Создание иммуногена на основе белка p17 вич-1 субтипа а

На правах рукописи

Аль-Шехадат

Руслан Исмаилович

СОЗДАНИЕ ИММУНОГЕНА НА ОСНОВЕ

БЕЛКА p17 ВИЧ-1 СУБТИПА А

03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011 2

Работа выполнена в ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России и Санкт-Петербургском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Козлов Андрей Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич, заведующий лабораторией, Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович заведующий лабораторией, Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Минздравсоцразвития России Ведущее учреждение: НИИ Гриппа Минздравсоцразвития России

Защита состоится «» _ 2012 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «» _ 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук. Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирус иммунодефицита человека первого типа является возбудителем опасного инфекционного заболевания – синдрома приобретенного иммунодефицита. В XXI веке распространение этого заболевания имеет характер пандемии. Уже с первых дней глобальной пандемии затрачиваются большие усилия для контроля прогрессирующего, вирус-индуцированного разрушения иммунной системы организма пациентов со СПИДом. Единственным доступным на сегодняшний день видом лечения является высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ). Однако, несмотря на то, что ВААРТ является триумфом современной медицины, его эффективность ограничивается высокой стоимостью, многочисленными побочными эффектами, необходимостью пожизненного применения без перерывов и, что главное, не полным восстановлением иммунной системы (Llibre et al., 2009). Дисфункция иммунной системы у пациентов, прошедших ВААРТ, ассоциирована с повышенным риском развития оппортунистических инфекционных заболеваний, раковых заболеваний, заболеваний почек и печени, ранним старением (Deeks and Phillips, 2009).

В настоящее время, когда число людей, инфицированных ВИЧ-1, в мире превысило 39 миллионов, остро необходимы новые, эффективные, нетоксические терапевтические подходы для борьбы с заболеванием.

Терапевтические вакцины против ВИЧ-1 представляют многообещающую стратегию, способную эффективно дополнить применяемые сейчас антиретровирусные препараты. Предполагается, что использование в качестве антигенов белков ВИЧ-1, отвечающих за иммуносупрессию и развитие СПИДа, даже у пациентов, прошедших ВААРТ, приведет к восстановлению нормального функционирования защитных систем организма. При этом присутствие на данных антигенах эпитопов для нейтрализующих/ингибирующих антител дополнительно уменьшит горизонтальную и вертикальную передачу вируса за счет выработки антител на слизистых оболочках. Все это уменьшит ВИЧ-1 ассоциированный вред, наносимый иммунной системе, и позволит обеспечить длительные перерывы между курсами ВААРТ.

Исследования последних лет показали, что матриксный белок p17 ВИЧ- является ключевым фактором иммунопатогенеза СПИДа, играющим важнейшую роль во всех этапах развития вируса и прогрессии заболевания.

Взаимодействие матриксного белка со своим рецептором-сиротой, экспрессирующимся практически на всех клетках иммунной системы, приводит к дерегуляции иммунной системы человека и созданию воспалительного микроокружения клеток, благоприятствующего размножение ВИЧ-1.

Связывание моноклональных антител против некоторых эпитопов белка p с поверхностью ВИЧ-1 инфицированных клеток приводит к уменьшению инфекционности вируса, то есть к уменьшению продуцирования вирусных частиц инфицированными клетками. Кроме этого, антитела к некоторым эпитопам матриксного белка обладают прямой вирус-нейтрализующей активностью, ингибируя инфицирование чувствительных клеточных линий после взаимодействия с вирионами.

Клинические исследования показали, что наличие высокого уровня антител к белку р17 коррелирует с медленным развитием СПИДа и, наоборот, уровень антител к р17 сильно падает при переходе от беcсимптомного течения инфекции к СПИДу.

Из вышеизложенного, следует, что выработка антител на белок p17 и его функционально значимые мотивы может уменьшить негативное влияние ВИЧ 1 на иммунную систему, способствовать восстановлению нормального функционирования защитных систем организма и уменьшить горизонтальную и вертикальную передачу вируса за счет выработки антител на слизистых оболочках.

Цель работы заключается в получении, очистке и изучении биохимических и иммунологических свойств белка р17 российского изолята ВИЧ-1 субтипа А и создании на его основе препарата иммуногена с перспективой его последующего использования в составе вакцины против ВИЧ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать штамм-продуцент белка p17 ВИЧ-1 субтипа А с высоким уровнем его экспрессии.

2. Разработать метод очистки рекомбинантного белка p17 из клеточных лизатов.

