Мутационная изменчивость гена tp53 при раке молочной железы
На правах рукописи
ДЕНИСОВ
Евгений Владимирович
МУТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА TP53
ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
03.02.07 – генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Томск – 2010
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего
профессионального образования “Томский государственный университет” и в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно исследовательском институте онкологии Сибирского отделения РАМН, г. Томск Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Чердынцева Надежда Викторовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Суханова Галина Алексеевна доктор медицинских наук Любченко Людмила Николаевна
Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва
Защита состоится «_» _ 2010 года в _час. _ мин.
на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 001.045.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ медицинской ге нетики СО РАМН по адресу: 634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН Автореферат разослан «_» _ 2010 года
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Кучер А.Н.
ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции по заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин, каждая 12-я имеет риск заболеть в течение жизни, смертность со ставляет 25-40% (Washbrook, 2006;
Комарова, 2008;
Давыдов, Аксель, 2009;
Чиссов, 2009). Генетическая детерминация, обусловленная наследственными нарушениями в высокопенетрантных генах, детектируется лишь в 5-8% слу чаев РМЖ (Карпухин и др., 2002;
Любченко и др., 2007;
Bradbury, Olopade, 2007;
Коваленко и др., 2008;
Foulkes, 2008). Этиология, генетические факто ры и молекулярные механизмы спорадического РМЖ до сих пор остаются не до конца изученными (Имянитов, Хансон, 2004;
Friedrich et al., 2008). Злока чественная трансформация клеток и опухолевая прогрессия, проявляющаяся клинически инвазией, регионарным и отдаленным метастазированием, связа ны с нарушениями нормального функционирования генома и, как следствие, с высокой генетической нестабильностью под влиянием эндогенных и экзо генных канцерогенных факторов, действие которых существенно модифици руется разной индивидуальной генетической предрасположенностью к забо леванию (Egger et al., 2004;
Sprague et al., 2007;
Копнин, 2007;
Заридзе, 2008;
Блохин, 2009). Молекулярный патогенез РМЖ, как и многих других онколо гических заболеваний, включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии, лежащих в основе опухолевой трансформации (Ляхович и др., 2004;
Payne, Kemp, 2005;
Croce, 2008;
Залетаев, 2008;
Лихтенштейн, 2009).
Ген TP53 является одним из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста, функция которого направлена на ограничение вероятности возникно вения генетически нестабильных клеток. Белок р53 осуществляет регуляцию широкого спектра клеточных процессов, выступая своего рода “молекуляр ным полисменом”, ведущим постоянный надзор за состоянием генома и уст раняющим потенциально опасные в плане злокачественной трансформации клетки (Phillips, 1999;
Чумаков и др., 2007;
Vousden, Lane, 2007;
Копнин, 2008). В человеческих популяциях активность белка р53 в значительной сте пени модифицирована генетическим полиморфизмом, наиболее значимым является точечная замена гуанина на цитозин в 72-м кодоне 4-го экзона (Ex4+119GC, Arg72Pro, rs1042522), при этом G и C аллели кодируют разли чающиеся по биохимическим и физиологическим свойствам белки, обла дающие разной эффективностью в поддержании генетического гомеостаза клетки в условиях влияния генотоксических факторов. Полиморфизм в 6-м интроне (IVS6+62GA, rs1625895), а также инсерция/делеция 16 п.н. в 3-м интроне (INDEL, IVS3+41ins16bp, rs17878362) могут существенно изменять «дозу» гена, тем самым влияя на активность белка р53 (Whibley et al., 2009).
По данным последних мета-анализов не обнаружено ассоциации формирова ния РМЖ с тем или иным генотипом (аллелем) по Ex4+119GC и IVS6+62GA полиморфизму гена TP53, тогда как инсерция 16 п.н.
(IVS3+41ins16bp) играла роль в развитии данного заболевания (Hu et al., 2010;
Ma et al., 2010). При этом в литературе имеются довольно противоре чивые данные о связи определенных генотипов (Ex4+119GC) с прогрессией РМЖ (Tommiska et al., 2005;
Xu et al., 2005;
Чердынцева и др., 2006;
Damin et al., 2006;
Toyama et al., 2007;
Costa et al., 2008;
Xu et al., 2008;
Hrstka et al., 2009). Недостаточная информативность мета-анализов и неоднозначность ре зультатов при оценке ассоциации полиморфизма TP53 с патогенетическими признаками заболевания могут быть обусловлены недоучетом статуса р собственно в опухолевых клетках, поскольку именно его нарушения в виде соматических мутаций, эпигенетических модификаций, аллельного дисба ланса (потеря гетерозиготности) лежат в основе злокачественной трансфор мации. Генетические изменения, приводящие к дисфункции опухолевых су прессоров, часто происходят в результате классического «двухударного» ме ханизма: соматические мутации либо метилирование в одном аллеле и утрата другого (Knudson, 1971, 2001). Ген TP53, как наиболее транскрипционно ак тивный, чья экспрессия индуцируется многими стрессорными стимулами, является высокочувствительной мишенью мутагенеза. При РМЖ до 50% опухолей содержат мутации в гене TP53, приводящие к частичной либо пол ной потере функциональности белка, и, более того, часто способствующие приобретению им онкогенных свойств. Такие различия в «функциональной значимости» мутаций, по-видимому, не позволяют получить однозначных результатов об их связи с проявлениями опухолевой прогрессии (Feki, Irminger-Finger, 2004;
Petitjean et al., 2007;
Brosh, Rotter, 2009). В литературе также есть немногочисленные указания, что метилирование гена TP53 при РМЖ может выступать в качестве альтернативного механизма инактивации белка р53 и ассоциировано с инвазивностью опухолевого процесса (Kang et al., 2001). Недавно в опухолевой ткани гетерозиготных по Ex4+119GC по лиморфизму больных РМЖ был показан феномен потери определенных ал лелей гена TP53 (Bonafe et al., 2003;
Kyndi et al., 2006). Более того, авторы выявили ассоциацию утраты аллелей с показателями выживаемости пациен тов, однако плохой прогноз в этих исследованиях был связан с потерей раз ных аллелей. Неоднозначность полученных этими авторами данных указы вает на важность продолжения исследований. Соматические мутации в гене TP53, метилирование и утрата аллелей могут обуславливать «двухударную»
инактивацию гена TP53, которая вносит вклад в формирование и прогрессию РМЖ. Все вышесказанное указывает на актуальность исследований, учиты вающих все возможные варианты изменений в гене TP53, которые могут оп ределять потенциальные механизмы его участия в опухолевой прогрессии РМЖ.
