - + + int + + + + + int - - + - int - - + - int + + + + + int - + - - int - - - - int «+» - наличие гена, «-» - отсутствие гена Некоторые профили, обнаруженные у рассматриваемых групп штаммов, были идентичными. Например, профиль фаговых генов A1 был выявлен у ряда штаммов генотипа emm1, выделенных как в Санкт-Петербурге, так и в Пекине.
Локализация бактериофагов в геноме S. pyogenes В результате ПЦР-анализа в геномах значительного числа исследуемых штаммов была установлена локализация четырех генов интеграз: int3, int4, int и int7. Так, локализация гена int3 была определена у 28 из 29 штаммов, гена int – у 43 из 69 штаммов, гена int5 – у 18 из 18 штаммов, и локализация гена int7 – у 44 из 51 штамма S. pyogenes, содержащих данные гены соответственно.
Очевидно, что у ряда штаммов гены int3, int4 и int7 располагались в других участках генома. Не исключено, что профаги, содержащие гены int3, int4 и int с неустановленной локализацией, имеют иную последовательность attР сайта и, следовательно, интегрируют в другой участок генома S. pyogenes. С другой стороны, вероятно, что в геноме S. pyogenes присутствует несколько сходных attB сайтов, что обуславливает возможность интеграции бактериофага в разные участки бактериального генома (Beres S.B. et.al., 2002;
Holden M.T. et.al., 2007;
Nakagawa I. et.al., 2003).
Кроме того, в геноме ряда исследуемых штаммов были выявлены профаги, подобные профагам, описанным ранее для штаммов S. pyogenes SF370 и MGAS5005 (Ferretti JJ. et.al., 2001;
Holden M.T. et.al., 2007), т.е., профаги, содержащие те же гены и имеющие ту же геномную локализацию, что и профаги штаммов SF370 и MGAS5005. Так, в геноме 8 штаммов был выявлен профаг, подобный профагу SF370.1, (гены int3 и mf2), в геноме 17 штаммов профаг, подобный профагу SF370.3 (гены int5, speI и speH), а в геноме штаммов - профаг, подобный профагу 5005.1 (гены int7 и M5005_Spy_0995).
Влияние умеренных бактериофагов на свойства S. pyogenes Известно, что приобретение или утрата профага бактериальным штаммом влечет за собой не только изменение структуры генома, но и может приводить к изменению биологических свойств этого штамма, в частности, характера роста или вирулентности. Однако подобные факты описаны для других видов бактерий, но не S. pyogenes. Поэтому одной из задач настоящей работы явился сравнительный анализ биологических свойств двух штаммов: штамма S.
pyogenes NZ131, содержащего профаг NZ131.2, и его лабораторного варианта штамма NZ131var, не содержащего данный профаг.
В результате исследования адгезивности, вирулентности и выживаемости штаммов NZ131 и NZ131var в человеческой крови значимых отличий между штаммами выявлено не было. В то же время, установлено, что штаммы NZ и NZ131var отличались по характеру роста в жидкой питательной среде.
Штамм NZ131var, утративший профаг, рос быстрее и давал большее количество биомассы, чем штамм NZ131 (рис. 2). Вероятно, это объясняется различиями в скорости репликации ДНК штаммов, поскольку утрата профага NZ131.2 привела к уменьшению размера генома штамма NZ131var примерно на 37,4 т.п.н. по сравнению с размером генома исходного штамма NZ131.
0, 0, 0, 0, ОП 0, 0, 0, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 время, ч NZ NZ131var Рисунок 2.
Кривые роста штаммов S. pyogenes NZ131 и NZ131var (для каждого штамма было проведено по три эксперимента и для полученных данных была вычислена ошибка среднего и построен доверительный интервал).
Таким образом, умеренные бактериофаги играют значительную роль в возникновении генетического разнообразия штаммов S. pyogenes, о чем свидетельствует высокая вариабельность наборов фаговых генов среди штаммов S. pyogenes, а также корреляция определенных фаговых генов с конкретным emm-генотипом или географическим регионом выделения штаммов. Кроме того, интеграция ДНК фага NZ131.2 в геном S. pyogenes приводит к изменению фенотипических свойств бактериального штамма.
2. Изучение рестрикционного полиморфизма геномной ДНК штаммов S. pyogenes методом пульс-электрофореза С целью выявления рестрикционного полиморфизма был проведен анализ SmaI паттернов хромосомной ДНК штаммов S. pyogenes методом PFGE. Для этого хромосомные ДНК штаммов были выделены и гидролизованы рестриктазой SmaI, а продукты гидролиза разделены в агарозном геле (рис. 3).
