Вирусоподобные наноразмерные частицы – носители антигенов вирусов гриппа и краснухи (
На правах рукописи
КОТЛЯРОВ РОМАН ЮРЬЕВИЧ
Вирусоподобные наноразмерные частицы – носители антигенов
вирусов гриппа и краснухи
(03.01.03 – молекулярная биология)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
МОСКВА-2010
Работа выполнена в лаборатории молекулярного клонирования Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН доктор биологических наук
Научный руководитель:
Равин Николай Викторович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Аграновский Алексей Анатольевич доктор биологических наук Николаева Людмила Ивановна
Ведущая организация:
Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН
Защита диссертации состоится «25» июня 2010 г. в часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико химической биологии имени А. Н. Белозерского, ауд. 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан «» мая 2010г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Вакцинация является одним из основных способов профилактики инфекционных заболеваний. Первым прототипом вакцины было использование ослабленной формы возбудителя заболевания, позднее были разработаны способы инактивации возбудителей, позволяющие сохранить их иммуногенные свойства. Следующим этапом явилось создание субъединичных вакцин, использующих один или несколько белков патогенного организма или даже их отдельных фрагментов эпитопов. Этот подход позволяет создавать полностью безопасные вакцины, однако подобные вакцины могут вызывать гораздо менее выраженный иммунный ответ, чем в случае использования аттенуированных или инактивированных возбудителей.
Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих патоген и содержащих отдельные белки патогена на поверхности частицы-носителя. Данный подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя взаимодействие вируса с иммунной системой. Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных черт живых систем и предоставляет поистине неисчерпаемые возможности для использования биомолекул в качестве строительных блоков «молекулярного конструктора» для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией, обширными возможностями направленной модификации современными методами генной инженерии являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы, образуемые в результате самособорки капсидных белков вирусов. В отличие от вирусов, такие вирусоподобные частицы не содержат генетического материала и являются полностью безопасными. С использованием методов генетической инженерии можно получить «химерные» капсидные белки, к которым присоединен целевой антиген, а в результате самосборки таких гибридных белков могут быть получены рекомбинантные вирусоподобные частицы, на поверхности которых представлен целевой антиген.
Представление антигенных детерминант на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность в сочетании с высоким выходом, легкостью очистки и стабильностью при хранении.
Рекомбинантные ВПЧ – вакцины могут быть получены в различных системах экспрессии, включая бактерии, дрожжи, клетки животных и растения. Растения могут стать недорогой и эффективной «биофабрикой»
для получения таких вакцин. Важными преимуществами растительных систем экспрессии являются безопасность продукта и возможность получения больших объемов биомассы. Традиционные методы получения рекомбинантных белков в растениях предполагают проведение генетической трансформации ядерного или хлоропластного генома, однако, обычной проблемой является низкий выход рекомбинантного белка, обусловленная им высокая стоимость очистки, а также длительное время, необходимое для создания растений-продуцентов. Альтернативой являются вирусные системы транзиентной экспрессии. Амплификация целевого гена при репликации вируса-вектора в клетке растения обеспечивает высокий уровень экспрессии в течение нескольких дней.
Предметом настоящей работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц – носителей антигенов возбудителей двух социально-значимых заболеваний, - гриппа и краснухи.
В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ мы использовали ядерный антиген вируса гепатита В (НВс – антиген), мономеры которого собираются в наноразмерные вирусоподобные НВс-частицы.
Современные противогриппозные вакцины основаны на получаемом в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах. Изменчивость высокоиммуногенных поверхностных белков вируса гриппа гемагглютинина и нейраминидазы – требует практически ежегодного создания вакцин, соответствующих новым штаммам вируса. Поэтому актуальной является задача создания рекомбинантных противогриппозных вакцин «универсального» действия, основанных на отдельных высококонсервативных белках вируса гриппа, иммуногенность которых может быть повышена за счет присоединения к наночастице – носителю.
Для решения этой задачи мы сконструировали НВс-частицы, представляющие внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа и разработали методы их получения в бактериях и растениях.
В настоящее время иммунопрофилактики краснухи используется живая вакцина, разработанная более 30 лет назад. Задача создания рекомбинантной вакцины против краснухи, не проявляющей негативных эффектов, обусловленных использованием живого вируса, является актуальной. Одним из путей ее решения является создание нановакцин, в которых в иммуногенной форме представлены основные эпитопы поверхностного белка Е1 вируса краснухи.
