Ирина рафаиловна изучение роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека hla-e в регуляции противоопухолевого иммунного ответа
На правах рукописи
УДК 575.11.1:599.323.4
Закеева Ирина Рафаиловна
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НЕКАНОНИЧЕСКОЙ МОЛЕКУЛЫ ГЛАВНОГО
КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ЧЕЛОВЕКА HLA-E В
РЕГУЛЯЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА
03.00.03 – молекулярная биология
Автореферат
диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
МОСКВА 2006
Работа выпонена в лаборатории генной терапии Института биологии гена РАН
Научный руководитель:
кандидат биологических наук С.С. Ларин
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, проф. Л.П. Сащенко доктор биологических наук, проф. С.М. Деев
Ведущая организация:
Российский государственный медицинский университет
Защита состоится «_» декабря 2006 года в _ часов на заседании Диссертационного совета Д. 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова 34/
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова Автореферат разослан «_» ноября 2006 года
Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук Грабовская Л.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В настоящее время наблюдается значительный рост онкологических заболеваний. Несмотря на разработку многочисленных подходов в терапии опухолей, раковые заболевания до сих пор занимают верхнии строки в мировом списке болезней вызывающих преждевременную смерть. Большинство нехирургических вмешательств, таких как лучевая и химиотерапия, направлены на быстрое уничтожение перерождённых клеток, однако при этом страдают также и нормальные клетки, что вызывает множество побочных эффектов и сильно ограничивает их применение в клинике. Использование специфичности иммунной системы при лечении онкологичекских заболеваний позволяет избежать ненужных потерь в виде здоровых клеток со стороны организма.
За последнее десятилетие был совершёл большой прорыв в области иммунологии раковых заболеваний, который послужил толчком к разработке многочисленных иммунотерапевтических методов борьбы со злокачественной трансформацией клеток. Однако, и иммунотерапия не всегда даёт ожидаемых результатов при внедрении в клиническую практику. Одним из объяснений является возможное ускользание опухолевых клеток от иммунного надзора или индукция трансформированными клетками толерантности опухолеспецифических лимфоцитов.
Показано несколько механизмов благодаря которым опухоли могут избегать иммунологического надзора: возникновение вариантов раковых клеток с утерей опухолевых антигенов (Urban J. et al., 1989), локальная экспрессия ингибиторных молекул, таких как трансформирующий фактор роста (ТФР-) (Torre-Amione G. et al., 1990) и Fas лиганд (Hahne M. et al., 1996), снижение уровня процессинга и презентации антигенов (Restifo N. Et al., 1991), а также потеря молекул МНС на клеточной поверхности (Haywood G. et al., 1971). Казалось бы, в случае снижения или полного исчезновения молекул МНС на поверхности, раковые клетки с одной стороны избегают лизиса цитотксическими Т-лимфоцитами (CTL), но с другой стороны становятся идеальными мишенями для естественных киллерных клеток (NK). Однако было показано, что большинство подобных клеток не чувствительны к NK клеточной цитотоксичности, то есть существует дополнительный, не выявленный ранее механизм ускользания раковых клеток от иммунологического надзора. Возможно, что одним из механизмов ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора может быть использование трансформированными клетками ингибиторных сигнальных путей NK и CTL клеток. Считается, что связывание ингибиторных рецепторов на поверхности CTL с соответствующими лигандами представленными на поверхности клеток-мишеней может подавлять эффекторные функции лимфоцитов (Leibson P. et al., 2004). Ряд человеческих ингибиторных рецепторов, распознающих молекулы МНС, включают в себя иммуноглобулиноподобные рецепторы киллерных клеток, узнающие классические молекулы МНС класса Ia (HLA-A,-B,-C) и молекулу HLA-G, а также рецепторы лектинового семейства NKG2, распознающие неканоническую молекулу HLA-E.
В 1998 году группа исследователей определила, что HLA-E является основным лигандом гетеромерной молекулы CD94/NKG2A - ингибиторного рецептора большинства NK клеток и Т-клеток, а также значительной части CD8 Т лимфоцитов (Braud V. et al., 1998). А в работе М. Ulbrecht и коллег было продемонстрировано использование человеческим цитомегаловирусом ингибиторной функции молекулы HLA-E для избежания лизиса NK клетками, путём предоставления мимикрирующего лидерную последовательность HLA-C нанопептида (Ulbrecht M. et al., 2000). Таким образом, родилась привлекательная идея о том, что раковые клетки со сниженным уровнем МНС класса Ia могут взамен увеличивать выход на поверхность неканонических молекул МНС, чтобы избежать как CTL, так и NK клеточной цитотоксичности.
