Актинобактерии рода rhodococcus, трансформирующие амиды карбоновых кислот
На правах рукописи
ПАВЛОВА Юлия Андреевна
АКТИНОБАКТЕРИИ РОДА RHODOCOCCUS,
ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ АМИДЫ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
03.02.03 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пермь - 2012
2
Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Пермь
Научный руководитель:
кандидат биологических наук, доцент Максимов Александр Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Смирнова Галина Васильевна доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра, Уфа
Защита состоится "_2_" _марта 2012 г. в 10_часов на заседании Диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342) 280 92 11.
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан "_1_" _февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Амидазы (КФ 3.5.1.4) – ферменты, Актуальность проблемы.
катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Амидазы участвуют в метаболизме азота в клетках и широко распространены в природе, обнаружены у про- и эукариот. У бактерий появление амидазной активности часто связано с метаболизмом нитрилов. Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются разной субстратной специфичностью. Некоторые из них катализируют гидролиз амидов алифатических кислот, другие расщепляют ароматические амидосоединения, третьи гидролизуют амиды аминокислот. Некоторые амидазы обладают стереоселективностью. Однако наличие у бактерий ферментов разных видов и их способность трансформировать различные типы субстратов не являются родо- или видоспецифичными признаками [Перцович и др., 2005].
Актуальность изучения амидаз и их продуцентов обусловлена значительной разнородностью структуры этих ферментов, свойств, генетической организации и регуляции активности, интеграции с другими процессами метаболизма, а также широкой субстратной специфичностью данных ферментов и стереоселективностью некоторых из них [Вейко и др.,1995;
Fournand, Arnaud, 2001]. Культуры, активно использующие амиды в качестве ростовых субстратов, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Arthrobacter и др. [Cowan, 1998;
Максимов и др., 2007] К настоящему времени амидазы остаются недостаточно изученными на молекулярном уровне, и их классификация окончательно не сформулирована. В классификации, основанной на субстратной специфичности, объединены ферменты, различающиеся по структурной организации, механизму действия и каталитическим свойствам [Fournand, Arnaud, 2001].
В связи с этим большой интерес представляет поиск продуцентов новых амидаз, различающихся каталитическими свойствами, сравнение генов и аминокислотных последовательностей данных ферментов с целью изучения их разнообразия и распространения определённых структурных типов у различных бактерий, эволюционной изменчивости, последующего определения взаимосвязи структуры и функции, механизмов экспрессии белков, уточнения механизмов их действия, структуры фермента и ее роли в катализе [Kotlova et al., 1999].
В последнее время пристальное внимание уделяется исследованиям в области стереоселективной трансформации субстратов клетками.
Стереоселективность позволяет использовать биокатализаторы для эффективного синтеза некоторых чистых энантиомеров, фармакологических препаратов, а также для получения и других продуктов, которые трудно синтезировать традиционными химическими способами. Некоторые амидазы проявляют энантиоселективность по отношению, например, к производным арилпропионовой кислоты. Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для биокаталитического получения различных карбоновых кислот, в частности, аммонийных солей акриловой и никотиновой кислот, нестероидных противовоспалительных препаратов [Song et al., 2007].
Успешное применение микроорганизмов в биокаталитических технологиях зависит от свойств биокатализаторов: скорости гидролиза субстрата, pH- и температурного оптимумов активности ферментов, субстратной избирательности, оптимального состава рабочей среды. Разные ферменты существенно различаются по этим свойствам, поэтому подобная характеристика фермента помогает оценить перспективы использования продуцентов. В связи с вышеизложенным, селекция и изучение бактерий – активных продуцентов амидаз является актуальным направлением микробиологических исследований [Перцович и др., 2005;
Syed et al., 2011].
– выделение, морфологическая и Цель настоящего исследования биохимическая характеристика почвенных бактерий, активно метаболизирующих амиды карбоновых кислот, исследование генов амидаз.
Основные задачи исследования 1. Выделить и идентифицировать микроорганизмы, метаболизирующие амиды и нитрилы, из различных образцов характерных почв Пермского края.
Выявить тип метаболизма нитрилов (нитрилазный и/или нитрилгидратазно амидазный).
2. Провести ПЦР-анализ генов амидаз, нитрилаз и нитрилгидратаз. Получить ПЦР-фрагменты, соответствующие белок-кодирующим последовательностям генов амидаз.
3. Провести BLAST-анализ и сравнение секвенированных последовательностей с известными генами амидаз разных типов. Определить аминокислотные последовательности амидаз. Провести сравнение с первичной структурой известных ферментов.
4. Охарактеризовать влияние факторов среды (рН, температуры, ингибиторов) на активность ферментов амидазы и нитрилгидратазы.
