Биокаталитическое окисление -ситостерола и его 3-ацил производных актинобактериями рода rhodococcus
На правах рукописи
НОГОВИЦИНА Екатерина Михайловна
БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
-СИТОСТЕРОЛА И ЕГО 3-АЦИЛ ПРОИЗВОДНЫХ
АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS
03.00.07 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пермь – 2007
2
Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научные руководители:
член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна кандидат химических наук Гришко Виктория Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат медицинских наук, доцент Коробов Владимир Павлович
Ведущая организация: Казанский государственный университет, кафедра микробиологии, Казань
Защита состоится «»_2007 г. в_ часов на заседании диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342)2446711.
Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан «»_2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, Ившина Ирина Борисовна чл.-корр. РАН
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Биотрансформация стеролов растительного и животного происхождения до андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен 3,17-диона, в результате которой осуществляются реакции окисления 3-гидроксильной группы в оксогруппу, окислительного отщепления алифатической боковой цепи стерола, изомеризации и дегидрогенизации – основная стадия процесса промышленного получения многих лекарственных гормональных препаратов. Среди оксигенированных метаболитов стеролов обнаружены вещества с выраженной противовоспалительной, иммуносупрессивной, гестагенной, диуретической, анаболической, контрацептивной, антифунгицидной активностью. В отличие от химического синтеза, микробиологические методы конверсии органических соединений дают возможность получать целевые продукты с высоким выходом в одну технологическую стадию, при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях. Ферментативный катализ позволяет осуществлять направленную трансформацию гидрофобных стериновых субстратов с высокой степенью регио- и стереоселективности, что является необходимым требованием для проявления биологической активности образующихся стероидных продуктов.
Процесс окислительной биотрансформации стеролов растительного и животного происхождения в андростановые соединения наиболее эффективно катализируется с использованием прокариотных организмов (Донова, 2006, 2007;
Mahato, Majumdar, 1993;
Mahato, Garai, 1997;
Fernandes et al., 2003). Одним из наиболее доступных стериновых субстратов для микроорганизмов является -ситостерол – растительный стерол, получаемый из отходов деревообрабатывающей промышленности. Известно, что в большинстве случаев первый этап биоконверсии -ситостерола катализируется бифункциональным ферментом холестеролоксидазой, ответственной за реакции окисления 3-гидроксильной группы в оксогруппу и изомеризации двойной связи при С-5 в С-4 положение. При этом образуется 3-оксосоединение – стигмаст-4-ен-3-он, который может в дальнейшем трансформироваться до андростановых производных – андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона. На следующей схеме представлены возможные пути биотрансформации -ситостерола:
O С т и гм ас т-4 -е н -3 -о н O O HO А н д р о с т-4 -ен -3,1 7 -д и о н -С и то ст ер о л O O А н д р о с та-1,4 -д и ен -3,1 7 -д и о н В настоящее время накапливается все больше сведений о способности к осуществлению селективной деградации боковой цепи стеролов представителями класса Actinobacteria (Stackebrandt et al., 1997). Среди актинобактерий высокой активностью оксигеназ и способностью ассимилировать гидрофобные субстраты отличаются представители рода Rhodococcus. Следует отметить, что типично бактериальный, а не мицелиальный характер роста родококков, способность их усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические субстраты в широком диапазоне концентрации и расти на минимальных средах, специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем и активность в экстремальных условиях внешней среды – все это делает использование этой группы актинобактерий технологически перспективным. Однако следует отметить, что сегодня известны пока лишь единичные работы по биоконверсии -ситостерола интактными клетками родококков (Iida et al., 1985;
Murohisa, Iida, 1993;
Mahato, Garai, 1997;
MacLachlan et al., 2000). В связи с этим актуальным является поиск новых бактериальных культур, катализирующих целевые реакции трансформации соединений с циклопентанопергидрофенантреновым остовом. С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol), включающего большое собрание чистых идентифицированных непатогенных штаммов родококков, выделенных из разнообразных природных субстратов (Catalogue of strains, 2005), представлялось возможным провести сравнительное исследование проявления стеролтрансформирующей активности в пределах данного рода, подобрать оптимальные условия и, по возможности, выявить новые продукты биоконверсии -ситостерола.
Цель настоящего исследования – оценка возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для биокаталитического окисления -ситостерола и его 3-ацилпроизводных.
Основные задачи исследования 1. Исследовать биокаталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении -ситостерола. Отобрать штаммы – наиболее активные биотрансформаторы -ситостерола.
2. Разработать оптимальные условия процесса окислительной трансформации -ситостерола с использованием алканотрофных родококков.
3. Провести сравнительное исследование холестеролоксидазной активности коллекционных культур родококков.
4. Изучить влияние индукторов и ингибиторов на стеролтрансформирующую активность родококков.
Научная новизна. Проведен анализ биокаталитической активности большого массива коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus в отношении -ситостерола и его 3-ацилпроизводных. Выявлена корреляция между видовой принадлежностью штаммов родококков и стеролтрансформирующей активностью. Показано, что представители вида R. ruber характеризуются наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении -ситостерола.
Установлено, что родококки активно трансформируют -ситостерол в стигмаст-4-ен-3-он в соокислительных условиях в процессе роста на н-гексадекане.