Цели и задачи работы В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования являлось исследование роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа. Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Определить уровень экспрессии молекулы HLA-E в ряде клеточных опухолевых линиях человека.
2. Оценить уровень представления молекулы на клеточной поверхности опухолевых клеток.
3. Исследовать возможное влияние микроокружения опухолей на экспрессию и представление на поверхность молекулы HLA-E.
4. Изучить влияние экспрессии на поверхности опухолевых клеток HLA-E на осуществление эффекторных функций NK клетками.
Научная новизна и практическая ценность работы В настоящей работе с использованием методов ПЦР в реальном времени, иммуноблотинга и проточной цитометрии впервые показана экспрессия неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости класса Ib HLA-E в клетках меланомы человека. Продемонстрирована дозозависимая индукция белка HLA-E цитокином интерферон-гамма, приводящая к выходу молекулы HLA-E на клеточную поверхность. Обнаружено, что стимулирование интерфероном-гамма выхода на поверхность клеток неканонической молекулы HLA-E зависит от эффективного процесса генерирования пептидов клеточным аппаратом деградации белков – протеасомой. Впервые продемонстрировано, что присуствие неканонической молекулы HLA-E на поверхности клеток-мишеней приводит к защите последних от NK-клеточной цитотоксичности, то есть получено экспериментальное подтверждение функциональной значимости молекулы HLA-E на клеточной поверхности в противоопухолевом иммунном ответе.
Полученные результаты могут быть использованы для улучшения эффективности иммунотерапевтических методов лечения опухолевых заболеваний.
Апробация работы Работа апробирована на семинаре в лаборатории генной терапии ИБГ РАН.
Данные, представленные в работе, докладывались на конференциях: International conference “Basic Science for Biotechnology and Medicine” (Новосибирск, 2006);
Cancer immunotherapy (New York, USA, 2006).
Структура диссертации Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Библиография включает в себя 168 источников. Работа проиллюстрирована рисунками и 3 таблицами.
Публикации Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Экспрессия мРНК молекулы HLA-E в клетках меланомы человека С помощью ПЦР в реальном времени мы проанализировали уровень транскрипции мРНК молекулы HLA-E, а также генов тяжелой цепи молекул МНС Ia класса - HLA-A, HLA-B и HLA-C, по сравнению с контрольными генами 2 микроглобулина, GAPDH и -актина в образцах меланомных линий человека (Рис.1). Как видно, уровень 2-микроглобулина был стабилен и в среднем превышал уровень суммарной мРНК генов тяжелых цепей МНС I класса в 2 раза во всех меланомных линиях, за исключением клеточной линии Mel Kor, в которой мРНК 2-микроглобулина обнаружено не было. Что касается гена HLA-E, то его мРНК присуствовала во всех исследуемых клеточных линиях в количестве сравнимом, а иногда даже превышающем, суммарный уровень экспрессии генов тяжелых цепей классических HLA-A, -B и –C. Таким образом, транскрипт молекулы HLA-E не только был обнаружен во всех исследуемых меланомных линиях, но и присутствует в клетках в достаточном количестве для синтеза белкового продукта.
До настоящего момента существовала гипотеза конкуренции между тяжёлыми цепями молекул MHC Ia класса и HLA-E за свободный 2 микроглобулин (Marin R. et al., 2003). Однако в наших экспериментах мы Рис. 1. Анализ экспрессии мРНК генов MHC I класса и 2-микроглобулина обнаружили, что мРНК 2-микроглобулина в исследуемых образцах превалирует над общим количеством тяжёлых цепей HLA, т.е. если предположить одновременное связывание всех молекул главного комплекса гистосовместимости I класса с 2-микроглобулином, то всегда будут оставаться свободные молекулы последнего. Таким образом, стадия транскрипции генов участников презентации HLA молекул на поверхность клетки скорее всего не является лимитирующей для клеток меланомы.
