щербо дмитрий сергеевич специальность – 03.01.03 – молекулярная биология автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук москва 2010 работа выполнена в группе флуорес ...

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

на правах рукописи

Щербо Дмитрий Сергеевич

специальность – 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в группе флуоресцентных инструментов для иммунологии и нейробиологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН (ИБХ).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Дмитрий Михайлович Чудаков

Официальные оппоненты:

Алексей Валерьевич Феофанов, доктор биологических наук, доцент, руководитель лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Сергей Владимирович Тиллиб, кандидат биологических наук, руководитель группы эпигенетических механизмов регуляции активности генов Института биологии гена РАН

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится «24» ноября 2010 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ).

Автореферат разослан «22» октября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В. А. Олейников Актуальность проблемы. Со времени открытия феномена флуоресценции зелёного белка (GFP) медузы Aequorea victoria прошло уже почти пятьдесят лет. Однако лишь в конце XX века благодаря бурному развитию технологий рекомбинантных ДНК с одной стороны и технических возможностей оптической микроскопии с другой, флуоресцентные белки нашли широкое прикладное применение в биологии. Множество исследовательских групп в течение двух последних десятилетий занято получением и описанием новых вариантов GFP подобных белков, а также разработкой методик и технологий на их основе. Из организмов, относящихся к различным таксономическим группам, выделены десятки флуоресцентных белков, на основе которых с помощью рационального дизайна созданы тысячи мутантных вариантов, оптимизированных для решения конкретных прикладных задач и обладающих теми или иными уникальными свойствами. На сегодняшний день исследователям доступны флуоресцентные белки с эмиссией почти в любой части видимого спектра. Единственным существенным пробелом остаётся дальнекрасная область, где отсутствуют белки, обладающие яркой стабильной флуоресценцией, пригодные для практического применения. Однако ткани животных наиболее эффективно пропускают свет именно в дальнекрасной и инфракрасной областях за счёт низких значений поглощения и рассеяния.

По этой причине получение ярких GFP-подобных белков с максимумами эмиссии флуоресценции более 630 нм является актуальной задачей. Получение таких белков позволит значительно повысить чувствительность методов визуализации, требующих проникновения сигнала через толщу живых тканей, например, в экспериментальной онкологии (для исследования развития опухолей, метастазирования и эффективности терапии), при изучении стволовых клеток, в биологии развития, нейрологии и многих других областях биомедицинской науки. Кроме того, получение белков, флуоресцирующих в дальнекрасной области видимого спектра, позволит расширить возможности многоцветного мечения, создать принципиально новые пары донор-акцептор для методов, основанных на безызлучательном переносе энергии (FRET), откроет новые возможности в дизайне биосенсоров.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы являлось получение новых вариантов GFP-подобных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии флуоресценции в красной, дальнекрасной и околоинфракрасной областях видимой части спектра, обладающих яркой и стабильной флуоресценцией и предназначенных для эффективной визуализации в лабораторных животных. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать максимально яркий красный флуоресцентный белок.

2. На его основе, получить флуоресцентные белки, характеризующиеся максимальным батохромным сдвигом спектра эмиссии при минимальных потерях в яркости флуоресценции.

3. На основе полученных красных и дальне-красных флуоресцентных белков, получить мономерные версии со сходными спектральными характеристиками, применимые для мечения белков слияния для визуализации в живых клетках и тканях.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате работы получен набор GFP-подобных флуоресцентных белков с эмиссией флуоресценции в диапазоне от красной до околоинфракрасной. Наряду с димерными вариантами получены мономерные аналоги, предназначенные для мечения целевых белков. Все белки охарактеризованы in vitro и протестированы на моделях in vivo от культур клеток, до лабораторных животных.

Полученные белки активно используются во многих лабораториях мира. Впервые был получен яркий и пригодный для практического применения флуоресцентный белок с максимумом эмиссии более 630 нм, а также белок с одним из самых длинноволновых максимумов эмиссии (при 670 нм). Описаны некоторые эффекты влияния аминокислотных замен в микроокружении хромофора на характеристики GFP-подобных белков:

фотостабильность, яркость, спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции.

Экспериментально подтверждено расположение некоторых аминокислотных остатков, отвечающих за олигомеризацию.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 137 ссылок. Диссертация содержит рисунков и 1 таблицу.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Ежегодном съезде Германского Общества клеточных биологов (Франкфурт-на-Майне, 2007);

Международном научно-методическом семинаре «Инновационные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008);

Ежегодном съезде Европейского молекулярно-биологического общества (Амстердам, 2009);

Конференции «Физиология 2010» (Манчестер, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть статей в международных рецензируемых журналах.

В связи с тем, что дальнекрасные флуоресцентные белки до настоящего момента не были обнаружены в природе, для получения белков со спектрами эмиссии флуоресценции смещёнными в более длинноволновую область, оптимальным предшественником является максимально яркий красный флуоресцентный белок. Получение такого белка и стало нашей первоочередной задачей.

Из морского анемона Entacmaea quadricolor (рис. 1 а) нами была клонирована кДНК красного флуоресцентного белка, названного eqFP578, с максимумами возбуждения и эмиссии флуоресценции при 552 и 578 нм, соответственно. Белок eqFP578 имеет молярный коэффициент экстинкции 102 000 М-1 см-1, квантовый выход 0,54, и суммарную яркость в 1, раза большую, чем DsRed2. Хромофорная группа ближайшего гомолога eqFP578 – белка eqFP611 (76% гомология аминокислотных последовательностей), также полученного из E. quadricolor, находится в состоянии транс-изомеризации, что является нетипичным для флуоресцентных белков. Так как хромофоробразующая триада аминоксилотных остатков (M-Y-G) и ключевые остатки микроокружения хромофора (N148, S165, H203) в белках eqFP578 и eqFP611 идентичны, можно заключить, что хромофор eqFP578 также транс изомеризован.

Белок eqFP578 дикого типа имеет относительно низкую скорость созревания хромофора при 37°C. Для решения этой проблемы мы провели несколько раундов случайного ПЦР-мутагенеза, направленных на оптимизацию созревания белка eqFP578. В ходе каждого раунда после инкубации в течение 15 часов при +37°C проводился визуальный отбор индивидуальных бактериальных клонов по яркости с использованием флуоресцентного стереомикроскопа. В результате был отобран оптимальный вариант, названный TurboRFP, с увеличенной относительно eqFP578 яркостью и значительно более быстрым созреванием.

Так как большинство природных красных флуоресцентных белков являются олигомерами, актуальным является искусственное получение их мономерных вариантов.

Для решения проблемы олигомеризации TurboRFP нами был проведён анализ структуры гомологичного белка eqFP611 и определены основные точки в составе гидрофильного интерфейса, отвечающие за димеризацию. По результатам анализа в аминокислотную последовательность белка с помощью сайт-специфичного мутагенеза нуклеотидной последовательности были введены следующие замены: R162E, Q166D, S180N, F198V, F200Y.