Выявлена зависимость холестеролоксидазной активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола. Экспериментально обосновано, что связанная пальмитиновая кислота, являющаяся структурным аналогом алифатической боковой цепи -ситостерола, оказывает индуктивное воздействие на активность холестеролоксидазы родококков. Обнаружено, что родококки в условиях кометаболизма в присутствии ростового субстрата глюкозы и ингибитора 9-гидроксилазы 2,2-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи -ситостерола с образованием андрост-4 ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона. Впервые обнаружено, что клетки R.
ruber катализируют наряду с реакциями окисления -ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата -ситостерола. Экспериментально подтверждена энзиматическая природа данной трансформационной реакции, которая реализуется в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биокаталическом потенциале актинобактерий рода Rhodococcus. В результате проведенных исследований отобраны культуры Rhodococcus spp., трансформирующие -ситостерол с образованием целевых продуктов, востребуемых в фармацевтической практике. Активные штаммы – биотрансформаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений – ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств.
Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах -ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет (http://www.iegm.ru/iegmcol).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Актинобактерии рода Rhodococcus проявляют выраженную холестеролоксидазную активность в отношении -ситостерола в соокислительных условиях в присутствии с н-гексадекана с образованием до 98 % стигмаст-4-ен-3 она.
2. Холестеролоксидаза представителей R. ruber обладает более высокой активностью в отношении -ситостерола по сравнению с таковой к холестеролу.
Холестеролоксидазная активность родококков индуцируется при использовании пальмитата -ситостерола.
3. Клетки R. ruber катализируют наряду с реакциями окисления -ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата -ситостерола.
4. Предварительно адаптированные к -ситостеролу клетки родококков в присутствии глюкозы и ингибиторов 9-гидроксилазы катализируют образование андростановых производных – андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17 диона.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ», Саратов, 2004;
II Всероссийской конференции «Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико фармацевтической промышленности» Пермь, 2004;
I и II Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, 2006.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 16 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 231 литературный источник, в том числе на русском и 182 на английском языках.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5.28, номер госрегистрации 01.9.70 005279), а также в рамках ФЦТНП РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», подпрограмма «Биологическое разнообразие».
Исследования поддержаны грантом РФФИ № 04-03-32063.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Рабочая коллекция бактериальных культур. В работе использовали штаммов из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (Каталог штаммов …, 1994;
http://www.iegm.ru/iegmcol/), принадлежащих к пяти видам Rhodococcus: R. erythropolis (41);
“R. longus” (6);
R. opacus (7);
R. rhodochrous (3);
R. ruber (71).
Условия культивирования. Родококки выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на орбитальных шейкерах (150 об/мин) при температуре 28оС.
Базовый состав минеральной среды культивирования включал следующие компоненты (г/л): KNO3 – 1,0;
KH2PO4 – 1,0;
K2HPO4 3H2O – 1,0;
NaCl – 1,0;
MgSO4 7H2O – 0,2;
СaCl2 3H2O – 0,02 (Каталог штаммов…, 1994). В среду добавляли дрожжевой экстракт и раствор микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974). При подборе эффективного растворителя -ситостерола испытывали ацетон, диметилсульфоксид, изопропанол, полипропиленгликоль, Tвин-40, Tвин-60, Tвин-80, или Тритон Х-100. В среду культивирования родококков вносили 0,5 г/л -ситостерола в качестве единственного источника углерода и энергии. При проведении экспериментов в соокислительных условиях в качестве косубстратов использовали н-гексадекан (0,1 об. %), глицерин (1,0 %) или глюкозу (1,0 %). При этом -ситостерол добавляли в среду культивирования родококков в виде раствора в изопропаноле одновременно с внесением бактериальных клеток или через 24-72 ч их роста. При исследовании зависимости между ростовым и биотрансформационным процессами испытывали питательные среды, отличающиеся по составу минеральных солей, источнику углерода (глицерин, глюкоза или ацетат аммония) или азота (нитраты или аммонийный азот). В отдельных экспериментах для ингибирования 9-гидроксилазы, инициирующей деструкцию полициклического остова стеролов, в ростовую среду добавляли 0,48 мМ 8-гидроксихинолина, Co(NO3)2, NaN3 или 0,01-0,48 мМ 2,2-дипиридила. Для доказательства ферментативной природы реакции этерификации -ситостерола дополнительно проводили опыты в присутствии нежизнеспособных клеток родококков, предварительно выдержанных при температуре 120С в течение 20 мин. Исследования по изучению субстратной специфичности холестеролоксидазы и условий индукции активности данного фермента проводили с использованием базовой минеральной среды в соокислительных условиях в присутствии н-гексадекана. Посевным материалом служили родококки (5,0 х 105 клеток/мл), предварительно выращенные на мясопептонном агаре или минеральной среде с добавлением 0,2 г/л -ситостерола в присутствии глюкозы.