Экспрессия белка HLA-E в клетках меланомы человека Обнаружив на предыдущем этапе достаточный уровень транскрипта HLA-E, мы получили важные предпосылки для поиска белкового продукта гена HLA-E в клетках меланомы. С помощью иммуноблотинга мы проанализировали наличие белка HLA-E в лизатах клеток меланомы из нашей коллекции, а также широкоиспользуемых опухолевых линиях из коллекции АТСС (Рис. 2). Во всех анализируемых линиях нами был обнаружен белок, молекулярной массой в 43кДа, соответствующий полноразмерному белку HLA-E. Однако, количество белка варьировало в различных клеточных линиях. Так, в клеточной линии Mel Kor было обнаружено крайне низкое, практически следовое количество белка, клеточные линии Mel 226, Mel R, Mel Cher и Mel 82 можно отнести к группе с небольшим уровнем экпрессии, тогда как в остальных линиях присутствовало значительное количество белка HLA-E.
Рис. 2. Анализ экспрессии белка HLA-E в лизатах клеточных линий меланомы человека методом иммуноблотинга Полученные нами результаты расходятся с данными опубликованными ранее (Palmisano G. et al., 2005), в которых было показано крайне ограниченное присутствие белка HLA-E в клетках меланомы. Для того, чтобы выяснить причину несоответствий, мы оценили уровень экспрессии молекулы HLA-E в широко используемых линиях опухолевых клеток из коллекции АТСС, которые частично также были проанализированы в цитируемой работе. Белок был обнаружен во всех клеточных линиях, кроме K562 и MCF-7, включая линии С-33а и HeLa, ранее считавшиеся негативными по HLA-Е. Полученные данные указывают на то, что в наших экспериментах чувствительность метода иммуноблотинга была выше, что позволило нам получить более достоверные и точные результаты.
Наши результаты коррелируют с последними данными, опубликованными французскими коллегами, которым также удалось показать присутствие полноразмерной молекулы HLA-E в ряде клеточных линий меланомы человека (Derre L. et al., 2006). Таким образом, экспрессия белка HLA-E в исследумых образцах была на детектируемом уровне, однако неравномерный характер экспрессии в индивидуальных линиях указывает на вероятную регуляцию экспрессии молекулы на уровне белкового синтеза.
Локализация молекулы HLA-E на поверхности меланомных клеток человека Поскольку молекула HLA-E может выполнять ингибиторную функцию только при её поверхностной локализации на клетке, то важно знать, что происходит с локализацией белка на поверхности клеток. Мы проанализировали методом проточной цитометрии наличие белка HLA-E на клеточной поверхности 15 меланомных линий человека с использованием моноклональных антител 3D12 к нативному белку HLA-E методом проточной цитометрии (Рис. 3). Также нас интересовала суммарная презентация канонических молекул комплекса гистосовместимости на поверхности исследуемых клеток, так как мы пытались найти взаимосвязь между изменением уровня МНС класса Ia и локализацией молекулы HLA-E на поверхности. Для этого мы параллельно окрашивали образцы с помощью антител к суммарному HLA-ABC. Полученные данные позволили разделить тестируемые линии на три категории. К первой группе относятся линии, которые имеют на своей поверхности молекулы как МНС Ia класса, так и HLA-E – это Mel Si, Mel 82, Mel 263, Mel Kis. Ко второй, и наиболее многочисленной, группе относятся опухоли, экспрессирующие исключительно классические молекулы MHC (HLA-A, -B, -C) – Mel Il, Mel P, Mel 311, Mel 259, Mel Cher, Mel Ibr, Mel MTP, Mel 226, Mel E, Mel R. Единственной меланомной линией на которой не было детектировано ни одной молекулы-представителя первого класса комплекса гистосовместимости была Mel Kor. Этот результат вполне объясним, так как клетки Mel Kor не содержат мРНК 2-микроглобулина, без которого не происходит сборки молекул HLA, а следовательно нарушается и их выход на поверхность клетки.
Рис. 3. Анализ локализации белка HLA-E на поверхности клеток меланомы человека методом проточной цитометрии HLA-E --- HLA-ABC Несколько неожиданным результатом было отсутствие HLA-E на таких меланомных клетках, как Mel Il и Mel 311, так как по данным вестерн-блот анализа в них был зафиксирован высокий уровень белка HLA-E, значительное преобладание экспрессии гена 2-микроглобулина над суммарным уровнем тяжелых цепей МНС I класса, а также достаточное количество HLA-A и HLA-C молекул, лидерные последовательности которых необходимы HLA-E в качестве основных источников нанопептидов. Другими словами, данные клеточные линии обладали всеми необходимыми условиями для выхода белка на поверхность клеток.