Цель исследования: Изучить мутационную изменчивость гена TP53, обусловленную генетическими вариациями, эпигенетическими модифика циями, потерей гетерозиготности и соматическими мутациями у больных ра ком молочной железы, и ее связь с патогенетически значимыми признаками заболевания.
Задачи исследования:
1. Оценить распределение генотипов по полиморфным вариантам гена TP53 в лейкоцитах периферической крови и в опухолевой ткани боль ных раком молочной железы.
2. Оценить потерю гетерозиготности на высоко вариабельных участках в локусе гена TP53 у гетерозиготных больных раком молочной железы с утратой аллелей в опухолевой ткани.
3. Провести анализ генетических и эпигенетических нарушений гена TP у больных раком молочной железы с утратой одного и сохранением дру гого аллелей в опухоли.
4. Провести анализ связи мутаций и генотипов по полиморфным вариан там гена TP53 у больных раком молочной железы с патогенетическими характеристиками опухолевого процесса, отражающими проявления опухолевой прогрессии.
Научная новизна исследования:
Впервые у больных раком молочной железы охарактеризован в сравни тельном аспекте полиморфизм гена TP53 (Ex4+119GC, IVS3+41ins16bp, IVS6+62GA) в лейкоцитах периферической крови и в опухоли. Показано, что в опухоли гетерозиготных по Ex4+119GC полиморфизму больных ра ком молочной железы утрата одного аллеля обусловлена делецией участка гена TP53, а инактивация другого – соматическими мутациями, что согласу ется с двухударной концепцией канцерогенеза А. Кнудсона. Впервые на тер ритории РФ выявлены новые мутации в гене TP53 у больных раком молоч ной железы: три в интронных областях – c.376-57AC, c.673-20GC, c.919+26_c.919+27ins1 и одна в 7-м экзоне – c.697_699del3, не представлен ные в базе IARC TP53 Mutation Database R14. Показано, что у больных, носи телей аллельного варианта C по Ex4+119GC полиморфизму гена TP53, реже отмечаются проявления опухолевой прогрессии по сравнению с пациентка ми, несущими G аллель. Наличие мутаций в полиморфных сайтах гена TP53, приводящих к несоответствию генотипов в лейкоцитах периферической кро ви и в опухолевой ткани больных РМЖ, ассоциировано с экспрессией рецеп торов к эстрогенам и прогестерону на опухолевых клетках.
Теоретическая и практическая значимость:
Полученные в данном исследовании результаты расширяют представле ния о молекулярно-генетических механизмах прогрессии рака молочной же лезы, в частности, о вкладе полиморфизма гена TP53 в развитие рака данной локализации. Одновременная оценка полиморфизма и соматического статуса гена TP53 может быть использована как оригинальный дополнительный ме тодологический подход для проведения исследований по изучению патогене за злокачественных новообразований других локализаций. На основании ре зультатов анализа связи молекулярно-генетических изменений гена TP53 в опухоли с патогенетическими характеристиками злокачественного процесса могут быть разработаны дополнительные критерии оценки прогноза клини ческого течения рака молочной железы, которые совместно со стандартными позволят повысить информативность прогноза и оптимизировать тактику ле чения, и, как следствие, увеличить эффективность терапии и качество жизни больных раком молочной железы. Новые сведения могут быть использованы в образовательном процессе при подготовке специалистов естественнонауч ного профиля.
Положения, выносимые на защиту:
1. Нарушения гена TP53 в опухоли гетерозиготных больных раком молоч ной железы могут происходить по принципу концепции двухударной инактивации А. Кнудсона, когда один аллель содержит мутацию, а дру гой делетирован.
2. Сравнительный анализ полиморфизма гена TP53 в лейкоцитах перифе рической крови и в опухолевой ткани может быть использован как до полнительный метод поиска инактивирующих событий данного гена при раке молочной железы.
3. Одновременная оценка полиморфизма и соматического статуса гена TP53 у больных раком молочной железы объективизирует представле ния о механизмах участия данного гена в прогрессии рака молочной же лезы.
Апробация работы: Материалы диссертационной работы были пред ставлены на: 54-57-й научных студенческих конференциях биолого почвенного факультета (Биологического института) Томского государствен ного университета “Старт в науку” (Томск, 2004-2008);
XLIII-XLV междуна родных научных студенческих конференциях “Студент и научно технический прогресс” (Новосибирск, 2005-2007);
I Российско-американской конференции “Биотехнология и онкология” (Санкт-Петербург, 2005);
Науч но-практической конференции “Достижения современной генетики”, посвя щенной 70-летию Новосибирской Государственной Медицинской Академии (Новосибирск, 2005);
X Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт Петербурге” (Санкт-Петербург, 2006);
Всероссийской конференции по фун даментальной онкологии “Петровские чтения – 2006, 2008” (Санкт Петербург, 2006, 2008);
XIV международной научной конференции студен тов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007);
II-IV региональных конференциях молодых ученых имени академика РАМН Н.В.