3. Исследовать биохимические и иммунологические свойства рекомбинантного белка p17.

4. Изучить системный и местный иммунный ответ на созданный иммуноген.

Научная новизна работы. Впервые создан штамм E. coli суперпродуцент рекомбинантного белка p17 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята и проведено детальное изучение биохимических и иммунологических свойств белка, полученного в прокариотической системе экспрессии. Обнаружено, что использование GC-богатого модифицированного гена p17 приводит к 40% увеличению его экспрессии в клетках E. coli по сравнению с нативным геном.

Показано, что данный эффект ассоциирован с увеличением термодинамической стабильности целевой мРНК и с повышением ее относительного содержания в клетках E.coli. Разработан эффективный способ одностадийной очистки рекомбинантного белка p17 из клеточного лизата с выходом 38 мг/л.

Впервые показано, что использование интерлейкина-1 в качестве адъюванта при подкожной иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным белком p17 приводит к достоверному увеличению титра специфических антител класса G к слабоиммуногенным, функционально значимым эпитопам белка p1710-30 и р1730-52. Обнаружено, что интраназальная иммунизация рекомбинантным белком р17 ВИЧ-1 субтипа А в сочетании с рекомбинантным ИЛ-1 является эффективным способом индукции местного гуморального иммунитета на всех слизистых оболочках мыши, однако, при этом практически не индуцируются системные антитела класса G.

Показано, что при интраназальной иммунизации белок p17 ВИЧ-1 субтипа А не обладает не специфическим иммуносупрессивным действием, а наблюдаемый эффект слабого индуцирования антител IgG при мукозальном введении, вероятно, связан с не достаточной абсорбцией белка или его физическим выведением со слизистой оболочки за счет взаимодействия с гепаран-сульфат протеогликанами.

Обнаружено, что наиболее эффективной схемой иммунизации рекомбинантным белком р17 ВИЧ-1 субтипа А для индуцирования как высокого уровня системного поствакцинального иммунитета, так и местного мукозального иммунного ответа, является первичная однократная парентеральная и последующая двукратная интраназальная вакцинация.

Данный вариант позволяет получить высокие уровни IgA к р17 на слизистых оболочках и напряженность поствакцинального системного иммунитета сопоставимую с таковой при только парентеральном введении иммуногена.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработана эффективная технология получения рекомбинантного белка p17 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята, которая может быть использована при крупномасштабном производстве. Очищенный рекомбинантный белок p17 может быть использован в качестве терапевтической вакцины против ВИЧ/СПИДа, в составе тест систем для выявления ВИЧ/СПИДа, для изучения различных функций белка p17.

Показано, что эффективным способом увеличения экспрессии вирусного гена p17 ВИЧ-1 субтипа А в клетках E. coli является использование GC богатого модифицированного варианта гена.

Показано, что для слабоиммуногенных эпитопов белка p17, каковыми являются фрагменты белка p1710-30 и р1730-52, использование интерлейкина-1 в качестве адъюванта позволило достоверно увеличить титр специфических антител класса G при подкожном введении.

Разработана эффективная схема иммунизации рекомбинантным белком p ВИЧ-1 субтипа А российского изолята (однократное парентеральное праймирование белком p17 совместно с ИЛ-1и последующие двукратное интраназальное бустирование p17+ИЛ-1для индукции высоких уровней IgA к р17 на всех слизистых оболочках и для индукции высоких уровней IgG в системном кровотоке. Полученная схема вакцинации может быть использована в доклинических и клинических испытаниях терапевтической вакцины против ВИЧ/СПИДа на основе рекомбинантного белка p17.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 17-й и 18-й международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье»

(Санкт-Петербург, 2008, 2009), на рабочем совещании по рассмотрению хода выполнения распоряжения Правительства РФ от 25 декабря 2007 г. № 1905-р (Новосибирск, 2009), а также на заседаниях кафедры биохимии Санкт Петербургского государственного университета и научных семинарах лаборатории молекулярной вирусологии ГосНИИ «Особо чистых биопрепаратов» ФМБА России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ: 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК;

2 патента на изобретение (1 патент и 1 заявка на патент с выданным решением о выдаче патента);

4 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 193 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками, содержит 7 таблиц и 2 приложения. Список литературы содержит 262 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Гены р17Nat и р17Mod, кодирующие белок p17, были амплифицированы с использованием плазмид pBMCGagNat и pBMCGagHum, кодирующих природный ген gag ВИЧ-1 и его модифицированный вариант. В модифицированном гене gag во всех кодонах, где это было возможно с сохранением смысла, методом сайт-направленного мутагенеза азотистые основания A/T были заменены на G/C. Для экспрессии генов, кодирующих белок р17 российского изолята ВИЧ-1 субтипа А, в клетках Escherichia coli использовался вектор pET151/D-TOPO (Invitrogen, США). Для проведения генно-инженерных работ использовались клетки E.coli DH10B/R (Gibсo, США), для экспрессии генов р17 использовались клетки E.coli штамма BL21 Star (DE3) (Invitrogen, США).