Мы предположили существование аллельных вариаций в лидерных пептидах молекул МНС Ia класса в исследуемых линиях, которые бы приводили к образованию неправильных, т.е. неспособных к связыванию с HLA-E, пептидов.
Однако, после скринирования человеческой базы данных молекул гистосовместимости (Robinson J. et al., 2003), мы не обнаружили аномальных вариаций в лидерных последовательностях HLA-A в анализируемых линиях. Таким образом, вероятно существует какой-то неизвестный механизм препятствующий транспорту белка HLA-E на поверхность клеток.
С другой стороны, мы так и не обнаружили клеточных линий, в которых наблюдалось бы одновременное снижение уровня молекул МНС Ia класса на фоне увеличения белка HLA-E на поверхности. Возможно, это связано с тем, что во время иммунного ответа клетки опухоли находятся под воздействием многих факторов, и в первую очередь под воздействием цитокинов. Так, большинство процессов клеточной цитотоксичности сопровождается секрецией интерферона гамма (INF-), то есть во время иммунного ответа клетки опухоли находятся под постоянным воздействием этого цитокина. Соответственно, следующим логическим шагом в нашем исследовании стало изучение экспрессии и локализации молекулы HLA-E на поверхности опухолевых клеток под влиянием модулирующего действия интерферона-гамма.
Экспрессия HLA-E в клетках меланомы человека под действием INF INF- является одним из главных цитокинов, секретируемых цитотоксическими клетками в очагах лизиса клеток-мишеней. Известно, что INF вызывает индукцию молекул главного комплекса гистосовместимости человека как I так и II класса, как часть защитного иммунного механизма, и его присутствие может влиять на статус клеток. Элементы, отвечающие на воздействие интерферона-гамма, были обнаружены в предлежащей промоторной области гена HLA-E, а дистально от элементов также был идентифицирован энхансер к этим последовательностям. Таким образом, для воссоздания условий, в которых находятся опухолевые клетки во время иммунного ответа, мы обрабатывали исследуемые образцы различными концентрациями INF-.
Клеточные линии меланомы человека культивировали 48 часов в присутствии различных доз INF- в среде. После чего анализировали уровень транскрипта мРНК HLA-E с помощью ПЦР в реальном времени. Количество полноразмерного белка исследовали методом иммуноблотинга (Рис. 4). Уровень мРНК генов домашнего хозяйства, таких как GAPDH, -актина, оставался прежним после воздействия интерферона-гамма. После воздействия цитокина мы наблюдали небольшое увеличение уровня мРНК 2-микроглобулина, а также тяжёлых цепей HLA Ia класса: для молекулы HLA-С увеличение было совсем незначительным и составило не больше 10%, тогда как количество мРНК HLA-В выросло после воздействия цитокина чуть заметнее – на 30%. Уровень мРНК молекул HLA-A незначительно понижался при воздействии INF-. Однако, наиболее значительные изменения уровня экспрессии мы получили именно для мРНК неканонической молекулы первого класса гистосовместимости HLA-E. Во всех клеточных линиях наблюдали резкое увеличение, в среднем в 2 раза, в количестве мРНК HLA-E (Рис. 4, Б). Таким образом, мы подтвердили, что воздействие интерферона-гамма на синтез матричной РНК человеческого лейкоцитарного антигена Е происходит именно на уровне транскрипции за счёт регуряторных элементов промоторной и дистальной промоторной зоны гена HLA E.
Рис. 4. Экспрессия HLA-E в клетках меланомы человека под действием INF-.
А. Иммуноблот-анализ клеточных лиатов меланом до и после добавления INF-, влияние различных доз INF- на уровень белка HLA-E. Б. Изменение уровня экспрессии мРНК генов МНС I класса и 2-микроглобулина под действием INF- (чёрные столбцы – уровень до индукции INF-, серые – посел индукции).