Научная новизна. Выделены чистые культуры бактерий, обладающие высокой амидазной активностью, которые идентифицированы на основании физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик как представители рода Rhodococcus. С помощью праймеров к генам, кодирующим амид- и нитрилгидролизующие ферменты, у изолятов подтверждено наличие генов амидазы и Fe-зависимой нитрилгидратазы. Показано, что амидазы катализируют гидролиз как алифатических, так и ароматических амидов, проявляют активность в широком диапазоне температуры и рН. Для экспрессии этих ферментов не требуется добавление индуктора в ростовую среду. Селекционированы штаммы, характеризующиеся высокой активностью амидазы (более 14 мкмоль/мг/мин при 25° по акриламиду), амидазная активность которых ассоциирована со способностью трансформировать нитрилы.
Впервые проведено сравнение нуклеотидных последовательностей ряда энантиоселективных амидаз из разных штаммов Rhodococcus, установлены их отличия от ранее известных гомологов. Секвенированы и депонированы в базу данных GenBank новые последовательности генов амидаз.
Теоретическое и практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур бактерий, метаболизирующих амиды до соответствующих карбоновых кислот. На основе разработанных праймеров предложен эффективный способ обнаружения генов, кодирующих амидазы разных структурных групп. Разработаны протоколы полимеразной цепной реакции, позволяющие дифференцировать наличие амидаз различных структурных групп.
Секвенированы гены амидаз из новых штаммов. Проведено их сравнение с ранее известными гомологичными генами и филогенетический анализ. Показано, что исследованные амидазы могут быть использованы для биокаталитической трансформации амидов, в т.ч. для энантиоселективного синтеза.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Выделенные и идентифицированные штаммы бактерий эффективно трансформируют алифатические и ароматические амиды в соответствующие карбоновые кислоты и обладают высокой амидазной активностью.
2. Амидазы исследованных штаммов Rhodococcus активны в широким диапазоне температур, имеют максимумом активности при рН 7 и стабильны при хранении.
3. Штаммы Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью, имеют гены, гомологичные известным последовательностям, кодирующим амидазы сигнатурного типа.
Апробация работы и публикации.
Всего по теме диссертации опубликовано 15 научных работ: 8 статей, четыре из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Материалы диссертации доложены на 4 международных 6 всероссийских и межрегиональных конференциях.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 166 наименований работ, в том числе 16 отечественных и зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0 406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная биология» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009–2010 гг.)» и гранта поддержки молодых ученых УрО РАН.
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования.
Выделение штаммов-продуцентов амидгидролизующих ферментов, условия их культивирования.
Материалом для выделения микроорганизмов служили образцы почв естественной среды и речного ила, собранных на территории Пермского края.
Штаммы выделяли методами накопительной культуры и прямого высева на минеральную среду N следующего состава (г/л): KH2PO4 - 1,0;
K2HPO43H2O - 1,6;
NaCl - 0,5;
MgSO47H2O - 0,5;
CaCl2 - 0,005;
CoCl26H2O - 0,01;
FeSO47H2O 0,005;
рН 7,2 ± 0,2) с добавлением ацетонитрила, акрилонитрила или изобутиронитрила в качестве единственных источников углерода и азота. В дальнейшем при выращивании чистых культур в зависимости от целей экспериментов в качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0,1% или другие углеродсодержащие соединения;
а в качестве источника азота - NH4Cl в концентрации 10 мМ или другие источники.
Методы таксономического анализа. При идентификации выделенных штаммов использовали Определитель бактерий Берджи (1997), а также диагностические таблицы и ключи, предложенные О.А. Нестеренко и др. (1985) и И.Б. Ившиной и др. (1995). Генетический анализ 16S рДНК исследуемых штаммов проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования.
Определение активности ферментов метаболизма амидов и нитрилов карбоновых кислот. Трансформацию амидов и нитрилов проводили с использованием биомассы исследуемых штаммов, ультразвуковых гомогенатов и/или бесклеточных препаратов в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7,2 при начальной концентрации субстрата до 2%;
реакцию останавливали добавлением 5 мкл концентрированной HCl и центрифугировали 5 мин при 12 об./мин. Для количественной оценки субстратов и продуктов метаболизма алифатических амидов и нитрилов в супернатанте использовали газовый хроматограф GC-2014, Shimadzu, Япония;
анализ ароматических нитрилов и продуктов их трансформации проводили с помощью жидкостного хроматографа высокого разрешения LC-10A, Shimadzu, Япония.
Бесклеточный препарат получали путем обработки клеток бактерий ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-4 (22 кГц, 10 мкА, принудительное охлаждение). Фракционированный супернатант использовали для оценки субстратной специфичности, влияния температуры, рН реакционной среды и ингибиторов на активность ферментов метаболизма нитрилов. Удельная активность фермента выражалась числом единиц активности (ЕД), приходящихся на 1 мг сухой массы. За единицу активности фермента (амидазы, нитрилазы, нитрилгидратазы) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль продукта (кислоты или амида) в единицу (1 мин) времени.