Для предотвращения минорной тетрамеризации TurboRFP была введена замена N126R, предотвращающая, по данным для белка eqFP611, межсубъединичные взаимодействия через гидрофобный интерфейс. Введение этих замен значительно снизило скорость созревания и яркость полученного варианта, но по данным гель-фильтрации, оказалось достаточным для нивелирования существования олигомерных форм. Для восстановления утраченных яркости и скорости созревания мы провели семь раундов случайного ПЦР мутагенеза, сохраняя при помощи праймеров ключевые для сохранения мономерности мутации (так называемый «полуслучайный» мутагенез). После каждого раунда проводился скрининг индивидуальных бактериальных клонов с отбором вариантов, как и при получении TurboRFP. Финальный вариант получил название TagRFP.

По данным электрофореза белок TurboRFP в нативных условиях существует в виде гомодимера. Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции составляют 553 и 574 нм, соответственно. Для TurboRFP характерны высокая pH-стабильность (pKa = 4,4), быстрое и полное созревание при 37°C, и высокая яркость: молярный коэффициент экстинкции составляет 92 000 M-1см-1, а квантовый выход флуоресценции 0,67 (суммарная яркость больше таковой DsRed2 в 1,7 раза). Для подтверждения отсутствия агрегации в эукариотических клетках нами были получены эукариотические экспрессионные вектора pTurboRFP-N и pTurboRFP-C. Через 5-7 дней после трансфекции клеток линии Phoenix Eco, флуоресцентный белок TurboRFP был равномерно распределён в цитоплазме, не формируя видимых агрегатов, что свидетельствует о достаточно низкой токсичности, позволяющей создавать стабильные клеточные линии и трансгенных животных экспрессирующих TurboRFP.

Молярный коэффициент экстинкции белка TagRFP составляет 100 000 M-1см-1, а квантовый выход равен 0,48 (суммарная яркость в 2,2 раза превышает таковую аналогичного мономерного красного флуоресцентного бела mCherry). TagRFP отличается высокой pH-стабильностью (pKa 4), а также быстрым и полным созреванием хромофора с отсутствием зелёной формы, что показано на спектре поглощения белка, с единственным максимумом при 556 нм (рис. 1 в). Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции TagRFP приходятся на 555 и 584 нм соответственно (рис. 1 б). По данным гель-фильтрации, TagRFP сохранил мономерную природу (рис. 1 и).

Нами был получен ряд эукариотических экспрессионных векторов, содержащих как TagRFP (pTagRFP-N, pTagRFP-C), так и слитные химерные конструкции TagRFP--актин и TagRFP--тубулин (pTagRFP--acitn и pTagRFP--tubulin), для проверки возможности использования белка в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки. Клетки линий HeLa и Phoenix Eco были трансфицированы pTagRFP-N и pTagRFP-C. В клетках линии Phoenix Eco обычно наблюдается высокий уровень экспрессии генетических конструкций, содержащих ориджин репликации SV40 с промотор CMV, поэтому они подходят для характеристики белков в условиях высоких концентраций in vivo. Появление красной яркой флуоресценции наблюдалось в клетках Phoenix Eco через 8 часов после трансфекции, а в клетках HeLa – через 12 часов. При этом, мы не наблюдали формирования видимых агрегатов даже через 5 дней после трансфекции (рис. 1 г). При экспрессии слитных химерных конструкций TagRFP--актин и TagRFP--тубулин в живых клетках мы наблюдали мечение актиновых филаментов и микротрубочек без неспецифичной локализации или агрегации (рис. 1 д-з). Чтобы показать возможность мечения органелл с помощью белка TagRFP мы получили рекомбинантную плазмиду pTagRFP-mito, содержащую а. Морской анемон Entacmaea quadricolor. б. Нормализованные спектры возбуждения (прерывистая линия) и эмиссии (непрерывная линия) TagRFP. в. Нормализованный спектр поглощения белка TagRFP. г. Клетки линии Phoenix Eco, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP-N, 5 дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. д, ж. Клетки линии 3T3, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP--tubulin, 5 дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. е. Клетки линии HeLa, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP--actin, 5 дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. з. Клетки линии HeLa, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP-mito, дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. и. Результаты гель фильтрации белков TurboGFP (димер, зелёная прерывистая линия), EGFP (мономер, зелёная непрерывная линия) и TagRFP (мономер, красная непрерывная линия).

TagRFP и последовательность нуклеотидов, кодирующую сигнал митохондриальной локализации предшественника VIII субъединицы оксидазы цитохрома C человека. В трансфицированных pTagRFP-mito клетках линии HeLa мы наблюдали специфичное мечение митохондрий и отсутствие анормальных органелл или агрегатов флуоресцентного белка даже через 3 дня после трансфекции.

Важной характеристикой флуоресцентных белков является фотостабильность флуоресценции. Мы проверили скорость фотообесцвечнивания белка TagRFP в клетках HeLa под воздействием лазерного излучения. Время полуобесцвечивания (снижения интенсивности флуоресценции на 50%) TagRFP (364 сек.) оказалось сходным с таковым ряда широко используемых флуоресцентных белков: Cerulean (287 сек.), EYFP (417 сек.), mCherry (352 сек.) и mPlum (300 сек.).

Полученные экспериментальные данные показывают, что TagRFP может быть с успехом использован для мечения индивидуальных белковых молекул, органелл и клеток.

Белки TagRFP и TurboRFP обладают яркой красной флуоресценцией по сравнению с наиболее часто используемыми аналогами, низкой токсичностью, высокой pH стабильностью.

Для разработки дальнекрасного флуоресцентного белка за основу был взят белок TurboRFP. Поиск ключевых положений аминокислотных остатков для сайт-специфичного мутагенеза был основан на данных рентгеноструктурного анализа гомологичного белка eqFP611. Так как спектральные характеристики GFP-подобных белков зависят от микроокружения хромофора, мы остановились на трёх ключевых положениях аминокислотных остатков, находящихся в непосредственной близости от хромофорной группы: N148, S165 и F181. Для создания библиотек кодирующих последовательностей мы провели сайт-специфичный ПЦР-мутагенез с использованием вырожденных по соответствующим кодонам праймеров. Таким образом, нами были получены три библиотеки кодирующих последовательностей с различными возможными комбинациями аминокислотных остатков в выбранных положениях. Первая библиотека содержала замены N148GATCS, S165GATCS, F181FLIMV (125 возможных комбинаций), вторая – замены N148FLIMV, S165GATCS, F181FLIMV (125 возможных комбинаций), третья – замены N148NKDEQHY, S165GATCS, F181FLIMV (175 возможных комбинаций). Так как любые изменения в микроокружении хромофора могут отрицательно сказаться на яркости и/или скорости созревания флуоресцентного белка, мы провели случайный ПЦР-мутагенез каждой библиотеки для последующего отбора вариантов с дополнительными заменами в окружении хромофора, которые могли бы компенсировать последствия направленного мутагенеза. Для скрининга библиотек клетки E. coli XL1 Blue были трансформированы полученными рекомбинантными плазмидами и высеяны на чашки Петри с твёрдой селективной средой. С использованием флуоресцентного стереомикроскопа Olympus SZX- с соответствующим набором светофильтров (фильтр возбуждающего света 520-620 нм, фильтр эмиссии 650LP) нами было подвергнуто скринингу около 100 000 индивидуальных клонов, при этом спектры эмиссии флуоресценции вариантов, обладавших наиболее яркой флуоресценцией, регистрировались при помощи спектрофотометра SMS2VIS, встроенного в стереомикроскоп. На этом этапе нами был найден вариант белка, обладавший максимумом эмиссии флуоресценции при 635 нм. Была определена кодирующая последовательность отобранного варианта: в положении 148 и 165 он содержал остатки серина, а в положении 181 – лейцина. Кроме того, замены H199Y и H203R были получены в ходе случайного ПЦР мутагенеза. Аминокислотный остаток в положении 203 находится в непосредственной близости от хромофорной группы, и замена остатка гистидина на остаток аргинина способна значительно влиять на спектральные свойства флуоресцентного белка.