В целом, разработка новых методов создания рекомбинантных вакцин с использованием достижений нанотехнологий и получения вакцинных препаратов в растениях-биофабриках является основой создания новых недорогих и эффективных препаратов для иммунопрофилактики социально-значимых заболеваний населения Российской Федерации.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц – носителей вакцинных белков вирусов гриппа и краснухи, и разработка методов их продукции в бактериях и растениях.
Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Создание систем экспрессии в клетках Escherichia coli вакцинных белков вируса краснухи и рекомбинантных НВс-частиц – носителей иммунодоминантных эпитопов белка Е1.
2. Получение рекомбинантных НВс-частиц, несущих М2е пептид вируса гриппа, в клетках Escherichia coli.
3. Конструирование самореплицирующихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях.
4. Создание систем экспрессии вакцинных белков вируса краснухи и гриппа в растениях Nicotiana benthamiana с помощью вирусных векторов.
Научная новизна Впервые получены рекомбинантные вирусоподобные частицы – носители иммунодоминантных эпитопов гликопротеина Е1 вируса краснухи, которые могут быть использованы как основа рекомбинантной вакцины против краснухи. Разработаны методы конструирования, получения в бактериальной системе экспрессии, выделения и очистки вирусоподобных НВс-частиц – носителей М2е пептида вируса пандемического штамма «свиного» гриппа H1N1v-2009. Показано, что иммунизация лабораторных животных полученным препаратом обеспечивает их защиту от летальной гриппозной инфекции.
Сконструированы вирусные векторы, обеспечивающие высокоэффективную экспрессию целевых белков в растениях за счет повышения эффективности трансляции РНК вируса-вектора благодаря использованию трансляционного энхансера.
Впервые продемонстрирована возможность экспрессии в растениях белка Е1 вируса краснухи и продукции НВс-частиц – носителей эпитопов этого белка. Впервые создана система продукции в растениях вирусоподобных НВс-частиц, представляющих М2е пептид вируса гриппа на своей поверхности, что открывает возможность получения «универсальных» противогриппозных вакцин в растениях-биофабриках.
Практическая значимость Разработанные методы конструирования и получения рекомбинантных вирусоподобных частиц – носителей антигенов вирусов гриппа и краснухи могут быть использованы для создания новых недорогих и эффективных рекомбинантных вакцин для профилактики этих заболеваний. В частности, НВс частицы – носители внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа являются основой «универсальной»
противогриппозной вакцины, эффективной в отношении различных штаммов вируса гриппа типа А, в том числе новых потенциально пандемических штаммов птичьего и свиного гриппа.
Апробация работы Полученные в диссертации результаты были представлены автором на следующих международных и российских конференциях:
международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2008), 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2008г.), V съезде ВОГИС (Москва, 2009), The 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology – XV Biotechnology Summer School (Гданьск, Польша, 2009), конференции «Горизонты нанобиотехнологии»
(Звенигород, 2009).
заключается в проведении Личный вклад автора экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Получен патент на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на страницe машинописного текста и включают _ рисунков и _ таблиц. Диссертация состоит из разделов: “Введение”, “Цель и задачи работы”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты”, “Обсуждение”, “Выводы”, “Cписок публикаций по теме диссертации”, “Cписок цитируемой литературы”, который содержит _ отечественных и _ иностранных источника.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Продукция вакцинных белков E1 и E12 вируса краснухи в клетках бактерий Escherichia coli.
В качестве основы для создания рекомбинантной вакцины против краснухи мы использовали поверхностный вирусный гликопротеин Е1 и полипептид Е12, представляющий собой фрагмент белка E1 c 154 по аминокислоту. Полипептид E12 содержит участок (199-239 а.о.), отвечающий за выработку вирус-нейтрализующих антител. Были сконструированы штаммы E. coli – продуценты полипептида Е12 и полноразмерного белка Е1. Системы экспрессии были созданы на базе вектора pQE30 (Qiagen), обеспечивающего продукцию рекомбинантного белка с 6-гистидиновым N-концевым «тагом». Уровни экспрессии целевых белков определяли с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Очистку рекомбинантного полипептида 6HIS-Е12 проводили с помощью металл афинной хроматографии. Как следует из полученных данных, полипептид Е12 экспрессируется в клетках E. coli на уровне 5-10% общего растворимого белка. Полученный препарат использовался в дальнейших экспериментах в качестве контрольного. Полноразмерный белков Е экспрессируется в E. coli на низком уровне (менее 3% общего белка) и подвергается протеолизу, что не позволяет получить препараты полноразмерного белка. Для продукции Е1 более перспективной является растительная система экспрессии.
2. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности эпитопы Е1 белка вируса краснухи и их получение в E. coli.