Выделение ДНК. Препараты хромосомной ДНК бактерий получали фенольным методом [Гловер и др., 1988]. Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом Бирнбойма и Доли. Для элиминации плазмид бактериальные клетки культивировали в течение 48 ч на среде LB с добавлением митомицина C или бромистого этидия. Анализ ДНК проводили методом электрофореза в горизонтальном агарозном геле [Маниатис и др., 1984].
Полимеразная цепная реакция. Реакционная смесь для амплификации ДНК содержала ПЦР-буфер, смесь дезоксинуклеотидфосфатов в концентрации 200 мкМ, праймеры в концентрации 5 мкМ и 2,5 ЕД Taq-полимеразы. Праймеры конструировали на основе анализа известных последовательностей генов амидаз, железо- и кобальт-зависимых нитрилгидратаз, приведенных в базе данных GenBank. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1% агарозном геле.
Секвенирование ДНК. Для очистки ПЦР-продукта перед секвенированием использовали смесь ферментов Exonuclease I(Exo I)/Shrimp Alkaline Phosphatase при 37°С в течение 40 минут. Секвенирующую реакцию проводили с использованием набора Big Dye Terminator при следующем температурном режиме: 95°С - 1мин, 95°С - 10 сек, 50°С - 5 сек, 60°С - 4 мин, 25 циклов. Для очистки продуктов секвенирующей реакции использовали Big Dye X Terminator Purification Kit.
После секвенирующей реакции образцы переосаждали этанолом и анализировали нуклеотидную последовательность с помощью систем секвенирования ДНК MegaBACE1000, APBiotech и 3500xl, Applied Biosystems.
Сравнительный анализ последовательностей ДНК. Полученные нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью пакета программ MegaBACE1000 и программы Chromas lite 2.1. Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2.
Статистическая обработка. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы. Достоверность различий определяли с использованием критерия Стьюдента. Анализ результатов проводили с помощью программ MS Excel и Statistica 5.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и селекция штаммов, метаболизирующих амиды и нитрилы.
Изучение аэробной гетеротрофной микрофлоры. Проведен скрининг микрофлоры, способной утилизировать амиды карбоновых кислот, в подзолистых, бурых и аллювиальных почвах на суглинистой основе, широко распространенных в Пермском крае (рис.1).
1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ а 1,00E+07 б в 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Рис. 1. Содержание гетеротрофных (а) и нитрилутилизирующих (б) и амидутилизирующих (в) бактерий в образцах почв. Аллювиальная луговая кислая почва: 4 – дернина, 5 – гумусовый горизонт;
6 – поверхностно-подзолистая супесчаная почва, гумусово-элювиальный горизонт;
аллювиальная болотная иловато-перегнойно-глеевая почва: 9 – гумусовый горизонт, 10 – переходный горизонт;
11 – иловые речные отложения;
бурая лесная кислая тежелосуглинистая почва: 12 – алфегумусовый горизонт, 13 – иллювиальный горизонт;
подзолистая лесная почва: 14 – элювиальный горизонт, 15 – иллювиальный горизонт;
дерново карбонатная почва: 16 – элювиальный горизонт, 17 – иллювиальный горизонт;
дерново-луговая глеевая почва: 18 – гумусовый горизонт, 19 – переходный горизонт Исследовано биологическое разнообразие бактерий, способных активно метаболизировать амиды и нитрилы карбоновых кислот, в образцах подзолистой лесной почв, собранных на территории Пермского края. Показано, что исследуемые почвы содержат значительное количество бактерий, трансформирующих производные карбоновых кислот. Максимальное их содержание отмечено в верхних горизонтах почв и в ризосферной зоне растений. Аналогичные данные получены ранее при анализе других типов почв. Наибольшее количество активных изолятов было выделено из образцов дерново-луговой почвы. Наибольшее таксономическое разнообразие отмечено в образцах верхнего слоя гумусового горизонта. Вероятно, это связано с метаболической активностью растений, в экссудате корней которых содержатся амидные и нитрильные соединения.
Меньшая численность деструкторов наблюдалась в нижележащих слоях. Бактерии, трансформирующие амиды и нитрилы, обнаружены во всех исследованных почвах в количестве 105-108 КОЕ/г сухой почвы.
Установлено, что изолированные культуры образуют симбиотические сообщества, трудно разделяемые на селективной среде, способные активно метаболизировать нитрилы в качестве основных источников углерода и азота. При прямом высеве на селективную среду из почвенного экстракта такие сообщества, состоящие из 2-5 культур бактерий разных видов, росли совместно в виде гомогенных, либо различающихся в периферической части колоний. Такие ассоциации, составлявшие до 9% колоний, как правило, сохранялись при пересеве на минимальную среду, но легко разделялись на среде LB.
Проведена идентификация бактерий по совокупности культурально морфологических, биохимических и хемотаксономических свойств. По данным окрашивания по Граму и КОН-теста установлено, что большая часть высеваемых микроорганизмов относится к грамотрицательным бактериям. Идентифицированы представители родов Arthrobacter, Acidovorax, Azomonas, Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas и др. Наибольшее количество изолятов, способных к росту на селективных средах принадлежит к родам Pseudomonas и Rhodococcus.