Впоследствии мы провели ещё 4 раунда случайного ПЦР-мутагенеза для оптимизации отобранного варианта по яркости и скорости созревания при 37°C, отбирая при этом для каждого следующего раунда при помощи скрининга варианты, наиболее соответствующие искомым характеристикам. После завершения всех раундов случайного ПЦР-мутагенеза мы отобрали вариант яркого дальнекрасного флуоресцентного белка, названный Katushka.

Следующим этапом нашей работы стало получение мономерного варианта белка Katushka. Так как ранее был успешно получен мономерный вариант белка TurboRFP – TagRFP, мы взяли его за основу и с помощью сайт-специфичного ПЦР-мутагенеза внесли ряд замен аминокислотных остатков в микроокружение хромофора, аналогичных таковым белка Katushka: R69K, N148S, F181L и H203R. Этих изменений оказалось достаточно для получения мономерного белка, обладающего сходными спектральными характеристиками с белком Katushka, названного mKate.

Мы провели ряд измерений in vitro для определения основных характеристик полученных белков. По данным флуориметрии белки Katushka и mKate обладают практически идентичными спектрами возбуждения и эмиссии флуоресценции. Максимум возбуждения приходится на 588 нм, максимум эмиссии флуоресценции – на 635 нм, что приближает спектральные характеристики этих флуоресцентных белков к оптимальным для использования при визуализации в лабораторных животных (рис. 2 а, б). Для подтверждения полного созревания хромофорной группы нами были сняты спектры поглощения полученных белков, обладающие единственным узким пиком, максимум которого совпадает с максимумом возбуждения флуоресценции (рис. 2 в). Эти данные свидетельствуют об отсутствии в зрелых белках Katushka и mKate промежуточных форм существования хромофора. По данным гель-фильтрации белок mKate является мономером при нанесении в концентрациях до 10 мг/мл, что позволяет использовать его для мечения индивидуальных белковых молекул in vivo. Ещё одной важной характеристикой флуоресцентных белков является зависимость интенсивности флуоресценции от значения pH среды. Измерения pH-стабильности полученных белков показали, что Katushka обладает высокой pH-стабильностью (pKa = 5,5), в то время как mKate несколько уступает по этому показателю (pKa = 6,0) (рис. 2 г). Квантовый выход флуоресценции белка Katushka составляет 0,34, а молярный коэффициент экстинкции 65 000 M-1 см-1. Для белка mKate эти характеристики составляют 0,33 и 45 000 M-1 см-1, соответственно.

а. Спектры поглощения основных внутриклеточных абсорберов: оксигемоглобина, гемоглобина (усреднены, черная сплошная линия) и меланина (чёрная пунктирная линия), а также спектр эмиссии белка Katushka (красная линия). Данные получены из http://omlc.ogi.edu.

б. Спектры возбуждения и эмиссии флуоресцентных белков Katushka (чёрная линия) и mKate (красная линия) в. Спектры поглощения белков Katushka (чёрная линия) и mKate (красная линия).

г. pH-стабильность флуоресценции белков Katushka (чёрная линия) и mKate (красная линия).

д. Спектры эмиссии некоторых флуоресцентных белков, данные пропорционально их относительной яркости.

е. Яркости флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков в пределах оптического окна, вычисленные как определённые интегралы в пределах 650-800 нм.

После исследования основных спектральных характеристик полученных флуоресцентных белков мы сравнили их in vitro с рядом аналогов. Мы проанализировали и нормализовали по относительной яркости спектры эмиссии белков Katushka, mKate и ряда наиболее используемых красных и дальнекрасных флуоресцентных белков: mPlum, eqFP611, mRaspberry, mCherry, TurboRFP, DsRed2, DsRed-Express, AQ143 и HcRed. (рис. 2 д).

После этого мы вычислили относительные яркости флуоресценции сравниваемых белков в области оптического окна (650-800 нм) как определённые интегралы от спектров эмиссии в этих пределах. По проведённым расчетам яркость ближайшего конкурента белка Katushka – eqFP611 в этих пределах составляет около 60% от яркости Katushka (рис. 2 е). Благодаря высоким значениям квантового выхода и молярного коэффициента экстинкции яркость флуоресценции белка Katushka в 7-10 раз превышает яркость флуоресценции спектрально близких белков HcRed и mPlum.

Для тестирования полученных флуоресцентных белков на токсичность мы провели ряд трансфекций клеток линий HeLa и Phoenix Eco рекомбинантными плазмидами, содержащими последовательности нуклеотидов, кодирующие флуоресцентные белки под контролем промотора CMV. Через 5-7 дней после трансфекции в клетках, экспрессирующих кодирующие последовательности белков DsRed2 и DsRed-Express наблюдалась локализация этих белков преимущественно в комплексе Гольджи, а в клетках, экспрессирующих кодирующие последовательности белков mCherry и mRaspberry – небольшие точечные агрегаты. Формирование крупных белковых агрегатов может быть токсичным для клеток, что затрудняет использование агрегирующих белков для получения стабильно экспрессирующих клеточных линий и трансгенных животных. В то же время в клетках, экспрессирующих кодирующие последовательности белков Katushka и mKate не наблюдалось видимой их агрегации, равно как и неспецифичной локализации (рис. 3 к). При этом яркий флуоресцентный сигнал появлялся через 10-14 часов после трансфекции, что свидетельствует о быстром созревании полученных белков в клетках млекопитающих.

Для проверки возможности использования мономерного белка mKate в качестве флуоресцентной метки в химерных конструкциях с другими белками мы использовали модель визуализации -актина и -тубулина. Для этого нами были получены рекомбинантные плазмиды, содержащие химерные генетические конструкции, где последовательность mKate находилась в одной рамке считывания с кодирующей последовательностью -актина или -тубулина. В клетках линий HeLa и 3Т3, трансфицированных полученными рекомбинантными плазмидами наблюдалось специфичное мечение актиновых филаментов или микротрубочек без присутствия видимых агрегатов флуоресцентной метки или её неспецифической локализации (рис. 3 л н).