Содержание клеточного белка и остаточного -ситостерола определяли через каждые 24 ч эксперимента. Определение белка осуществляли модифицированным методом Лоури (Горина, Яковлева, 1980), содержание остаточного -ситостерола в культуральной жидкости – ферментативным методом С.С. Allain (1974) с использованием коммерческой тест-системы контроля уровня холестерола (ООО «Ольвекс Диагностикум», Санкт-Петербург) и спектрофотометра Lambda EZ «Perkin-Elmer» (США). Контроль чистоты исследуемых культур проводили с помощью светового микроскопа Аxiostar plus (Германия) с фазово-контрастным устройством.
Исследование продуктов биотрансформации. Продукты биотрансформации -ситостерола и его 3-ацилпроизводных экстрагировали этилацетатом. Объединенные экстракты сушили с помощью сульфата натрия, растворитель удаляли на роторном испарителе. Качественное определение продуктов биотрансформации -ситостерола проводили методом тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием пластин «Merck» (Германия). Для обнаружения стигмаст-4-ен-3-она и андростановых производных использовали ультрафиолетовый облучатель КФ-4М (Россия), другие соединения (в частности, -ситостерол, его сложные эфиры и пр.) регистрировали после опрыскивания 5 %-м раствором Н2SO4 и последующего прогревания пластины при 95-100оС в течение 2-3 мин. Более детально продукты биотрансформации -ситостерола анализировали с помощью методов хромато-масс-спектрометрии с использованием газового хроматографа Agilent 6890N (США) (кварцевая колонка HP-5MS SN US 15189741-1) на базе аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН, и высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа Милихром «Научприбор» (Россия) (колонка 6.30.2 см с фазой Lichrosorb RP-18) на базе Института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, Новосибирск. При изучении влияния различных растворителей -ситостерола на трансформирующую активность родококков, в опытах по оптимизации условий биоконверсии стерола до андростановых производных, а также при исследовании процесса биоконверсии сложных эфиров -ситостерола качественный и количественный анализ продуктов биотрансформации осуществляли методом УФ спектроскопии с использованием спектрофотометра Lambda EZ201 «Perkin-Elmer»
(США).
Продукты биоконверсии -ситостерола выделяли с использованием методов препаративной тонкослойной хроматографии на пластинах фирмы «Merck»
(Германия) или колоночной хроматографии на силикагеле фирмы «Merck»
(Германия). Элюентом служила смесь гексана с добавлением от 5 до 95 % этилацетата. Оптическое вращение [D] соединений определяли для соответствующих растворов в этаноле на поляриметре 341 Perkin–Elmer (США) при длине волны 589 нм. Температуру плавления кристаллических соединений измеряли на приборе ПТП (Россия). Соотношение продуктов реакции и структуру индивидуальных соединений подтверждали данными ЯМР 1H спектрометрии.
Спектры ЯМР 1H для растворов в CDCl3 записывали на спектрометре Varian Mercury Plus 300 (300 МГц, внутренний стандарт – ГМДС) на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь.
Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6.0 (StatSoft Inc., 2001), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку. Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990). Для кластерного анализа использовали показатели взвешенного среднего числа пары группы, расстояние между которыми рассчитывалось по формуле City-block Manhattan distance, позволяющей снизить влияние отдельных больших различий между объектами на рассчитываемое расстояние.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По нашим данным, все исследуемые штаммы родококков используют -ситостерол в качестве единственного источника углерода и энергии. Как видно из табл. 1, уровень биоконверсии стерола, как правило, не превышает 20 %. Штамм R. ruber ИЭГМ 233, деградирующий более 25 % -ситостерола и характеризующийся более выраженной стеролтрансформирующей активностью, использовался нами в дальнейших исследованиях в качестве модельного.
Таблица 1.
Биотрансформация -ситостерола клетками родококков Содержание в сумме продуктов Сумма реакции, г/л Штамм продуктов стигмаст-4-ен-3-он -ситостерол реакции, г/л Абиотический контроль 0,50 ± 0,001 0,50 ± 0,001 Не обнаружено R. erythropolis ИЭГМ 22 0,49 ± 0,001 0,42 ± 0,013 0,014 ± 0,0008 (2,8)* R. erythropolis ИЭГМ 23 0,46 ± 0,018 0,42 ± 0,002 0,008 ± 0,0010 (1,7) R. erythropolis ИЭГМ 179 0,48 ± 0,025 0,42 ± 0,005 0,012 ± 0,0017 (2,5) R. erythropolis ИЭГМ 183 0,50 ± 0,001 0,48 ± 0,007 0,011 ± 0,0023 (2,2) R. ruber ИЭГМ 77 0,49 ± 0,009 0,47 ± 0,018 0,002 ± 0,0010 (0,4) R. ruber ИЭГМ 80 0,49 ± 0,010 0,45 ± 0,037 Не обнаружено R. ruber ИЭГМ 233 0,36 ± 0,023** 0,34 ± 0,005** 0,012 ± 0,0017 (3,3) R. ruber ИЭГМ 322 0,45 ± 0,011 0,43 ± 0,010 Не обнаружено Примечание. *В скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-3-она в сумме продуктов реакции. -Ситостерол добавляли в среду культивирования родококков в виде порошка в качестве единственного источника углерода и энергии. Приведены данные после 5 сут культивирования родококков. **Полученные результаты достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при p0,05.