Для определения нуклеотидных последовательностей генов р17 ВИЧ-1, клонированных в плазмидном векторе pET151/D-TOPO, проводили секвенирование по методу Сэнджера с помощью набора DYEnamic ET dye terminator kit (GE Healhcare, США).

Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва). Для измерения относительного содержания мРНК применяли метод ПЦР в реальном времени с использованием красителя SYBR GREEN. Эффективность амплификации определяли по внешней стандартной кривой с использованием серии разведений образца 5 нг, 10 нг, нг, 50 нг. В качестве отрицательного контроля использовалась реакция без добавления ДНК. Нормализацию данных проводили по количеству клеток, концентрации РНК и кДНК. Расчеты проводили методом Сt.

Индукцию экспрессии генов в штаммах продуцентах осуществляли с использованием ИПТГ (Sigma, США) в конечной концентрации 1 мМ при ОП600=0.6-0.8 в течение 9 часов. Для автоиндукции экспрессии 0,2% лактозой использовали метод Штудиера (Studier, 2005).

Для иммобилизованной металлоаффинной хроматографии (ИМАХ) в нативных использовали сорбент Ni-НТУ сефарозу (GE Helthcare, США) и клетки, разрушенные без использования детергента 6 М гуанидин гидрохлорида. Элюцию белка проводили ступенчатым градиентом имидазола (20-250 мМ). Для ИМАХ в денатурирующих условиях использовали сорбент Ni-НТУ сефарозу и клетки, разрушенные с использованием детергента 6 М гуанидин гидрохлорида. Элюцию проводили ступенчатым градиентом рН (8.0 – 4.0). Фракции, содержащие белок р17, объединяли и диализовали против 500 кратного избытка 5 мМ Na-aцетатного буфера pH 5.0. Полученный препарат белка замораживали в аликвотах по 50 мкг при -70С и использовали для дальнейшего анализа.

В работе были использованы самки беспатогенных мышей линии BALB/c весом 20-22 грамм. (НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН, Пущино). Каждая экспериментальная группа включала 5 – 10 животных.

Влагалищные смывы получали путем 5-кратного промывания с помощью микродозатора влагалища животных 40 микролитрами PBS. Для забора образцов слюны животным предварительно внутрибрюшинно вводили 0,1 мл раствора пилокарпина гидрохлорида с концентрацией 1 мг/мл после чего им в рот помещали диск из фильтровальной бумаги (тип GF/C) с последующей экстракцией 5% обезжиренным молоком. Образцы фекалий у каждой мыши собирали индивидуально. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) получали путем промывания легких через трахею 1 мл PBS. Кровь получали из ретроорбитального синуса.

Исследование уровня ИЛ-2 в супернатантах культур клеток селезенки проводили с помощью биотеста с использованием ИЛ-2 зависимой линии СTLL-2 (Gillis et al., 1982). В качестве стандарта использовали рекомбинантный ИЛ-2 человека (Sigma, США) с известной биологической активностью. Уровни ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-10 и ИЛ-17А в супернатантах спленоцитов измеряли с помощью иммуноферментных наборов EIA Expansion Kit (R&D; Systems, США). Титр антител (IgA, IgG и IgM) к р17 и пептидам из него в сыворотках определяли с помощью твердофазного ИФА. Анализировались значения оптических плотностей в тех разведениях, значения оптических плотностей в которых лежали на линейном участке кривой, построенной в билогарифмических координатах. Проводили анализ линии тренда степенного типа и для определения искомого титра рассчитывали логарифм по снованию теоретического разведения образца, в котором значение оптической плотности за вычетом фона было равно 0,1. В случае, если расчетный значение получали меньше 1, то титр условно считали равным нулю. При анализе уровней IgA из за низких значений оптических плотностей, которые позволяли рассчитать титр описанным способом лишь у небольшой части животных, проводили сравнение значений OП450 после вычета фона при минимальном разведении исследуемых смывов (1:6 для влагалищных смывов, 1:3 для экстрактов фекалий и смывов из носоглотки).