В результате исследования среди 17 штаммов генотипа emm1, выделенных в Санкт-Петербурге, было обнаружено 2 паттерна PFGE, а среди 18 штаммов генотипа emm12, выделенных в Санкт-Петербурге – 8 паттернов PFGE. При исследовании 30 штаммов генотипов emm1 и 21 штамма генотипа emm12, выделенных в Пекине, было выявлено 11 и 10 паттернов PFGE соответственно.
В целом, среди 86 штаммов S. pyogenes всего выявлено 26 SmaI паттернов PFGE. Три из них были выявлены у штаммов разных групп. В частности, паттерн В3 (рис. 3) был характерен для 9 штаммов, выделенных в Санкт Петербурге (генотип emm12), и для одного штамма, выделенного в Пекине (генотип emm12).
1 2 3 4 5 6 7 485 т.п.н.
436,5 т.п.н.
Рисунок 3.
Рестрикционные паттерны PFGE хромосомной ДНК штаммов S.
242,5 т.п.н.
генотипа pyogenes emm12, 194 т.п.н. выделенных в Санкт-Петербурге Треки 1 – 8: паттерны В3-В соответственно.
145,5 т.п.н.
Стрелками обозначены молекулярные массы 97 т.п.н. соответствующие конкатамерам ДНК фага лямбда и хромосомным ДНК 48,5 т.п.н.
Saсcharomyces cerevisiae.
3. Сравнительный анализ штаммов S. pyogenes методом RAPD Гетерогенность паттернов RAPD штаммов S. pyogenes Для сравнительного анализа штаммов методом RAPD была необходима предварительная стандартизация условий метода. Основанием для этого явились публикации, указывающие на невысокую воспроизводимость и невозможность сопоставления результатов RAPD (Matthews R.C., 1993;
Nandi S. et.al., 2008;
Seppl H., 1994), что ставило под сомнение целесообразность использования данного метода для сравнительного анализа штаммов. Таким образом, было необходимо выяснить, действительно ли результаты RAPD плохо воспроизводимы, и если это так, то не является ли причиной этого нестандартизованность условий реакций, применяемых в разных лабораториях.
С этой целью был проведен ряд экспериментов, в которых для анализа одной и той же ДНК изменяли условия ПЦР (концентрация ДНК, модель амплификатора и компоненты ПЦР смеси). В результате проведенного исследования оказалось, что количество, размеры и интенсивности продуктов амплификации, получаемых для одного и того же штамма (паттерн RAPD) действительно зависят от ряда условий, например, модели амплификатора или реагентов одного наименования, но разных производителей. При этом в результате исследования было показано, что при использовании стандартизованных условий результаты RAPD анализа являются хорошо воспроизводимыми и позволяют эффективно проводить сравнительный анализ штаммов (рис. 4).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2000 п.н. Рисунок 4.
Паттерны RAPD штаммов S. pyogenes генотипа emm1, 1200 п.н.
выделенных в Пекине Треки 1-11: паттерны С9 С19 соответственно.
800 п.н.
Стрелками обозначены молекулярные массы, соответствующие маркерным фрагментам 400 п.н.
ДНК.
В целом, в результате исследования 86 штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине, было выявлено паттернов RAPD. В частности, среди штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Санкт-Петербурге, было выявлено 3 и 5 различных паттернов RAPD соответственно, а при исследовании штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенных в Пекине – 11 и 8 паттернов RAPD соответственно. В результате сравнительного анализа штаммов, выделенных в различных географических регионах и относящихся к разным emm-генотипам, идентичных паттернов RAPD выявлено не было.
Комплексный анализ штаммов В результате сопоставления данных, полученных при помощи методов RAPD, PFGE и ПЦР-анализа на наличие фаговых генов, было выявлено генетических вариантов среди штаммов S. pyogenes, выделенных в Санкт Петербурге (табл. 2), и 42 генетических варианта – среди штаммов, выделенных в Пекине. При этом, не было выявлено одинаковых генетических вариантов среди штаммов S. pyogenes, выделенных в различных географических регионах и относящихся к разным emm-генотипам. В то же время, ряд штаммов в пределах каждой из исследуемых групп (штаммы, выделенные в одном географическом регионе и принадлежащие к одному emm-генотипу) относились к одному и тому же генетическому варианту. Например, шесть штаммов генотипа emm1, выделенные в Санкт-Петербурге, относились к генетическому варианту А1-В1-С1 (табл. 2). Это дало основание предположить, что данные штаммы являются близкородственными и, возможно, эпидемически связаны между собой. В целом, наблюдалось большее генетическое разнообразие штаммов, выделенных в Пекине, по сравнению со штаммами, выделенными в Санкт-Петербурге.