Влияние условий культивирования на холестеролоксидазную активность родококков. При подборе условий повышения биодоступности -ситостерола оказалось, что при использовании синтетических сурфактантов в качестве растворителей стерола наблюдается повышение степени стеролдеградирующей активности родококков, что приводит к достоверному снижению содержания -ситостерола в среде после 5 сут роста бактериальных клеток. Так, с помощью метода УФ спектроскопии обнаружено, что в присутствии Твина-40 продукция стигмаст-4-ен-3-она увеличивается в 2 раза по сравнению с таковой при добавлении -ситостерола в среду культивирования в нерастворенном виде (табл. 2). Однако присутствие сурфактантов в составе экстрактов продуктов биотрансформации -ситостерола препятствует проведению хромато-масс-спектрометрического анализа образцов, полученных при скринировании. В связи с этим в качестве растворителя -ситостерола мы использовали изопропанол (табл. 2), который способствует некоторому повышению стеролтрансформирующей активности родококков.
Таблица 2.
Влияние используемых растворителей -ситостерола на стеролтрансформационную активность клеток R. ruber ИЭГМ Содержание в сумме продуктов реакции, г/л Растворитель -ситостерола -ситостерол стигмаст-4-ен-3-он 0,34 ± 0,005 0,012 ± 0,0017 (2,4)* Без растворителя (Контроль) Ацетон 0,40 ± 0,027 0,010 ± 0,0040 (2,0) Диметилсульфоксид 0,46 ± 0,006 0,009 ± 0,0001 (1,8) Изопропанол 0,37 ± 0,051 0,016 ± 0,0071 (3,2) Полипропиленгликоль 0,29 ± 0,029 0,009 ± 0,0037 (1,7) Твин-40 0,29 ± 0,010 0,051 ± 0,0042** (9,4) Твин-60 0,19 ± 0,020 0,027 ± 0,0012** (5,7) Твин-80 0,04 ± 0,012** 0,009 ± 0,0090 (1,8) Тритон Х-100 0,31 ± 0,033 Не обнаружено Примечание. *В скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-3-она от исходной концентрации (0,5 г/л) -ситостерола. **Экспериментальные показатели статистически достоверно отличаются от результатов остальных вариантов опыта при p0,05.
С целью повышения степени биоконверсии -ситостерола родококки выращивали в присутствии глицерина, глюкозы или н-гексадекана. Как видно из рис. 1, в присутствии глюкозы максимальный (до 71,3 %) уровень биодеструкции -ситостерола достигается при росте родококков при условии добавления стерола в ростовую среду через 2 сут от начала эксперимента при переходе культуры в раннюю стационарную фазу роста.
0,6 0, Содержание -ситостерола, г/л 0, 0, Содержание белка, г/л 0, 0, 4 2 0, 0, * 0, * * 0, 0, 0 0 1 2 3 4 5 6 Время, сут Рис. 1. Биодеградация -ситостерола с использованием R. ruber ИЭГМ 233.
1 – в качестве источника углерода – -ситостерол (контроль), 2 – добавление стерола в среду с глюкозой одновременно с внесением культуры, 3 – через 1 сут роста культуры, 4 – через 2 сут роста культуры, 5 – через 3 сут роста культуры, 6 – кривая роста культуры, выращенной в присутствии глюкозы. Стрелками указан момент внесения стерола.
*Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при p0,05.
При исследовании влияния на эффективность процесса биоконверсии других ростовых субстратов (рис. 2) выявлено, что уровень стеролдеградирующей активности родококков в присутствии глицерина или н-гексадекана ниже, чем таковой при использовании глюкозы. Однако в присутствии глюкозы наблюдается значительная потеря стеринового субстрата, о чем свидетельствует низкий выход суммы продуктов реакции, при этом выход стигмаст-4-ен-3-она составляет лишь 14 % от исходной концентрации стерола. Образование стигмаст-4-ен-3-она наиболее активно протекает в условиях соокислительного роста родококков в присутствии н-гексадекана (табл. 3). В течение 7 сут культивирования бактериальных клеток в среде с -ситостеролом накапливается 0,35 г/л стигмаст-4 ен-3-она, в то время как общая сумма продуктов реакции составляет 0,46 г/л.
0, Концентрация -ситостерола, г/л 0, 0, 0, 0,2 * * * * * 0,1 * 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время, сут Рис. 2. Содержание остаточного -ситостерола при росте R. ruber ИЭГМ 233 в присутствии -ситостерола в качестве единственного источника углерода (2), а также в соокислительных условиях в присутствии глицерина (3), н-гексадекана (4) или глюкозы (5).
1 – абиотический контроль. Стрелкой указано время внесения стерола.
*Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при p0,05.
Таблица 3.
Биотрансформация -ситостерола клетками R. ruber ИЭГМ 233 в присутствии различных ростовых субстратов Содержание в сумме продуктов реакции, Сумма г/л Ростовой субстрат продуктов реакции, г/л -ситостерол стигмаст-4-ен-3-он Без косубстрата 0,39 0,37 ± 0,051 0,02 ± 0,007 (5,2;
4,0) (контроль) н-Гексадекан 0,46 0,11 ± 0,018* 0,35 ± 0,098** (76,1;
70,0) Глицерин 0,27 0,21 ± 0,023 0,06 ± 0,007 (22,2;
12,0) Глюкоза 0,13 0,06 ± 0,004** 0,07 ± 0,007 (53,9;
14,0) Примечание. В скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-3-она в сумме продуктов реакции и от исходной концентрации (0,5 г/л) -ситостерола в ростовой среде. Приведены данные после 7 сут культивирования родококков.