Статистический анализ полученных результатов осуществлялся с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Данные представлены в таблицах и графиках в виде: среднее значение ± стандартное отклонение. Различия считались достоверными при р0,05 в парном тесте Стьюдента с неравными отклонениями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гетерологичная экспрессия генов в клетках E. coli является одним из наиболее эффективных способов получения рекомбинантных белков (Hannig и Makrides, 1998;

Baneyx, 1999). Однако, несмотря на большое количество достоинств E.coli, далеко не всегда можно рутинным способом получить высокий уровень экспрессии целевого гена в данной системе. Для получения штамма-продуцента белка р17, ВИЧ-1 субтипа А сразу использовались 2 гена:

природный (нативный) p17Nat и модифицированный р17Mod, так как даже небольшое увеличение продуктивности штамма в масштабах производства может привести к многомиллионной экономии. В р17Mod во всех кодонах, где это было возможно с сохранением смысла, А/Т основания были заменены на G/C. В результате, G/C состав модифицированного гена p17 увеличен на 58% по сравнению с нативным.

Были созданы два штамма-продуцента белка р17 BL21p17Nat и BL21p17Mod, содержащие нативный и модифицированный ген соответственно. Была проведена оптимизация культивирования и экспрессии генов в полученных штаммах-продуцентах, при этом варьировались следующие параметры: тип индуктора, время индукции и условия культивирования.

Вначале проводилась классическая индукция экспрессии с использованием мМ ИПТГ (рис. 1). Индукцию экспрессии проводили, когда ОП600 культуры клеток достигла 0.6-0.8. Штамм BL21p17Mod характеризуется более быстрым синтезом белка р17, чем штамм BL21p17Nat. Так, уже через 15 минут после индукции на электрофореграмме лизата клеток штамма BL21p17Mod белок р является самой мажорной полосой, составляющей 15% от общего клеточного белка, через 3 часа после индукции уровень экспрессии достигает максимума и составляет 39% от общего клеточного белка. У штамма BL21p17Nat уровень экспрессии достигает максимума также через 3 часа и составляет 28%. Без индукции ни в одном из штаммов не было обнаружено непреднамеренного синтеза рекомбинантного белка, «подтекания Т7 промотора». Уровень накопления рекомбинантного белка р17 штаммом BL21p17Mod на 39% больше уровня накопления рекомбинантного белка штаммом BL21p17Nat, что следует из денситометрического анализа электрофореграмм.

А Б BL21p17Nat BL21p17Mod +IPTG -IPTG +IPTG -IPTG время после индукции, ч м м М, кДА 0 0,25 0,5 0,75 1 2 3 9 1 0 0,25 0,5 0,75 1 2 3 7 9 12 3 4 5 6 7 8 9 10 12 3 4 5 6 7 8 9 10 1. Маркер молекулярного веса 1. Маркер молекулярного веса 2-9. Лизаты клеток в различное время 2-10. Лизаты клеток в различное время после индукции после индукции 10. Лизаты клеток без индукции 11. Лизаты клеток без индукции Рисунок 1. Электрофореграмма лизатов клеток E.coli штамма BL21p17Nat (А) и штамма BL21p17Mod после индукции экспрессии 1 мМ ИПТГ Кроме классической индукции экспрессии с использованием ИПТГ проводилась автоиндукция экспрессии 0.2% лактозой по методу Штудиера (рис 2). Данный метод индукции экспрессии был выбран, как более простая, эффективная и недорогая альтернатива классической индукции с использованием ИПТГ. При использовании автоиндукции для биосинтеза рекомбинантного белка р17 в клетках E.coli уровень его экспрессии в штамме BL21p17Mod составил 36%, а в штамме BL21p17Nat – 26%. Увеличение экспрессии модифицированного гена по сравнению с нативным составило 36% при автоиндукции, что сопоставимо с данными при индукции экспрессии ИПТГ. Однако, при автоиндукции экспрессии оптическая плотность культур клеток после индукции была выше в 4-5 раз.

Полученные характеристики уровней экспрессии нативного и модифицированного генов, кодирующих белок р17 ВИЧ-1 субтипа А, значительно выше описанных в литературе для генов, кодирующих белок р ВИЧ-1 субтипа В и субтипа С, и составляющих от 7.5% до 14% от общего клеточного белка (Burnette et al., 1992;

Massiah et al., 1994;

Matthews et al., 1994;

Saito et al., 1995;

Ishikawa et al., 1998;

Gupta et al., 2001).