Таблица 2. Суммарные данные по генетической неоднородности штаммов, выделенных в Санкт-Петербурге Число Профиль Паттерн Паттерн Генетический штаммов фаговых генов вариант RAPD PFGE генотип emm А1-В1-С 6 A B А2-В1-С 1 A2 C А3-В2-С 1 A3 B А4-В1-С 7 C A4 B А4-В3-С C А5-В3-С 1 A5 B генотип emm А6-В4-С 1 A6 B4 C А7-В5-С 2 A7 B5 C А8-В4-С 2 A8 C B А7-В4-С 7 C A А7-В5-С 1 B5 C А9-В4-С 1 A9 B4 C А10-В6-С 1 A10 B6 C А11-В7-С 1 A11 B C А13-В4-С 1 A13 B А12-В8-С 1 A12 B8 C 4. Выявление и характеристика ранее не обнаруженного транспозона S. pyogenes Обнаружение генов транспозона При анализе паттернов RAPD штаммов S. pyogenes было показано, что у из 86 исследуемых штаммов в структуре паттерна RAPD присутствовал фрагмент ДНК размером 536 п.н. (рис. 5). 5 из этих 39 штаммов были выделены в Санкт-Петербурге (1 штамм генотипа emm1 и 4 штамма генотипа emm12), а штамма – в Пекине (18 штаммов генотипа emm1 и 16 штаммов генотипа emm12).
Маркерный фрагмент ДНК размером 536 п.н. был выделен из геля, а его нуклеотидная последовательность секвенирована и депонирована в базу данных GenBank. В результате анализа было 1 обнаружено, что данная нуклеотидная последовательность на 100% гомологична фрагментам двух генов (SPT_1915 и SPT_1916) транспозона, характерного для штаммов Streptococcus pneumoniae, и не описанного ранее для S. pyogenes.
На основании полученных данных было предположено, что наличие маркерного фрагмента размером 536 п.н. в паттерне RAPD штаммов S.
536 п.н.
pyogenes может свидетельствовать о присутствии полноразмерного транспозона в геноме этих Рисунок 5. штаммов. Для проверки данного предположения Паттерн RAPD, содержащий на основании нуклеотидной последовательности S.
маркерный фрагмент ДНК были сконструированы пары размером 536 п.н. (трек 1) и pneumoniae паттерн RAPD, не содержащий праймеров на пять генов транспозона (SPT_1906, SPT_1907, SPT_1915, SPT_1916 и ген SPT_1931).
этот фрагмент (трек 2).
В результате ПЦР-анализа было показано, что все 39 штаммов S. pyogenes, в паттерне RAPD которых присутствовал фрагмент ДНК размером 536 п.н., содержали гены транспозона S. pneumoniae (SPT_1906, SPT_1907, SPT_1915, SPT_1916 и SPT_1931) (табл. 3). В геноме 17 из 47 штаммов, не имеющих маркерного RAPD фрагмента, также присутствовали гены SPT_1906, SPT_1907, SPT_1915, SPT_1916 и SPT_1931. В геноме остальных 30 штаммов S. pyogenes транспозон выявлен не был.
Таблица 3. Результаты ПЦР-анализа штаммов и их устойчивость к тетрациклину Наличие генов Принадлежность Устойчивость Число транспозона (SPT_1906, Наличие к tetM штаммов гена tetM SPT_1907, SPT_1915, транспозону тетрациклину SPT_1916, SPT_1931) 4 + + + + 1 + + + 4 + + - + 7 + + - 11 + - - + 12 + - - 4 + + - + 6 + + - 4 + - - + 2 + - - 1 + + + + 30 - - - Определение локализации транспозона Локализацию обнаруженного транспозона в геноме S. pyogenes определяли следующим образом (рис. 6).
Рисунок 6.