Васильева “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онколо гии” (Томск, 2007-2009);
III международной конференции “Фундаменталь ные науки медицине” (Новосибирск, 2007);
5-й международной конференции по раку молочной железы “Сердце, душа и наука: это всего лишь маленький мир” (Виннипег, Канада, 2008);
Российской научно-практической конферен ции с международным участием “Современные аспекты диагностики и лече ния рака молочной железы” (Томск, 2008);
Всероссийской конференции с международным участием “Молекулярная онкология” (Новосибирск, 2008);
13-й Зимней школе “Роль биомолекул в норме и при патологии” (Хельсинки, Финляндия, 2009);
Международной конференции по раку молочной железы (Брюссель, Бельгия, 2009);
Сибирско-Тайваньском форуме “Опыт научно технического и инновационного сотрудничества Томской области и Тайваня” (Томск, 2009).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 34 печатных работы, в том числе 4 статьи в журналах Перечня ведущих рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результа ты диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литера туры, описания материалов и методов исследования, собственных результа тов и их обсуждения, заключения и выводов. Данные проиллюстрированы таблицами, 16 рисунками. Библиографический список включает 223 источ ника, из них 30 работ отечественных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве материала исследования использовали образцы опухолевой ткани (n=80) и лейкоцитов периферической крови (n=80) больных споради ческим РМЖ в возрасте от 29 до 76 лет (средний возраст 51,7±1,6), получав ших комбинированное лечение в клинике НИИ Онкологии СО РАМН в 2004 2008 годах. Диагноз был подтвержден морфологически. В исследование включены больные с операбельной формой РМЖ стадии T1-4N0-2M0. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциально сти в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288). Было получено раз решение этического комитета НИИ Онкологии СО РАМН. Материалом для исследования послужила ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани больных РМЖ. В качестве негативного и позитив ного контролей при секвенировании нуклеотидной последовательности гена TP53 на участках 5, 7 и 8-го экзонов использовали ДНК опухолевых линий с заведомо известным статусом, любезно предоставленных профессором П.М. Чумаковым (Научно-исследовательский институт Лернера, Кливленд, США).
В ходе работы были изучены 3 полиморфных варианта гена TP53, мини и микросателлитные участки в гене TP53 (VNTR) и в локусе 17p13. (D17S796), метилирование промоторной области и 4-го экзона гена TP53, со матические мутации на участках 5, 7 и 8-го экзонов и в прилежащих к ним интронных областях гена TP53. В исследовании использована полимеразная цепная реакция и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, метил-специфическая полимеразная цепная реакция, секвенирование (табл.
1).
Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США), Fisher's exact test (Khan, 2003). Для проверки гипотезы о значимости различий между ис следуемыми группами использовали критерий согласия 2, определяемый Таблица 1 - Последовательности праймеров, используемые в данной работе Регион Праймеры п.н. Ссылка Ta 3-й интрон F5'-TGGGACTGACTTTCTGCTCTT-3' 57С (Wu et al., 2002) (IVS3+41ins16bp) R5'-TCAAATCATCCATTGCTTGG-3' 6-й интрон F5'-TGGCCATCTACAAGCAGTCA-3' 57С 404 (Wu et al., 2002) (IVS6+62GA) R5'-TTGCACATCTCATGGGGTTA-3' 4-й экзон F5'-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3' 63С 199 (Ara et al., 1990) (Ex4+119GC) R5'-TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3' VNTR F5'-ACTCCAGCCTGGGCAATAAGAGCT-3' (1-й интрон 64С 131 (Hahn et al., 1993) R5'-ACAAAACATCCCCTACCAAACAGC-3' гена TP53) F5'-CAATGGAACCAAATGTGGTC-3' 144 63С D17S796 (Grebe et al., 1997) R5'-AGTCCGATAATGCCAGGATG-3' Mt F5'-CGTCGTATTTCGGATTAGATTTC-3' Промотор Mt R5'-AAAAAAACGTAAACGCTTCTCGC-3' (Almeida et al., 55С (CG повторы) 2009) UnMt F5'-GGTTGTTGTATTTTGGATTAGATTTT-3' UnMt R5'-AAAAAAAACATAAACACTTCTCACC-3' 4-й экзон F5'-GTCGTTTTAAGTAATGGATG-3' 53С (CG повторы) R5'-AACAACTAACCGTACAAATCAC-3' F5'-GCCGTCTTCCAGTTGCTTTATC-3' 5-й экзон R5'-GCCAGACCTAAGAGCAATCAGTG-3' собственный дизайн F5'-GGAGAATGGCGTGAACCTGG-3' 7-й экзон 383 63С R5'-GGAAGAAATCGGTAAGAGGTGGG-3' F5'-GAATCTCCTTACTGCTCCCACTC-3' 8-й экзон R5'-GTCTCCTCCACCGCTTCTTG-3' Примечания: F – прямой праймер;
R – обратный праймер;
Mt, UnMt – праймеры на метилированную и неметилиро ванную последовательности;
Ta – температура отжига.
в четырехпольных таблицах (при значении абсолютных частот в анализируе мых ячейках больше 10). В том случае, если значение таковых было меньше 10 и 5, использовали критерий 2 с поправкой Йетса и точный критерий Фи шера (Ф), соответственно. Файлы секвенирования ДНК обрабатывали с по мощью пакета прикладных программ DNADynamo (Blue Tractor Software Ltd., Великобритания). В качестве референсной последовательности исполь зовали вариант гена TP53 (NC_000017.9), полученный из базы данных На ционального института биотехнологии (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Информацию об известных на настоящий момент мутациях в гене TP53 по лучали из соответствующей базы данных (IARC TP53 Mutation Database R14) (Petitjean et al., 2007). При анализе мутаций использована номенклатура (вер сия октябрь 2007 г.) описания генетических вариаций (den Dunnen, Antonarakis, 2000).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Распределение генотипов по полиморфизму гена TP (Ex4+119GC, IVS6+62GA и IVS3+41ins16bp) у больных РМЖ в крови и опухолевой ткани В опухолевой ткани больных РМЖ по сравнению с лейкоцитами пери ферической крови нами отмечена тенденция к уменьшению частоты гетеро зиготного генотипа по Ex4+119GC полиморфизму (p=0,09;
табл. 2).
Таблица 2 – Распределение генотипов гена TP53 (полиморфизм Ex4+119GC, IVS3+41ins16bp и IVS6+62GA) у больных РМЖ в лейкоцитах крови и в опухолевой ткани Парные образцы крови и опухоли РМЖ (n=80) Генотипы p* лейкоциты крови опухоль N % N % 42 52,5 39 48,8 0, G/G 32 40,0 22 27,5 0, G/C 6 7,5 6 7,5 1, Ex4+119GC C/C - - 11 13,7 G/ - - 2 2,5 -/C 65 81,3 61 76,3 0, w/w 14 17,5 15 18,7 0, w/16bp IVS3+41ins16bp 1 1,2 2 2,5 0, 16bp/16bp - - 2 2,5 w/ 63 78,8 58 72,5 0, G/G 16 20,0 21 26,3 0, IVS6+62GA G/A 1 1,2 1 1,2 1, A/A Примечания: * – уровень статистической значимости различий распре деления генотипов между лейкоцитами периферической крови и опухолевой тканью;
G/-, -/C и w/- – генотипы с утратой одного аллеля.
