Исследование взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток арабидопсиса
На правах рукописи
Степанченко
Наталья Сергеевна
Исследование взаимодействия сигнальных путей
этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации
культивируемых клеток арабидопсиса
03.01.05 – физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва
Научный руководитель:
доктор биологических наук Новикова Галина Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Медведев Сергей Семенович доктор биологических наук Трофимова Марина Сергеевна
Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской акаде мии сельскохозяйственных наук.
Защита состоится «11» октября 2011 г. в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу:
127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.
Факс: (499) 977-80-18, электронная почта: [email protected];
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской акаде мии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.
Автореферат диссертации размещен на сайте www.ippras.ru.
Автореферат разослан « 7 » сентября 2011 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук М.И. Азаркович
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Накопившаяся за последние годы информация об осо бенностях функционирования путей передачи гормональных сигналов в клетках рас тений позволяет заключить, что интегрированный ответ растительного организма на фитогормоны – результат переноса гормонального сигнала между различными инфор мационными каналами (взаимодействие путей передачи гормональных сигналов). На организменном уровне такое взаимодействие проявляется в способности интегриро вать вне- и внутриклеточные сигналы при помощи сети, образуемой компонентами пу тей передачи сигналов фитогормонов.
Известно, что при стрессах этилен и АБК влияют на синтез друг друга (Ruggiero et al., 2004), а пути передачи их сигналов в подвергнутых стрессам растениях могут взаимодействовать (Beaudoin et al., 2000;
Ghassemian et al., 2000;
Wang et al., 2007).
Напротив, сведения о взаимодействии сигнальных путей этилена и АБК в не подверг нутых стрессорному действию клетках отсутствуют. Более того, данные, полученные на интактных растениях и/или изолированных органах/тканях растений, не позволяют сделать вывод о том, в регуляции какого ответа, проявляющегося на клеточном уров не, могут взаимодействовать сигнальные пути этилена и АБК. Для ответа на сформу лированный вопрос целесообразно использовать биологическую модель, лишенную организменного уровня контроля. Последнему требованию удовлетворяют культиви руемые in vitro клетки, представляющие собой популяцию клеток с вектором отбора по интенсивности и устойчивости пролиферации.
Имеется множество примеров, демонстрирующих взаимосвязь физиологических ответов растений на фитогормоны, которые выражаются в изменениях их роста и раз вития, где одним из основополагающих процессов является деление клеток. Если гло бальная роль ауксинов и цитокининов в качестве позитивных регуляторов пролифера ции клеток не вызывает сомнений (del Pozo et al., 2005), то роль этилена и АБК в деле нии клеток остается предметом интенсивной дискуссии, а взаимное влияние путей пе редачи сигналов этих гормонов в связи с делением клеток остается мало исследован ным вопросом.
Цели и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в поиске пунктов воз можного взаимодействия путей передачи сигналов этилена и АБК в контроле клеточ ных делений в культивируемых клетках Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
1. Охарактеризовать на цитологическом и физиологическом уровнях биологическую модель – культивируемые in vitro клетки A. thaliana – для проведения биохимиче ских и молекулярно-биологических экспериментов.
2. Выяснить влияние экзогенной АБК на пролиферацию культивируемых клеток A.
thaliana дикого типа (Col-0), а также клеток мутантов по генам ETR1, CTR1 и EIN2.
3. Изучить влияние АБК на фосфорилирование белков в клетках Col-0, а также эти лен-нечувствительных мутантов etr1-1, ctr1-1 и ein2-1, и идентифицировать АБК регулируемые протеинкиназы и/или фосфорилируемые ими белки.
4. В культивируемых клетках Col-0, etr1-1 и ein2-1 проанализировать влияние АБК на транскрипцию генов, кодирующих протеинкиназы, которые функционируют в путях передачи сигналов этилена и АБК.
Научная новизна. В работе впервые получены, охарактеризованы и использованы в качестве экспериментальной модели суспензионные культуры клеток этилен нечувствительных мутантов A. thaliana etr1-1, ctr1-1 и ein2-1. Показано, что этилен, образующийся при культивировании клеток, необходим для их устойчивой пролифе рации. Экспериментально подтверждено, что в культивируемых клетках A. thaliana нечувствительность к этилену влияет на передачу сигнала АБК. Мутации, блокирую щие работу этиленового сигнального пути (etr1-1, ein2-1), ведут к увеличению синтеза АБК в течение субкультивирования, а также к проявлению дифференциального эф фекта экзогенно добавляемой АБК на синтез ДНК, пролиферацию и рост клеток, а также на образование трахеальных элементов. В культивируемых клетках A. thaliana обнаружена митоген-активируемая протеинкиназа (МАПК) ERK1-типа, идентичная МРК11. На основании данных по экспрессии генов, кодирующих МАПК, установлено, что в клетках Col-0, etr1-1 и ein2-1 МРК1/2/4 могут функционировать в пути передачи сигнала АБК, МРК3/5 – в активируемом этиленом МАП-киназном каскаде, тогда как МРК6 вовлечена в регуляцию синтеза этилена. Функционирование белков ETR1, EIN и энзиматическая активность МАПК МРК6 определяют баланс между пролиферацией и дифференцировкой в культивируемых клетках A. thaliana. Предложена схема взаи модействия сигнальных путей этилена и АБК в контроле пролиферации.
Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют глубже по нять молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции фитогормонами как про лиферации клеток в суспензионных культурах, так и при переходе культивируемых клеток к цитодифференцировке. Эти данные могут быть использованы для дальнейше го изучения взаимодействия путей передачи сигналов разных фитогормонов, которое выражается в регуляции клеточного цикла растительных клеток. Полученные резуль таты о взаимодействии сигнальных путей фитогормонов в активно пролиферирующих клетках могут быть использованы при чтении курсов лекций по молекулярной биоло гии, физиологии и биохимии растений для студентов и аспирантов биологических спе циальностей.
Апробация работы. Основные результаты научной работы были представлены: на XVI и XVII Международных конгрессах Федерации Европейских Обществ Биологов растений (Финляндия, Тампере, 2008;
Испания, Валенсия, 2010);
конференциях моло дых ученых ИФР РАН (Москва, 2009, 2010);
на XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2009” (Москва, 2009);
на меж дународной конференции “Plant abiotic stress – from signaling to development” (Эстония, Тарту, 2009);
на Годичном собрании Общества физиологов растений России, междуна родной научной конференции “Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера”, (Апатиты, Россия, 2009);
на VI Международной научной конференции “Регуляция роста, развития и продуктив ности растений” (Беларусь, Минск, 2009);
на VII съезде Общества физиологов расте ний России “Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновацион ных биотехнологий» (Нижний Новгород, Россия, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из которых 5 – в рецензируемых изданиях.
Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор лите ратуры, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного тек ста, включает 20 рисунков, 11 таблиц. Список литературы включает 233 наименова ния, из которых – 227 на иностранных языках.