Таким образом, нами было показано отсутствие негативных эффектов при экспрессии Katushka и mKate в клетках млекопитающих, а также описана возможность использования белка mKate для флуоресцентного мечения целевых белков in vivo.

Мы провели сравнение фотостабильности белков Katushka и mKate с рядом флуоресцентных белков в клетках линии HeLa двумя методами: выжигания во флуоресцентном микроскопе с помощью ртутной лампы и в конфокальном микроскопе с использованием лазерного света высокой интенсивности. При этом результаты напрямую зависели от использованного источника света. Мы предположили, в качестве возможного объяснения, что ртутная лампа постоянно облучает светом всё поле зрения, а конфокальное сканирование подразумевает небольшое время экспозиции каждой точки сканируемой области.

Время полувыгорания белка Katushka в конфокальном микроскопе превышало время полувыгорания белков Cerulean, EYFP, mCherry и mPlum приблизительно в два раза. Под воздействием излучения ртутной лампы (светофильтр 540-580 нм, мощность 200 мВт/см2) в первые 90 сек. наблюдалось небольшое увеличение интенсивности флуоресцентного сигнала белка Katushka, далее кинетика выгорания была близка к таковой mCherry. При этом белок mKate показал сходную кинетику изменения флуоресцентного сигнала, включающую стадию увеличения сигнала, при экспериментах с использованием конфокального микроскопа, где время полувыгорания составило 1154 сек, что превышало аналогичное значение для белка mRaspberry в 3,6 раза. При воздействии излучения ртутной лампы mKate показал самую высокую фотостабильность флуоресценции среди всех исследованных мономерных флуоресцентных белков.

Завершающим этапом стала проверка возможности использования белка Katushka в экспериментах, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах. В качестве модели мы визуализировали мышечные ткани лягушки Xenopus laevis. Работа с лягушками проводилась в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН А.Г.Зарайским и коллегами. Для тканеспецифической экспрессии кодирующих последовательностей белков Katushka, DsRed-Express и mPlum мы использовали контроль фрагмента промотора кардиоактина X. laevis длиной 800 п.о., обладающий специфической активностью в скелетных мышцах и кардиомиоцитах лягушек. В трансгенных эмбрионах, экспрессирующих Katushka мы наблюдали яркую флуоресценцию в области сомитов и зачатка сердца, при этом в эмбрионах, экспрессирующих DsRed-Express флуоресцентный сигнал из области сердца практически не проникал через богатые желтком ткани, в то время как сомиты могли быть с лёгкостью визуализированы (рис. 3 а, в, д, ж). Это можно объяснить тем, что сомиты покрыты лишь тонким слоем эпидермиса, в отличие от зачатка сердца, окружённого богатыми желтком клетками, что свидетельствует о лучшем проникновении через такни более длинноволновой флуоресценции. При этом а-з. Трансгенные эмбрионы X.laevis, экспрессирующие Katushka (а-г) и DsRed-Express (д-з) под контролем промотора кардиоактина. Фотографии в белом свете (а, б и д, е) и флуоресцентные изображения (родаминовый фильтр, в, г и ж, з) передней части трансгенных эмбрионов с левой стороны (а, в, д, ж) и поперечного сечения (б, г, е, з) в плоскостях, показанных пунктиром (направление указано стрелками).

и. Фотография в белом свете (верхняя) и флуоресцентное изображение (нижнее) 2,5-месячных лягушек, экспрессирующих DsRed-Express (слева) и Katushka (справа).

Работа с лягушками выполнена в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН.

к. Клетки линии Phoenix Eco, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pmKate-N, пять дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

л. Клетки линии HeLa, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pmKate--actin. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

м, н. Клетки линии 3T3, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pmKate--tubuilin. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

флуоресценция в дальнекрасной области спектра белка mPlum, обладающего в ~10 раз менее яркой флуоресценцией, чем Katushka, также практически не проникала через ткани зародыша, что говорит о важности для такого проникновения не только длины волны, но и интенсивности флуоресценции. Впоследствии было проведено поперечное рассечение эмбрионов в области сердца. При исследовании среза яркая флуоресценция в области сердечного зачатка наблюдалась у эмбрионов, экспрессирующих как Katushka, так и DsRed Express (рис. 3 б, г, е, з). Кроме того, в лягушках, достигших возраста 2,5 месяца белок Katushka удавалось визуализировать через всё тело, в то время как сигнал DsRed-Express слабо проникал через ткани (рис. 3 и).

Таким образом, нами были показаны преимущества белка Katushka для визуализации объектов в многоклеточных организмах в сравнении с белками DsRed-Express и mPlum.

Для объяснения сложной кинетики процесса фотообесцвечивания белка mKate, включающей фазу усиления флуоресцентного сигнала, а также относительно невысокой pH стабильности флуоресценции этого белка нашими коллегами из Лаборатории кристаллографии макромолекул Национального института онкологии США были получены данные кристаллографии mKate. Был проведён рентгеноструктурный анализ кристаллов mKate, полученных при трёх значениях pH: 2,0, 4,2 и 7,0. Было установлено, что в mKate наблюдается pH-зависимая цис-транс изомеризация хромофорной группы. При pH 2,0 90% хромофорных групп находятся в нефлуоресцентном транс- положении. Наиболее яркая флуоресценция mKate наблюдается при значении pH 7,0;

в этом случае наблюдается наличие лишь 10% транс- изомеров. При pH 4,2 количество транс- и цис- форм составляет ~70% и ~30% соответственно. Незначительная фотоактивация при облучении зелёным светом также может объясняться фотоиндуцируемой цис-транс изомеризацией хромофора.

На основании этих данных мы предположили, что стабилизация хромофорной группы во флуоресцентном цис- положении за счёт изменения микроокружения позволит значительно повысить яркость и pH-стабильность флуоресценции mKate. Из данных рентгеноструктурного анализа можно заключить, что остаток серина в положении стабилизирует транс- конформацию хромофора, как это происходит в eqFP611 и хромобелках, в то время как остаток серина в положении 148 стабилизирует цис конформацию, по аналогии с большинством красных флуоресцентных белков, включая DsRed.

Для дестабилизации транс-изомера хромофора mKate и смещения равновесия в сторону преимущественного существования флуоресцентной цис-формы мы получили с помощью сайт-специфичного ПЦР-мутагенеза библиотеку последовательностей mKate, содержащую варианты с кодонами всех двадцати возможных аминокислот в положении 165. На основе библиотеки были получены бактериальные экспрессионные конструкции.