1 2 Маркер молекулярного веса М, кДА 1.

Лизаты клеток E.coli штамма 2.

BL21p17Nat после индукции лизаты клеток E.coli штамма 3.

BL21p17Mod после индукции p Рисунок 2.

Электрофореграмма лизатов клеток E.coli штаммов BL21p17Nat и BL21p17Mod после автоиндукции экспрессии по методу Штудиера Для определения стабильности созданных штаммов была проведена их детальная характеристика с целью определения причин, влияющих на увеличение экспрессии модифицированного гена, кодирующего белок р17.

Как уже упоминалось выше, в результате модификации нативного гена, кодирующего белок p17, его G/C состав был увеличен на 58%. Данное увеличение G/C состава привело к двукратному увеличению термодинамической стабильности структуры м-РНК p17Mod по сравнению со структурой мРНК р17Nat.

В результате модификации была увеличена не только термодинамическая, но и ферментативная стабильность мРНК p17Mod по сравнению с p17Nat. Так, увеличение G/C состава модифицированного гена привело к уменьшению A/U богатых участков в мРНК p17Mod, которые являются сайтами узнавания для бактериальной эндорибонуклеазы G.

Кроме этого, методом ПЦР в реальном времени было показано увеличение в 85 раз относительного содержания мРНК р17Mod по сравнению с мРНК р17Nat. Данное увеличение может быть связано как с повышением относительного содержания м-РНК р17Mod на клетку за счет увеличения скорости и эффективности транскрипции, так и с повышением ее термодинамической и ферментативной стабильности.

Кроме увеличения стабильности мРНК в модифицированном гене было снижено на 80.6% содержание редких для E.coli кодонов по сравнению с нативным геном. Однако после модификации часть редких кодонов остается, а некоторые даже появляются. Поэтому повышение экспрессии модифицированного гена, кодирующего белок р17, может быть связано с описанным выше увеличением относительного содержания и термодинамической стабильности мРНК p17Mod по сравнению с мРНК p17Nat.

Для дальнейшей работы был выбран штамм BL21p17Mod и автоиндукция экспрессии. Показано, что в клетках данного штамма 91% белка р17 находится в супернатанте, т.е. является растворимым, и только 9% приходится на осадок, т.е. на нерастворимую фракцию (тельца включения). После разрушения бактериальных клеток была проведена очистка рекомбинантного белка p17 из лизатов клеток E.coli штамма BL21p17Mod методом ИМАХ с использованием сорбента Ni-НТУ сефарозы. Так как, в клетках E.coli штамма BL21p17Mod белок р17 не полностью растворим, то процедура частичной очистки р проводилась двумя различными вариантами ИМАХ, т.е. в нативных и денатурирующих условиях.

При очистке в нативных условиях с хорошим выходом за один хроматографический цикл можно получить рекомбинантный белок р17 с чистотой всего 80%. Белок р17 элюируется с колонки размытым пиком, начинает сходить при концентрации имидазола 40 мМ, достигает максимума при концентрации имидазола 100 мМ и заканчивает элюироваться при концентрации имидазола 150 мМ. Чистота белка р17 во фракциях, элюируемых 150 мМ имидазолом, составляет 95%, однако выход белка при этом всего 2 мг с 1 литра культуры клеток. Кроме этого при данном способе очистки теряется 9% белка p17, находящегося в нерастворимой фракции клеток E. coli.

При очистке в денатурирующих условиях с хорошим выходом за один хроматографический цикл можно получить рекомбинантный белок р17 с чистотой 97%. Белок элюируется с колонки одним пиком при рН элюирующего буфера 4,0 (рис. 3). Выход белка при этом составляет 38 мг на 1 литр культуры.

Следует заметить, что максимально описанный выход белка составляет для р17 ВИЧ-1 субтипа В – 14.7 мг на 1 литр культуры клеток, а для субтипа С – 7. мг на 1 литр культуры бактериальных клеток (Gupta et al., 2001). Очистка белка р17 ВИЧ-1 субтипа А, впервые описанная в представленной работе, на выходе дает 38 мг белка на 1 литр культуры клеток с чистотой 97%.

Маркер молекулярного веса 1.

Лизат, клеток E.coli штамма BL21p17Mod 2.

после индукции экспрессии Фракция, элюируемая с сорбента при рН 4. 3.

Рисунок 3.