Объекты и методы исследования Растительный материал и обработка клеток. Объектом исследования служили суспензионные культуры клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. четырех генотипов:
дикий тип (экотип Columbia, Col-0) и этилен-нечувствительные мутанты ctr1-1 (consti tutive triple response 1), etr1-1 (ethylene resistant 1) и ein2-1 (ethylene insensitive 2). Куль туры выращивали в среде SH (Shenk and Hildebrandt, 1972) в стеклянных колбах в тем ноте при температуре 26°С и постоянном перемешивании. Период субкультивирова ния составлял 10 дней. Обработку клеток АБК (25 мкМ), U0126 (20 мкМ), BrdU ( мкМ) проводили на 5-й день субкультивирования. Время инкубации клеток с добав ленными растворами составляло 3 час. В экспериментах, в которых изучали совмест ное влияние перечисленных выше веществ, клетки 1 час обрабатывали АБК, а затем добавляли соответствующее соединение и инкубировали еще 2 час. По окончании об работки и удаления среды клетки замораживали в жидком азоте и хранили при темпе ратуре –70°С.
Рост суспензионных культур определяли весовым методом, а размер клеток оценивали по диаметру протопластов, выделение которых проводили по методу, опи санному Смоленской и Носовым (1988).
Цитологический анализ суспензионных культур. Клетки фиксировали сме сью уксусной кислоты с 96% этанолом (1:3). Митотический индекс подсчитывали на препаратах, окрашенных по Фельгену. Приготовленные постоянные препараты ис пользовали для определения количества ДНК в ядрах (Greilhuber, 2005).
Цитофотометрию проводили двухволновым методом (Мендельсон, 1969) в мик роспектрофотометре Univar (Reichert-Jung). В качестве стандарта использовали клетки апикальной меристемы корня Vigna radiata cv. Berken с известным количеством ДНК (4C = 2,1 пг) (Zoriniants et al., 2003). Данные по количеству ДНК в ядрах анализирова ли по методу, описанному Nosov с соавт. (1983).
Определение выделения этилена проводили в газовом хроматографе Цвет 106 с пламенно-ионизационным детектором и устройством для концентрирования углеводо родов (Ракитин, Ракитин, 1986).
Определение содержания АБК в клетках суспензионных культур проводили по методике Карягина (Карягин, 1998) в газовом хроматографе Газохром 1109 с высоко чувствительным и селективным по отношению к АБК детектором по захвату электро нов.
Выделение растворимых белков. Замороженные в жидком азоте клетки гомоге низировали и экстрагировали белки в (1:1,5, вес/объем) 50 мМ Трис-HCl (рН 7,6), ко торый содержал 10 мМ MgCl2, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ), 1 мМ ЭГТА, 2 мМ Na3VO4, 1 мМ бензамидин, 10 мМ NaF, 50 мМ глицерофосфат и 250 мМ сахарозу. Растворимые белки, полученные центрифугирова нием (130000 g, 3 час), переводили в 10 мМ Трис-HCl (рН 7,6) гель-фильтрацией в ко лонках NAP-5 (GE Healthcare Life Science). Содержание белка определяли с бицинхо ниновым реагентом (BCA-Protein assay) (Sigma).
Фосфорилирование белков in vitro и разделение меченых белков двумерным электрофорезом (2-DЕ). Фосфорилирование цитозольных белков in vitro проводили в реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 1 мМ MnCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 2 мМ Na3VO4, 10 мМ -глицерофосфат, 1 мМ бензамидин, 10 мкМ АТФ и 18,5 кБк [-32P]АТФ/мкг белка (уд. активность ТБк/ммоль). Реакцию инициировали добавлением 50-100 мкг белка и проводили в те чение 20 мин при 30°С. Белки осаждали при –20°С 80% ацетоном. Осадки, промытые 2-3 раза 80% ацетоном, растворяли в буфере, содержащем 7,5 М мочевину, 2 М тиомо чевину, 1% Тритон Х-100, 4% CHAPS, 20 мМ ДТТ, 0,2% Bio-Lyte 3/10 (Bio-Rad). В аналитических целях разделение белков при помощи 2-DЕ осуществляли в Mini PROTEAN 2-D Electrophoresis Cell (Bio-Rad) по O’Farrell (1975). Для идентификации фосфобелков MALDI-TOF MS и LC-ESI MS/MS продукты реакции фосфорилирования фракционировали в первом направлении на IPG Strips (длина 7 см, диапазон рН 4-7, Bio-Rad) согласно инструкции производителя. Во втором направлении проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 12,5% ПААГ по Laemmli (1970). Гели ок рашивали Кумасси G-250 (Neuhoff et al., 1985), высушивали и экспонировали с рентге новской пленкой Biomax MR (Kodak). Вырезанные из 2-DE-гелей полипептиды, соот ветствующие фосфобелкам, идентифицировали MALDI-TOF MS в центре “Постге номные и нанотехнологические инновации” на базе Инновационного центра медицин ских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА, LC-ESI MS/MS анализ фосфобелков проводили в Отделе биомолекулярной масс спектрометрии медицинского факультета Лейденского университета (Нидерланды).
Изоэлектрическое фокусирование белков в нативных условиях при помощи MicroRotofor Liquid-Phase IEF Cell (Bio-Rad) проводили согласно протоколу произво дителя.
Определение МАП-киназной активности in vitro проводили, инкубируя белко вые образцы (10 мкг) в течение 20 мин при 30°С в реакционной смеси, содержащей 0,25 мг/мл основного белка миелина (MBP), 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, мМ MnCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 2 мМ Na3VO4, 10 мМ глицерофосфат, 1 мМ бензамидин, 10 мкМ АТФ и 37 кБк [-32P]АТФ (уд. активность 110 ТБк/ммоль). Реакцию останавливали добавлением буфера образцов для ДДС-Na электрофореза и кипячением. Затем проводили электрофорез в денатурирующих усло виях в 15% ПААГ. Для визуализации фосфорилированного MBP высушенные окра шенные гели экспонировали с рентгеновской пленкой Biomax MR (Kodak).
Определение МАП-киназной активности in situ проводили в 10% ПААГ с 0, мг/мл MBP, заполимеризованным в ПААГ. После электрофореза гели инкубировали в 20% изопропаноле, 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 5 мМ 2–меркаптоэтаноле (2МЕ) с по следующей промывкой в 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) с 5 мМ 2МЕ. Затем белки повторно денатурировали при помощи 6 М гуанидингидрохлорида в 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) с 5 мМ 2МЕ. Ренатурацию белков проводили в 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,04% Твин и 5 мМ 2МЕ. Далее гели предынкубировали в 40 мМ Hepes-NaOH (pH 8,0), содержа щем 2 мМ ДТТ, 10 мМ MgCl2, 0,1 мМ ЭГТА и 1 мМ MnCl2. Реакцию фосфорилирова ния в геле проводили в 40 мМ Hepes-NaOH (pH 8,0), содержащем 40 мкМ АТФ, 10 мМ MgCl2, 1 мМ MnCl2 и 74 кБк/мл [-32P]АТФ (уд. активность 110 ТБк/ммоль). Реакцию терминировали 5% ТХУ с 1% Na4P2O7. Высушенные гели экспонировали с рентгенов ской пленкой Biomax MR (Kodak).