После трансформации компетентных клеток последние были помещены на твёрдую селективную среду с ампициллином и инкубировались в течение 12-15 часов при +37°C. В результате скрининга индивидуальных клонов по яркости был отобран наиболее яркий вариант, содержащий замену аминокислотного остатка S165A. Этот результат согласуется с выдвинутым нами предположением, так как в отличие от гидрофильного полярного остатка серина гидрофобный неполярный остаток аланина не способен принимать участие в комплексе водородных взаимодействий, стабилизирующих хромофорную группу mKate в транс-конформации. Изменение соотношения конформеров в пользу флуоресцентной цис формы должно при этом приводить к увеличению яркости при кислых и физиологических значениях pH. Для улучшения скорости созревания полученного варианта mKate мы провели два раунда случайного ПЦР-мутагенеза, сопровождавшихся отбором наиболее ярких и быстро созревающих белков. Вариант, наиболее соответствовавший искомым характеристикам, содержал дополнительные аминокислотные замены V48A и K238R и получил название mKate2. Эти замены значительно ускоряют созревание белка при +37°C, что показано в Escherichia coli, при этом аргинин в положении 238 содержится также в белке eqFP578.

После получения mKate2 мы решили проверить влияние замены S165A на характеристики белка Katushka. Как и ожидалось, введение с помощью сайт-специфичного мутагенеза соответствующих нуклеотидных замен в кодирующую последовательность Katushka увеличило яркость белка на ~20%. Чтобы получить вариант, пригодный для мечения индивидуальных белковых молекул мы решили создать тандем, состоящий из двух субъединиц димерного белка, ковалентно связанных полипептидным GS-богатым линкером. Полученная псевдомономерная метка была названа tdKatushka2.

Спектральные характеристики белка mKate2 (максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции при 588 и 633 нм соответственно) сходны с таковыми белка mKate. Яркость флуоресценции mKate2 составляет 74% от яркости EGFP, что в 10 раз больше яркости белка mPlum. По сравнению с mKate молярный коэффициент экстинкции увеличен в ~2 раза (и составляет 62 500 М-1см-1), а квантовый выход флуоресценции в ~1,4 раза (и составляет 0,4).

Удельная яркость tdKatushka2 на молекулу больше таковой EGFP в 1,46 раза (молярный коэффициент экстинкции tdKatushka2 равен 2 x 66 250 М-1см-1, а квантовый выход 0,37).

Созревание хромофорной группы протекает быстро и полно. Время полусозревания mKate – менее 20 минут, при 40 минутах для mCherry, 75 минутах для mKate и 100 минутах для TagRFP. На спектре поглощения mKate2 выделяется единственный пик, соответствующий красной форме хромофора (совпадающий по форме со спектром возбуждения флуоресценции) (рис. 4 а). Сохранение мономерности при получении mKate2 было подтверждено при помощи гель-фильтрации.

Как и ожидалось, mKate2 обладает значительно лучшей pH-стабильностью флуоресценции по сравнению с mKate (pKa mKate = 6,2;

pKa mKate2 = 5,4) (рис. 4 б), что даёт mKate2 преимущество при использовании в качестве метки как в кислой среде (лизосомы, поздние эндосомы), так и при физиологических значениях pH. pKa для белка tdKatushka также равна 5,4. Для определения фотостабильности флуоресценции белков mKate2 и tdKatushka2 и сравнения её с наиболее известными аналогами (mKate, mCherry, mRaspberry и mPlum) использовались химерные конструкции флуоресцентных белков с гистоном H2B, синтезируемые в клетках HeLa. Фотостабильность определялась как при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа (рис. 4 г), оборудованного лазерами с длинами волн 488 нм и 543 нм, так и с использованием флуоресцентного микроскопа (рис. 4 д). Белок mKate2 оказался фотостабильнее, чем mKate, mRaspberry и mPlum в обоих случаях. Кроме того, как и предполагалось, мы не наблюдали стадии фотоактивации, характерной для mKate. Таким образом, можно заключить, что хромофор белка mKate2 благодаря аминокислотной замене S165A стабилизируется, в основном, во флуоресцентной цис конформации.

а. Нормализованные спектры поглощения (чёрная линия), возбуждения (прерывистая красная линия), эмиссии флуоресценции (непрерывная красная линия) белка mKate2.

б. pH-стабильность флуоресценции белков mKate (чёрная линия) и mKate2 (красная линия).

в. Спектры эмиссии сравниваемых флуоресцентных белков, данные пропорционально их относительной яркости.

г. Фотостабильность флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе.

д. Фотостабильность флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков во флуоресцентном микроскопе.

Чтобы охарактеризовать белки mKate2 и tdKatushka2 in vivo в эукариотических клетках мы получили рекомбинантные генетические конструкции, содержащие кодирующие последовательности этих белков (mKate2-N и tdKatushka2-N) и провели ряд трансфекций клеток линий HeLa и Phoenix Eco. При микроскопии трансфицированных клеток мы наблюдали равномерную цитоплазматическую и ядерную локализацию яркого флуоресцентного сигнала при отсутствии видимых агрегатов или неспецифичной локализации через 4 дня после трансфекции. Эти данные говорят о низкой токсичности полученных белков и о принципиальной возможности их использования в стабильно трансфицированных клеточных линиях. Следующим этапом нашей работы стала проверка белков mKate2 и tdKatushka2 в качестве генетически кодируемых меток для индивидуальных белковых молекул. Мы получили 20 слитных химерных конструкций, содержащих кодирующие последовательности mKate2 и tdKatushka2 и различных клеточных белков, а также сигналов внутриклеточной локализации. Для большинства слитных белков наблюдалась правильная локализация и функциональность. Например, Изображения клеток, трансфицированных рекомбинантными генетическими конструкциями, кодирующими следующие слитные белки: А-а – mKate2--актин;

А-б – mKate2-эпитоп-RhoB-GTPазы (локализация в эндосомах);

А-в – mKate2-ламин;

А-г – mKate2-клатрин (лёгкая цепь);

А-д – mKate2-PTS (сигнал пероксисомальной локализации);

А-е – mKate2-c-Ha-Ras (мембранная локализация);

А-ж – mKate2--тубулин;

А-з – mKate2-VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein);

А-и – mKate2-аннексин-А4;

А-к – mKate2 паксиллин-12;

А-л – mKate2--актинин;

А-м – mKate2-виментин;

А-н – mKate2-Golgi (81 N-концевой аминокислотный остаток -1,4-галактозилтрансферазы, локализация в комплексе Гольджи);

А-о – mKate2 EB3 (белок семейства RP/EB, ассоциированный с микротрубочками);

А-п – mKate2-цитокератин;

А-р – mKate2-зиксин;

А-с – mKate2-коннексин-43;

А-т – mKate2-H2B;

А-у – mKate2-субъединица-VIII-цитохром-c оксидазы (митохондриальная локализация);

А-ф – mKate2-лизосомальный-мембранный-гликопротеин (лизосомальная локализация);

Б-а – tdKatushka2-клатрин (лёгкая цепь);

Б-б – tdKatushka2--актин;

Б-в – tdKatushka2-VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein);

Б-г – tdKatushka2-c-Ha-Ras (мембранная локализация);

Б-д – tdKatushka2-фибрилларин;

Б-е – tdKatushka2-PTS (сигнал пероксисомальной локализации);

Б-ж – tdKatushka2-Golgi (81 N-концевой аминокислотный остаток -1,4 галактозилтрансферазы, локализация в комплексе Гольджи);

Б-з – tdKatushka2-зиксин;

Б-и – tdKatushka2-2 коннексин;

Б-к – tdKatushka2-лизосомальный-мембранный-гликопротеин (лизосомальная локализация);

Б-л – tdKatushka2-кадгерин;

Б-м – tdKatushka2-VSVG (гликопротеин вируса визикулярного стоматита, мембранная локализация);

Б-н – tdKatushka2-ламин;

Б-о – tdKatushka2-EB3 (белок семейства RP/EB, ассоциированный с микротрубочками);

Б-п – tdKatushka2-паксиллин. Клетки линии HeLa на всех изображениях, кроме А-а, А-ж, А-о, Б-о, где использованы клетки FoLu. Флуоресцентная микроскопия.