В качестве основы для создания вирусоподобных частиц – носителей эпитопов Е1 белка был использован ядерный антиген вируса гепатита В (НВс – антиген). Мономеры этого белка, состоящие из 183 а.о., собираются в икосаэдрические частицы диаметром 34 нм, состоящие из субъединиц, организованных в димерные блоки. Последовательность НВс содержит аргинин-богатый С-концевой домен, связывающий вирусную ДНК при сборке вириона, при экспрессии в E. coli этот домен связывает бактериальную РНК, наличие которой в вакцинном препарате нежелательно. Поскольку С-концевой домен (а.о. 150-183) не требуется для сборки частиц, он был удален и заменен остатком цистеина, введение которого повышает стабильность НВс частиц. Два района HBc могут быть использованы для презентации чужеродных пептидов на поверхности HBc частиц, - N конец белка и иммунодоминантная петля, расположенная между 75 и 85 аминокислотными остатками белка. Поэтому для презентации Е1-эпитопов было сконструировано две серии рекомбинантных генов, кодирующих гибридные НВс белки, содержащие вставку эпитопа либо на N-конце, либо в иммунодоминантной петле.
В качестве эпитопов белка Е1, которые должны быть представлены на поверхности НВс частиц, использовали полноразмерный пептид Е (199-239 а.о.) либо его укороченные производные, E12_199 (199-239 а.о.) и E12_209 (209-239 а.о. белка Е1), которые, тем не менее, содержат основной иммунодоминантный эпитоп Е1 белка. Эти фрагменты клонировали как на N конец HBc, так и в район иммунодоминантной петли, гибридные белки экспрессировали в E. coli с использованием вектора pQE60. Уровни экспрессии целевых белков определяли с помощью SDS-PAGE. Было установлено, что уровень экспрессии гибридных белков, содержащих эпитоп Е12 как на N конце, так и в иммунодоминантной петле НВс антигена, крайне низкий (целевой продукт не детектируется).
Аналогичные белки, содержащие фрагменты E12_199, E12_209 вируса краснухи в районе иммунодоминантной петли, синтезируются в E. coli, но нерастворимы в неденатурирующих условиях. Крайне низким оказался и уровень экспрессии гибридного белка, содержащего эпитоп E12_199 на N конце НВс. Только гибридный белок Е209НВс, содержащий на N-конце НВс антигена короткий эпитоп E12_209, хорошо экспрессируется в E. coli и в значительной степени находится в растворимой фракции (Рис. 1).
1 2 3 4 5 Рисунок 1. SDS-PAGE анализ белковых препаратов, выделенных из штамма продуцента E209HВc и препарата очищенных E209HВc частиц.
1, - маркер мол. веса (отмечено положение маркеров 18 и 26 кД), 2, - белковый препарат из штамма продуцента E209HВc до индукции, 3, - белковый препарат из штамма продуцента E209HВc после индукции, 4, - белковый препарат из штамма продуцента E209HВc после индукции, растворимая фракция, 5, - препарат очищенных E209Hbc частиц.
Положение E209HBc указано стрелкой Синтезированный в E. coli и других системах экспрессии НВс антиген может собираться in vivo в вирусоподобные частицы. Поскольку гибридный белок Е209НВс экспрессировался в E. coli и присутствовал в растворимой фракции, то можно было ожидать, что он образует рекомбинантные НВс-частицы в клетках штамма-продуцента. Поэтому были проведены эксперименты по выделению и очистке рекомбинатных НВс-частиц методом осаждения сульфатом аммония (патент РФ №2312146), в результате чего был получен препарат очищенных E209Hbc – частиц. Структуру выделенных частиц анализировали с помощью электронной микроскопии. Проведенный анализ подтвердил факт сборки гибридных белков E12_209_HBc в наноразмерные частицы, сходные с частицами, образуемыми нативным НВс антигеном (Рис. 2). Таким образом включение E12_209 пептида в N-конец НВс не вызывает нарушения сборки гибридных субъединиц HBc в вирусоподобные частицы или их агрегации.
Рисунок 2. Электронно микроскопический анализ препаратов Е209НВс частиц (слева) и немодифицированных НВс частиц (справа).
Иммунологические характеристики препарата Е209НВс частиц в опытах на лабораторных животных были определены совместно с лабораторией П.Г. Свешникова (ОАО «ВНЦМДЛ»). Иммунизацию мышей препаратом Е209НВс наночастиц проводили двухкратно внутрибрюшинно (дозы по 20 мкг), без адъюванта Фрейнда и с адъювантом. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку здоровой мыши. Титры антител у иммунизированных животных определяли в ИФА, в качестве антигенов тестировали вирусоподобные частицы вируса краснухи, Е209НВс и немодифицированный НВс антиген. Как и следовало ожидать, Е209НВс частицы являются сильным иммуногеном, титр антител, связывающихся с сорбированным Е209НВс составлял более 10000.