Вестерн блоттинг. После электрофоретического разделения (ДДС-Na ПААГ и 2 DE) белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (45 мкм, Hybond-C Extra, GE Healthcare Life Science) в Trans-Blot SD Electrophoretic Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) при 0,8 мА/см2 в течение 2 час. Высушенные мембраны экспонировали с рентгенов ской пленкой Biomax MR (Kodak). После этого мембраны инкубировали с первичными антителами в TBST (10 мМ Трис-HCl рН 7,6, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20) с 2% жела тиной в течение ночи при 4°С. В качестве первичных антител для иммунодетекции ис пользовали анти-ERK1 и анти-фосфоERK1 кроличьи поликлональные и анти фосфотирозиновые (pY20) мышиные моноклональные антитела (Sigma), а для визуа лизации – антимышиные и антикроличьи антитела, меченые пероксидазой хрена (Promega).
Окраску гелей азотнокислым серебром проводили по Ansorge (1985) или Shevchenko с соавт. (1996).
Выделение ДНК из культивируемых in vitro клеток. Навеску замороженных в жидком азоте клеток (около 100 мг сырого веса) растирали в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. ДНК выделяли при помощи набора реактивов GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma) в соответствии с протоколом фирмы производителя. Концентрацию выделенной ДНК определяли спектрофотометрически.
Аллель-специфическая ПЦР. Поскольку мутации ctr1-1, etr1-1 и ein2-1 точечные, то праймеры подбирали к участку гена, где локализована мутация. ПЦР проводили в 10 мкл буфера, содержащего 60 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% Тритон Х-100, 10 мМ 2МЕ, 0,2 мМ дНТФ, 3 ед. активности Taq-полимеразы Hot Taq (Fermentas), 0,5 мкМ праймеров, 10-100 нг ДНК. Реакцию инициировали добавле нием в раствор ДНК-матрицы. Продукты реакции анализировали при помощи элек трофореза в 1% агарозном геле.
ПЦР с обратной транскрипцией. Навеску замороженных в жидком азоте клеток растирали в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. РНК выделяли при помощи набора Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию выделенной РНК определяли спектрофотометрически.
Качество образцов РНК оценивали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле.
Препараты РНК очищали от примеси ДНК при помощи DNase I (Fermentas), инкуби руя 1 мкг РНК c 1 ед. активности фермента в течение 1 час при 37°С в буфере, содер жащем 100 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 25 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2. Полученные препараты использовали для синтеза кДНК при помощи обратной транскриптазы SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) в соответствии с протоколом про изводителя. Синтез второй цепи проводили при помощи ПЦР в 10 мкл смеси, содер жащей 60 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% Тритон Х-100, мМ 2МЕ, 0,2 мМ дНТФ, 3 ед. активности Taq-полимеразы, 0,5 мкМ праймеров, 2- мкл смеси кДНК. Продукты реакции анализировали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле.
Количественное определение включения бромдезоксиуридина (BrdU) в ДНК проводили как описано Ueda с соавт. (2005). Выделенную из культивируемых клеток геномную ДНК (2 мкг) денатурировали 0,4 N NaOH, затем нейтрализовали добавлени ем 1М Трис-HCl (рН 6,8). Нейтрализованный раствор одноцепочечной ДНК (50 нг) при помощи Bio-Dot SF Microfiltration apparatus (Bio-Rad) наносили на нитроцеллю лозную мембрану Hybond-C Extra (45 мкм), мембрану высушивали на воздухе, а затем ДНК фиксировали ультрафиолетом. Мембрану инкубировали с моноклональными ан тителами против BrdU (Sigma). Для визуализации использовали антимышиные антите ла, коньюгированные с пероксидазой хрена (Promega).
Обработку данных проводили при помощи компьютерных программ Progenesis PG220 v2006 (Nonlinear Dynamics Ltd.) и One-Dscan V1.3 (Scanalytics). В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения из трех независимых экспе риментов и их стандартные ошибки.
Результаты и обсуждение Характеристика суспензионных культур. Поскольку первичными эксплантами для получения клеточных суспензий были листья растений A. thaliana с точечными мутациями etr1-1, ctr1-1 и ein2-1, то при помощи аллель-специфической ПЦР мы под твердили, что культивирование in vitro не привело к реверсии мутаций. В течение пе риода субкультивирования клетки в небольших кластерах имеют форму удлиненных “клеточных файлов”, указывая на непрерывность их роста и деления. За период суб культивирования суспензия Col-0 прирастала в 14,7 раз;
штаммы etr1-1 и ein2-1 при растали в 7,5 и 6,4 раз соответственно, тогда как штамм ctr1-1 рос менее интенсивно (индекс роста 3,0). Удельная скорость роста (max, сут-1) клеток составила для Col- 0,43, etr1-1 0,33, ctr1-1 0,17 и ein2-1 0,34. Несмотря на различия в скорости роста, жиз неспособность всех штаммов была высокой (не менее 90%). Так как время удвоения числа клеток Col-0 (38 час) меньше, чем у этилен-нечувствительных мутантов, то можно заключить, что для деления клеток в культуре необходима чувствительность к этилену и сбалансированная работа этиленового сигнального пути. Клетки мутантов по морфологии отличались от Col-0: клетки etr1-1 значительно мельче, клетки ein2- гетерогенны по размерам, а клетки ctr1-1 в 1,5-2 раза крупнее. Кроме того, у etr1-1 и ein2-1 постоянно образовывались трахеальные элементы (ТЕ), которые не встречались у Col-0 и ctr1-1.
При культивировании in vitro клетки продуцируют этилен, который может влиять на скорость пролиферации и эндоредупликацию ядерной ДНК (Dan et al., 2003). В свя зи с этим мы исследовали степень гетерогенности культивируемых клеток по количе ству ядерной ДНК. Количество ДНК в ядрах Col-0 варьировало от 2С до 32С с преоб ладанием 8С (47%). Распределение ядер по количеству ДНК в культуре etr1-1 сходно с диким типом, но спектр плоидности более узкий. В культуре ein2-1 число клеток с ко личеством ДНК 8С и 16С было примерно одинаковым и составляло 32% и 36% соот ветственно. Однако стоит отметить, что в культуре ein2-1 ядра с 32С встречались ча ще, чем в Col-0. В популяции клеток ctr1-1 доля ядер с 16C существенно выше (~25%), чем в Col-0 и etr1-1. Эти данные согласуются с результатами, полученными на этиоли рованных проростках Arabidopsis (Gendreau et al., 1999). Показано, что обработка про ростков Col-0 предшественником этилена АЦК вела к увеличению доли полиплоидных ядер, которая сравнима с таковой у ctr1-1, но в отсутствие этилена.