Схема эксперимента по определению локализации транспозона в геноме S. pyogenes Были проведены рестрикция хромосомной ДНК штамма S. pyogenes 94С, содержащего транспозон, рестриктазой и лигирование HindIII рестрицированной хромосомы с коммерческим препаратом pUC HindIII/BAP. В результате лигирования молекул вектора с большим количеством фрагментов, полученных после рестрикции хромосомной ДНК, ожидалось образование разных вариантов рекомбинантных молекул вектора, отличающихся встроившимися в них фрагментами хромосомной ДНК. Искомая молекула представляла собой вектор pUC118, содержащий вставку, состоящую из фрагмента хромосомной ДНК S. pyogenes и прилегающего к нему 5'-конца транспозона. Лигазную смесь использовали в качестве ДНК матрицы для ПЦР с двумя праймерами, один из которых соответствовал фрагменту вектора перед вставкой (М3(2)), а другой - 5'-концу транспозона (tn1r). В результате ПЦР должен был образоваться амлификат, состоящий из трех последовательностей:
последовательность участка вектора перед вставкой (№1), последовательность, соответствующая хромосомной ДНК (№2), и последовательность №3, соответствующая 5'-концу транспозона. Как и ожидалось, в результате ПЦР был получен амплификат, секвенирование которого позволило определить, что в геноме штамма 94С транспозон расположен рядом с хромосомным геном Spy_0237 (рис. 7).
Рисунок 7.
Локализация генов транспозона на хромосомной ДНК S. pyogenes.
Стрелками обозначены праймеры на соответствующие гены.
Для подтверждения полученных данных были сконструированы соответствующие праймеры, и проведена ПЦР с парами праймеров carb-tn1r и tn3f-cons (рис. 7). В результате ПЦР и последующего секвенирования был выявлен сайт интеграции транспозона в геноме штамма S. pyogenes 94С, представляющий собой последовательность TTTTTTATTTTTAAAA. При этом, в геномах лишь трех штаммов S. pyogenes (94С, 114С и 120С) транспозон расположен между хромосомными генами Spy_0237 и Spy_0238 (рис. 7), а у остальных штаммов локализован в других участках генома, и обнаружение этих сайтов интеграции требует дополнительных экспериментов.
Наличие у S. pyogenes гена устойчивости к тетрациклину tetM и его принадлежность транспозону Исходя из того, что у штаммов S. pneumoniae в состав анализируемого транспозона входит ген tetM, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, было предположено, что исследуемые штаммы S. pyogenes, содержащие этот транспозон, также содержат ген tetM. ПЦР-анализ на наличие гена tetM показал, что данный ген присутствовал в геноме 27 штаммов S. pyogenes, содержащих обнаруженный транспозон (табл. 3). Пять из этих штаммов были выделены в Санкт-Петербурге, а 22 штамма – в Пекине.
Чтобы определить, входит ли ген tetM в состав данного транспозона, на основании нуклеотидной последовательности транспозона S. pneumoniae были сконструированы праймеры 1916f и tetM2r, где tetM2r – праймер на ген tetM, а 1916f – праймер на ген SPT_1916, расположенный рядом с геном tetM и также принадлежащий транспозону (рис. 7). В результате ПЦР-анализа было показано, что у всех 5 штаммов S. pyogenes, выделенных в Санкт-Петербурге, и лишь у одного штамма, выделенного в Пекине, ген tetM был ассоциирован с обнаруженным транспозоном. Вероятно, в геноме ряда штаммов ген tetM мог присутствовать в составе других генетических элементов. Данный факт не является неожиданным, т.к. для многих грамположительных бактерий показано присутствие гена tetM в составе различных коньюгативных элементов семейства Tn916-Tn1545 (Clewell D.B. et.al., 1995), а у ряда штаммов S.
pyogenes выявлено наличие гена tetO, высокогомологичного гену tetM, в составе одного из профагов (Brenciani A. et.al., 2010;
Giovanetti E. et.al., 2003).
Устойчивость штаммов S. pyogenes к тетрациклину С целью выявить возможную взаимосвязь между наличием гена tetM и устойчивостью штаммов S. pyogenes к тетрациклину была проведена оценка чувствительности данных штаммов к тетрациклину. В результате исследования оказалось, что 28 из 86 исследуемых штаммов были устойчивы к тетрациклину.
При этом наличие гена tetM было выявлено лишь у 13 из 28 устойчивых к действию тетрациклина штаммов. Учитывая, что у бактерий рода Streptococcus, помимо гена tetM, обнаружено еще 5 генов tet: tetK, tetL, tetO, tetQ и tetT, возможно, что устойчивость к тетрациклину остальных 23 штаммов была обусловлена наличием в их геноме какого-либо из этих генов (Chopra J. et.al., 2001;
Clermont D. et.al., 1997). Кроме того, не все штаммы, содержащие ген tetM, были устойчивы к тетрациклину, что, вероятно, объясняется нарушениями в экспрессии гена tetM или белка TetM.