Титр антител, связывающихся с немодифицированным НВс, был примерно в 10 раз ниже, что свидетельствует о том, что включение эпитопа заметно меняет иммунологические характеристики и, вероятно, структуру НВс частиц. Титр антител, связывающихся с ВПЧ вируса краснухи, составлял 1:10000, причем антитела иммунизированных мышей специфически связывались с Е1 белком в Вестерн-блоте. Титр антител не менялся в зависимости от наличия/отсутствия адъюванта, что свидетельствует о том, что НВс - наночастицы сами по себе являются эффективным адъювантом.
Корректность выбора Е209 в качестве иммунодоминантного эпитопа белка Е1 подтверждается тем, что полученное против ВПЧ краснухи моноклональное антитело Ru6, связываюшееся с Е1, также специфически связывалось и с НВс частицами – носителями Е209 пептида, но не с немодифицированными НВс частицами. Таким образом, можно сделать вывод о том, что иммунизация животных сконструированными Е209НВс наночастицами приводит к активации иммунного ответа против Е1 белка вируса краснухи. Полученные результаты дают основания полагать, что Е209НВс частицы могут быть основой новой рекомбинантной вакцины против краснухи.
3. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности внеклеточный домен М2 белка вируса «свиного»
гриппа и их получение в E. coli.
Одним из перспективных направлением разработки новых противогриппозных вакцин является использование в качестве их основы внеклеточного домена высококонсервативного мембранного белка М вируса гриппа, присоединенного к вирусоподобной частице – носителю. В качестве носителя, как и в предыдущем разделе работы, мы использовали НВс антиген.
Последовательность М2е высококонсервативна у всех «человеческих» штаммов вируса гриппа типа А, однако, у штаммов животного происхождения она существенно отличается. Так, М2е вируса «свиного» гриппа A/California/04/2009(H1N1), вызвавшего пандемию 2009г., по 4 из 23 аминокислотных остатков отличается от консенсусной последовательности М2е «человеческих» штаммов (Рис. 3). Такие различия могут определять специфичность вакцин на основе М2е. Поэтому в этой части работы мы сконструировали рекомбинантные М2еНВс частицы, представляющие на своей поверхности М2е пептид вируса «свиного» гриппа A/California/04/2009(H1N1). Поскольку полученные в предыдущих разделах результаты показывают, что введение чужеродных последовательностей в иммунодоминантную петлю нарушает экспрессию и/или растворимость частиц, для конструирования химерных НВс-частиц в качестве места вставки М2е пептида был использован N-конец белка.
хозяин штамм последовательность М2е пептида SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD свинья/ A/California/04/ человек SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD человек консенсусная последовательность SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD человек A/PR/8/ SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD птица A/Chicken/Kurgan/05/ SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD птица A/Duck/ Potsdam1402-6/ Рисунок 3. Сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных доменов М2 белков различных штаммов вируса гриппа человека и животных.
Отличия от консенсусной последовательности М2е «человеческого» вируса гриппа типа А выделены серым.
Синтезированый ген, кодирующий гибридный белкок М2еНВс со «свиным» М2е (далее - M2sHBc), клонировали в экспрессионном векторе pQE60. Гибридный белок хорошо экспрессируется в E. coli (Рис. 4А) и в основном содержится в растворимой фракции. Далее были проведены эксперименты по выделению и очистке M2sHBc частиц из штамма продуцента. Сборка М2еНВс в вирусоподобные наночастицы была подтверждена электронно-микроскопическим анализом очищенного препарата (Рис. 4В).
(В) Рисунок 4. Получение и очистка М2еНВс частиц.
(А) Результаты анализа белковых препаратов с помощью SDS-PAGE.
1, - маркер молекулярной массы (показаны положения маркеров 19 и 26 кДа) 2, - белковый препарат из штамма DLT1270/ pQE-M2sHBc до индукции экспрессии М2sНВс 3, - то же, но через 16 часов после индукции экспрессии М2еНВс 4, - очищенный препарат M2eHBc частиц (В) Электронно-микроскопический анализ препаратов M2sHBc – частиц.