Влияние АБК на синтез ДНК и митотическую активность. Измерение содер жания эндогенной АБК в клетках в течение периода субкультивирования показало, что количество гормона у etr1-1 и ein2-1 имело тенденцию к повышению, тогда как у Col- количество АБК практически не менялось. Опираясь на эти данные, клетки обрабаты вали экзогенной АБК (25 мкМ) на 4-5 день после инокуляции в свежую питательную среду, когда содержание эндогенной АБК сходно у всех генотипов.
Влияние АБК на пролиферацию клеток было оценено по синтезу ДНК и митотиче ской активности. Поскольку АБК как возможный регулятор деления клеток блокирует клетки на границе G1/S, мы проанализировали эффект АБК на синтез ДНК, определяя in vivo включение аналога тимидина 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК. В клет ках Col-0 обработка АБК вызывала устойчивое снижение включения BrdU в ДНК (Рис.
1). Этот результат может быть следствием негативного эффекта АБК на синтез ДНК, что согласуется с данными лите ратуры (Swiatek et al., 2002).
Включение BrdU в ДНК клеток Включение BrdU (ОЕ) etr1-1 повышалось под влиянием АБК, тогда как у мутантов ctr1- и ein2-1 эффект АБК достоверно не проявлялся. Следовательно, в системе, где отбор клеток осуще ствляется по признаку активной пролиферации, нечувствитель ность к этилену может влиять на передачу сигнала АБК, которая в норме ведет к ингибированию Col-0 etr1-1 ctr1-1 ein2- синтеза ДНК. В экспоненциаль - AБК + АБК ной фазе роста синтез ДНК в контрольных условиях согласу Рис. 1. Влияние АБК на включение 5-бром-2 ется с митотической активно дезоксиуридина (BrdU) в ДНК клеток Col-0, etr1-1, стью (r = 0,98), которая в свою ctr1-1 и ein2-1.
очередь отражает процессы, происходящие в популяциях клеток. При нормально функционирующем пути переда чи этиленового сигнала, как в клетках Col-0, АБК ингибировала синтез ДНК (G1/S пе реход) и не влияла на величину митотического индекса (МИ) (5,4%). В суспензиях etr1-1 и ein2-1 массово встречаются ТЕ, то есть определенная доля клеток выходила из цикла и переходила к терминальной дифференцировке (образование ТЕ), поэтому по пуляции клеток etr1-1 и ein2-1 имели МИ 2,8% и 2,7% соответственно. Экзогенная АБК в отсутствие восприятия этиленового сигнала стимулировала синтез ДНК у etr1 1, но не у ein2-1, где этилен воспринимается, но его сигнал не проводится. Значитель ная часть клеток ctr1-1 отвлекается на процессы эндоредупликации ДНК и, вероятно, задерживается в фазе G2. Экзогенная АБК не влияла на синтез ДНК в клетках ctr1-1, но препятствовала переходу клеток к эндоциклам, что видно по возрастанию МИ с 3,5% до 4,3%.
Влияние АБК на рост и морфологию клеток. Чтобы выяснить влияние АБК на рост и морфологию, клетки переносили в среду, уже содержавшую АБК, и каждые двое суток измеряли сырой вес, число погибших клеток, а также количество ТЕ (Рис. и Таблица 1). В конце периода субкультивирования у Col-0 снижалась биомасса, тогда как у ein2-1 в ответ на АБК не наблюдалось изменений роста. Особенно сильно эффект АБК проявлялся у etr1-1: прирост биомассы был значительным, ко личество ТЕ снижалось, и повы Индекс роста шалась доля живых клеток. На против, в культуре ein2-1 более чем в 2-3 раза увеличивалось + АБК число ТЕ, а процент живых кле ток снижался. Поскольку в ходе культивирования клеток экзоген 0 ная АБК замедляла снижение Col-0 etr1-1 ein-2- продукции этилена только в – АБК + АБК культуре Col-0, а доля живых клеток при этом увеличивалась, Рис. 2. Влияние АБК на индекс роста клеток сус то можно допустить, что роль эк пензионных культур A. thaliana Col-0, etr1-1 и ein2 1. зогенной АБК состояла в под АБК (25 мкМ) добавляли в среду в момент пересад держании синтеза этилена на ки клеток, индекс роста, число погибших клеток и уровне, который позволял клет количество трахеальных элементов культур изме ряли в конце периода субкультивирования. кам продолжать пролиферацию.
Таблица 1. Влияние АБК на число трахеальных элементов (ТЕ) и жизнеспособ ность клеток культур Col-0, etr1-1 и ein2-1.
Col-0 etr1-1 ein2- Сутки АБК ТЕ, Живые ТЕ, Живые ТЕ, Живые х 10-3 х 10-3 х 10- клетки, % клетки, % клетки, % – 0 91,5 ±0,5 80 ±11 90,7± 0,88 52 ±4 91,1 ±0, + 0 92,8 ±0,8 67 ±12 95,1 ±0,59 118 ±6 88,4 ±1, – 0 69,5 ±0,5 49 ±2 94,2 ±1,2 33 ±3 93,4 ±0, + 0 71,1 ±2,9 29 ±5 97 ±0,57 132 ±13 83,4 ±1, Представлены средние значения и их стандартные ошибки.
Таким образом, в культивируемых клетках A. thaliana нечувствительность к этиле ну влияла на проявление ответа на АБК. Мутации, блокирующие работу этиленового сигнального пути (etr1-1, ein2-1), ведут к увеличению синтеза АБК в течение субкуль тивирования, а также к проявлению дифференциального эффекта экзогенной АБК на синтез ДНК, пролиферацию, рост клеток и образование ТЕ. В норме (Col-0) экзогенная АБК снижает синтез ДНК (Рис. 1) и последующую пролиферацию клеток, но у штам мов мутантов “спасает” от негативных последствий, связанных с отсутствием этилено вого сигналинга (Рис. 2 и Таблица 1).
Влияние АБК на фосфорилирование растворимых белков клеток A. thaliana.
Несмотря на своеобразие судьбы клеток etr1-2, ctr1-1 и ein2-1, популяции стабильно поддерживаются в условиях in vitro, что указывает на нормальное функционирование системы циклин-зависимых протеинкиназ, которые обеспечивают прохождение кле точного цикла. Мы сосредоточили внимание на поиске макромолекул, функциониро вание которых не дублирует элементы универсальной циклин-зависимой машины кле точного цикла. Такими макромолекулами могут быть протеинкиназы и/или протеин фосфатазы – ключевые компоненты пути передачи сигналов АБК и этилена (Schweig hofer et al., 2007, Yoo et al., 2008, Fujita et al., 2009).