Электрофореграмма белка р17, частично очищенного методом ИМАХ в денатурирующих условиях из лизатов клеток E.coli штамма BL21p17Mod с использованием сорбента Ni-НТУ сефарозы Полученный очищенный белок p17 после концентрирования и диализа использовали для изучения его иммунологических свойств.

Первоначально был проведен анализ гуморального иммунного ответа при иммунизации животных различными дозами белка р17 ВИЧ-1 субтипа А совместно с гидроокисью алюминия. Для положительного контроля иммунизации был использован сильнейший адъювант Фрейнда, запрещенный к применению на людях. Белок р17 является иммуногенным для мышей линии Balb/C, и при иммунизации им выявляются достаточно высокие уровни специфических иммуноглобулинов класса G. При этом введение белка в адъюванте на основе гидроокиси алюминия вызывало образование меньших уровней антител, чем при иммунизации животных в адъюванте Фрейнда, даже при введении существенно более высокой дозы белка (рис. 4).

Однако, уровень антител IgG к пептиду p1710-30 был низким и после двух иммунизаций начал детектироваться примерно у половины животных только в группах, иммунизированных дозой в 20 и 35 мкг белка р17 на мышь. В группе, иммунизированной белком с адъювантом Фрейнда, после двух иммунизаций титр IgG к данному пептиду выявлялся у всех животных.

Поэтому было принято решение для усиления иммунного ответа на функционально-значимые эпитопы использовать в качестве адъювантов препараты, обладающие аналогичными адъюванту Фрейнда иммуностимулирующими механизмами действия, но разрешенные к применению на людях. В качестве таких адъювантов в данной работе исследовались: рекомбинантный ИЛ-1бета человека, пептид KP- VQGEESNDK (фрагмент ИЛ-1бета, обладающий иммуностимулирующей активностью) и дипептид -D-Glu-L-Trp (бестим).

Исходный фон 1 иммунизация 2 иммунизации 20, 18, log2 разведения 16, Титр антител, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, 0, 2,5 мкг/мышь 5 мкг/мышь 10 мкг/мышь 20 мкг/мышь 35 мкг/мышь 10 мкг/мышь p17 + Alum p17+ Alum p17 + Alum p17 + Alum p17 + Alum p17 + AФ Условия иммунизации Рисунок 4. Титры антител класса G к белку р17 после одной и двух иммунизаций (log2 разведения) Применение исследованных адъювантов не приводит к увеличению титров IgG к целому белку (таблица 1).

Таблица 1.

Влияние исследуемых адъювантов на титры IgG к белку р17 и его фрагментам Адъювант Доза, Антиген мкг/кг p1710-30 р1730-52 p17113- р 10,4±1,1 1,3±2, Контроль (PBS) - 3,9±4,7 10,8±1,5 0,6±2,0 7,0±4, КР-18 5,9 9,7±2,1 0,0±0,0 7,6±7, 295 10,6±1,8 0,5±1,7 3,9±7, Бестим 0.1 10,0±2,3 0,6±1,8 3,0±4, 1 9,4±1,3 3,1±4, 6,0±3,5** ИЛ-1 5 9,6±1,3 4,5±4,0* 10,9±2,6** 50 *p0.05 и **р0.01 – различия с контрольной группой достоверны В то же время для слабоиммуногенных эпитопов, каковыми являются фрагменты белка p1710-30 и р1730-52, использование интерлейкина-1 в качестве адъюванта позволило достоверно увеличить титр специфических антител.

Данное наблюдение представляется весьма существенным, поскольку практически все важные с точки зрения нейтрализации и ингибирования ВИЧ эпитопы белка p17 являются низкоиммуногенными.

Однако, для увеличения эффективности терапевтической вакцинации против ВИЧ необходимо индуцировать не только системный иммунный ответ на функционально-значимые эпитопы белка p17, но и вызвать развитие местного иммунного ответа на слизистых оболочках человека. В связи с этим были исследованы особенности иммунного ответа у мышей на белок p17 при различных путях введения антигена. Было показано, что интраназальная иммунизация белком р17 в сочетании с ИЛ-1 является эффективным способом индукции местного гуморального иммунитета на всех слизистых организма.