В 26,3% (21/80) случаев нами идентифицированы мутации в полиморф ных сайтах гена TP53 в опухолевой ткани больных РМЖ, приводящие к не соответствию генотипов в лейкоцитах периферической крови и в опухоли.
Большая часть (66,7%;
14/21) таких мутаций обусловлена утратой одного ал леля у гетерозиготных пациенток, в частности, в 78,6% (11/14) потерей алле ля С по Ex4+119GC полиморфизму (табл. 2, 3). Следует также отметить, что потеря аллелей гена TP53 детектировались почти у половины (38,9%;
14/36) гетерозиготных носителей (Ex4+119GC и IVS3+41ins16bp). В меньшем чис ле случаев (33,3%;
7/21) были обнаружены различные типы мутаций, пред ставленные точечными заменами c.214GC и c.672+62GA либо инсерцией 16 п.н. в полиморфных сайтах гена TP53 (Ex4+119GC, IVS6+62GA и IVS3+41ins16bp) (данные не представлены).
Таблица 3 – Мутации в полиморфных сайтах гена TP53, обнаруженные в опухолевой ткани больных раком молочной железы Генотип: кровь опухоль LOH Образец Ex4+119GC IVS3+41ins16bp IVS6+62GA VNTR D17S G/C G/ 1 - - - + G/C G/ 2 - - - + G/C G/ 3 - - + + G/C G/ 4 - - + + G/C G/ 5 - - - G/C G/ 6 - - + + G/C G/ 7 - - + + G/C G/ 8 - - + + G/C G/- w/16bp w/ 9 - + + G/C G/ 10 - - + G/C G/- w/w w/16bp G/G G/A 11 + + G/С C/ 12 - - - + G/С C/ 13 - - - w/16bp w/ 14 - - - + Примечания: LOH – оценка потери гетерозиготности по мини- и микро сателлитному локусам;
“-” – отсутствие LOH на данном участке;
“+” – нали чие LOH.
Изучение потери гетерозиготности у больных РМЖ, носителей гете розиготного генотипа гена TP53 (Ex4+119GC и IVS3+41ins16bp) с утра той аллелей в опухоли Проведенный анализ мини- и микросателлитных локусов показал, что большинство гетерозиготных больных РМЖ (85,7%, 12/14), в опухоли кото рых отмечалась утрата одного аллеля, характеризуется аллельным дисбалан сом на двух локусах, при этом на вариабельном участке 1-го интрона гена TP53 LOH детектировалась в 57,1% (8/14) случаев (Рис. 1;
табл. 3).
Рис. 1 – Пример анализа потери гетерозиготности по участкам VNTR в 1-м интроне гена TP53 (А) и D17S796 (В). 1 – образец с LOH;
2 – образец без LOH;
* – уровень флюоресценции;
** – температура плавления.
Изучение метилирования и соматических мутаций гена TP у гетерозиготных больных РМЖ с потерей одного и сохранением другого аллелей Метилирование CG пар в промоторной области ассоциировано с потерей генной экспрессии и прекращением образования белкового продукта (Agirre et al., 2003;
Duffy et al., 2009). Кроме того, эпигенетические модификации эк зонных областей могут отражаться на компактизации хроматина и снижении интенсивности репликации ДНК (Sharma et al., 2010). В соответствии с этим нами проведен анализ метилирования промотора, а также 4-го экзона гена TP53 ввиду того, что большинство случаев делеции аллелей детектировалось у гетерозиготных по Ex4+119GC полиморфизму больных РМЖ (табл. 3). Ни в одном из проанализированных нами опухолевых образцов не установлено метилирование CG пар промоторной области гена TP53 (Рис. 2А). При ана лизе статуса метилирования CG повторов 4-го экзона гена TP53 мы обнару жили, что ДНК лейкоцитов периферической крови здоровых людей, а также опухолевая ДНК пациенток с РМЖ содержали метилированные цитозины (Рис. 2Б). Данный факт весьма интересен, поскольку ранее высокий уровень (до 50%) метилирования 4-го экзона был отмечен в бластоцистах зародышей человека (Magdinier et al., 2002). В связи с этим авторами сделано предполо жение о значительной роли процесса метилирования гена TP53 на участке 4 го экзона в предимплантационном развитии организма человека. Однако в настоящее время показано, что метилирование достаточно часто встречается и в отсутствии патологии, т.е в норме (Zhang, Meaney, 2010).
При секвенировании 5, 7 и 8-го экзонов и прилежащих к ним интронных областей гена TP53 (Рис. 2 В,Г) у больных РМЖ с соматическими мута циями данного гена чаще наблюдалась потеря аллеля С (Ex4+119GC) Рис. 2 – Анализ метилирования промоторной области (А), 4-го экзона (Б) и хроматограммы анализа нуклеотидной последовательности (В, Г) гена TP53 в опухолевой ткани больных РМЖ. ММВ – маркер молекулярного веса;
НК, ПК – негативный и позитивный контроли;
М, НМ – праймеры на метилированную и неметилированную последовательности;
НМР – неметилированная референсная последовательность;
О – опухолевый образец;
А431 – опухолевая линия.
(табл. 4, табл. 5;
точный критерий Фишера: односторонний p=0,02;
двусто ронний p=0,03).
Таблица 4 – Частота потери аллеля С (Ex4+119GC) гена TP53 у боль ных РМЖ с наличием либо отсутствием соматических мутаций в 5, 7 и 8-м экзонах и прилежащих к ним интронах Наличие мутаций гена TP норма (n=19) мутации (n=15) p N % N % 16 84,2 7 46, - 0,02* Потеря аллеля С 0,03** 3 15,8 8 53, + Примечания: “-”, “+” – отсутствие/наличие потери аллеля С. В таблице приведен уровень статистической значимости точного одностороннего (*) и двустороннего (**) критерия Фишера.