Клетки всех генотипов в фазе экспоненциального роста в течение трех часов обра батывали АБК (25 мкМ). Концентрация АБК и время экспонирования были выбраны на основании наших данных об отсутствии эффекта кратковременной обработки АБК на синтез этилена. Мы не выявили различий в спектрах фосфорилированных in vitro цитозольных белков, выделенных из обработанных АБК клеток Col-0, etr1-1, ctr1-1 и ein2-1, однако имелись различия по степени фосфорилирования индивидуальных по липептидов. На рис. 3 приведен радиоавтограф 2-DE геля, где номерами 1, 10, 11, 12, 14, 17, 21, 22, 23, 30, 33 и 34 отмечены полипептиды, уровень фосфорилирования кото pH 7,5 - 4, 225 100 14 13 75 11 35 15 50 16 35 18 20 21 24 25 27 15 Рис. 3. Авторадиограмма фосфорилированных in vitro белков клеток Col-0. Отмечены все проанализированные фосфопротеины.
рых дифференциально регулировался экзогенной АБК как у Col-0, так и у всех мутан тов. Эти данные указывают на присутствие в культивируемых клетках АБК-зависимых протеинкиназ, отличающихся от этилен-регулируемых.
Известно, что в клетках животных и дрожжей MAП-киназы важны как для клеточ ной пролиферации, так и для регуляции клеточного цикла (Pearce and Humphrey, 2001).
Представлялось вполне логичным допустить, что эффект АБК мог быть связан с изме нениями энзиматической активности этих протеинкиназ. МАП-киназы работают в кас кадах, включающих три функционально связанных фермента: МАПККК–МАПКК– МАПК. Чтобы убедиться, что среди АБК-регулируемых фосфобелков могут иметься МАПКК, клетки сначала обработали специфическим ингибитором МАПКК U0126, а затем – АБК. В ответ на обработку клеток U0126 наблюдалось значительное снижение уровня фосфорилирования некоторых белков (Рис. 4), что указывало на вероятное присутствие МАПК, за активацию которых отвечают МАПКК.
4 74 А pI pI pI кД Col-0, контроль Col-0, АБК Col-0, U0126, АБК 4 74 74 pI pI pI кД etr1-1, контроль etr1-1, АБК etr1-1, U0126, АБК 4 7 4 pI pI Б Вестерн-блот (anti-ERK1) Вестерн-блот (anti-PY20) Рис. 4. А. Влияние ингибитора МАПКК (U0126) на АБК-зависимое фосфорилирование белков клеток Col-0 и etr1-1.
Б. Вестерн-блот анализ белков, разделенных при помощи 2-DE, с антителами против МАПК ERK1 типа (anti-ERK1) и против фосфотирозина (anti-PY20).
У Arabidopsis 12 из 23 МАПК относятся к МАПК ERK1-типа (The Arabidopsis Ge nome Initiative, 2000). При помощи анти-ERK1 антител мы показали, что среди белков, степень фосфорилирования которых изменялась после обработки клеток АБК в при сутствии U0126, имеются МАПК ERK1-типа (Рис. 4). При помощи антител против фосфоТир (анти-рY20) было подтверждено наличие терминальных МАПК, так как только терминальные МАПК фосфорилируются по аминокислотным остаткам Тре и Тир в мотиве фосфорилирования Тре-Глу-Тир. Фосфобелки с мол. массами от 37 до кД и pI 5,5-7,0 реагировали не только с анти-ERK1, но и с анти-pY20 антителами (Рис.
4). Таким образом, в цитозоле культивируемых клеток A. thaliana присутствуют регу лируемые АБК протеинкиназы, среди которых имеются МАПК иммунологически близкие МАПК ERK1-типа.
Влияние АБК на МАП-киназную активность в клетках Col-0 и этилен нечувствительных мутантов. Для обогащения фракции цитозольных белков МАПК мы применили изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в MicroRotofor Liquid-Phase IEF Cell. При этом способе ИЭФ белки разделяются по величинам pI, которые соответ ствуют pI нативных белков. В результате были получены 10 фракций (диапазон pН 3,0 10,0), ферментативную активность которых проверяли в реакции фосфорилирования in vitro с экзогенным субстратом MAПК MBP. Наибольший эффект АБК на MBP киназную активность проявился во фракциях с рН от 5,1 до 6,8 (Рис. 5А). В этих фрак циях содержались белки, которые наиболее активно и АБК-зависимо фосфорилирова ли МВР. Мол. массы этих белков были определены при помощи фосфорилирования MBP in situ (в геле) (Рис. 5Б). MBP-фосфорилирующая активность ассоциирована с полипептидами 41 и 45 кД (Рис. 5Б), что соответствует мол. массам терминальных МАПК. У Col-0 во фракции с рН 5,1-5,4 АБК активировала МАПК с мол. массой кД, а у ein2-1 – 45 кД. Это свидетельствует о том, что в зависимости от функциональ ной активности этиленового сигнального пути в ответ на АБК активируются разные Col-0 etr1-1 ein2- 3.9 5.1 6.2 6.8 4.7 5.3 6.4 4.1 5.4 6.8 7. pH 4. А MBP MBP Б кД АБК – + – + – + – + – + – + – +– + – + – +– +– + АБК Рис. 5. Влияние АБК на фосфорилирование MBP in vitro (А) и in situ (Б) фракциями белков после ИЭФ в нативных условиях.
МВР-киназы. Далее мы проверили кросс-реактивность белков с анти-рY20, а также с антителами против фосфорилированной формы ERK1. Так как 41-кД и 45-кД полипеп тиды реагировали с обоими типами антител, то дифференциально регулируемые МВР киназы можно отнести к МАПК ERK1-типа. Чтобы установить мол. массу и pI инди видуальных МАПК, с белками фракции с рН 5,1-5,4 провели фосфорилирование МВР in situ после 2-DE. Было обнаружено, что у Col-0 и ein2-1 в ответ на АБК работали раз ные МАПК. У ein2-1 конститутивная активность некоторых из них сравнима с АБК индуцируемой у Col-0. То есть, в клетках, где этиленовый сигнал не проводится, могут работать МАПК, которые в норме обеспечивают проведение сигнала АБК. Несмотря на высокую разрешающую способность 2-DE, попытка идентифицировать АБК регулируемые МАПК при помощи MALDI-TOF MS оказалась неудачной из-за высо кого фона МВР, запролимеризованного в гелях второго направления, и мы были вы нуждены искать способы предварительной подготовки белковых фракций для иденти фикации фосфорилированных белков.
Идентификация предполагаемых субстратов МАПК при помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии. Для определения уникального профиля АБК-регулируемых фосфопротеинов для каждого генотипа было выбрано по 12 полипептидов, уровень фосфорилирования которых дифференциально менялся в ответ на АБК. Эти полипеп тиды вырезали из 2-DE гелей, и для их идентифицикации применяли MALDI-TOF MS и LC-ESI MS/MS. В результате были идентифицированы МАПК МPK11, две енолазы, белок KRP4 (Kip-related protein), бета-субъединица АТФ синтазы, фактор инициации трансляции 4А (eF4A), фактор транскрипции SCL9 (Scarecrow-like 9), НАДФ зависимая оксидоредуктаза, аннексин 2 (ANNAT2), альдо/кето редуктаза, PYL8, гли церальдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Рис. 6). Все перечисленные белки обнаружены во фракциях, обладавших МАП-киназной активностью. Проанализировав последователь ности этих белков в базах данных NetPhos и NetPhosK, мы нашли, что в аминокислот ных последовательностях нескольких белков имеются PX(S/T)P мотивы, которые фос форилируют МАПК. То есть, эти белки могут быть потенциальными субстратами МАПК или других протеинкиназ, способных их фосфорилировать АБК-зависимо.