слитный белок mKate2-аннексин-IV при воздействии иономицина на клетку перемещался, как и ожидалось, из цитоплазмы на ядерную и клеточную мембраны.

Чтобы проверить возможность использования mKate2 для визуализации объектов в многоклеточных организмах мы поместили кодирующую последовательность mKate2 под контроль фрагмента промотора Xanf1 X.laevis. Полученные рекомбинантные плазмиды экспрессировались в трансгенных X.laevis (работа с лягушками была выполнена в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН). Как и ожидалось, мы наблюдали яркий флуоресцентный сигнал в передней части головы, включая глаза и назальные плакоды. Для сравнения яркости и скорости созревания mKate и mKate2 при использовании для визуализации в лабораторных животных мы провели микроинъекции конструкций mKate-N и mKate2-N в эмбрионы X.laevis на стадии двух бластомеров. При этом яркость флуоресцентного сигнала mKate2 оказалась значительно выше. В качестве модели мечения индивидуальных белковых молекул в целом организме мы использовали X.laevis, экспрессирующие рекомбинантные генетические конструкции, кодирующие слитный химерный белок mKate-2-зиксин. При этом, несмотря на высокий уровень экспрессии обеспечиваемый промотором CMV, мы не наблюдали проявлений токсичности слитного белка: головастики выглядели здоровыми и выживаемость была сопоставима с контрольными головастиками, экспрессирующими EGFP. Эти результаты свидетельствуют о низкой токсичности mKate2 для живых организмов.

После того, как нами был получен и охарактеризован набор ярких дальнекрасных GFP-подобных белков, следующей задачей стало дальнейшее смещение спектров эмиссии флуоресценции вариантов GFP-подобных белков в более длинноволновую (околоинфракрасную) область спектра. Флуоресцентный сигнал белков с максимумами эмиссии при длинах волн больших 640 нм должен ещё более эффективно проникать через живые ткани. Кроме того, так как в экспериментах, связанных с визуализацией в лабораторных животных, обычно требуются высокие концентрации репортера, критичной является низкая цитотоксичность метки. Хотя, по имеющимся у нас данным, токсичность белка Katushka достаточно низка даже при высоких концентрациях для создания стабильных линий Xenopus laevis и Danio rerio мы поставили перед собой задачу получить варианты с ещё более низкой токсичностью.

В недавней работе Стрэка и соавт. была предложена методика отбора нетоксичных вариантов флуоресцентных белков, основанная на бактериальной экспрессионной системе.

Мы использовали описанный метод для поиска наименее цитотоксичных вариантов белка Katushka среди его предшественников, полученных ранее. По результатам скрининга был отобран вариант Katushka-9-5, обладавший практически идентичными спектральными характеристиками, но проявлявший значительно более низкую токсичность, оказывая в высокой концентрации наименьшее влияние на рост бактерий. В то же время, ни Katushka 9-5, ни Katushka не проявляли видимой цитотоксичности в живых клетках линии HeLa. Для окончательного сравнения токсичности in vivo мы провели микроинъекции рекомбинантных плазмид, содержащих кодирующие последовательности Katushka-9-5 и Katushka в эмбрионы Xenopus laevis на стадии двух клеток (работа с лягушками была выполнена в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН). Суммарно было проведено 600 микроинъекций в пяти независимых экспериментах, при этом учитывалось количество эмбрионов, доживших до стадий 25 и 42. По результатам экспериментов в X.laevis наименее токсичным оказался вариант Katushka-9-5 (рис. 6 а) и именно он был отобран для дальнейшего смещения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции в более длинноволновую область спектра.

На основании анализа трёхмерной структуры mKate, в высокой степени гомологичной структуре Katushka, мы выбрали ряд положений аминокислотных остатков, потенциально способных влиять на спектральные характеристики белка: M14, L16, M44, T62, Y121, S148, S165, M167, R203 и L205 и провели сайт-специфичный мутагенез соответствующих кодонов.

Полученные библиотеки содержали по несколько вариантов аминокислотных замен в этих ключевых положениях в различных комбинациях и подвергались впоследствии случайному ПЦР-мутагенезу. Суммарно скринингу во флуоресцентном бинокуляре подверглось более миллиона индивидуальных клонов и в результате было отобрано два варианта, наиболее соответствующих искомым характеристикам. Белки, обладавшие максимумами эмиссии флуоресценции при 650 и 670 нм (рис. 6 б), получили названия eqFP650 и eqFP соответственно. Определение кодирующих последовательностей белков показало, что eqFP650 содержал аминокислотные замены N24G и M44A, а eqFP670 – замены M14T, N24G, M44C, S148N и S165N. Следует отметить, что остаток метионина в положении 44 также заменён на остаток небольшого размера в двух недавно опубликованных дальнекрасных флуоресцентных белках: mNeptune, полученном Рождером Тьеном и коллегами на основе mKate и E2-Crimson, полученном Бенджамином Гликом и коллегами на основе DsRed Express2. Образующаяся в результате такой замены полость занята молекулой воды, формирующей водородную связь с ацилиминным кислородом хромофорной группы. Таким образом, вполне вероятно, что введение небольшого аминокислотного остатка в положении 44 является универсальным способом смещения спектра эмиссии флуоресценции в более длинноволновую область спектра для всех белков, несущих DsRed-подобный хромофор.

eqFP650, обладая высокой яркостью, характеризуется значительным батохромным сдвигом эмиссии флуоресценции: максимум возбуждения флуоресценции приходится на 592 нм (при 588 нм у Katushka), а максимум эмиссии – на 650 нм (при 635 нм у Katushka). На сегодняшний день eqFP650 обладает самой высокой яркостью среди всех флуоресцентных белков с максимумами эмиссии более 635 нм. Квантовый выход eqFP650 составляет 0,24, а молярный коэффициент экстинкции равен 65 000 М-1 см-1. eqFP670 обладает не столь высокой яркостью (квантовый выход – 0,06, молярный коэффициент экстинкции – 70 000 М-1 см-1), однако для него характерен значительно больший батохромный сдвиг как спектра эмиссии так и спектра возбуждения флуоресценции: максимумы при 670 нм и нм соответственно. Максимумом эмиссии при 670 нм к настоящему времени среди всех флуоресцентных белков обладает только eqFP670, что делает его первым в мире GFP подобным белком со столь значительно смещённым в длинноволновую область спектром эмиссии флуоресценции. Флуоресценция eqFP670 эффективно возбуждается широко распространёнными лазерами с длинами волн 633 или 635 нм.