Таблица Процентное соотношение почвенных бактерий, обладающих системой метаболизма нитрилов и амидов (n=400) Вид, род % Вид, род % R. erythropolis 15 Agrobacterium sp. R. rhodochrous 5 Alcaligenes sp. R. ruber 7 Acidovorax sp. R.luteus 2 Azomonas sp. Nocardia sp. 3 Azotobacter sp. Arthrobacter sp. 2 P. putida B. subtilis 2 P. fluorescens B. mycoides 2 Pseudomonas sp. Другие грам + 7 Другие грам – Удельная активность грамотрицательных изолятов уступала активности грамположительных культур. В ходе селекционного процесса при постепенном повышении концентрации субстрата (амида) получены культуры 4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-2, 11-1-3, П-11-8, проявляющие амидазную активность более 10 Ед. Культуры отнесены к роду Rhodococcus на основании следующих признаков:
грамположительные клетки с выраженным клеточным циклом, формируют на плотных средах круглые, гладкие или шероховатые, кремовые (11-1-3), молочно белые (4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-2) или желто-оранжевые (11-8, 11-8-5) колонии, в гидролизатах клеток исследуемых штаммов были обнаружены мезо-ДАПК, арабиноза, галактоза, миколовые кислоты, идентичные таковым для представителей рода Rhodococcus.
В разные стадии жизненного цикла клетки выделенных штаммов отличались по морфологии. Клетки 12-часовых культур представляли собой нити, в результате фрагментации распадающиеся на палочковидные формы. К 24 часам роста культуры были представлены палочковидными и кокковидными формами. Таким образом, выделенные штаммы имели характерный для нокардиоподобных бактерий клеточный цикл развития: кокки-«гифы»-палочки-кокки Для дальнейших исследований использовали культуры с наибольшей амидазной и нитрилгидратазной активностью (более 10 ЕД), в отношении труднометаболизируемых субстратов – изобутиронитрила, изобутирамида.
Видовая принадлежность представителей рода Rhodococcus была подтверждена методом ПЦР-анализа с видоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК Rhodococcus rhodochrous, R. erythropolis и R. ruber и секвенирования генов 16S рРНК. В качестве контроля использовали ДНК коллекционных штаммов R. erythropolis ИЭГМ 62Т, R. rhodochrous ИЭГМ 7Т и R. ruber ИЭГМ 70Т, полученных из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (WFCC #768).
R. rhodochrous ИЭГМ 62т R. erythropolis ИЭГМ62т R. erythropolis ИЭГМ 7т R. rhodochrous ИЭГМ7т R. ruber ИЭГМ70т А Б 100 b маркер 11-8- 11-8- 4-1- 4-1- 6-2- 1 kb 11- 12- 12- 11- 11- 3- 3- 801 пн 433 пн Рис. 2. ПЦР-идентификация штаммов рода Rhodococcus с видоспецифичными праймерами, к 16S РНК: А – R. erythropolis;
Б – R. rhodochrous.
Штаммы 4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-1-3, 11-2 отнесены к виду R. erythropolis, штамм 11-8 идентифицирован как R. rhodochrous (рис.2).
Зависимость амидазной и нитрилгидратазной активности изолятов от фазы роста. Были исследованы ростовые характеристики и зависимость амидазной и нитрилгидратазной активности от фазы роста активных штаммов R. erythropolis 4 1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-1-3, 11-2 и R. rhodochrous 11-8. Культуры выращивали на минеральной среде N, содержащей 0,1 % глюкозу и 10 мМ ацетонитрил.
Максимальная активность амидазы и нитрилгидратазы штамма R. erythropolis 6-2-1 наблюдалась в первой половине экспоненциальной фазы и составляла 12,9 и 21,1 мкмоль/мг/мин соответственно. При дальнейшем культивировании плотность культуры увеличивалась, но наблюдалось падение активности обоих ферментов. Аналогичным образом изменялась активность ферментов у штамма R. erythropolis 4-1-6, однако его амидазная активность, достигавшая 7,7 мкмоль/мг/мин, была значительно ниже нитрилгидратазной, составлявшей в максимуме 18,22 мкмоль/мг/мин. При выходе культуры в стационарную фазу активность обоих ферментов падала до 2,05 ЕД и 0,86 ЕД соответственно (рис. 3).
мкмоль/мг/мин 12 0, ОП 0, 10 0, 0, 0, 6 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 24 48 72 96 120 144 ч нитрилгидратазная активность амидазная активность плотность культуры A мкмоль/мг/мин 25 1, ОП 0, 0, 0, 5 0, 0 0 24 48 72 96 120 144 ч нитрилгидратазная активность амидазная активность плотность культуры Б Рис. 3. Зависимость активности амидазы и нитрилгидратазы штаммов R. rhodochrous 11-8 (A) и R. erythropolis 4-1-6 (Б) от фазы роста при культивировании на среде N c 10 мМ ацетонитрилом.