*Достоверно по отношению к контролю при p0,05. **Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при p0,01.
Как видно из представленной на рис. 3 дендрограммы, построенной по данным определения содержания стигмаст-4-ен-3-она в сумме продуктов биотрансформации, большинство исследуемых штаммов родококков в присутствии н-гексадекана трансформируют -ситостерол с образованием стигмаст-4-ен-3-она.
При этом обнаруживается корреляция между видовой принадлежностью исследуемых штаммов родококков и их стеролтрансформирующей активностью.
Так, представители R. ruber характеризуются более выраженной конвертирующей активностью в отношении -ситостерола (группа В, рис. 3). На рис. 4 представлены хроматограммы продуктов биотрансформации стерола клетками родококков, полученные с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Исследование субстратной специфичности холестеролоксидазы. Как было отмечено выше, превращение -ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он катализируется ферментом холестеролоксидазой. Как правило, максимальная активность бактериальной холестеролоксидазы проявляется в отношении холестерола (MacLachlan et al., 2000). В результате сравнительных исследований трансформирующей активности родококков в отношении холестерола и -ситостерола нами обнаружено, что по уровню образования 4-ен-3-оновых продуктов представители R. ruber отличается более высокой активностью холестеролоксидазы в отношении -ситостерола, а не холестерола (табл. 4).
Следует отметить, что в литературе встречаются единичные сведения (Wovcha et al., 1979;
Barthakur et al., 1996) о способности мутантных штаммов микобактерий к более эффективной биотрансформации растительных стеролов с разветвленной боковой цепью по сравнению с холестеролом.
При исследовании субстратной специфичности холестеролоксидазы родококков в отношении 3-ацилпроизводных -ситостерола нами выявлена зависимость активности фермента бактериальных клеток от длины ацильного фрагмента (R = CH3COO– или C15H31COO–) в молекуле сложного эфира -ситостерола. При постановке данных экспериментов был выбран штамм R. erythropolis ИЭГМ 487, характеризующийся умеренной холестеролоксидазной активностью в отношении -ситостерола (см. табл. 4).
Рис. 3. Дендрограмма, иллюстрирующая результаты биотрансформации -ситостерола родококками при росте на н-гексадекане.
Дендрограмма построена на основании данных по определению содержания стигмаст 4-ен-3-она в сумме продуктов биотрансформации -ситостерола.
Рис. 4. Хроматограммы продуктов биотрансформации -ситостерола клетками родококков в соокислительных условиях в присутствии н-гексадекана.
1 – стигмаст-4-ен-3-он;
2 – -ситостерол.
Как видно из табл. 5, данный штамм при росте на н-гексадекане конвертирует 26,3 % стерола в стигмаст-4-ен-3-он. При использовании пальмитата -ситостерола у родококков значительно повышается активность холестеролоксидазы, при этом образуется 54,4 % стигмаст-4-ен-3-она (табл. 5). При биоконверсии ацетата -ситостерола регистрируется присутствие только -ситостерола (14,5 %) – продукта гидролиза сложноэфирной связи. Полученные данные согласуются с предположением (Halpern, 1981) об индуктивном влиянии жирнокислотного остатка, представляющего собой структурный аналог алифатической боковой цепи молекулы стерола, на синтез холестеролэстеразы и последующую продукцию холестеролоксидазы.
Таблица 4.
Биотрансформация холестерола и -ситостерола при росте клеток родококков на н-гексадекане Продукты биотрансформации стеролов, % Штамм холест-4-ен-3-он стигмаст-4-ен-3-он Абиотический контроль Не обнаружено Не обнаружено R. erythropolis ИЭГМ 10 82,8 ± 4,23 67,5 ± 3,23* R. erythropolis ИЭГМ 16 97,9 ± 2,11 10,5 ± 8,56* R. erythropolis ИЭГМ 267 93,3 ± 6,51 37,3 ± 23, R. erythropolis ИЭГМ 507 85,5 ± 14,49 48,6 ± 0,07* R. erythropolis ИЭГМ 487 100,0 ± 0,00 26,3 ± 1,26* R. ruber ИЭГМ 80 23,6 ± 5,18 29,1 ± 10, R. ruber ИЭГМ 233 34,3 ± 11,41 71,2 ± 11,20* R. ruber ИЭГМ 235 39,2 ± 1,53 70,0 ± 20, R. ruber ИЭГМ 381 83,4 ± 9,47 75,0 ± 8, R. ruber ИЭГМ 468 23,6 ± 7,93 51,6 ± 4,99* Примечание. Приведены данные после 5 сут культивирования родококков.
*Экспериментальные показатели достоверно (p0,05) отличаются от результатов, полученных при использовании в качестве субстрата биоконверсии холестерола.