Результаты исследования дают основание утверждать, что в геноме S.
pyogenes впервые выявлен транспозон, не обнаруженный ранее у данного вида бактерий и, возможно, приобретенный ими посредством межвидового горизонтального переноса генов от штаммов S. pneumoniae.
В целом, в настоящем исследовании была выявлена значительная генетическая гетерогенность штаммов S. pyogenes как генотипа emm1, так и генотипа emm12. Продемонстрирована роль мобильных генетических элементов в возникновении геномного полиморфизма штаммов, а также влияние бактериофага NZ131.2 на характер роста S. pyogenes. Кроме того, проведенное исследование позволило обнаружить новый транспозон, ранее не описанный для штаммов S. pyogenes.
ВЫВОДЫ:
1. Штаммы S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, выделенные в Санкт Петербурге (РФ) и Пекине (КНР), гетерогенны по набору генов вирулентности и генов интеграз, входящих в состав умеренных бактериофагов.
2. На основании комплексного анализа паттернов RAPD, паттернов PFGE и профилей фаговых генов штаммов S. pyogenes установлено большее генетическое разнообразие штаммов, выделенных в Пекине по сравнению со штаммами, выделенными в Санкт-Петербурге.
3. Утрата профага NZ131.2 штаммом S. pyogenes NZ131 приводит к изменению характера роста штамма, но не оказывает влияние на его адгезивность, вирулентность и выживаемость в цельной человеческой крови.
4. Стандартизованный метод RAPD позволяет выявлять новые генетические элементы S. pyogenes. В геноме ряда штаммов S. pyogenes генотипов emm1 и emm12, присутствует ранее не обнаруженный транспозон, содержащий ген устойчивости к тетрациклину tetM и локализованный между хромосомными генами Spy_0237 и Spy_0238.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:
Полякова Е., Гао В., Янг Я., Суворов, Тотолян А. Молекулярно 1.
генетическое сравнение штаммов Streptococcus pyogenes типов emm1 и emm по набору профаговых генов // ЖМЭИ. 2009. №2. С.18-24.
Полякова Е.М., Дмитриев А.В. Ранее не обнаруженный транспозон 2.
штаммов Streptococcus pyogenes, устойчивых к действию тетрациклина // Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. 2011. Т.3. №3. С.68-73.
Статьи в других изданиях:
3. Suvorov A.N., Polyakova E.M., McShan W.M., Ferretti J.J. Bacteriophage content of M49 strains of Streptococcus pyogenes // FEMS Microbiology Letters.
2009. V.294. P. 9-15.
Полякова Е.М., Мнацаканян Е.С., Бурова Л.А., Дмитриев А.В.
4.
Генетическая гетерогенность штаммов Streptococcus pyogenes генотипа emm // Мед. Акад. Журн. 2010. Т.10. №1. С.39-44.
Тезисы:
1. Polyakova E., Suvorov A., Gao W., Yang H., Ferretti J. GAS strain from various sources have specific and different phage genes profiles // Abstracts of XVIIth Lancefield Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Greece, Porto Heli. 2008. Р. 89.
2. Polyakova E., Mnatsakanyan E., Burova L., Totolian A., Dmitriev A. Genetic heterogeneity of emm12 genotype Streptococcus pyogenes strains isolated in Saint Petersburg, Russia // 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Finland, Helsinki. 2009. R2151.
Полякова Е.М., Дмитриев А.В. Генетическая гетерогенность штаммов 3.
Streptococcus pyogenes, выделенных от детей в Санкт-Петербурге // 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XIX века», РФ, Пущино. 2009. С. 206-207.
Полякова Е.М., Дмитриев А.В., Дмитриева Н.Ф., Ещина А.С., Брико 4.
Н.И. Геномный полиморфизм штаммов Streptococcus pyogenes генотипа emm12, выделенных в различных географических регионах // «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», РФ, Санкт Петербург. 2010. С.126-127.
Полякова Е.М., Дмитриев А.В. Выявление маркеров генетического 5.
полиморфизма Streptococcus pyogenes методом RAPD // «Молекулярная диагностика-2010», РФ, Москва. 2010. Т. III. C. 430-431.
Полякова Е.М. Обнаружение и характеристика нового транспозона 6.
Streptococcus pyogenes // Всероссийская научная конференция молодых ученых:
«Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», РФ, Санкт Петербург. 2010. Т.10. №5. С. 90.