По результатам иммунноблотинга нами также было продемонстрировано изменение в количестве синтезируемого белка. Для большинства исследумых клеточных линий меланомы человека было показано увеличение количества полноразмерной молекулы HLA-E под действием интерферона-гамма, и воздействие носило дозозависимый характер (Рис. 4, А). Из полученных данных можно вывести интересную закономерность: в клеточных линиях c изначально высоким уровнем базальной (т.е. до обработки клеток INF-) экспрессии, как например в меланомных клетках линий Mel MTP, индукция цитокином не была ярко выраженной, а в клеточных линиях с низкой базальной экпрессией, как например Mel 259 и Mel P, индукция достигала соизмеримого с первой группой меланом уровня. Таким образом, можно сказать, что после воздействия INF происходило своеобразное выравнивание по количеству белка HLA-E в клетках меланомы человека.
Таким образом, можно предположить, что в реальных условиях in vivo уровень защиты опухолевых клеток молекулой HLA-E зависит от локального присутствия INF- и процесс скорее всего является дозозависимым.
Транспорт на мембрану молекулы HLA-E под действием INF Как уже говорилось выше, для регуляции противоопухолевого иммунного ответа важна поверхностная локализация белка. Особый интерес представляют клеточные линии, в которых белок имеется внутри клеток, но по каким-то причинам отсутствует на поверхности. Вероятно, что в условиях модулированного окружения может происходить выход молекул HLA-E на поверхность опухолевых клеток. Увеличение количества полноразмерного белка в клетках меланомы человека под воздействием INF- является важной предпосылкой для INF индуцированного, HLA-E опосредованного механизма ускользания опухолевых клеток от иммунологического надзора, однако наибольший интерес к молекуле в нашем исследовании проистекает имеено в области функционирования HLA-E на поверхности клеток в качестве лиганда к ингибиторным рецепторам цитотоксических клеток. Поэтому следующим этапом исследования было изучение выхода на клеточную поверхность комплекса HLA-E в присутствии интерферона гамма в культуральной среде.
В культуральную среду к клеткам меланомы in vitro добавляли рекомбинантный человеческий интерферон-гамма до конечной концентрации нг в мл. Также как и в экпериментах по локализации белка на клеточной поверхности в покоящихся клетках, клетки окрашивали моноклональными антителами 3D12 к нативному белку HLA-E, а также антителами к суммарному HLA-ABC, и проводили сравнительный анализ методом проточной цитометрии до и после обработки интерфероном-гамма.
“ –“ INF- “ +“ INF Рис. 5. Анализ молекул HLA-АВС и HLA-E на поверхности клеточных линий меланомы человека после воздействия INF- методом проточной цитометрии На рисунке 5 представлены результаты анализа методом проточной цитометрии присутствия молекул HLA-ABC и HLA-E на поверхности клеточных линий меланомы человека после воздействия INF-. Видно, что под действием цитокина не происходит существенного увеличения количества мембраноассоциированных молекул МНС Ia класса – единственной линией в которой наблюдается небольшое повышение плотности HLA-ABC на поверхности была линия Mel Ibr. На самом деле, мы скорее наблюдали обратный эффект заметный сдвиг пика в сторону уменьшения поверхностной фракции молекул данного класса.
Наоборот, концентрация молекул HLA-E на клеточной поверхности всех исследуемых клеток меланомы человека увеличивалась, за исключением клеточной линии Mel Kor, особенности которой мы уже обсуждали ранее, а именно отсутствие молекул 2-микроглобулина и, как следствие, отсутствие МНС экспрессии. Удивительно, что в клеточных линиях, в которых белок HLA-E отсутствовал на поверхности, но был в цитоплазме клеток в обычных условиях, после стимуляции цитокином обнаружилось значимое количество молекул HLA-E на поверхности клеток. Четыре клеточные линии у которых изначально была обнаружена мембранная локализация HLA-E, после индукции INF- увеличивали плотность HLA-E на поверхности в 3 раза.
Таким образом, под воздействием INF- большинство клеток меланомных линий человека начинают презентовать на своей поверхности детектируемое количество неканонических молекул главного комплекса гистосовместимости HLA-E, что указывает на возможность последних защищать опухолевые клетки от лизиса цитотоксическими клетками путём взаимодействия с соответствующими ингибиторными рецепторами, например, на NK клетках.
Участие протеасомальной деградации белков в стимулировании презентации HLA-E молекул на клеточной поверхности интерфероном- гамма Последнии эксперименты выявили прямую связь между стимуляцией клеток цитокином INF- и увеличением мРНК, зрелого белка, а также выходом на поверхность молекул HLA-Е. Полученные результаты указывают на то, что физическое увеличение внутриклеточного белка могло стать причиной его появления на клеточной поверхности. Однако известно, что интерферон-гамма также может индуцировать транскрипцию ряда белков, участвующих в протеасомальной деградации белков.