Можно отметить, что максимальная амидазная активность штамма 11- проявляется в начале экспоненциальной фазы, когда бактериальная культура обладает наименьшей плотностью. Нитрилгидратазная активность достигает максимума позднее – к середине экспоненциальной фазы. При последующем культуральном росте стабильно наблюдается снижение активности обоих ферментов.
Трансформация амидов и нитрилов выделенными штаммами.
Активность амидазы клеток у таких культур, как R. erythropolis 4-1, 6-2-1, 11-2, значительно превышала нитрилгидратазную в широком интервале температур.
Наилучшим субстратом для амидазы был короткоцепочечный ацетамид. Реакция с большей скоростью проходила при высоких значениях температуры (50С), что соотносится с данными о термостабильности амидазы. Штамм 6-2-1 проявлял более высокую активность по отношению к бензамиду, чем другие культуры (табл.2).
Таблица Активность амидазы почвенных штаммов Амидазная активность, ЕД 11-2 11-8 4-1 6-2- Субстрат 25С 50С 25С 50С 25С 50С 25С 50С Ацетамид 23,11 81,45 5,99 11,71 8,44 8,51 18,49 38, Акриламид 14,96 30,18 3,46 8,56 4,12 8,21 12,89 16, Пропионамид 27,43 58,47 6,01 15,56 5,08 14,07 20,53 35, Бутирамид 0,96 1,50 0,65 1,52 1,51 1,94 0,72 1, Изобутирамид 1,16 2,31 1,87 3,33 1,38 1,64 1,56 2, Бензамид 0,80 2,30 0,30 1,09 0,77 2,70 4,20 9, Проведена трансформация нитрилов, включая алифатические, разветвленные, непредельные, гидрокси- и ароматические нитрилы, и соответствующих амидов выделенными штаммами с высокой скоростью роста на изобутиронитриле. Результаты конверсии, осуществляемой наиболее активными штаммами, приведены в табл. 3.
Таблица Активность нитрилгидратазы почвенных штаммов Нитрилгидратазная активность, ЕД 11-2 11-8 4-1 6-2- Субстрат 25С 50С 25С 50С 25С 50С 25С 50С Ацетонитрил 0,27 0,19 0,84 0,08 1,68 0,42 10,00 12, Акрилонитрил 3,47 0,64 4,72 2,16 1,61 1,26 6,41 3, Пропионитрил 3,66 1,72 18,87 7,40 7,09 3,50 6,53 1, Бутиронитрил 2,32 1,79 21,48 12,69 3,48 2,43 6,15 3, Изобутиронитрил 6,18 3,93 33,30 21,98 8,61 4,83 8,23 4, Бензонитрил 3,50 0,80 0,20 0,24 0,10 0,19 0,33 0, Известно, что штаммы, выделенные методом накопительной культуры, часто проявляют высокую конвертирующую способность именно к тому субстрату, который использовался для селекции [Layh et al., 1997]. В нашей работе наилучшими субстратами для нитрилгидратаз большинства штаммов (R. erythropolis 4-1, 11-2, R. rhodochrous 11-8 др.) оказался изобутиронитрил. Так, нитрилгидратаза штамма 11-8 гидратировала ацетонитрил почти в 40 раз медленнее, чем изобутиронитрил. У штамма 11-2 скорость гидратации ароматического бензонитрила была на уровне алифатических нитрилов.
Энантиоселективная биотрансформация амида ибупрофена клетками Rhodococcus. Конверсию ибупрофена клетками R. erythropolis 6-2-1 проводили в калий-фосфатном буфере pH 8. В качестве субстрата использовали рацемический препарат ибупрофенамида, содержащий равные доли (по 50%) R и S-энантиомеров в концентрации 2 мг/мл. Биокатализатор добавляли в реакционную среду из расчёта 1 г сухого веса на 100 мл среды. Трансформацию проводили при температуре 30°С и перемешивании 100 об./мин. В результате до 98,7% S-энантиомера ибупрофенамида трансформировалось в S-ибупрофен (рис. 4).
R,S-ибупрофенамид % S-ибупрофен 0 60 120 180 240 300 мин.
Рис. 4. Трансформация амида ибупрофена клетками R.erythropolis 6-2-1.
Влияние температуры и pH на активность амидаз. Удельную амидазную активность клеток и бесклеточных экстрактов штаммов R.erythropolis 4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-2 и, R.rhodochrous 11-8 измеряли в интервале температур от 5 до 80°С при рН 7,2 по изменению концентрации акриламида в течение 10 минут реакции.
На рис. 5 показано влияние температуры на активность амидазы R.erythropolis 6-2-1 в составе клеток и ферментного препарата. Подобный температурный профиль наблюдался у всех исследованных нами амидаз.
16 мкмоль/мг/мин мкмоль/мг/мин 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 °С рН препарат амидазы препарат амидазы клетки клетки А Б Рис. 5. Влияние температуры (А) и рН (Б) на амидазную активность клеток и препарата амидазы R. erythropolis 6-2-1 по отношению к акриламиду.