Особого внимания заслуживает идентифицированная нами МАПК MPK11, являющая ся ближайшим гомологом MPK4, поскольку недавно показано, что у Arabidopsis обе МАПК участвуют в цитокинезе (Kosetsu et al., 2010). Следует подчеркнуть, что иден тификация МАПК МРК11 была подтверждена при помощи LC-ESI MS/MS.
Основываясь на имеющихся в литературе данных, в отношении некоторых из идентифицированных белков можно высказать соображения об их потенциальной ро ли в качестве субстратов MAПK.
Известно, что факторы транскрипции – наиболее “привычные” внутриклеточные субстраты МАПК. В этом смысле интересен белок SCL9. В покоящемся центре корня Arabidopsis дикого типа и ctr1-1 обработка этиленом приводила к увеличению числа клеток (Ortega-Martinez et al., 2007), что, по-видимому, связано с ростом экспрессии SCR в ответ на этилен. Поскольку в нашей работе обработка АБК усиливала синтез ДНК в etr1-1, то можно думать, что АБК-регулируемое фосфорилирование SCL9 – результат функционирования как пути передачи сигнала этилена, так и АБК.
pI 5.5 6. 1. Аннексин 2. НАДФ-зависимая оксидоредуктаза, 3. Альдо/кето редуктаза, кД 4. PYL 5. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа 50 1 2 3 4 2 4 5.0 6.0 pI Фракция кД АБК рН 5,2-5, 6. eF4A 7. Бифункциональная енолаза 8. МPK 9. SCL 10. KRP 11. Енолаза 10 12. -субъединица Фракция 9 АТФ синтазы рН 6,2-6,8 АБК Рис. 6. АБК-регулируемое фосфорилирование белков фракций с рН 5,2-5,4 и 6,2-6,8, по лученных после ИЭФ в нативных условиях.
Цифрами отмечены фосфобелки, идентифицированные при помощи MALDI-TOF MS.
Представлены авторадиограммы. Приведены списки идентифицированных белков. Под черкнуты белки, у которых найдены потенциальные сайты фосфорилирования МАПК.
Белок KRP4 присутствует в клетках в нефосфорилированном состоянии, подтвер ждая, что использованные в наших экспериментах клетки митотически активны. Име ются данные, что пик экспрессии KRP4 приходится на G2 (Menges et al., 2005), а белок KRP4 необходим для прохождения S-фазы (Ormenese et al., 2004). Обнаружено также, что у Arabidopsis при обработке АБК индуцировалась транскрипции KRP1/2 (Wang et al., 1998), что позволяет думать о KRP1 как о важном регуляторе АБК-зависимого ин гибирования роста.
В клетках высших эукариот фактор инициации трансляции eIF4A является суб стратом MAPKAPK (MAPK activated protein kinase), которую фосфорилируют МАПК.
В клетках млекопитающих MAPKAPK2 регулирует прохождение S-фазы, а также G2/M переход в ответ на облучение УФ-С средней интенсивности (Mаnke et al., 2005), причем MAPKAPK2 – внутриклеточный субстрат МАПК SAPK (Stress-activated protein kinase). Следовательно, нельзя исключить, что eIF4A может быть потенциальным суб стратом и для МАПК ERK1-типа.
Специального внимания заслуживает белок PYL8 (Pyrabactin resistance-like), при надлежащий семейству рецепторов АБК. Кроме PYL8 в состав этого семейства входят ещё 13 белков, причем все они способны специфически связывать физиологически ак тивную АБК (Park et al., 2009). Мы показали, что PYL8 присутствует в клетках Arabi dopsis в фосфорилированном виде. Это согласуется с существующими представления ми о механизме функционирования рецепторов АБК (Miyazono et al., 2009), а с другой стороны, указывает, что в исследуемой клетках путь передачи сигнала АБК функцио нально активен.
Суммируя данные масс-спектрометрии, подчеркнем, что обнаруженные нами бел ки ассоциированы с G1- и S А Col-0 etr1-1 ein2-1 фазами, что согласуется с резуль татами анализа транскриптома MPK Arabidopsis, которые показали, что транскрипция генов, кодирующих MPK идентифицированные белки, так MPK же связана с фазами G1 и S (Menges et al., 2002).
MPK Влияние АБК на транскрип MPK5 цию генов индивидуальных МАПК. Для того чтобы все-таки MPK подойти к анализу индивидуаль ных МАПК, мы изучили влияние actin АБК на транскрипцию генов ин + + + АБК дивидуальных МАПК. Для анали за были выбраны гены тех МАПК, Б Col- о которых известно как об участ etr1-1 ein2- никах путей передачи гормональ SnRK2.2 ных сигналов (МРК1/2/3/6), так и SnRK2.3 о регуляторах клеточного цикла (MPK4/5) (Menges et al., 2008).
SnRK2.6 При помощи ОТ-ПЦР мы выясни ли (Рис. 7А), что в экспоненци actin альной фазе роста культивируе мых клеток Col-0, etr1-1 и ein2- + + + АБК конститутивный уровень транс Рис. 7. Влияние АБК на транскрипцию генов инди- крипции МРК4 по сравнению с видуальных МАПК (А) и SnRK2 (Б) в культивируе- генами других МАРК самый высо мых клетках Col-0, etr1-1 и ein2-1.
кий и зависит от обработки АБК только у Col-0. Напротив, гены МРК1 и МРК2 транскрибировались на крайне низком уровне, что совпадает с данными литературы (Ortiz-Masia et al., 2007). После обработ ки АБК транскрипция МРК1 увеличивалась в Col-0 и ein2-1, тогда как транскрипция МРК2 существенно росла как у Col-0, так и у etr1-1. Можно предположить, что роль MPK1/2 в пролиферирующих клетках связана с передачей сигнала АБК. В популяции клеток Col-0 и ein2-1 транскрипция МРК5 более чем в два раза повышалась в обрабо танных АБК клетках, а в клетках etr1-1 мы не обнаружили влияния АБК на транскрип цию МРК5. Экспрессия МРК3 индуцировалась в клетках Col-0 в ответ на обработку АБК, а у etr1-1 и ein2-1 была низкой и не зависела от АБК. Как в популяции Col-0, так и в клетках etr1-1 МРК6 транскрибировалась на достаточно высоком уровне и была АБК-зависимой. Поскольку etr1-1 не воспринимает этилен вследствие мутации в ре цепторе этилена ETR1, то ответственной за обнаруженное изменение уровня экспрес сии МРК6 следует считать АБК. Согласно существующим представлениям, МАП киназный модуль с МРК3/6 функционирует как при биосинтезе этилена, так и в пути передачи этиленового сигнала (Yoo et al., 2008). Однако тот факт, что при обработке АБК транскрипция МРК6 усиливается и в клетках Col-0, и в клетках обоих этилен нечувствительных мутантов приводит нас к заключению, что в культивируемых клет ках в путях передачи сигналов и АБК, и этилена может работать МАПК MPK6.