Таблица 5 – Соматические мутации гена TP53, обнаруженные у больных РМЖ Позиция Частота в IARC Тип Участок в кДНК и первичной TP53 Mutation мутации структуре белка р53 Database R Интрон интронная 4 c.376-57AC * интронная 6 c.673-20GC * интронная 7 c.782+18AT ** интронная 8 c.919+26_c.919+27ins1 * Экзон сайленс 5 c.390CT, p.Leu130Leu 0, миссенс 5 c.466CT, p.Arg156Cys 1, миссенс 5 c.488AG, p.Tyr163Cys 0, миссенс 5 c.501GC, p.Gln167His 0, миссенс 5 c.538GA, p.Glu180Lys 0, миссенс 5 c.541CT, p.Arg181Cys 1, миссенс 5 c.557AG, p.Asp186Gly 0, фреймшифт 7 c.697_699del3 * миссенс 7 c.697CT, p.His233Tyr 0, миссенс 7 c.743GA, p.Arg248Gln 1, сайленс 7 c.762CT, p.Ile254Ile 0, миссенс 8 c.827CA, p.Ala276Asp 0, миссенс 8 c.856GA, p.Glu286Lys 0, Примечания: * – новые мутации в гене TP53, ранее не представленные в IARC TP53 Mutation Database R14;
** – частота мутации не приведена в IARC TP53 Mutation Database R14.
Проведенный анализ соматических мутаций в гене TP53 у больных РМЖ позволил получить приоритетные сведения, поскольку в настоящее время данный тип нарушений в опухолях молочной железы на территории Российской Федерации охарактеризован плохо. В текущей версии IARC TP Mutation Database R14 информация о мутациях гена TP53 при РМЖ в РФ не представлена совсем (Petitjean et al., 2007). Однако, в 2008-м году группой российских исследователей охарактеризован спектр соматических мутаций у российских женщин с уни- и билатеральным РМЖ (Suspitsin et al., 2008). В нашем исследовании большинство мутаций ранее были обнаружены при РМЖ другими авторами (табл. 5), однако одна – c.501GC – идентифициро вана при данном заболевании впервые. Четыре мутации (три в интронных областях – c.376-57AC, c.673-20GC, c.919+26_c.919+27ins1 и одна в 7-м экзоне – c.697_699del3) обнаружены нами впервые (данные нарушения не представлены в IARC TP53 Mutation Database R14).
Двухударная модель инактивации гена TP53 при раке молочной железы Учитывая вышеприведенные результаты, можно заключить, что инакти вация гена TP53 при РМЖ происходит в рамках двухударной концепции А. Кнудсона, когда один аллель содержит мутацию, а второй делетирован. В большинстве случаев мы наблюдаем данную закономерность для гетерози готных по Ex4+119GC полиморфизму больных РМЖ, при этом функцио нальная дифференциация между аллелями может определять инактивирую щие события в гене TP53 (Рис. 3). В частности, аллельный вариант С, белок р53Pro которого является ярко выраженной трансактивационной и репараци онной молекулой, преимущественно утрачивается посредством делеции (по теря гетерозиготности), а аллель G, кодирующий более слабый в плане защи ты от стрессорных воздействий белок р53Arg, инактивируется точечными мутациями в 5, 7 и 8-м экзонах гена TP53.
Рис. 3 – Двухударная модель инактивации гена-супрессора опухолевого роста TP53 при раке молочной железы. Рассмотрен пример инактивации гена TP53 у гетерозиготных по Ex4+119GC полиморфизму больных РМЖ.
Полиморфизм гена TP53 (Ex4+119GC, IVS6+62GA и IVS3+41ins16bp) и клиническое течение рака молочной железы Были изучены частоты различных генотипов и аллелей гена TP53 у больных РМЖ с различными патогенетическими характеристиками злокаче ственного процесса. Отмечено, что у больных РМЖ с генотипом С/С (Ex4+119GC) по сравнению с пациентками с G/G и G/C чаще наблюдался клинически более благоприятный локализованный процесс заболевания (83,3% против 35,7% и 34,4%, соответственно;
точный критерий Фишера:
односторонний p=0,03;
двусторонний p=0,06). Кроме того, у женщин с гено типом С/С отмечался только уницентрический характер роста опухоли, тогда как почти у четверти носителей G/G генотипа обнаружены мультифокальные опухоли, более агрессивные по своей природе (табл. 6). Следует отметить, что и носителей аллеля С было вдвое больше в группе больных с уницентри ческими опухолями, чем среди больных с мультицентрическим ростом (дан ные не представлены). Также установлено, что у больных РМЖ с наличием экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону на опухолевых клетках по сравнению с пациентками с рецептор-негативными опухолями чаще встречаются обнаруженные нами мутации в полиморфных сайтах гена TP (данные не представлены).
Таблица 6 – Частота уницентрического (УЦ) и мультицентрического (МЦ) РМЖ, отсутствие (N0) и наличие (N1-2) локорегионарного метастазиро вания у больных с генотипами по полиморфизму Ex4+119GC гена TP53.
G/G G/C C/C Генотипы (Ex4+119GC) N % N % N % УЦ Характер 28 75,7 22 81,5 6 100, опухолевого роста МЦ 9 24,3 5 18,5 0 0, 0,80* p Лимфогенное 15 35,7 11 34,4 5 83, N метастазирование 27 64,3 21 65,6 1 16, N1- 0,03** 0,90* p 0,06*** Примечания: * – уровень статистической значимости различий между больными РМЖ с генотипами G/G и G/C;
**, *** – уровень статистической значимости точного одностороннего и двустороннего критерия Фишера, со ответственно, показывающий различия между группами больных РМЖ с ге нотипами G/G и C/C, G/C и C/C.
Заключение В данной работе проведено изучение полиморфизма гена TP (Ex4+119GC, IVS6+62GA и IVS3+41ins16bp) в лейкоцитах перифериче ской крови и в опухоли больных РМЖ, выявлены основные события, приво дящие к инактивации р53 в опухоли по принципу двухударного механизма.
Осуществлена оценка влияния полиморфных вариантов и мутаций гена TP на клиническое течение РМЖ посредством выявления связи с различными проявлениями опухолевой прогрессии.