Установлено, что амидазная активность ферментного препарата достигала максимума при 50°С и затем быстро снижалась с повышением температуры. При комнатной температуре (25°С) фермент проявлял лишь 50% от максимальной активности. Также было показано, что фермент в составе клеток проявляет максимальную амидазную активность при более высокой температуре – 55-60°С (рис. 5 А).
На каталитическую активность ферментов большое влияние оказывает рН среды. Измерена активность амидазы штаммов R.erythropolis 4-1-7, 4-1-6, 6-2-1, 11 1-3, 11-2 и R. rhodochrous 11-8 по отношению к акриламиду в интервале pH от 2, до 12,0 при 25°C. Показано, что препарат амидазы R. erythropolis 6-2-1 имеет пик активности в диапазоне рН от 6,0 до 7,5, достигающий максимального значения при рН 7,0. За пределами этих значений рН наблюдается резкое снижение активности.
Из графика следует, что при рН 5,0 и 9,0 фермент проявляет лишь 50% от максимальной активности (рис. 5 Б).
Действие ингибиторов ферментов на активность амидаз. Исследовано влияние ряда потенциальных ингибиторов ферментов на активность амидазы.
Реакция проводилась в фосфатном буфере с pH 7,2 при температуре 25°C в течение 10 минут (рис. 6).
ин н ол т о ид l на т N ль l А S ио ми та Cl 3) 4) 2O NO O SO a SD аз ДТ gC oC ви з ан ро uS O SO Zn це ба ла N др H Fe H Э Ag эт C че нт i(N да C ме кар си 2( ги ко мо N Al ок ил ап ми др ен рк се ги ф Ферментный препарат,% Клетки,% Рис. 6. Влияние ингибиторов на амидазную активность препарата фермента и целых клеток R. erythropolis 6-2-1 по отношению к акриламиду (концентрации ингибиторов – 1мМ). 100% - активность клеток и фермента без ингибиторов.
Анализ влияния ингибиторов на активность амидазы R. erythropolis 6-2- показал, что активность фермента была практически полностью подавлена 1 мМ растворами нитрата серебра и хлорида ртути, что свидетельствует о наличии сульфгидрильных групп, играющих большую роль в каталитическом процессе и поддержании активной структуры фермента. Ингибирующее влияние на амидазную активность оказывал йодацетат – реагент, специфически взаимодействующий с сульфгидрильными группами белков.
Амидазную активность также снижали гидроксиламин, мочевина, семикарбазид и фенилгидразин. Так как в своей структуре данные ингибиторы содержат амидную группу, можно предположить, что они действуют на фермент по типу обратимого конкурентного ингибирования. Более чем на 50% подавлял амидазную активность восстанавливающий агент - меркаптоэтанол. Хелатирующий агент ЭДТА не оказывал существенного влияния на активность фермента, что свидетельствует о том, что амидаза не является металлозависимым ферментом.
Установлено, что соли тяжелых металлов, а также ряд реагентов (гидроксиламин, йодацетат, семикарбазид) оказывают незначительное влияние на активность клеток и в то же время существенно ингибируют препарат амидазы R. erythropolis 6-2-1. В целом фермент в составе клеток был менее подвержен ингибирующему влиянию. Это связано, по-видимому, с действием различных стабилизирующих внутриклеточных факторов и с ограниченным проникновением ингибиторов в цитоплазму.
ПЦР-анализ генов амидаз. Для идентификации генов, кодирующих ферменты гидролиза амидов, проведен ПЦР-анализ изолятов с применением набора праймеров, специфичных к генам известных в настоящее время видов этих ферментов.
В геномах 35 изолятов Rhodococcus обнаружены последовательности размером ок. 1566 п.н., родственные ранее известным генам энантиоселективных амидаз R. erythropolis (GenBank, E12517), R. rhodochrous N-771, N-774 (GenBank, X54074) (рис. 7,А).
11-1- 11-1- 11-8- 4-1- 4-1- 6-2- А 1 kb 12- 11- 11- 16- 16- 1 566 п.н. 14- 16- 16- Б 1 kb 12- 12- 12- 13- 15- 4- 14- 4- 1 038 п.н. Рис. 7. Последовательности ДНК изолятов Rhodococcus, гомологичные: А – гену амидазы R. erythropolis (GenBank, E12517), 1566 п.н., Б – гену амидазы R. erythropolis (GenBank, M88614), 1038 п.н.
У 9 штаммов амплифицировались последовательности, гомологичные гену R. erythropolis (GenBank, M88614), относящемуся к структурному семейству нитрилаз-цианидгидратаз (рис. 7,Б). Гены других видов амидаз встречались со значительно меньшей частотой.
Установлено, что более 94% почвенных изолятов, обладающих нитрилгидратазной активностью, выделенных методом прямого высева, содержат гены железозависимой нитрилгидратазы.