Эффективность полученных препаратов в качестве кандидатных вакцин была исследована в ГУ НИИ гриппа СЗО РАМН на лабораторных животных. Мышей иммунизировали с применением для первого введения вакцины адъюванта TiterMax Gold Adjuvant (Sigma), а для двух последующих иммунизаций - неполного адъюванта Фрейнда. Для определения иммуногенности кандидатной вакцины были исследованы сыворотки мышей через 2 недели после 1-ой и после 3-ей иммунизации, для проведения ИФА использовали два синтетических пептида, последовательности которых соответствовали М2е вируса свиного гриппа A/California/04/2009 и вируса «птичьего» штамма A/Duck/Potsdam/1402 6/1986. Полученные результаты показывают, что после 3-х кратной иммунизации в высоких титрах (более 1:50.000) образуются сывороточные антитела изотипа IgG, связывающиеся как с синтетическим пептидом G- «свиного» гриппа A/California/7/2009, последовательность которого соответствовала использованному для иммунизации М2еНВс, так и с синтетическим пептидом G-19, последовательность которого соответствуют М2е гетерологичного штамма «птичьего» гриппа.
Динамика гибели мышей после заражения адаптированными к мышам штаммами свиного и птичьего гриппа представлена на Рис. 5.
Полученные данные свидетельствуют о 100% протективном действии М2sHBc в отношении свиного гриппа после трехкратной иммунизации.
Частичная защита от инфекции (60% выживаемость в опытной группе против 13% в контрольной), наблюдалась и в отношении «птичьего»
штамма A/Duck/ Potsdam/1402-6/1986, у которого аминокислотная последовательность М2е пептида отличается от таковой у «свиного»
штамма. Таким образом, полученные M2sHBc частицы могут являться основой создания рекомбинантной вакцины против современного пандемического «свиного» гриппа H1N1.
Рисунок 5. Динамика гибели мышей, иммунизированных М2sHBc частицами, после заражения различными штаммами вируса гриппа (доза 5 LD/50).
Консервативность аминокислотной последовательности М2 белка стала основой разработки противогриппозных вакцин «универсального»
действия на его основе. Поскольку практически все выделенные из человеческой популяции вирусы гриппа типа А имеют одинаковую последовательность М2е, перспектива создания такой вакцины является реальной. Однако, появившиеся в последние годы штаммы животного происхождения, в частности вирус «свиного» гриппа, имеют отличия в последовательности М2е пептида и, как показывают полученные нами результаты, эффективность М2е-вакцин в отношении гетерологичных штаммов гриппа является более низкой. Одним из путей создания М2е вакцин, эффективных в отношении широкого спектра штаммов гриппа, как человеческих, так и животных, может стать включение в состав М2еНВс частиц нескольких копий М2е пептида, последовательности которых соответствуют различным штаммам гриппа человека и животных.
4. Конструирование самореплицирующихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях Целью этой части работы было конструирование фитовирусных векторов для последующей продукции в растениях вакцинных белков вирусов краснухи и гриппа. Ряд таких экспрессионных векторов на основе геномов Х-вируса картофеля, был сконструирован на Кафедре Вирусологии Биологического факультета МГУ и в Центре «Биоинженерия» РАН.
В качестве основы для создания новых вирусных векторов был использован описанный в работе (Комарова и др. 2006) вирусный вектор рА7248 (PVXdt_GFP), основанный на геноме вируса Х картофеля (ХВК).
Этот вектор включает 5’-нетранслирумый участок генома ХВК, ген полимеразы, первый промотор субгеномной РНК, целевой ген gfp, последние 60 нуклеотидов гена белка оболочки и 3’-нетранслируемый участок генома ХВК. Вся эта конструкция помещена между 35S промотором и 35S терминатором и клонирована в бинарном векторе pBIN19. При доставке в клетки с помощью агроинфильтрации листьев происходит заражение большей части клеток листа в инфицированной области, репликация вирусного вектора в отдельных клетках, синтез субгеномных РНК и экспрессия целевого гена на высоком уровне.
Эффективность вирусного вектора определяется как уровнем накопления мРНК вектора в инфицированных клетках, так и эффективностью ее трансляции. Примером трансляционного энхансера, повышающего эффективность трансляции мРНК в растениях является 5’ нетранслируемая (лидерная) последовательность РНК 4 вируса мозаики люцерны, далее именуемая AMV. Однако, влияние этой последовательности, равно как и других трансляционных энхансеров, на эффективность фитовирусных векторов не исследовалось. Поэтому была поставлена задача конструирования нового фитовирусного вектора на основе генома Х вируса картофеля, содержащего непосредственно перед целевым геном последовательность трансляционного энхансера AMV, что в соответствии с нашим предположением могло повысить продуктивность вирусной системы экспрессии в несколько раз за счет повышения эффективности трансляции содержащей целевой ген субгеномной РНК.