Таким образом, в результате проведенных исследований нами подобраны условия направленного биокаталического окисления -ситостерола и его производных до стигмаст-4-ен-3-она, предусматривающие использование изопропанола в качестве растворителя данных стеролов, ростового субстрата н-гексадекана и представителей R. ruber – эффективных биокатализаторов ключевого процесса конверсии -ситостерола. Образующийся в процессе биотрансформации стигмаст-4-ен-3-он может использоваться непосредственно в качестве лекарственного препарата для лечения андрогензависимых заболеваний (Streber, 1993).
Таблица 5.
Биотрансформация сложных эфиров -ситостерола клетками R. erythropolis ИЭГМ 487 при росте на н-гексадекане Содержание в сумме продуктов реакции, % Стерин остаточный стигмаст-4-ен-3-он -ситостерол стерин 73,7 – 26,3 ± 1, -Ситостерол (контроль) 85,5 14,5 Не обнаружено Ацетат -ситостерола 22,2 31,5 54,4 ± 8,10* Пальмитат -ситостерола Примечание. Приведены данные после 5 сут культивирования родококков.
*Данные достоверно (p0,05) отличаются от контроля.
Исследование влияния состава питательной среды и адаптированной формы биокатализатора на процесс биотрансформации -ситостерола.
Необходимо отметить, что во всех экспериментах по биотрансформации -ситостерола регистрируется довольно низкий (до 2 %) уровень андростановых производных – интермедиатов органического синтеза современных лекарственных средств. В связи с этим при разработке оптимальных условий процесса отщепления боковой цепи -ситостерола нами было испытано 10 питательных сред для культивирования родококков, различающихся по минеральному составу, источникам углерода и азота. Использование лишь одной питательной среды D. Wilmaska с соавт. (1995), содержащей глюкозу и азот в аммонийной форме, позволило незначительно (до 4,0 %) увеличить выход андростановых производных.
При этом в качестве основного продукта биоконверсии -ситостерола у скринированных штаммов родококков (табл. 6) наряду со стигмаст-4-ен-3-оном обнаруживается ацетат -ситостерола (до 75,5 %) – продукт этерификации стерола.
Использование приема предварительной адаптации клеток родококков на среде D. Wilmaska с соавт. (1995) с добавлением 0,2 г/л -ситостерола в качестве индуктора стеролтрансформирующей активности не привело к увеличению выхода андростановых производных, но позволило значительно (до 99 %) повысить выход ацетата -ситостерола. Как видно из табл. 6, способность к этерификации -ситостерола характерна в основном для представителей вида R. ruber.
Таблица 6.
Биотрансформация -ситостерола при росте клеткок родококков в течение 5 сут в среде D. Wilmaska с соавт. (1995) Неадаптированные клетки Адаптированные клетки Штамм Ацетат Ацетат Остаточный Стигмаст- Остаточный Стигмаст -ситостерола*, -ситостерола, стерол, % 4-ен-3-он, % стерол, % 4-ен-3-он, % % % R. ruber ИЭГМ 179 26,76 73,24 0,00 0,00 24,99 74, R. ruber ИЭГМ 233 54,22 7,76 50,25 13,20 21,20 65, R. ruber ИЭГМ 381 15,11 21,22 63,67 30,06 37,16 92, R. ruber ИЭГМ 467 25,44 18,64 55,92 20,15 20,00 59, R. ruber ИЭГМ 577 24,43 18,89 56,68 1,98 0,00 99, R. ruber ИЭГМ 583 11,42 14,76 73,82 0,00 21,17 84, R. ruber ИЭГМ 597 15,42 21,14 63,43 2,21 0,00 97, R. erythropolis ИЭГМ 10 17,68 18,90 63,42 27,55 16,73 55, R. erythropolis ИЭГМ 478 16,01 23,89 59,99 6,83 31,05 62, R. erythropolis ИЭГМ 270 82,10 17,90 0,00 83,60 16,40 0, R. erythropolis ИЭГМ 509 77,09 22,91 0,00 95,13 4,87 0, R. erythropolis ИЭГМ 507 9,4 15,10 75,50 14,41 20,37 65, R. erythropolis ИЭГМ 766 87,3 12,7 0,00 2,00 2,00 0, Примечание. *При использовании нежизнеспособных клеток родококков ацетат -ситостерола не образуется.
Биотрансформация -ситостерола алканотрофными родококками в присутствии ингибиторов 9-гидроксилазы. Необходимо отметить, что в скрининговых опытах с использованием адаптированных клеток родококков нами обнаружен штамм R. erythropolis ИЭГМ 766, катализирующий процесс практически 100 %-го разрушения -ситостерола (см. табл. 6). Для получения андростановых производных мы исследовали биотрансформационную активность данного штамма в присутствии различных ингибиторов 9-гидроксилазы, катализирующей начальную стадию деструкции полициклического остова молекулы стерола. Как видно из табл. 7, используемые ингибиторы проявляют практически одинаковое влияние на стеролдеградирующую активность R. erythropolis ИЭГМ 766. При этом андростановые соединения в сумме продуктов реакции не регистрируются. С целью обеспечения выхода андростановых производных нами были подобраны оптимальная концентрация и время внесения ингибиторов в среду культивирования. Аналитические исследования продуктов биотрансформации -ситостерола, полученных в условиях ингибирования 9 гидроксилазы родококков и выделенных в индивидуальном виде методом колоночной хроматографии, свидетельствуют о том, что добавление 0,03 мМ 2,2 бипиридила через 24 часа роста родококков способствует повышению выхода андростановых производных с 4,0 до 31,5 % (табл. 8).