У всех исследованных штаммов обнаружены гены, кодирующие субъединицу (ген nha) и -субъединицу (ген nhb) железосодержащей нитрилгидратазы, гомологичные известным у R. rhodochrous N-771, N-774. С помощью комбинирования в ПЦР праймеров к генам субъединиц определено их взаимное расположение в опероне: за геном nha следует ген nhb. Размер фрагмента, содержащего обе субъединицы, составил 1,3 т.п.н.
Гены, кодирующие нитрилазу, альдоксимдегидратазу и Со-зависимую нитрилгидратазу, обнаруженные у других почвенных изолятов, у изучаемых высокоактивных штаммов не детектировались.
Таким образом, установлено, что амидазная активность большей части изолятов ассоциирована со способностью трансформировать нитрилы.
Анализ последовательности генов и полипептидных Проведено секвенирование полных последовательностей амидаз.
последовательностей ПЦР-фрагментов, соответствующих генам амидаз.
Полученные нуклеотидные и аминокислотные последовательности депонированы в базу данных GenBank под номерами: R. erythropolis 11-2 – JN936271, R. rhodochrous 11-8 – JN936272, R. erythropolis 4-1-7 – JN936273, R. erythropolis 6-2-1 – JN936274, R. erythropolis 11-1-3 – JN889708, R. erythropolis 4-1-6 – JN889709.
Показано, что нуклеотидные последовательности энантиоселективных амидаз гомологичны генам ферментов из Rhodococcus sp. N-771 (AB016078, GenBank), N-774 (X54074, GenBank), R. erythropolis (AY026386, GenBank) R.
rhodochrous (E12517, GenBank). Установлено, что гены амидаз селекционированных штаммов обладают наибольшей гомологией (на 98-99,3%) последовательности E12517, в то время, как гомология гену фермента Rhodococcus sp. N-771 составляла от 95,98 до 97% (табл.4).
Последовательности, полученные в ПЦР-реакции с праймерами AmiReR, на 95-99,7% гомологичны гену амидазы R. erythropolis, приведенному в базе данных GenBANK под номером M88614, относящемуся к структурному семейству нитрилаз-цианидгидратаз [Перцович и др., 2005].
Таблица Гомология генов энантиоселективных амидаз (%) штамм E12517 X54074 4-1-6 4-1-7 11-8 6-2-1 11-1-34 11- E12517 100 95,53 98,40 99,10 99,17 99,23 98,00 99, X54074 100 97,00 95,98 95,98 96,04 96,10 95, 4-1-6 100 99,29 99,29 99,17 97,83 98, 4-1-7 100 100 99,90 98,53 99, 11-8 100 99,87 98,53 99, 6-2-1 100 98,59 99, 11-1-34 100 98, 11-2 В результате перевода нуклеотидной последовательности в аминокислотную установлено, что у исследуемых штаммов есть ряд нуклеотидных замен по сравнению с ранее известными последовательностями, что, вероятно, обусловливает установленные различия субстратной специфичности ферментов.
При этом сходство соответствующих аминокислотных последовательностей с геном из R. rhodochrous (E12517, GenBank) составляло от 98,27 до 98,85%, в то время, как гомология гену из Rhodococcus sp. N-774 находилась в интервале от 96,35 до 96,74% (табл. 4).
Проведено сравнение аминокислотных последовательностей, соответствующих секвенированным генам амидаз.
Таблица Гомология аминокислотных последовательностей энантиоселективных амидаз (%) штамм E12517 X54074 4-1-6 4-1-7 11-8 6-2-1 11-1-34 11- E12517 100 95,78 98,27 98,66 98,66 98,85 98,27 98, X54074 100 96,35 96,54 96,54 96,54 96,74 96, 4-1-6 100 99,62 99,62 99,42 98,66 99, 4-1-7 100 100 99,80 99,04 99, 11-8 100 99,80 99,04 99, 6-2-1 100 99,04 99, 11-1-34 100 99, 11-2 Установлено, что гомология аминокислотных последовательностей исследуемых амидаз относительно известной последовательности E12517 из R. erythropolis составляет от 98,27 до 98,85% (табл. 5).
Среди почвенных изолятов Rhodococcus, обладающих высокой амидазной активностью, наиболее распространены гены амидаз двух типов, гомологичные последовательностям из R. erythropolis, GenBank, E12517 и R. erythropolis, GenBank, M88614. Филогенетический анализ секвенированных последовательностей позволяет предположить, что структура вновь выявленных генов ближе к консенсусной, чем последовательности, депонированные в GenBank E12517, M88614.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что бактерии, активно трансформирующие амиды карбоновых кислот, представлены во всех изученных типах почв Пермского края в количестве 105-108 КОЕ/г. сухой почвы. Среди культур, обладающих высоким уровнем амидазной активности, преобладают актинобактерии рода Rhodococcus.