На первом этапе на основе вектора рА7248 был создан вектор рА7248Т, содержащий на месте гена gfp ген устойчивости к тетрациклину (tet). Этот вектор дает возможность осуществлять клонирование целевого гена в один этап, с использованием уникальных сайтов рестриктаз AscI (ggcgcgcc) и SmaI (cccggg). На следующем этапе перед геном tet была клонирована последовательность трансляционного энхансера AMV, в результате чего был создан вектор рА7248amvТ, который в дальнейшем использовали для экспрессии целевых белков в растениях.
Для определения влияния трансляционного энхансера AMV на уровень продукции целевого белка вирусом-вектором, было сконструировано два репортерных вирусных вектора, в которых ген tet был заменен на репортерный ген gfp, - pA7248GFP и pA7248amvGFP, отличающиеся отсутствием или наличием последовательности AMV между точкой начала субгеномной РНК и геном gfp (Рис. 5).
Рисунок 5. Схемы вирусных векторов pA7248AMV-GFP и pA7248-GFP.
Векторы рА7248Т и рА7248amvТ имеют такие же структуры, но содержат ген tet вместо гена gfp.
Показаны области Т-ДНК вирусных векторов. 5 и 3 - нетранслируемые области генома ХВК;
RDRP – РНК зависимая РНК полимераза ХВК;
Sgp1 – первый субгеномный промотор ХВК. 35S – промотор, 35S-T – терминатор РНК вируса мозаики цветной капусты. LB и RB – левая и правая границы Т-ДНК. Первый кодон гена gfp подчеркнут, нуклеотидная последовательность AMV выделена серым, последовательности сайтов рестрикции XbaI и AscI выделены курсивом.
Для сравнения эффективности сконструированных нами векторов проводили эксперимент по транзиентной экспрессии гена gfp. Для этого агробактерии, содержащие экспрессионные векторы, вводили в клетки N.
benthamiana с помощью агроинфильтрации. Через 3 суток из зон агроинфильтрации отбирали пробы растительной ткани и проводили количественное определение белка GFP. Было установлено, что уровень синтеза GFP при использовании вектора pA7248amvGFP примерно в 4 раза (3,6±0,4) выше, чем для аналогичного вектора без AMV. Общее количество синтезируемого GFP отражает как процессы трансляции мРНК, так и ее содержание в клетке, обусловленное уровнем ее синтеза и/или стабильностью. Поэтому для определения того, какой из этих факторов определяет обнаруженные нами различия в содержании GFP, был проведен эксперимент по сравнению концентраций мРНК gfp в растениях продуцентах. С помощью количественной ОТ-ПЦР было установлено, что наличие AMV не влияет содержание мРНК gfp в клетке. Таким образом, повышенный уровень синтеза GFP в случае использования вируса-вектора pA7248-AMVGFP, обусловлен именно более эффективной трансляцией субгеномной РНК.
5. Экспрессия в растениях белка Е1 вируса краснухи и рекомбинантных НВс частиц, несущих эпитопы этого белка.
Для экспрессии в растениях вакцинных белков вируса краснухи было применено два подхода. Во-первых, экспрессия полноразмерного белка Е1, который может являться основой создания рекомбинантной вакцины. Во-вторых, были разработаны системы экспрессии вирусо подобных частиц на основе НВс антигена, содержащих эпитопы белка Е1.
Для экспрессии в растениях к полноразмерному гену Е1 белка были присоединены последовательности, кодирующие N-концевой полигистидиновый «таг» и С- концевую последовательность сигнала локализации в эндоплазматическом ретикулуме, SEKDEL. Синтетический ген Е1 клонировали в вирусном векторе pA7248amvT (Рис. 6) и N. benthamiana экспрессировали в растениях с помощью агроинфильтрации.
Рисунок 6. Вирусные векторы, обеспечивающие продукцию НВс антигена и вакцинных белков вируса краснухи в растениях.
Продукцию белка Е1 анализировали методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, полученных к экспрессированному в E. coli пептиду Е12. В результате было установлено, что полноразмерный белок Е1 хорошо экспрессируется в растениях, но нерастворим в неденатурирующих условиях. Уровень экспрессии составлял 3-5% общего белка. В отличие от экспрессии в E. coli, в клетках растений не наблюдалось протеолиза Е1 белка (Рис. 7). В целом полученные данные позволяют сделать заключение о том, что растительная система экспрессии может быть использована для получения Е1 белка в практически-значимых количествах.
Рисунок 7. Вестерн-блот анализ белковых препаратов, выделенных из растений продуцентов Е1 белка (слева) и Е12НВс частиц (справа).