Установлено, что при росте бактериальных клеток в течение 5 сут в среде D. Wilmaska с соавт. (1995) в присутствии 0,03 мМ 2,2-бипиридила повышение выхода андростановых производных наблюдается на фоне снижения стеролдеградирующей активности R. erythropolis ИЭГМ 766 по сравнению с контрольным вариантом (рис. 5). При этом внесение в питательную среду ингибитора в концентрации 0,03 мМ не оказывает негативного воздействия на скорость роста исследуемой культуры.
Структура андростановых продуктов биотрансформации -ситостерола – андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона – подтверждена с помощью методов ЯМР и масс-спектрометрии, УФ спектроскопии.
Таблица 7.
Биотрансформация -ситостерола клетками R. erythropolis ИЭГМ в присутствии ингибиторов 9-гидроксилазы Содержание в сумме продуктов Сумма продуктов реакции, г/л (%) Ингибитор* реакции, г/л -ситостерол стигмаст-4-ен-3-он Без ингибитора 0,12 ± 0,005 0,02 ± 0,008 0,08 ± 0, (контроль) NaN3 0,50 ± 0,004 0,38 ± 0,022 0,17 ± 0, Co(NO3)2 0,32 ± 0,098 0,37 ± 0,009 0,08 ± 0, 2,2-Бипиридил 0,43 ± 0,073 0,41 ± 0,010 0,16 ± 0, 8-Гидроксихинолин 0,50 ± 0,006 0,33 ± 0,021 0,20 ± 0, Примечание. *Ингибиторы вносили в среду D. Wilmaska с соавт. (1995) в концентрации 0,48 мМ. Достоверность между контрольным и опытным вариантом при p0,05.
Таблица 8.
Биоконверсия -ситостерола R. erythropolis ИЭГМ 766 в присутствии ингибитора 2,2-бипиридила Содержание в сумме продуктов реакции, г/л Концентрация Сумма 2,2-бипиридила, продуктов стигмаст-4- андростановые -ситостерол мМ (мг%) реакции, г/л ен-3-он производные Без ингибитора 0,12 ± 0,005 0,02 ± 0,008 0,08 ± 0,006 Не обнаружено (контроль) 0,35 ± 0,064 0,20 ± 0,023 0,07 ± 0,020 0,10 ± 0,011 (31,5)* 0,03 (0,5) 0,09 (1,5) 0,41 ± 0,038 0,26 ± 0,013 0,08 ± 0,010 0,07 ± 0,009 (17,1) 0,16 (2,5) 0,49 ± 0,014 0,20 ± 0,012 0,22 ± 0,008 0,07 ± 0,016 (14,2) 0,22 (3,5) 0,49 ± 0,008 0,36 ± 0,031 0,09 ± 0,004 0,04 ± 0,022 (8,1) 0,48 (7,5) 0,49 ± 0,008 0,38 ± 0,045 0,07 ± 0,027 0,04 ± 0,013 (8,1) Примечание. *В скобках приведено процентное содержание андростановых производных в сумме продуктов реакции. Достоверность между контрольными и опытными данными при p0,05.
0,5 0, Содержание ситостерола, г/л 0, 0,4 Содержание белка, г/л 4 0, 0, 0, ** * * 0, 0, 0, 0, 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время, сут Рис. 5. Биодеградация -ситостерола при росте адаптированных клеток R. erythropolis ИЭГМ 766 в среде D. Wilmaska c соавт. (1995).
1, 2 – содержание остаточного -ситостерола в среде без ингибитора (контроль) и в присутствии 0,03 мМ 2,2-бипиридила, соответственно, 3, 4 – накопление клеточного белка в присутствии 2,2-бипиридила и без ингибитора (контроль), соответственно.
Стрелкой указано время внесения ингибитора. Достоверность между контрольным и опытным вариантом при *p0,01;
**p0,05.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что изученные коллекционные штаммы бактерий рода Rhodococcus способны к осуществлению направленной биотрансформации -ситостерола до соединений, широко востребуемых в фармацевтической практике. Показано, что холестеролоксидазная реакция родококков с образованием 4-ен-3-оновых производных наиболее эффективно протекает в присутствии ростового субстрата н-гексадекана. Холестеролоксидазная активность родококков может быть индуцирована при использовании в качестве субстрата биоконверсии сложного эфира -ситостерола и пальмитиновой кислоты. В процессе ацилирования наиболее целесообразно использование предварительно адаптированных к стеролу клеток R.
ruber, катализирующих в условиях кометаболизма с глюкозой образование до 99,0 % ацетата -ситостерола. Обнаружен штамм R. erythropolis ИЭГМ 766, конвертирующий -ситостерол до андрост-4-ен-3,17-диона (26,0 %) и андроста-1,4 диен-3,17-диона (5,5 %) в условиях использования в качестве косубстрата глюкозы и добавления 0,03 мМ 2,2-дипиридила через 1 сут роста бактериальных клеток.