РМЖ характеризуется чрезвычайной вариабельностью течения злокаче ственного процесса, молекулярные механизмы которого во многом остаются неясными. Нарушения в гене TP53, который осуществляет регуляцию генов, вовлеченных в опухолевую прогрессию, могут вносить вклад в клиническое течение РМЖ. По нашим результатам больные РМЖ, носители генотипа С/С (Ex4+119GC полиморфизм), чаще характеризуются менее агрессивным уницентрическим ростом опухоли и низкой склонностью к лимфогенному метастазированию, что может обеспечивать благоприятный прогноз заболе вания для данной категории больных РМЖ. Показанная закономерность кос венно подтверждается данными о пониженном риске регионарного метаста зирования у пациенток с уницентрическим РМЖ (Керимов, 2006;
Вторушин, 2007). Механизм вклада Ex4+119GC полиморфизма гена TP53 в указанные проявления опухолевой прогрессии может объясняться высоким трансакти вационным потенциалом белка p53Pro, кодируемого аллелем C, в отношении индукции транскрипции антиметастатических генов и генов, ответственных за характер опухолевого роста и другие клинические формы прогрессии РМЖ (Mashimo et al., 1998;
Zou et al., 2000;
van Golen, 2003;
Stein et al., 2004;
Bertucci et al., 2005;
Van Laere et al., 2005;
Wallden et al., 2005;
Janicke et al., 2008).
В 26,3% (21/80) случаев у больных РМЖ в опухолевой ткани показаны мутации в полиморфных сайтах (Ex4+119GC, IVS6+62GA и IVS3+41ins16bp) гена TP53, обусловленные в большинстве своем (66,7%;
14/21) утратой одного аллеля у гетерозиготных пациенток, среди них в 78,6% (11/14) случаев отмечена потеря аллеля С по Ex4+119GC полиморфизму.
Следует отметить, что утрата аллелей гена TP53 детектировались почти у по ловины (38,9%;
14/36) гетерозиготных носителей. Мы показали, что основ ным механизмом, приводящим к потере аллелей, в частности, аллеля C, явля ется делеция участка гена TP53. Кроме того, потеря аллеля С и, соответст венно, сохранение аллеля G, чаще встречаются у больных c соматическими мутациями гена TP53 на участках 5, 7 и 8-го экзонов и прилежащих к ним интронах. Среди идентифицированных соматических мутаций гена TP53 че тыре (три в интронных областях – c.376-57AC, c.673-20GC, c.919+26_c.919+27ins1 и одна в 7-м экзоне – c.697_699del3) обнаружены впервые, т.к. они не представлены в базе IARC TP53 Mutation Database R (Petitjean et al., 2007). Закономерность сочетания делеций, приводящих к по тере аллеля С, и высокой частоты соматических мутаций, инактивирующих аллель G, позволяет нам рассмотреть данный феномен как подтверждение двухударной инактивации гена TP53 в течении развития РМЖ (концепция А. Кнудсона). В клиническом ракурсе формирование мутаций в полиморф ных сайтах гена TP53 ассоциировано с экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону. Механизм ассоциации, вероятно, заключается в наличии не посредственного генотоксического воздействия метаболитов эстрогенов на ген TP53 (Joosten et al., 2004;
Zoon et al., 2009).
Литературные сведения о наличии высокого трансактивационного и ре парационного потенциала для кодируемого белка р53Pro (Thomas et al., 1999;
Pim, Banks, 2004;
Siddique, Sabapathy, 2006) наряду с нашими данными о свя зи кодирующего белок р53Pro аллеля С (Ex4+119GC) с более благоприят ным клиническим течением РМЖ и высокой частоте его потери в опухоли молочной железы, вероятно, придающей опухолевым клеткам селективное преимущество в росте, позволяют характеризовать данную молекулу р53 как наиболее биологически активную по сравнению с р53Arg в плане проявления протективных свойств в отношении прогрессии РМЖ. Таким образом, на ос новании этого, а также учитывая ранее показанную в другом исследовании связь утраты аллеля С в опухолевой ткани с низкой безрецидивной и общей выживаемостью (Bonafe et al., 2003), мы можем рекомендовать анализ Ex4+119GC полиморфизма гена TP53 и его соматического статуса в опухо ли как дополнительный метод оценки злокачественности клинического тече ния в плане прогноза заболевания.
Полученные в исследовании результаты расширяют представления о вкладе гена TP53 в патогенез рака молочной железы. Данные о связи аллелей и мутаций гена TP53 с клиническими проявлениями опухолевой прогрессии могут служить основой для разработки дополнительных прогностических критериев заболевания.
ВЫВОДЫ В 26,3% случаев у больных раком молочной железы в опухолевой ткани 1.
отмечены мутации в полиморфных сайтах (Ex4+119GC, IVS6+62GA и IVS3+41ins16bp) гена TP53, в большинстве своем (66,7%) обусловленные утратой одного аллеля у гетерозиготных пациенток в 40,0% случаев, при этом в 78,6% выявлена потеря аллеля С (Ex4+119GC).
У больных раком молочной железы, носителей гетерозиготного генотипа 2.
(Ex4+119GC ), утрата одного из аллелей в опухоли объясняется делеци ей участка гена TP53, что подтверждается высоким уровнем (85,7%) по тери гетерозиготности в локусе VNTR 1-го интрона гена TP53 и на участ ке хромосомы 17p13.1 (локус D17S796) у данной категории пациенток.
У пациенток с раком молочной железы в случаях утраты одного и сохра 3.
нения другого аллеля гена TP53 в опухолевой ткани не обнаружено мети лирование промоторной области данного гена.
Частота потери аллеля С (Ex4+119GC) гена TP53 в опухолевой ткани 4.
существенно выше у больных раком молочной железы с мутантным р (5,7, 8-й экзоны и смежные интроны) по сравнению с пациентками, не имеющими р53 мутаций (53,3% против 15,8%;
точный критерий Фишера:
односторонний p=0,02;
двусторонний p=0,03).
В опухолевой ткани больных раком молочной железы идентифицированы 5.
четыре новые мутации гена TP53 (три в интронных областях – c.376 57AC, c.673-20GC, c.919+26_c.919+27ins1 и одна в 7-м экзоне – c.697_699del3), которые не представлены в последней версии IARС TP Database Mutation R14.
6. У пациенток с генотипом С/С (Ex4+119GC) чаще наблюдался клиниче ски благоприятный локализованный процесс (83,3%) заболевания по сравнению с носителями G/G (35,7%) и G/C (34,4%;
точный критерий Фишера: односторонний p=0,03;
двусторонний p=0,06) генотипов.