IgA к р17 выявлялись во всех секретах животных, иммунизированных интраназально, тогда как парентеральная иммунизация индуцировала значимый уровень специфических IgA только в фекалиях, где их количество было примерно одинаковым во всех группах животных. При этом добавление ИЛ- при интраназальной иммунизации значимо увеличивало уровень иммуноглобулинов этого класса в слюне и влагалищных смывах и слабо – в БАЛ, а титр IgA к иммуногену во влагалище практически достигал, а в слюне – даже превосходил уровень IgG, который наблюдался в соответствующем секрете при парентеральной иммунизации. Однако, в отличие от парентеральной вакцинации данный способ иммунизации слабо индуцировал системный иммунитет, измеряемый по уровню IgG в сыворотке крови.

Данный феномен является уникальным для комбинации изучаемого белка p17 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята с интерлейкином 1 бета человека.

Были проведены эксперименты, направленные на уточнение особенностей иммунного ответа на рекомбинантный белок р17 при интраназальной иммунизации. Для этого проведено изучение влияния вакцинации рекомбинантным белком р17 на иммунный ответ против овальбумина (ОвА) при одновременной иммунизации двумя антигенами.

Было показано (таблица 2), что совместная интраназальная иммунизация белком р17 и овальбумином не влияет на интенсивность иммунного ответа на овальбумин. Т.е. уровень системных IgG и местных IgA при одновременной и/н иммунизации двумя антигенами равен уровню антител при иммунизации только ОвА.

Таким образом, при интраназальной иммунизации белок p17 ВИЧ-1 субтипа А не обладает неспецифическим иммуносупрессивным действием, а наблюдаемый эффект слабого индуцирования антител IgG при мукозальном введении, вероятно, связан с недостаточной абсорбцией белка или его физическим выведением со слизистой оболочки за счет взаимодействия с гепаран-сульфат протеогликанами.

Таблица 2.

Титры антител класса G в сыворотке крови мышей.

Номер Иммунизация Титры IgG к р17 Титры IgG к ОвА группы р17 и/н 1,6±0,1 0,4±0, 1,1±0, р17 + ИЛ-1 и/н 2,8±0,5* ОвА и/н 1,7±0,1 3,1±0, 1,4±0, ОвА + ИЛ-1 и/н 4,2±0,2* р17+ОвА и/н 2,0±0,5 2,9±0, 2,3±0, р17+ОвА + ИЛ-1 и/н 4,0±0,4* р17 + Alum п/э 4,9±0,6 0,0±0, * отличия от группы, иммунизированной тем же антигеном без адъюванта достоверны (р0.05).

В связи с полученными результатами были проведены эксперименты по поиску схем иммунизации, сочетающих парентеральное и мукозальное введение антигена белка р17 ВИЧ-1 субтипа А, которые позволили бы индуцировать как высокий уровень системного иммунитета, так и местный мукозальный иммунный ответ (таблица 3А).

Таблица 3.

А. Схемы иммунизации экспериментальных животных.

Дни эксперимента № группы Д0 Д7 Д 1 (интактные) - - и/н (с ИЛ-1) и/н (с ИЛ-1) и/н (с ИЛ-1) п/к (Alum) в/б (Alum) 3 п/к (Alum) и/н (с ИЛ-1) и/н (с ИЛ-1) в/б (Alum) и/н (с ИЛ-1) и/н (с ИЛ-1) п/к (Alum) + в/б (Alum) + и/н (с ИЛ-1) и/н (с ИЛ-1) и/н (с ИЛ-1) Б. Системный и местный гуморальный ответ на белок р17.

Группа IgG IgA, OD в сыворотке, Log10 Влагалищные смывы Фекалии Носоглотка 1,6±0,1 0,002±0,004 0,003±0, 1 0,026±0, 2,8±0,5 0,201±0,201 0,113±0,096 0,136±0, 4,9±0,6 0,005±0,009 0,038±0,014 0,002±0, 4,2±0,4 0,354±0,270 0,133±0,076 0,352±0, 3,4±1,2 0,011±0,014 0,053±0,026 0,013±0, 4,7±0,2 0,070±0,092 0,096±0, 0,261±0, Согласно полученным данным (таблица 3Б) среди исследованных вариантов наиболее перспективной представляется схема иммунизации, при которой животные вначале однократно вакцинируются парентерально, а затем дважды интраназально (группа 4). Данный вариант иммунизации позволяет получить высокие уровни IgA к р17 на слизистых оболочках и высокие уровни IgG в системном кровотоке, сопоставимые с таковыми при только парентеральном введении иммуногена. Вариант одновременной парентеральной и интраназальной иммунизации также возможен (группа 6), однако, дает менее стабильный уровень местного иммунитета. Вероятно, подобная схема требует более тщательной отработки, как суммарной дозы антигена, так и дозировок, приходящихся на различные пути введения. Схема иммунизации, при которой вначале проводится интраназальная, а затем парентеральная иммунизация наименее эффективна (группа 5), так как не сопровождается стимуляцией местного иммунитета.