1. Маркер молекулярного веса, размеры полос указаны в килодальтонах 2. Неинокулированные листья N. benthamiana – нерастворимая фракция 3.Листья N. benthamiana, инокулированные вирусом-вектором рА7248amvE1 (слева) или рА7248amvE12НВс (справа) – нерастворимая фракция.
В растворимой фракции белки E1 и Е12НВс не обнаружены.
Поскольку НВс антиген используется в качестве белка-носителя для создания вирусоподобных частиц, содержащих эпитопы вирусов краснухи и гриппа, нами была поставлена задача создания эффективной системы получения НВс-частиц в растениях. Известно, что природный НВс антиген плохо экспрессируется в растениях, возможно, вследствие неоптимального для растений кодонового состава природного гена НВс. Поэтому, прежде всего был проведен дизайн и синтез искусственного гена НВс, последовательность которого была оптимизирована по кодоновому составу для экспрессии в растениях. Синтетический ген НВс клонировали в векторе pA7248amvT. Для экспрессии НВс в растениях созданный вирусный вектор pA7248amvHBc вводили в клетки N. benthamiana с помощью агроинфильтрации. Продукцию НВс анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Было установлено, что НВс экспрессируется в растениях на уровне 1-2% общего белка и находится в растворимой фракции.
Два эпитопа Е1 белка были использованы в экспериментах по продукции в растениях рекомбинантных НВс-частиц, - эпитоп Е12 (154 – 239 а.о. белка Е1) и его укороченный вариант E12rd (165-239 а.о. белка Е1).
Эпитоп Е12 присоединяли к N-концу НВс (гибридный белок Е12НВс), а в случае эпитопа E12rd были созданы химерные гены, обеспечивающие экспрессию эпитопа как N конце HBc (ген E12rdHBc), так и в районе иммунодоминантной петли (ген НВс/E12rd). Синтетические гены Е12НВс, E12rdHBc и НВс/E12rd клонировали в вирусном векторе pA7248amvT и экспрессировали в растениях N. benthamiana. Анализ белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов, показал, что гибридный белок Е12НВс синтезируется в растениях, но находится в нерастворимой фракции, уровень экспрессии составляет 0.9%. Напротив, гибридные белки E12rdHBc и HBC/E12rd синтезируются в клетках N. benthamiana и в основном присутствуют в растворимой фракции. Однако уровень экспрессии этих белков не превышает 0.1% общего белка.
5. Создание систем экспрессии в растениях вирусоподобных НВс частиц, представляющих на своей поверхности внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.
Полученные результаты показывают, что искусственный ген НВс, может эффективно экспрессироваться в растениях N. benthamiana с помощью вирусного вектора pA7248amvT, причем синтезированный НВс присутствует во фракции растворимых белков. Поэтому аналогичный подход был использован для экспрессии в растениях химерного НВс с присоединенным М2е пептидом.
Мы синтезировали искусственный ген М2ерНВс, кодирующий гибридный белок, содержащий М2е пептид вируса гриппа на N-конце НВс антигена. Последовательность М2е соответствует штамму вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 (H5N2).
Для создание вирусного вектора – продуцента М2еНВс белка последовательность М2еpНВс клонировали в рА7248AMV в результате чего был сконструирован рекомбинантный вектор pA7248amvM2epHBc.
Вектор вводили в штамм A. tumefaciens GV3101, рекомбинантные белки N. benthamiana экспрессировали в листьях используя методику агроинокуляции. Для подавления пост-транскрипционного ген сайленсинга одновременно в листья растений инфильтрировали агробактерии, содержащие вектор-продуцент белка Р19. Через 6-10 суток выделяли препараты белков из зон агроинфильтрации. Для определения выхода целевого белка M2epHBc полученные препараты анализировали с помощью Вестерн-блот анализа. Результаты анализа белковых препаратов, выделенных из растений – продуцентов представлены на Рис. 8. Из полученных результатов следует, что белок M2epHВc эффективно экспрессируется в клетках N. benthamiana, причем является растворимым.
Выход M2epHВc составляет 1-2% от фракции растворимых белков.
На следующем этапе вирусоподобные частицы, образованные M2epHВc, очищали разработанным нами методом осаждения сульфатом аммония, а затем дифференциальным центрифугированием в градиенте сахарозы и хлористого цезия, что позволило получить препарат чистотой более 90%. Электронно-микроскопический препаратов анализ подтвердил сборку гибридных белков M2epHBc в наноразмерные частицы (Рис. 9).