Наиболее активными биокатализаторами процесса окислительного превращения -ситостерола являются R. erythropolis ИЭГМ 10, ИЭГМ 487, ИЭГМ 766;
R. ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220, ИЭГМ 233, ИЭГМ 235, ИЭГМ 577, ИЭГМ 597, трансформирующие -ситостерол с образованием ацетата -ситостерола, стигмаст-4-ен-3-она, андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен 3,17-диона, выход которых составляет от 31,5 до 99 %.
Активные штаммы – биотрансформаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений – ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств. Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах -ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет (http://www.iegm.ru/iegmcol).
Выводы 1. Установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus активно трансформируют -ситостерол в стигмаст-4-ен-3-он в условиях кометаболизма в процессе роста на н-гексадекане. Наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении -ситостерола характеризуются представители вида R. ruber, при этом выход основного окисленного продукта достигает 98,0 %.
2. Выявлена зависимость холестеролоксидазной активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола Экспериментально обосновано, что пальмитат -ситостерола оказывает индуктивное воздействие на холестеролоксидазную активность родококков.
3. Установлено, что родококки, предварительно адаптированные к -ситостеролу, при росте на глюкозе в присутствии ингибитора 9-гидроксилазы 2,2-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи -ситостерола с образованием андростановых производных.
4. Впервые обнаружено, что клетки R. ruber катализируют наряду реакциями окисления -ситостерола реакцию ацилирования с образованием (до 99,0 %) ацетата -ситостерола. Экспериментально подтверждена энзиматическая природа реакции этерификации стерола, более эффективно реализуемой в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата.
5. Наиболее активными биокатализаторами процесса окислительного превращения -ситостерола являются R. erythropolis ИЭГМ 10, ИЭГМ 487, ИЭГМ 766;
R. ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220, ИЭГМ 233, ИЭГМ 235, ИЭГМ 577, ИЭГМ 597 трансформирующие -ситостерол с образованием ацетата -ситостерола, стигмаст-4-ен-3-она, андрост-4-ен-3,17 диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона, выход которых составляет от 31,5 до 99,0 %.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Ноговицина Е.М., Гришко В.В., Ившина И.Б. Биотрансформация стеринов бактериями рода Rhodococcus sensu stricto//Матер. Х Всерос. научно практ. конф. «Экология: проблемы и пути решения». Ч. 2. – Пермь, 2002. – С. 138-144.
2. Ноговицина Е.М. Биотрансформация сложных эфиров -ситостерола алканотрофными родококками//Матер. II Междунар. конф. «Экология и научно технический прогресс». – Пермь, 2003. – С. 125-126.
3. Ноговицина Е.М. Индуктивное влияние сложных эфиров -ситостерола на холестеролоксидазную активность родококков//Матер. Региональной конф.
молодых ученых. «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». – Пермь, 2004. – С. 80-85.
4. Ноговицина Е.М., Гришко В.В., Ившина И.Б. Трансформация сложных эфиров -ситостерола под воздействием штамма Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 487//Матер. III Всерос. конф. «Химия и технология растительных веществ». – Саратов, 2004. – С. 104-106.
5. Ноговицина Е.М., Гришко В.В., Ившина И.Б., Толстиков А.Г.
Биотрансформация -ситостерола в присутствии биокатализатора Rhodococcus ruber ИЭГМ 233 и ингибиторов 9-гидроксилазы//Матер. II Всерос. конф.
«Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико фармацевтической промышленности». – Пермь, 2004. – С. 178-181.
6. Ноговицина Е.М., Гришко В.В., Кукина Т.П., Ившина И.Б. Изучение способности алканотрофных родококков к биотрансформации стигмаст-5-ен-3 ола//Вестник Пермского госуниверситета. Серия Биология. – 2004. – N. 2. – С. 118-122.
7. Ившина И.Б., Гришко В.В., Ноговицина Е.М., Кукина Т.П., Толстиков Г.А. Биотрансформация -ситостерола и сложных эфиров -ситостерола актинобактериями рода Rhodococcus//Прикладная биохимия и микробиология. – 2005. – Т. 41, N. 6. – С. 626-633.
8. Ноговицина Е.М., Гришко В.В., Каменских Т.Н., Ившина И.Б.
Использование коллекционных штаммов родококков с выраженной активностью холестеролоксидазы для биотрансформации -ситостерола//Матер. II Междунар.
конф. «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». – Пермь-Казань-Пермь, 2005. – С. 74-75.
9. Ноговицина Е.М., Гришко В.В., Ившина И.Б. Биотрансформация -ситостерола актинобактериями рода Rhodococcus в условиях ингибирования 9-гидроксилазы//Матер. I Всерос. молодежной школы-конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». – Москва, 2005. – С. 99-100.
10. Ноговицина Е.М., Гришко В.В. Биотрансформация -ситостерола с использованием целых клеток алканотрофных родококков//Матер. II Всерос.
молодежной школы-конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». – Москва, 2006. – С. 85-86.
НОГОВИЦИНА Екатерина Михайловна БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ -СИТОСТЕРОЛА И ЕГО 3-АЦИЛ ПРОИЗВОДНЫХ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS Автореферат Лицензия ПД-11-0002 от 15.12. Подписано в печать – 26.05.2006. Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1, Формат 6084/16. Набор компьютерный. Заказ № 81к/2006.
Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113, т. (342) 219-80-