Отсутствие промежуточных форм существования хромофоров после созревания белков eqFP650 и eqFP670 подтверждается наличием единственного узкого пика на спектре поглощения каждого из них (рис. 6 в). eqFP670 обладает высокой pH-стабильностью (pKa eqFP670 = 4,5, pKa eqFP650 = 5,7) и крайне высокой фотостабильностью флуоресценции (рис. 6 г, д), что важно при проведении длительных экспериментов с продолжительным облучением и накоплением флуоресцентного сигнала. Такая неординарная фотостабильность (равно как и высокая pH-стабильность) может объясняться уникальной комбинацией аминокислотных остатков 148N и 165N, ранее не встречавшаяся во а. Сравнение цитотоксичности Katushka-9-5 (оранжевые столбцы) и Katushka (красные столбцы) в эмбрионах Xenopus laevis. Показано количество эмбрионов, доживших до стадий 25 и 42, соответственно. б.

Нормализованные спектры возбуждения (пунктирные линии) и эмиссии (непрерывные линии) флуоресценции белков epFP650 (красные линии) и eqFP670 (чёрные линии). в. Нормализованные спектры поглощения белков eqFP650 (красная линия) и eqFP670 (чёрная линия). г, д. Нормализованные кривые фотообесцвечивания сравниваемых белков – eqFP650 (красная линия), eqFP670 (чёрная линия), mNeptune (оранжевая линия), E2-Crimson (тёмно-красная линия) – во флуоресцентном (г) и конфокальном (д) микроскопах.

флуоресцентных белках. Возможно, два остатка аспарагина в этих положениях способствуют плотной упаковке хромофорной группы, не оставляя полостей вокруг, что способствует изоляции хромофора от внешних воздействий.

eqFP650 и eqFP670 характеризуются высокой скоростью созревания при 37°C в Escherichia coli: яркие флуоресцентные сигналы наблюдаются после 12 часов инкубации. По сравнению с Katushka-9-5 белки eqFP650 и eqFP670 отличаются одной аминокислотной заменой на наружной поверхности белка (N24G), характерной для avGFP и E2-Crimson. Эта замена не должна оказывать влияния на цитотоксичность полученных белков, что подтверждено тестами в бактериях, показавшими, что токсичность epFP650, eqFP670 и Katushka-9-5 одинакова. В эукариотических клетках линии HeLa через 14 часов после трансфекции мы наблюдали высокий уровень сигнала eqFP650, сигнал eqFP670 также можно было детектировать. В клетках линии HEK-293T, отличающихся более высоким уровнем экспрессии последовательностей под контролем промотора CMV, сигналы обоих полученных белков были высоки через 14 часов после трансфекции, при этом eqFP650 и eqFP670 были равномерно распределены по эукариотическим клеткам, видимые агрегаты отсутствовали. Следующим этапом нашей работы стало определение эффективности белков а. Изображения в отражённом свете (возбуждение 605/30 нм, эмиссия 660/20 нм) мышей после внутримышечных микроинъекций клеток линии HEK-293T, продуцирующих белки E2-Crimson, mNeptune и eqFP650. б, в. Интенсивность флуоресцентного сигнала инъецированных клеток, регистрируемого с помощью наборов заграждающих фильтров (длина волны отложена по оси абсцисс) при использовании фильтров возбуждающего света 570/30 (б) и 605/30 (в). Значения были нормализованы на интенсивность сигнала светлячковой люциферазы. Эксперименты на мышах были проведены в Мичиганском университете, США, на оборудовании IVIS Spectrum system (Caliper).

eqFP650 и eqFP670 при визуализации объектов в целых организмах. Для этого клетки линии HEK-293T, трансфицированные рекомбинантными генетическими конструкциями, обеспечивающими экспрессию кодирующих последовательностей Katushka, eqFP650, eqFP670, mNeptune и E2-Crimson в эукариотических клетках, были внутримышечно инъецированы в ягодицу мыши. Для нормализации эффективности трансфекции и общего числа введённых клеток, последние были также котрансфицированы рекомбинантными генетическими конструкциями, несущими кодирующую последовательность светлячковой люциферазы. Изображения мышей, показанные на рисунке 7 а, были получены с использованием фильтра возбуждающего света 605/30 нм и фильтра эмиссии 660/20 нм, при этом eqFP650 обладал наиболее интенсивным флуоресцентным сигналом.

Количественные данные, полученные при детекции с помощью фильтров возбуждающего света 570/30 нм и 605/30 нм также выявили более высокие уровни сигналов в случае eqFP650 (рис. 7 б, в).

В результате проделанной работы нами был получен и охарактеризован набор из восьми флуоресцентных белков, флуоресцирующих в красной, дальнекрасной и околоинфракрасной областях спектра, с максимумами эмиссии флуоресценции в диапазоне от 570 до 670 нм. Все флуоресцентные белки, полученные в ходе данной работы являются мутантными вариантами белка eqFP578 дикого типа из морского анемона Entacmaea quadricolor. Выравнивание аминокислотных последовательностей приведено на рисунке 8.

Флуоресцентные белки были оптимизированы для решения определённых экспериментальных задач;

проверки в модельных системах показали высокую эффективность полученных белков по сравнению с существующими аналогами. Многие из разработанных белков обладают уникальными характеристиками. Katushka2 – наиболее яркий белок среди всех GFP-подобных белков с максимумами эмиссии более 620 нм.

eqFP670 имеет наиболее длинноволновый максимум эмиссии флуоресценции среди всех флуоресцентных белков, известных на сегодняшний день, кроме того, для него характерна крайне высокая фотостабильность флуоресценции. Сочетание низкой токсичности, эмиссии в околоинфракрасной области спектра и высокой яркости делает белок eqFP предпочтительным для экспериментов, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах. Белки TurboRFP и TagRFP отличаются высокой яркостью в красном диапазоне. Мономерные флуоресцентные белки TagRFP, mKate и mKate2, а также псевдомономерная метка tdKatushka2 должны стать как подходящим дополнением для многоцветного мечения белков, так и основой для разработки различных биосенсоров, в том числе, основанных на FRET.