Влияние АБК на транскрипцию генов протеинкиназ семейства SnRK2. В на стоящее время принимается, что протеинкиназы семейства SnRK2 – важные компо ненты путей передачи таких стрессовых сигналов, при которых растет содержание эн догенной АБК (Baena-Gonzalez et al., 2007). Мы изучили влияние экзогенной АБК на транскрипцию генов протеинкиназ SnRK2.2/2.3/2.6, для которых показано участие в передаче сигнала АБК (Hrabak et al., 2003;
Boudsocq et al., 2004, Yoshida et al., 2006, Fujii and Zhu 2009). Уровень транскрипции SnRK2.2 у всех генотипов был достаточно высоким в контроле и практически не менялся при обработке АБК (Рис. 7Б). По срав нению с мутантами в Col-0 экзогенная АБК вызывала усиление транскрипции SnRK2.6.
Наиболее сильным оказался эффект АБК в отношении SnRK2.3, транскрипция которой у Col-0 увеличивалась в 16 раз, а у etr1-1 АБК индуцировала экспрессию SnRK2.3. У ein2-1 высокий уровень транскрипции всех SnRK2 в контроле может свидетельство вать, что у этого мутанта путь передачи сигнала АБК работает конститутивно. Учиты вая, что в середине экспоненциальной фазы роста содержание эндогенной АБК одина ково, обнаруженные изменения транскрипции SnRK2.2/2.6 – результат обработки экзо генной АБК.
Заключение Внутриклеточными регуляторами пролиферации и дифференцировки у растений являются фитогормоны, ответы на которые в растительной клетке обеспечиваются взаимодействием путей передачи их сигналов. Хотя число сообщений о наличии взаи модействия путей передачи гормональных сигналов постоянно увеличивается, сведе ния о молекулярных механизмах взаимодействия крайне ограничены. Предполагается, что взаимодействие может выражаться, во-первых, во влиянии на синтез друг друга, во-вторых, в наличии общего сигнального компонента в путях передачи сигналов, в третьих, в существовании общих генов-мишеней, что приводит к кооперативной регу ляции определенного ответа. Так, показано взаимодействие путей передачи сигналов этилена и АБК в таких процессах как прорастание семян (Beaudoin et al., 2000;
Ghas semian et al., 2000;
Chiwocha et al., 2005), движение замыкающих клеток устьиц (Ta naka et al., 2005, 2006), изменение роста корней, включая формирование латеральных корней при тепловом стрессе (Sharp and LeNoble, 2002;
Spollen et al., 2000). Однако на основании этих данных трудно высказать предположения о возможном влиянии эти лена и АБК на деление клеток. Вместе с тем, нельзя исключить, что в регуляции про лиферации этилен и АБК способны быть как позитивными, так и негативными регуля торами. Действительно, недавно показано, что этилен, а не ауксин – признанный пози тивный регулятор клеточной пролиферации – способен усиливать клеточные деления в покоящемся центре корня (Ortega-Martinez et al., 2007). Хотя АБК часто рассматрива ют в качестве гормона-ингибитора роста, имеются данные, указывающие, что АБК в низких концентрациях способна активировать рост (Sharp et al., 2000;
Cheng et al., 2002).
Использовав культивируемые in vitro клетки A. thaliana Col-0, а также этилен нечувствительных мутантов etr1-1, ctr1-1 и ein2-1, мы показали, что в этой биологиче ской модели пути передачи сигналов этилена и АБК взаимодействуют, но взаимодей ствие путей передачи сигналов этилена и АБК не выражается только во взаимном влиянии на синтез друг друга. Мы не обнаружили существенного роста продукции этилена в ответ на кратковременную обработку клеток экзогенной АБК, хотя известно, что в ответ на абиотические стрессы происходит значительный рост продукции этиле на и АБК. С другой стороны, измерение влияния АБК на биосинтез этилена в процессе культивирования клеток показало, что только в клетках Col-0 синтез этилена поддер живался на уровне, который позволял клеткам продолжать делиться.
Представляется весьма вероятным, что взаимодействие этилена и АБК связано с их регуляцией экспрессии генов-мишеней. Однако изучение этого вопроса не было зада чей нашей работы. Более того, следует специально подчеркнуть, что гены-мишени яв ляются эффекторами, а не компонентами сигнальных путей. Поэтому попытаемся суммировать полученные нами данные, касающиеся собственно компонентов сигналь ных путей этилена и АБК.
Связывание добавленной в среду культивирования АБК с рецептором ведет к взаимодействию протеинфосфатазы РР2С с гормон-рецепторным комплексом и ее инактивации. В результате инициируется путь передачи сигнала АБК, в котором функционируют протеинкиназы семейства SnRK2, АБК-зависимо фосфорилирующие свои мишени. Среди них могут быть и МАПК, которые, по-видимому, участвуют в опосредованном АБК снижении уровня пролиферации посредством активации иден тифицированного в нашей работе белка KRP4, функции которого как ингибитора цик лин-зависимых протеинкиназ показаны (Ormenese et al., 2004).
Мы установили, что по мере культивирования клеток образуется этилен, что опре деляется активной работой АЦК-синтазы 6 – субстрата МАПК MPK6 (Feilner et al., 2005). Сигнал о связывании этилена с его рецепторами (ETR1/2, ERS1/2, EIN4) прово дится через МАП-киназный модуль, в котором функционируют МАПК MPK3/6 (Yoo et al., 2008). В ответ на этилен усиливается транскрипция генов, кодирующих РР2С (Schweighofer et al., 2007). Протеинфосфатазы РР2С подгруппы B и некоторые пред ставители подгруппы А имеют домены, обеспечивающие их связывание с МАПК, в том числе с MPK6 (Schweighofer et al., 2007). Связывание РР2С с MPK6 ведет к сни жению активности MPK6, и, как следствие, может происходить авторегуляция биосин теза этилена на уровне, который позволяет клеткам активно пролиферировать.
Теперь рассмотрим последствия описанных выше событий применительно к про цессам, происходящим на клеточном уровне. Когда путь передачи сигнала этилена функционально активен, то клетки активно пролиферируют, а экзогенная АБК выпол няет свою функцию ингибитора синтеза ДНК и деления. Если путь передачи этилено вого сигнала конститутивно активен, то клетки начинают выходить из цикла и перехо дить к эндоредупликации. В этом случае экзогенная АБК способствует реактивации клеточных делений. При инактивации пути передачи этиленового сигнала идет актив ная дифференцировка на фоне незначительной пролиферации. Если этилен не воспри нимается, то, вероятно, кроме дифференцировки может происходить и массовая гибель клеток, а экзогенная АБК “спасает” клетки, усиливая пролиферацию на фоне снижаю щейся дифференцировки. Если сигнал этилена воспринимается, но не проводится, то идет активная дифференцировка, которую усиливает экзогенная АБК, при этом про лиферация клеток снижается.