7. У больных раком молочной железы с экспрессией на клетках опухоли ре цепторов к эстрогенам и прогестерону чаще встречаются мутации в по лиморфных сайтах гена TP53 (31,9% и 35,9%), чем у пациенток с отсутст вием экспрессии (11,5%;
12,5%;
точный критерий Фишера: односторон ний p=0,04 и 0,02;
двусторонний p=0,08 и 0,03, соответственно).
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Белявская В.А., Бабышкина Н.Н., 1.
Сметанникова Н.А., Гервас П.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Гарбу ков Е.Ю., Малиновская Е.А., Литвяков Н.В., Воевода М.И. Исследова ние связи полиморфизма генов онкосупрессора p53, гена хемокинового рецептора CCR5 и их сочетаний с риском развития и прогрессированием рака молочной железы // Молекулярная медицина. 2007. № 1. С. 23–31.
Денисов Е.В., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Гарбуков Е.Ю., Слоним 2.
ская Е.М., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Стегний В.Н., Чердын цева Н.В. Мутации в гене-супрессоре TP53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы // Сибирский онкологиче ский журнал. 2008. № 2. С. 32-36.
Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Слонимская Е.М., 3.
Крицкая Н.Г., Гарбуков Е.Ю., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Бабышки на Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Григорьева Е.С., Назаренко М.С., Сенников С.В., Горева Е.П., Козлов В.А., Воевода М.И., Максимов В.Н., Белявская В.А., Чердынцева Н.В. Генетические и клинико патологические особенности рака молочной железы у больных с сохра ненной менструальной функцией и в менопаузе // Успехи геронтологии.
2008. Т. 21, № 4. С. 643-653.
4. Denisov E.V., Cherdyntseva N.V., Litvjakov N.V., Malinovskaya E.A., Voe voda M.I., Belyavskaya V.A., Stegniy V.N. TP53 mutations and Arg72Pro polymorphism in breast cancer patients’ tumors // Cancer Genetics and Cyto genetics. 2009. Vol. 192. P. 93-95.
Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Ба 5.
бышкина Н.Н., Гарбуков Е.Ю., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Доро шенко А.В., Красулина Н.А. Механизмы опухолевой прогрессии: роль генов апоптоза и цитокинов// Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. Вып. 11. Новоси бирск: Альфа Виста, 2007. С. 28-39.
Денисов Е.В., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Малиновская Е.А., Ба 6.
бышкина Н.Н., Стегний В.Н., Белявская В.А., Воевода М.И., Чердынцева Н.В. Изучение взаимосвязи Arg72Pro полиморфизма и соматических му таций гена TP53 у больных раком молочной железы // Молекулярно биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Мас ленникова. Вып.13. Новосибирск: Альфа Виста, 2009. С. 66-74.
7. Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Гуляева Л.Ф., Пустыльняк В.О., Гарбуков Е.Ю., Литвя ков Н.В., Стахеева М.Н., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Григорьева Е.С., Лебедев И.Н., Назаренко М.С., Сенников С.В., Силков А.Н., Жовмер А.С., Горева Е.П., Гришанова А.Ю., Горева О.Б., Середина Т.А., Талабан В.О., Ляхович В.В., Голованова О.В., Шевченко А.В., Салахутдинова М.Ю., Максимов В.Н., Воевода М.И., Коненков В.И., Пузырев В.П., Козлов В.А. Генетические полиморфизмы в риске формирования и прогрессии рака молочной железы в сибирском регионе России // Материалы Сибирско-Тайваньского форума. Томск, 2009.
С. 19-25.
8. Денисов Е.В., Гервас П.А. Полиморфизм онкосупрессорного гена р53 и гена хемокинового рецептора CCR5 у больных раком молочной железы // Материалы XLIII международной студенческой конференции «Сту дент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2005. С. 17.
9. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Севостьянова Н.В., Уразова Л.Н., Гер вас П.А., Коломиец С.А., Литвяков Н.В., Денисов Е.В., Воевода М.И., Чойнзонов Е.Ц. CCR5 как потенциальный медиатр активности P53: ком бинации аллеальных полиморфизмов CCR5 и P53 у больных со злокаче ственными новообразованиями // Тезисы I Российско-американской конференции “Биотехнология и онкология”. Санкт-Петербург, 2005.
С. 142-143.
10. Гервас П.А., Бабышкина Н.Н., Денисов Е.В., Слонимская Е.М., Стахее ва М.Н., Чердынцева Н.В. Исследование полиморфизма 72 кодона гена р53 у больных раком молочной железы // Материалы итоговой научно практической конференции с международным участием “Актуальные вопросы здравоохранения регионов Сибири”. Красноярск, 2005.
С. 299-300.
11. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Севостьянова Н.В., Гервас П.А., Ура зова Л.Н., Слонимская Е.М., Коломиец С.А., Литвяков Н.В., Бабышкина Н.Н., Стахеева М.Н., Денисов Е.В., Воевода М.И., Чойнзонов Е.Л. Ис следование роли комбинаций вариантных аллелей генов апоптоза, фер ментов метаболизма и цитокинов в риске возникновения и прогнозе клинического течения злокачественных новообразований // Материалы II международной конференции “Молекулярная медицина и биобезо пасность”. Москва, 2005. С. 283-284.
12. Гервас П.А., Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Стахеева М.Н., Слоним ская Е.М., Белявская В.А., Чердынцева Н.В. Опухолеассоциированный полиморфизм генов р53 и CCR5 у больных раком молочной железы // Тезисы I Съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 2005. С. 180-182.
Денисов Е.В., Гервас П.А., Бабышкина Н.Н., Савенкова О.В., Глущенко 13.
С.А., Малиновская Е.А. Полиморфизм участков генов р53 и хемокино вого рецептора CCR5: связь с прогрессией рака молочной железы // Ма териалы XLIV международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» Новосибирск, 2006. С. 116.
Денисов Е.В., Гервас П.А., Бабышкина Н.Н., Савенкова О.В., Глущенко 14.
С.А., Малиновская Е.А. Популяционно-генетический анализ связи по лиморфизма участков генов р53 и CCR5 с прогрессией рака молочной железы // Материалы LV научной студенческой конференции биолого почвенного факультета Томского государственного университета “Старт в науку”. Томск, 2006. С. 3-4.