Таким образом, отработанная в данной работе схема иммунизация белком p17, показавшая наилучшие результаты по стимулированию системного и местного иммунного ответа, сочетает однократное парентеральное праймирование и двукратное интраназальное бустирование совместно с адъювантом ИЛ1бета. Последовательная вакцинация с использованием различных путей введения антигена совместно с сильными адъювантами представляет эффективную стратегию для расширения репертуара стимулированных Т клеток, манипулирования путями миграции CD4+ и СD8+ резидентных эффекторных клеток и клеток памяти, которая может значительно усилить иммунный ответ на патоген и его компоненты, как в системной циркуляции, так и в локальных местах его проникновения и размножения.

ВЫВОДЫ Получен штамм E. coli – суперпродуцент рекомбинантного белка р 1.

российского изолята ВИЧ-1 субтипа А с максимальной продуктивностью 39+/ 1% от общего клеточного белка. Высокая эффективность экспрессии белка р достигнута за счет использования в составе генно-инженерной конструкции искусственно синтезированного оптимизированного гена р17, богатого G+C основаниями, и метода автоиндукции. Увеличение экспрессии оптимизированного гена р17 связано с повышением относительного содержания соответствующей мРНК в клетках E. coli.

Разработан метод очистки рекомбинантного белка p17 на основе 2.

иммобилизованной металлоаффинной хроматографии, позволяющий получить белок с чистотой 97% и выходом 38 мг/л. Совокупность изученных биохимических свойств высокоочищенного белка позволяет сделать вывод о возможности использования его в качестве иммуногена.

Создан препарат иммуногена на основе белка р17, который стабилен в 3.

растворе и в лиофилизированном состоянии. Данный препарат обладает иммуногенностью у мышей линии Balb/C, вызывая при различных условиях вакцинации индукцию специфического системного и/или местного гуморального иммунного ответа на всех слизистых оболочках.

Разработана схема иммунизации, основанная на свойствах белка p 4.

российского изолята ВИЧ-1 субтипа А, обеспечивающая одновременную индукцию высоких уровней антигенспецифических IgA на слизистых оболочках и высоких уровней антигенспецифических IgG в системном кровотоке.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Аль-Шехадат Р.И., Духовлинов И.В., Кобатов А.И., Климов Н.А., Козлов А.П.

1.

Получение рекомбинантного белка р17 вируса иммунодефицита человека субтипа А // Биотехнология – 2010 – №6 – С. 19-26.

Аль-Шехадат Р.И., Духовлинов И.В., Климов Н.А., Козлов А.П.

2.

Рекомбинантный иммуноген для иммунизации против белка р17 вируса иммунодефицита человека // Заявка на патент на изобретение (решение о выдаче патента от 19.02.2010) - 18.12.2008 - № 2008149816/13(065371).

Аль-Шехадат Р.И., Петров А.В., Климов Н.А., Симбирцев А.С., Козлов А.П.

3.

Способ получения антител к белку р17 ВИЧ // Патент – 03.11.2009 - № 2412946.

Аль-Шехадат Р.И., Духовлинов И.В., Ворожцова Е.В., Мурашев Б.В., Климов 4.

Н.А., Козлов А.П. Исследование механизмов, лежащих в основе увеличения экспрессии G+C обогащенных генов // Материалы 17-ой международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» – 2008 – стр. 10-11.

Духовлинов И.В., Аль-Шехадат Р.И., Климов Н.А, Козлов А.П. Углубленное 5.

изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка р17 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята // Материалы рабочего совещания по рассмотрению хода выполнения распоряжения Правительства РФ от 25 декабря 2007 г. №1905-р – 2009 – стр. 83-88.

Аль-Шехадат Р.И., Петров А.В., Духовлинов И.В., Климов Н.А., Козлов А.П.

6.

Анализ гуморального иммунного ответа на белок р17 ВИЧ-1 субтипа А у мышей линии BALB/c // Материалы 18-ой международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» – 2009 – стр. 7-8.

Матюнина Е.А., Аль-Шехадат Р.И., Духовлинов И.В., Климов Н.А., Козлов 7.

А.П. Технология получения адъювантов на основе рекомбинантного флагеллина // Материалы 18-ой международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» – 2009 – стр. 29.