Протеасома представляет собой большой многосубъединичный комплекс белков, который в ядре и в цитоплазме осуществляет селективную деградацию белков и является центральным компонентом в каскаде протеолитической обработки белков необходимых для формирования антигенных пепетидов, презентируемых молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости на поверхности клеток (Рис. 6).
Рис. 6. Процессирование антигенов для презентации классическими молекулами главного комплекса гистосовместимости I класса. Большинсто пептидов для классических молекул МНС I класса образуются из белков в цитозоле клетки в процессе их деградации по убиквитин-протеасомному пути. Антигенные пептиды, образуемые протеасомой либо уже правильного размера, либо удлинённые с N-конца. Дальнейшая подгонка происходит с помощью дополниьтельной обработки аминопептидазами в цитозоле или в просвете ЭПР. Пептиды транспортируются в просвет ЭПР с помощью белка, ассоциированного с транспортом антигенов (ТАР, от анг. Transport associated with antigen processing), и в конечном итоге загружаются во вновь синетизированные молекулы МНС I класса с последующей транспортировкой на клеточную поверхность.
Иногда, чтобы обеспечивать более эффективный процессинг антигенов, клетка может замещать некоторые из своих протеасомальных субъединиц более подходящими субъединицами, образуя так называемую иммунопротеасому. Было показано образование иммунопротеасомы под воздействием цитокина INF- во время вирусной инфекции в клетке. INF- индуцирует замещение трёх каталитических субъединиц – 1, 2, 5 – на соответствующие иммунопротеасомные субъединицы - 1i, 2i, 5i, более известные как белки LMP (от анг. low-molecular-weight protein 2), MECL1 (от анг. multicatalytic endopeptidase complex-like-1) и LMP7, соотвественно. Считается, что подобная замена позволяет варьировать расщепление полипептидной цепи. Также, интерферон-гамма влияет на синтез ряда цитоплазматических аминопептидаз, участвующих в “подгонке” пептидов после 26S гидролиза для последующей загрузки их уже в ЭПР в пептидсвязывающие карманы тяжёлых цепей МНС.
Логично предположить, что существует связь между индукцией интерфероном-гамма усиления протеасомальной деградации белков, которая бы обеспечивала тяжёлую цепь HLA-E пептидами, стабилизирующими молекулу на клеточной поверхности. Для ответа на поставленный вопрос мы заингибировали протеасомную деградацию белков с применением традиционных ингибиторов протеасом. В качестве ингибитора протеасом мы использовали коктель ингибиторов I типа из лактацистина и калпаина – ALLN. ALLN добавляли к обработанным и необработанным IFN- культивируемым клеткам in vitro с последующим анализом клеток на предмет экспрессии молекул HLA-E методом проточной цитометрии (Рис. 7).
Из полученных результатов видно, что добавление ALLN к кондиционной среде полностью отменяло способность IFN- стимулировать выход HLA-E на клеточную поверхность, при этом внутриклеточная концентрация белка по результатам иммуноблотинга не менялась. Таким образом, усиление деградации белков интерфероном гамма приводит к генерированию пептидов для HLA-E, что, вероятно, стимулирует выход на поверхность неканонической молекулы HLA-E путём стабилизации молекулы пептидами.