Таким образом, восприятие и передача этиленового сигнала определяет соотноше ние пролиферации и гибели клеток, которое может корректироваться АБК. Механизм гибели клеток в отсутствие восприятия этилена, по всей видимости, должен отличать ся от запрограммированной клеточной смерти, например, сопровождающей старение.
Проведение сигнала этилена определяет баланс между пролиферацией и цитодиффе ренцировкой, которая также может быть настроена в ту или иную сторону при помощи АБК. Оба эти обстоятельства требуют дальнейшего изучения, которое проводится на ми в настоящее время.
Выводы:
1. Суспензионные культуры клеток A. thaliana экотипа Columbia и этилен нечувствительных мутантов сохраняют исходные генотипы, что делает их адек ватной моделью для изучения взаимодействия путей передачи сигнала этилена и других фитогормонов в контроле пролиферации клеток.
2. Снижение числа делящихся клеток у мутантов по негативным (ETR1 и CTR1) и позитивному (EIN2) регуляторам пути передачи этиленового сигнала указывает, что для пролиферации культивируемых клеток необходима сбалансированная ра бота этиленового сигнального пути.
3. В культивируемых клетках A. thaliana нечувствительность к этилену влияет на пе редачу сигнала АБК. В норме экзогенная АБК снижает синтез ДНК и последую щую пролиферацию клеток, а у штаммов мутантов “спасает” от негативных по следствий, связанных с отсутствием этиленового сигналинга.
4. Мутации, блокирующие работу этиленового сигнального пути (etr1, ein2), ведут к увеличению синтеза АБК в течение субкультивирования, а также к проявлению дифференциального эффекта экзогенно добавляемой АБК на синтез ДНК, проли ферацию и рост клеток, а также на образование трахеальных элементов.
5. Экзогенная АБК регулирует протеинкиназу, которая на основании биохимических и иммунологических характеристик отнесена к МАПК ERK1-типа и идентифици рована как МРК11.
6. В клетках Col-0, etr1 и ein2 экспрессия генов, кодирующих МАПК, дифференци ально регулируется в ответ на обработку экзогенной АБК. Полученные данные указывают, что МАПК МРК1/2/4 могут функционировать в пути передачи сигнала АБК, МРК3/5 – в активируемом этиленом МАП-киназном каскаде, тогда как МРК6 вовлечена в регуляцию синтеза этилена.
7. Взаимодействие сигнальных путей этилена и АБК происходит на уровне МАПК МРК6. Функционирование белков ETR1, EIN2 и энзиматическая активность МРК определяют баланс между пролиферацией и дифференцировкой в культивируемых клетках A.thaliana.
Список публикаций по теме диссертации:
1. Новикова Г.В., Никашин Б.А., Степанченко Н.С., Мошков И.Е. (2007) Фосфо протеомика в исследованиях регуляторных систем растений: дивиденды секве нированных геномов. Доклады VI съезда физиологов растений России, 1, с. 205 207.
2. Stepanchenko N.S., Nikashin B.A., Nosov A.V., Novikova G.V., Moshkov I.E.
(2008) Ethylene and ABA may share signaling component upon A.thaliana plants re sponse to UV-B. Physiol. Plant., 133, P01-069.
3. Степанченко Н.С. (2009) Фосфорилирование белков в листьях Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. при действии ультрафиолета В. XVI Международная конфе ренция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2009”, Москва, с.
240.
4. Stepanchenko N.S., Novikova G.V., Nosov A.V., Moshkov I.E. (2009) Cross-talk between ethylene and abscisic acid signaling pathways mediates proliferation of Arabidopsis thaliana cultivated cells. Abstr. Plant Abiotic Stress – from Signaling to Development, Tartu, Estonia, p. 17.
5. Мошков И.Е., Новикова Г.В., Степанченко Н.С. (2009) Этилен: маленькая мо лекула – большие вопросы. Годичное собрание Общества физиологов растений (тезисы докладов), Апатиты, Россия, с. 9.
6. Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) Влияние этилена и абсцизовой кислоты на фосфорилирование белков культивируемых in vitro клеток Arabidopsis thaliana, находящихся в разных фазах клеточного цикла.
Годичное собрание Общества физиологов растений России (тезисы докладов), Апатиты, Россия, с. 319.
7. Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) Культиви руемые in vitro клетки A. thaliana – модель для изучения влияния этилена и АБК на пролиферацию клеток. VI-я Международная научная конференция “Регуля ция роста, развития и продуктивности растений”, Минск, с. 144.
8. Новикова Г.В., Степанченко Н.С., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) В начале пути: восприятие АБК и передача ее сигнала у растений. Физиология растений, 56, с. 806-823.
9. Stepanchenko N.S., Novikova G.V., Nosov A.V., Moshkov I.E. (2010) Ethylene and ABA affect the proliferation of in vitro cultivated A. thaliana cells. Book of Abstr., XVII Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB), Valencia, Spain, P11-003.
10. Мошков И.Е, Степанченко Н.С., Новикова Г.В. (2010) Передача этиленового сигнала: CTR1 – вопросы и ответы. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума “Растение и стресс”, Москва, с. 246-247.
11. Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Носов А.В., Мошков И.Е. (2011) Взаимодей ствие сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролифера ции культивируемых клеток A. thaliana. VII съезд Общества физиологов расте ний России “Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инно вационных биотехнологий”, Нижний Новгород, с. 665.
12. Мошков И.Е., Степанченко Н.С., Новикова Г.В. (2011) Передача этиленового сигнала: CTR1 – вопросы и ответы. VII съезд Общества физиологов растений России “Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инноваци онных биотехнологий”, Нижний Новгород, с. 487.
13. Степанченко Н.С., Новикова Г.В. Мошков И.Е. (2011) Количественное опреде ление содержания белка. Физиология растений, 58, 737-742.
14. Зорина А.А., Миронов К.С., Степанченко Н.С., Синетова М.А., Коробан Н.В., Зинченко В.В., Куприянова Е.В., Аллахвердиев С.И., Лось Д.А. (2011) Системы регуляции стрессовых ответов у цианобактерий. Физиология растений, 58, 643 663.
15. Zorina A., Stepanchenko N., Sinetova M., Panichkin V.B., Novikova G.V., Moshkov I.E., Zinchenko V.V., Shestakov S.V., Suzuki I., Murata N., Los D.A. (2011) Eu karyotic-like Ser/Thr protein kinases SpkC/F/K are involved in phosphorylation of GroES in the cyanobacterium Synechocystis. DNA Research, 18, 137-151.
16. Степанченко Н.С., Фоменков А.А., Мошков И.Е., Ракитин В.Ю., Новикова Г.В., Носов А.В. (2011) Культивируемые in vitro клетки этилен нечувствительных мутантов Aradidopsis thaliana – модель для изучения взаимо действия путей передачи сигналов фитогормонов в контроле пролиферации кле ток. Представлена в Доклады РАН.