15. Cherdyntseva N.V., Belyavskaya V.A., Gervas P.A., Fleming M.V., Sevos tyanova N.V., Kolomiets S.A., Denisov E.V., Slonimskaya E.M., Voevoda M.I., Perelmuter V.M., Choinzonov E.L. Cytokine and apoptotic gene poly morphism association with cancer progression and prognosis // The proceed ings of 3rd International conference. Novosibirsk, 2006. P. 23.
Бабышкина Н.Н., Гервас П.А., Денисов Е.В., Сметанникова Н.А., Беляв 16.
ская В.А., Стахеева М.Н., Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М. Полимор физм гена хемокиновго рецептора CCR5 и онкосупрессорного белка р53: взаимосвязь с рискм формирования и прогрессированием рака мо лочной железы // Материалы X Российского онкологического конгресса.
Москва, 2006. С. 168.
Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит 17.
вяков Н.В. Анализ полиморфизма и соматических мутаций гена p53 при раке молочной железы // Материалы XLV международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2007. С. 149-150.
Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит 18.
вяков Н.В., Чердынцева Н.В. Генетический полиморфизм и мутации онкосупрессорного гена p53 у больных раком молочной железы // Тези сы XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 2007. С. 51-52.
Денисов Е.В., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Малиновская Е.А., Ба 19.
бышкина Н.Н., Григорьева Е.А., Гарбуков Е.Ю., Чердынцева Н.В. Взаи мосвязь Arg72Pro полиморфизма гена p53 с у уровнем соматических му таций того же гена в клетках рака молочной железы // Материалы 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2007». Санкт-Петербург, 2007. С. 12-13.
Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит 20.
вяков Н.В. Мутации и полиморфизм в гене р53 у больных раком молоч ной железы // Материалы LVI научной студенческой конференции био лого-почвенного факультета Томского государственного университета “Старт в науку” Томск, 2007. С. 8-9.
Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит 21.
вяков Н.В. Взаимосвязь соматических мутаций полиморфизма гена р у больных раком молочной железы // Материалы региональной конфе ренции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева “Акту альные вопросы экспериментальной и клинической онкологии”. Томск, 2007. С. 39-41.
Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Лит 22.
вяков Н.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Статус гена p53 при раке молочной железы: взаимосвязь мутаций и полиморфизма 72 кодона // Материалы III международной конференции «Фундаментальные науки медицине». Новосибирск, 2007. С. 23.
Чердынцева Н.В., Гервас П.А., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., 23.
Литвяков Н.В., Денисов Е.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Тузиков С.А., Белявская В.А., Воевода М.И., Перельмутер В.М. Подходы генети ческой эпидемиологии: от оценки риска до прогнозирования исхода зло качественных новообразований // Материалы III международной конфе ренции «Фундаментальные науки - медицине». Новосибирск, 2007.
С. 81.
Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Лит 24.
вяков Н.В. Полиморфизм и частота соматических мутаций гена р53 у больных раком молочной железы // Научные труды VIII конференции с международным участием “Генетика человека и патология”. Томск, 2007. С. 311-312.
Чердынцева Н.В., Гервас П.А., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Ба 25.
бышкина Н.Н., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Тузи ков С.А., Гарбуков Е.Ю., Перельмутер В.М., Белявская В.А., Воевода М.И. Полиморфизм гена онкосупрессора р53 и функционально связан ных генов в оценке риска и прогноза злокачественных новообразований // Научные труды VIII конференции с международным участием “Гене тика человека и патология”. Томск, 2007. С. 324-325.
Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Вто 26.
рушин С.В., Глущенко С.А., Литвяков Н.В. Мутации гена TP53 при раке молочной железы и их взаимосвязь с клинико-патологическими пара метрами заболевания // Материалы III региональной конференции моло дых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева “Актуальные вопро сы экспериментальной и клинической онкологии”. Томск, 2008.
С. 39-40.
Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Сло 27.
нимская Е.М., Чердынцева Н.В. Изучение связи полиморфных вариан тов генов CCR5 и P53 с лимфогенным метастазированием у больных ра ком молочной железы // Материалы Российской научно-практической конференции “Современные аспекты диагностики и лечения рака мо лочной железы”. Томск, 2008. С. 25-26.
Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Литвяков Н.В., 28.
Стегний В.Н., Чердынцева Н.В. Селективная инактивация Arg72Pro ал лелей гена TP53 при раке молочной железы // Материалы всероссийской конференции с международным участием “Молекулярная онкология”.
Новосибирск, 2008. С. 13-14.
Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Чер 29.
дынцева Н.В., Слонимская Е.М. Взаимосвязь полиморфных вариантов гена-онкосупрессора р53 и гена хемокинового рецептора ССR5 с риском возникновения и прогрессированием рака молочной железы // Материа лы всероссийской конференции с международным участием “Молеку лярная онкология”. Новосибирск, 2008. С. 77-78.
Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Гервас П.А., Добродеев А.Ю., Дени 30.
сов Е.В., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В., Тузиков С.А., Слонимская Е.М., Перельмутер В.М. Роль гена р53 в формирова нии и прогрессии злокачественных новообразований // Материалы все российской конференции с международным участием “Молекулярная онкология”. Новосибирск, 2008. С. 165-166.
31. Denisov E.V., Babyshkina N.N., Litvjakov N.V., Malinovskaya E.V., Slo nimskaya E.M., Stegniy V.N., Cherdyntseva N.V. TP53 gene mutations and Pro72Arg polymorphism in breast patient’s tumour //
Abstract
Book of IM PAKT Breast Cancer Conference. Brussels, 2009. P. ii38.
Денисов Е.В., Сухановская Т.В., Литвяков Н.В., Малиновская Е.А., 32.
Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Статус гена TP53 как прогностиче ский маркер рака молочной железы // Материалы Сибирско Тайваньского форума. Томск, 2009. С. 102-103.
Денисов Е.В., Сухановская Т.В., Дульцева Т.С., Малиновская Е.А. По 33.
лиморфизм Arg72Pro гена TP53 в опухолевой ткани: связь с характером опухолевого роста рака молочной железы // Материалы V региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии”.
Томск, 2010. С. 38-39.
Дульцева Т.С., Сухановская Т.В., Денисов Е.В. Новые мутации в гене 34.
супрессоре опухолевого роста TP53 у больных раком молочной железы // Материалы V региональной конференции молодых ученых им. Акаде мика РАМН Н.В. Васильева “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии”. Томск, 2010. С. 39-40.