10 20 30 40 50 60 | | | | | | | avGFP MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTG-KLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMK DsRed MRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIP eqFP578 MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGERKPYEGTQTMKIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKTFINHTQGIP TurboRFP MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMKIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKAFINHTQGIP Katushka MSVLITENMHMKLYMEGTVNDHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMKIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKTFINHTQGIP eqFP650 MGEDSELISENMHMKLYMEGTVNGHHFKCTSEGEGKPYEGTQTAKIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKTFINHTQGIP eqFP670 MGEDSELISENMHTKLYMEGTVNGHHFKCTSEGEGKPYEGTQTCKIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKTFINHTQGIP TagRFP MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIP mKate MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKTFINHTQGIP mKate2 MVSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKAVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKTFINHTQGIP 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | avGFP QHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKN DsRed --DYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTM-GWEASTERLYPR--DG eqFP578 --DLFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSLQNGCIIYNVKINGVNFPSNGSVMQKKTL-GWEANTEMLYPA--DG TurboRFP --DFFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSFQNGCIIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTR-GWEANTEMLYPA--DG Katushka --DFFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSLQNGCLIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEASTEMLYPA--DS eqFP650 --DFFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSLQNGCLIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEASTEMLYPA--DS eqFP670 --DFFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSLQNGCLIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEANTEMLYPA--DS TagRFP --DFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEANTEMLYPA--DG mKate --DFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEASTEMLYPA--DG mKate2 --DFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEASTETLYPA--DG 160 170 180 190 200 210 220 | | | | | | | | avGFP GIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGD-GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK DsRed VLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKP---VQLPGYYYVDSKLDITSH-NEDYTIVEQYERTEGRHHLFL eqFP578 GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVDHRLERIKE-ADKETYVEQHEMAVAKYCDLPSKLGHR TurboRFP GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVDHRLERIKE-ADKETYVEQHEMAVAKYCDLPSKLGHR Katushka GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVDRRLERIKE-ADKETYVEQHEMAVARYCDLPSKLGHS eqFP650 GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVDRKLERIKE-ADKETYVEQHEMAVARYCDLPSKLGHS eqFP670 GLRGHNQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVDRKLERIKE-ADKETYVEQHEMAVARYCDLPSKLGHS TagRFP GLEGRSDMALKLVGGGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKE-ADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHK mKate GLEGRSDMALKLVGGGHLICNLKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDRRLERIKE-ADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHK mKate2 GLEGRADMALKLVGGGHLICNLKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDRRLERIKE-ADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHR Хромофоробразующие триады аминокислотных остатков подчёркнуты. Отмечены замены аминокислотных остатков относительно белка eqFP578: тёмно-красным фоном выделены замены, приводящие к батохромоному сдвигу спектра эмиссии флуоресценции;

синим фоном выделены замены, приводящие к разрушению межсубъединичных взаимодействий в молекуле белка;

ярко-красным фоном выделена замена 165A, ключевая для увеличения яркости mKate2, зелёным фоном выделены замены, отличающие Katushka 9-5 от Katushka, т.е. приводящие к снижению токсичности;

серым фоном отмечены прочие замены, приводящие к ускорению фолдинга белка или замены, эффект которых точно не определён.

На рисунке дана зависимость яркости флуоресценции полученных белков от длины волны максимумов эмиссии. Чёрными стрелками показана последовательность работы (для каждого этапа приведены основные введённые аминокислотные замены). Димерные белки изображены двумя кругами, мономерные – одним кругом.

1. Получен и охарактеризован яркий красный флуоресцентный белок TurboRFP, а также его мономерная версия – TagRFP;

показана применимость TagRFP для мечения исследуемых белков в живых клетках.

2. Установлено положение основных аминокислотных остатков (126, 162, 166, 180, 198, 200), отвечающих за димеризацию флуоресцентного белка eqFP578.

3. Установлено положение ряда аминокислотных остатков (14, 44, 69, 148, 165, 181, 203), влияющих на смещение спектра эмиссии флуоресцентного белка eqFP578 в длинноволновую часть спектра.

4. Получен и охарактеризован первый яркий дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka, а также его мономерная версия – mKate. Для мечения целевых белков получены улучшенные версии – mKate2 и тандем tdKatushka2. Показана их эффективность при визуализации в лягушках Xenopus laevis.

5. Получены околоинфракрасные низкотоксичные флуоресцентные белки eqFP650 и eqFP670. Показано, что белок eqFP650 является на сегодняшний момент предпочтительным маркером для визуализации в толще живых тканей в лабораторных животных.

1. E. M. Merzlyak, J. Goedhart, D. Shcherbo, M. E. Bulina, A. S. Shcheglov, A. F. Fradkov, A.

Gaintzeva, K. A. Lukyanov, S. Lukyanov, T. W. Gadella and D. M. Chudakov. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat Methods, 2007. 4(7): p. 555-7.

2. D. Shcherbo, E. M. Merzlyak, T. V. Chepurnykh, A. F. Fradkov, G. V. Ermakova, E. A. Solovieva, K.

A. Lukyanov, E. A. Bogdanova, A. G. Zaraisky, S. Lukyanov and D. M. Chudakov. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods, 2007. 4(9): p. 741-6.

3. S. Pletnev, D. Shcherbo, D. Chudakov, N. Pletneva, E. Merzlyak, A. Wlodawer, Z. Dauter and V.

Pletnev. A crystallographic study of bright far-red fluorescent protein mKate reveals pH-induced cis-trans isomerization of the chromophore. J Biol Chem, 2008. 283(43): p. 28980-7.

4. D. Shcherbo, E. A. Souslova, J. Goedhart, T. V. Chepurnykh, A. Gaintzeva, I.I. Shemyakina, T. W.

Gadella, Lukyanov S. and D. M. Chudakov. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol, 2009. 9(1): 24.

5. D. Shcherbo, C. S. Murphy, G. V. Ermakova, E. A. Solovieva, T. V. Chepurnykh, A. S. Shcheglov, V.

V. Verkhusha, V. Z. Pletnev, K. L. Hazelwood, P. M. Roche, S. Lukyanov, A. G. Zaraisky, M. W.

Davidson and D. M. Chudakov. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.

Biochem J, 2009. 418(3): p. 567-74.

6. D. Shcherbo, I.I. Shemiakina, A. V. Ryabova, K. E. Luker, B. T. Schmidt, E. A. Souslova, T. V.

Gorodnicheva, L. Strukova, K. M. Shidlovskiy, O. V. Britanova, A. G. Zaraisky, K. A. Lukyanov, V. B.

Loschenov, G. D. Luker and D. M. Chudakov. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods, 2010. 7(10): 827-9.

\ 1. D. Shcherbo, E. M. Merzlyak. Super-bright monomeric and far-red fluorescent proteins. Annual Meeting of the German Society for Cell Biology. Frankfurt, Germany, 2007.

2. Е.А. Souslova, D.S. Shcherbo, V.V. Belousov, K.A. Lukyanov, V.V. Verkhusha, D.M. Chudakov.

Novel fluorescent proteins and instruments on their base. International scientific-methodical seminar “Innovative methods of microscopy in research of living systems”. Saint-Petersburg State University, Saint-Petersburg, Russia, 2008.

3. D.S. Shcherbo, M.W. Davidson, D.M. Chudakov. Far-red fluorescent tags for protein labeling. The EMBO Meeting 2009, Amsterdam, The Netherlands, 2009.

4. E.A. Souslova, D.S. Shcherbo, I.I. Shemiakina, K.A. Lukyanov, D.M. Chudakov. Novel far-red and near infra-red fluorescent proteins. Physiology 2010 Meeting. Manchester, UK, 2010.