- IFN + IFN -A N LL MEL +A N LL Рис. 7. Экспрессия белка HLA-E на клеточной поверхности в присутсвии интерферона гамма и ингибитора протеасом ALLN - - - HLA-ABC – HLA-E серый пик – идиотипический контроль Ранее, группой исследователей во главе с Veronique Braud было продемонстрировано, что для формирования функционального пептида, способного связываться с молекулой HLA-E, необходимо сначала отщепление с помощью сигнальной пептидазы сигнальной последовательности классических молекул МНС I класса и неканонической молекулы HLA-G с последующим внутримембранным расщеплением аспарагиновой протеиназой, которая носит название пептидаза сигнального пептида (SSP, от анг. signal peptide peptidase) (Lemberg et al., 2001). Участие же протеасомы в расщеплении сигнального пептида от классических молекул МНС I класса и молекулы HLA-G с одной стороны не очень понятно, так как было показано, что протеасома с большим трудом расщепляет короткие пептиды и в основном специализируется на полноразмерных и удлинённых полипептидных цепях. С другой стороны, если вспомнить, что протеасома при генерировании антигенных пепетидов для классических молекул МНС I класса формирует как раз правильные С-концевые пептиды, но удлиненные на N-конце, тогда как сигнальная пептидаза и SSP формируют удлинённые именно с C-конца пептиды, то участие 26S протеасомы как раз объяснимо. Таким образом, формирование правильного пептида для закладки в пептид-связывающий домен HLA-E происходит, вероятно, в несколько стадий – сначала происходит формирование правильного N-конца с помощью сигнальных пептидаз, а на второй стадии с помощью протеасомы происходит подгонка пептида с С-конца. Возможно, что такой непростой механизм генерирования антигенного пептида для HLA-E прежде всего связан с несовершенством клеточной системы протеаз, которые в силу узнавания определённых аминокислотных последовательностей, т.е.
своеобразной “специализации”, не могут производить одновременное расщепление в случае несоответствия сайтов. Не стоит также забывать о нестабильности пептидов в цитоплазме клеток: возможно захват протеасомой сигнальных пептидов после расщепления SSP носит не только функциональный характер в формировании правильного С-конца пептида, но также и защитную функцию. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные флюоресцентной микроскопии о локализации 26S протеасомы в цитоплазме клеток близко к поверхности эндоплазматического ретикулума (Reitz E. et al., 1997). То есть в свете полученных исследователями результатов можно представить, что после расщепления лидерной последовательности SSP может происходить прямая поставка пептида протеасоме, избегая воздействия цитоплазматических протеаз. Однако попытки найти белки, взаимодействующие с субъединицами 26S на поверхности ЭПР, пока не увенчались успехом, и гипотеза остаётся всего лишь предположением.
Выход молекулы HLA-E на поверхность клеток под действием INF защищает клетки меланомы человека от цитотоксического действия лимфоцитов Нам удалось показать наличие белка, его поверхностную локализацию и индукцию интерфероном-гамма. Однако до момента демонстрации функциональной значимости молекулы HLA-E в противоопухолевом иммунном ответе наша гипотеза остаётся всего лишь гипотезой. Соответственно, следующим этапом нашего исследования стало выявление функциональной активности молекул HLA-E на поверхности опухолевых клеток. Ранее Michaelsson J. с коллегами показали, что положительные по NKG2 рецепторам и отрицательные по KIR рецепторам NK-клетки клеточной линии NKL способны лизировать только клетки не несущие молекулу HLA-E на своей поверхности, а клетки с молекулой HLA-E были не чувствительны к цитотоксическому действию NKL клеток (Michaelsson J et al., 2002).
В нашем случе, мы протестировали клетки линии Mel Si, которые постоянно экспрессируют HLA-E на клеточной поверхности, Mel P, которые презентируют молекулу HLA-E на клеточную поверхность только в условиях индукции интерфероном-гамма, а также клеточную линию Mel Kor, у которой полностью отсутсвуют молекулы МНС I класса на поверхности (Рис. 8). При анализе клеток линии Mel Si мы обнаружили, что они обладают устойчивостью к лизису NKL даже в условиях высокого соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням. И наоборот, клеточная линия Mel Kor была чувствительна к NK-клеточному лизису независимо от обработки интерфероном-гамма.
% лизированных клеток соотношение цитотоксические клетки: клетки-мишени Рис. 8. Анализ количества лизированных клеток меланомы человека, экспрессирующих различное количество молекул HLA-E на клеточной поверхности, цитотоксическими NKL клетками Интересные результаты мы получили при тестировании клеточной линии Mel P, клетки которой в покоящемся состоянии не экспрессируют HLA-E на поверхности и, соотвественно, были чувствительны к лизису NKL клеткам – мы получили 85% лизированных клеток при соотношении 80:1 эффекторных клеток и клеток-мишеней. Предынкубация клеток Mel P с INF- делала клетки устойчивыми к NK клеточному лизису, именно за счёт презентации неканонической молекулы HLA-E на поверхность клеток.