2. Селекционированы штаммы Rhodococcus с высокой активностью амидазы (более 5 мкмоль/мг/мин), имеющие нитрилгидратазно-амидазную систему метаболизма нитрилов.
3. Установлено, что высокая активность амидаз исследованных штаммов Rhodococcus проявляется в диапазоне 25-60°С с максимумом при 50°С.
Оптимальная рН реакционной среды составляет от 5 до 8 с максимумом 7.
4. Показано, что исследованные штаммы Rhodococcus эффективно трансформируют амиды карбоновых кислот. При трансформации ибупрофенамида продуктом является S-ибупрофен с энантиомерным избытком 97%.
5. У большинства изолятов Rhodococcus, обладающих высокой амидазной активностью, обнаружены фрагменты ДНК размером ок. 1566 пн, на 98-99,3% гомологичные гену энантиоселективной амидазы R. erythropolis, GenBank E12517 и на 96-97% последовательности Rhodococcus sp. N-774, GenBank X54074. У ряда изолятов обнаружены фрагменты размером 1100 пн, на 95-99,7% совпадающие с последовательностью амидазы R. erythropolis, GenBank M88614.
6. Установлено, что гомология аминокислотных последовательностей исследуемых энантиоселективных амидаз относительно известной последовательности E12517 из R. erythropolis составляет от 98,27 до 98,85%.
7. В геноме исследуемых штаммов обнаружены гены - и -субъединиц Fe-зависимых нитрилгидратаз, гомологичные описанным ранее у штаммов Rhodococcus sp. N-771, N-774 и R312.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ 1. Павлова Ю.А., Неустроева А.Н., Максимов А.Ю. Сравнительный анализ последовательностей генов амидаз почвенных актинобактерий рода Rhodococcus // Известия Самарского научного центра РАН. 2011. Т.13, №5(3). С. 272-276.
2. Павлова Ю.А., Неустроева А.Н. Симбиотические почвенные бактерии, трансформирующие нитрилы и амиды карбоновых кислот. // Вестник Оренбургского государственного университета. 2011. №16. С.177-179.
3. Павлова Ю.А., Неустроева А.Н., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Исследование влияния температуры, рН и ингибиторов на активность энантиоселективной амидазы Rhodococcus erythropolis // Вестник уральской медицинской академической науки. 2011. №4/1(38). С.44-45.
4. Максимова А.В., Павлова Ю.А., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А.
Характеристика генов, кодирующих альдоксимдегидратазы нитрилутилизирующих почвенных бактерий // Вестник уральской медицинской академической науки. 2011.
№4/1(38). С.39-40.
Публикации в других журналах и сборниках 5. Павлова Ю.А., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю. Распространение нитрилутилизирующих бактерий в почвах Пермского края // Экология: проблемы и пути решения. Пермь. 2007. C.102-106.
6. Павлова Ю.А., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю. Трансформация нитрилов карбоновых кислот штаммами – продуцентами нитрилгидратазы и амидазы // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. Матер. Межрег.
науч. конф. Пермь. 2007. С.85-87.
7. Kusnetsova M.V., Pavlova Yu.A., Maksimov A.Yu. Thermostable amidase of soil bacteria // Modern problems of microbiology and biotechnology. Odessa. 2007. P. 122.
8. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Штаммы актинобактерий рода Rhodococcus для биологической очистки вод от нитрильных и амидных загрязнений // VII Междунар. Конф. «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет.
Тез. докл. 2008. Пермь-Н.Новгород. С. 22.
9. Максимов А.Ю., Павлова Ю.А., Демаков В.А. Молекулярно-генетический анализ амидаз почвенных бактерий // III Междунар. конф. «Микробное разнообразие:
состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». Тез. докл. 2008.
Пермь-Н.Новгород. С. 66-67.
10. Демаков В.А., Павлова Ю.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В. Почвенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью // Вестник Пермского Университета. 2009. 10 (36). С.79-83.
11. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю. Амидазы нитрилтрансформирующих почвенных бактерий // Актуальные аспекты современной микробиологии: Матер.
V молодежной школы-конференции с международным участием. Москва. 2009. С.
104-105.
12. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю. Скрининг и секвенирование генов амидаз из почвенных изолятов Rhodococcus // Симбиоз Россия 2009. Матер. II Всеросс. с междунар. участ. конгресс студ. и аспир.-биол. Пермь. 2009. C. 234-237.
13. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю. Штаммы Rhodococcus, обладающие термостабильной амидазной активностью // Симбиоз Россия 2010. Матер. III Всеросс. с междунар. участ. конгресс студ. и аспир.-биол. Нижний Новгород. 2010.
C. 65-66.
14. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов амидаз // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы VII Международной конференции. Минск. 2010. С. 141-143.
15. Павлова Ю.А., Неустроева А.Н. Амидазы почвенных бактерий рода Rhodococcus // Симбиоз Россия 2011. Матер. IV Всеросс. с междунар. участ. конгр. студ. и аспир.-биол. Воронеж. 2011. C. 153-156.