(А) (В) (С) 1 2 3 4 1 2 3 1 Рисунок 8. Вестерн-блот (A, B) и электрофоретический (С) анализ белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов рекомбинантных вирусоподобных НВс- частиц.
(А) Детекция моноклональными антителами против HBc.
(B) Детекция моноклональными антителами против M2е пептида.
(С) Белковый препарат M2epHВc, выделенный из N. benthamiana, дважды осажденный сульфатом аммония. Положение M2epHВс указано стрелкой.
1, - маркер молекулярного веса, размеры полос указаны в килодальтонах, 2, - растворимые белки из неинокулированных листьев N. benthamiana, 3, - растворимые белки из листьев N. benthamiana, инокулированных вирусом вектором рА7248amvM2epHBc, 4, - растворимые белки из листьев N. benthamiana, инокулированных вирусом вектором рА7248amvHBc.
Проведенные в НИИ гриппа СЗО РАМН на лабораторных животных эксперименты показали, что полученные в растениях М2ерНВс частицы являются высокоиммуногенными, а иммунизация ими мышей обеспечивает защиту от летальной гриппозной инфекции.
Рисунок 9. Электронно микроскопический анализ полученных в растениях M2epHBc частиц, очищенных с помощью осаждения сульфатом аммония и ультрацентрифугирования.
ВЫВОДЫ Escherichia coli 1. Сконструированы и получены в клетках рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие эпитоп белка Е1 вируса краснухи.
Escherichia coli 2. Сконструированы и получены в клетках рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.
3. На основе генома Х вируса картофеля создан вирусный вектор для продукции рекомбинантных белков в растениях, содержащий перед целевым геном последовательность 5’-нетранслируемого района РНК вируса мозаики люцерны. Введение этой последовательности в вирус вектор позволяет повысить уровень продукции целевого белка в растениях в 3-4 раза за счет повышения эффективности трансляции содержащей целевой ген субгеномной РНК.
4. Созданы фитовирусные системы продукции в растениях белка Е1 вируса краснухи и рекомбинантных вирусоподобных частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих эпитоп белка Е1.
5. Созданы фитовирусные системы продукции в растениях рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Равин Н.В., Марданова Е.С., Котляров Р.Ю., Новиков В.К., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. Определение полной нуклеотидной последовательности генома нового штамма Х вируса картофеля и создание на его основе вирусного вектора для продукции целевых белков в растениях. // Биохимия. –2008 – Т.73, - С. 54 – 61.
2. Марданова Е.С., Котляров Р.Ю., Равин Н.В. Повышение эффективности продукции рекомбинантных белков в растениях за счет оптимизации трансляции РНК вируса-вектора. // Молекулярная биология. – 2009 – Т.43, №3, - С. 568–571.
3. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Расшифровка генома нового высокопатогенного штамма Х-вируса картофела «Ока-2» и клонирование кДНК копии его генома. // XIV Международная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007», Россия, Москва. – Т.1. С. 14.
4. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Продукция вакцинных белков вируса краснухи в растениях. // Международный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Украина, Крым, Судак. – 2008 – С. 76.
5. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Конструирование вирусных векторов для продукции рекомбинантных белков в растениях. // «12-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых», Россия, Пущино. – 2008 – С. 210.
6. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Конструирование рекомбинантных вирусоподобных наночастиц – носителей эпитопов вирусов краснухи и гриппа. // V съезд ВОГИС, Россия, Москва. – 2009 – Т.2, С. 7. Kotlyarov R.Y., Mardanova E.S. Construction of recombinant virus-like nanoparticles carrying epitopes of rubella and influenza viruses. //The 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology – XV Biotechnology Summer School, Gdansk, Poland, – 2009 – P. 61.
8. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Создание систем экспрессии в растениях вакцинных белков краснухи и гриппа. // «Горизонты нанобиотехнологии», Россия, Звенигород. – 2009 – С. 51.
9. Ravin N.V., Kotlyarov R.Y., Kuprianov V.V., Mardanova E.S., Dykov M., Grudinin M.P., Kiselev O.I., Skryabin K.G. (2010) Development of plant viral expression systems for production of influenza virus vaccine proteins in plants.
// X European congress of virology, Cernobbio, Italy, – 2010 –P. 282.
По результатам работы получен патент РФ на изобретение (№ 2390563).
Котляров Р.Ю., Марданова Е.С., Равин Н.В., Свешников П.Г., Скрябин К.Г. Рекомбинантный вирусный вектор для продукции в растениях белка Е1 вируса краснухи (варианты) и система экспрессии белка Е1 вируса краснухи в клетках растения (варианты).