Недавно, роль молекулы HLA-E в избежании CTL и NK клеточной цитотоксичности была также показана на клетках рака желудка ассоциированного с вирусом Эпштейн-Барр (Dutta N. et al., 2006). Однако, авторы работы считают, что снижение HLA-A и HLA-B при одновременном повышении выхода на поверхность молекул HLA-E в опухолевых клетках происходит исключительно благодаря вирусной инфекции, что позволяет раковым клеткам избежать лизиса.
Нам же удалось показать, что устойчивость опухолевых клеток к лизису цитотоксическими клетками происходит независимо от экспрессии вирусных белков в клетке.
Таким образом, присутствие в норме неканонической молекулы HLA-E на клеточной поверхности, также как и индукция интерфероном-гамма мембранной локализации молекулы HLA-E на поверхности опухолевых клеток, защищает клетки меланомы человека от цитотоксичности NKL клеток, несущих на своей поверхности исключительно CD94/NKG2A рецепторы. Так как большинство Т и NK клеток in vivo экспрессируют этот рецептор на своей поверхности, то очень вероятно, что опухолевые клетки могут использовать молекулу HLA-E путём предоставления её на клеточной поверхности во время иммунного ответа в качестве механизма защиты от клеточно-опосредованной цитотоксичности и тем самым избегать иммунологического отторжения in vivo.
ВЫВОДЫ 1. Впервые показана экспрессия неканонической молекулы HLA-E во всех покоящихся клетках меланомы человека, соизмеримая с экспрессией классических молекул главного комплекса гистосовместимости человека Iа класса.
2. Выход белка HLA-E на клеточную поверхность в покое происходит в 25% исследуемых клеточных линиях меланомы человека.
3. Продемонстрирована дозозависимая индукция интерфероном-гамма экспрессии молекулы HLA-E в опухолевых клетках.
4. Показано, что выход на поверхность клеток меланомы человека молекул HLA-E происходит под действием INF- и характерен для всех клеточных линий, имеющих молекулы MHC Ia касса и функциональный 2 микроглобулин.
5. Впервые показано, что стимулирование INF- выхода на поверхность клеток неканонической молекулы HLA-E зависит от эффективного процесса генерирования пептидов протеасомой.
6. Впервые продемонстрировано, что присутствие неканонической молекулы HLA-E на поверхности клеток-мишеней приводит к защите последних от NK-клеточной цитотоксичности, то есть получено экспериментальное подтверждение функционирования молекулы HLA-E на клеточной поверхности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Бережной А.Е., Закеева И.Р., Кибардин А.В., Чернышева А.Д., Моиссенко В.М., Данилов А.О., Демидов Л.В., Барышников А.Ю., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. (2006) Анализ экспрессии молекул HLA-E в клетках меланомы человека. Росс. Биотерапев. Журнал, № 3, стр. 27-35.
2. Бережной А.Е., Закеева И.Р., Кибардин А.В., Чернышева А.Д., Михайлова И.Н Барышников А.Ю., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. (2006) Новые мишени для противоопухолевой иммунотерапии. International conference “Basic Science for Biotechnology and Medcine”, стр. 27.
3. Berezhnoy A., Zakeyeva I., Kibardin A., Chernysheva A., Moiseyenko V., Demidov L., Danilov A., Baryshnikov A., Gnuchev N., Georgiev G., Larin S.
(2006) HLA-E expression in tumor cells in context of tumor immune rejection.
International Cancer Immunotherapy Symposia, p. P-07.
4. Kibardin AV, Mirkina II, Baranova EV, Zakeyeva IR, Georgiev GP, Kiselev SL.
2003. The differentially spliced mouse tagL gene, homolog of tag7/PGRP gene family in mammals and Drosophila, can recognize Gram-positive and Gram negative bacterial cell wall independently of T phage lysozyme homology domain.
J. Mol Biol. 326(2): 467-74.
5. Кибардин А.В., Миркина И.И., Баранова Е.В., Закеева И.Р., Георигиев Г.П., Киселев С.Л. (2003) Анализ экспрессии белков кодируемых генами семейства tag7/tagL (PGRP-S,L) в периферических клетках крови человека.
Генетика. Т.39, № 2, стр. 244-249.
6. Прыжкова М.В., Закеева И.Р., Кибардин А.В., Георгиев Г.П., Киселев С.Л.
(2004) Использование генетически модифичицрованных эмбриональных стволовых клеток для создания трансгенных мышей. Генетика. Т.40, № 3, стр. 235-