Распространение пурпурных несерных бактерий в перифитоне водотоков разного генезиса, их роль в азотфиксации и денитрификации
На правах рукописи
ГАЛЯМИНА Валентина Владимировна
РАСПРОСТРАНЕНИЕ ПУРПУРНЫХ НЕСЕРНЫХ БАКТЕРИЙ
В ПЕРИФИТОНЕ ВОДОТОКОВ РАЗНОГО ГЕНЕЗИСА,
ИХ РОЛЬ В АЗОТФИКСАЦИИ И ДЕНИТРИФИКАЦИИ
03.02.03 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пермь – 2011
Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Учреждения Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Саралов Александр Иванович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Соловых Галина Николаевна доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Защита состоится «»_2011 г. вчасов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342)280 92 Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан «»_ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Фототрофные пурпурные несерные бактерии (ПНБ) благодаря универсальности обмена и пластичности метаболизма весьма широко распространены в водоемах разного типа [Горленко и др.,1977]. Принято считать, что они обычно не образуют массовых скоплений. ПНБ наиболее быстро растут в фотоорганотрофных условиях. Такие исключительные условия создаются в природе сравнительно редко. В водоемах, где формируется анаэробная зона, наряду с органическими соединениями часто появляется сульфид. Хотя ряд видов ПНБ способен использовать H2S, но они реализуют его с меньшей эффективностью, чем фототрофные серобактерии [Горленко, 2010].
Поэтому в донных осадках и стратифицированных водных массах озер, содержащих сульфид, ПНБ вытесняются на второй план зелеными и пурпурными серобактериями. Поэтому роль ПНБ в микробиологических процессах цикла серы в озерах представляется несущественной. Однако ПНБ здесь могут играть важную роль в микробиологических процессах круговорота азота [Кузнецов и др., 1985]. У чистых культур различных видов ПНБ установлена способность к аммонификации, азотфиксации, нитратредукции или денитрификации [Satoh, 1977;
Klemme, 1979;
Alef et al., 1982;
Castillo, Cardenas, 1982;
Madigan et. al., 1984;
Shapleigh, 2009].
В последние десятилетия особый научный интерес вызывают прикрепленные формы микроорганизмов в водотоках разного генезиса.
Перифитонные сообщества являются традиционным объектом экологических исследований, поскольку в обрастаниях подводных субстратов обитает большинство водных микроорганизмов [Константинов, 1986;
Watnick, Kolter, 2000]. Здесь обычно доминируют микроскопические водоросли и бактерии, которые способны быстро реагировать на изменения окружающей среды [Горбунов, Уманская, 2008]. В частности, на примере предгорной реки Сылва (бассейн р.Камы) установлено, что не планктону, а фито- и бактериоперифитону принадлежит ведущая роль в самоочищении и биопродуктивности быстротекущих вод [Беляева и др., 2007]. Часть работ в этом направлении посвящена изучению активности азотфиксации и денитрификации перифитонных микробоценозов, но преимущественно в озерах и водохранилищах [Steppe et al., 1996;
Pinckney, Paerl, 1997;
Smith, Lee, 2006;
Falcon et. al., 2007;
Ishida et. al., 2008;
Inglett et al., 2009]. К настоящему времени имеются лишь единичные сведения о распространении ПНБ и их участии в процессах цикла азота в составе перифитонных сообществ проточных природных и антропогенных систем [Finke, Seeley, 1978;
Rybakova et al., 2009].
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение распространения пурпурных несерных бактерий в перифитоне водотоков разного генезиса, оценка их вклада в процессы цикла азота:
азотфиксацию и денитрификацию.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.
1. Провести учет численности ПНБ в планктоне и обрастаниях подводных субстратов водотоков Камского и Байкальского бассейнов.
2. Установить таксономическую принадлежность ПНБ, доминирующих в перифитонных сообществах.
3. Оценить способность культур изолятов ПНБ к азотфиксации, нитратредукции и денитрификации.
4. Определить интенсивность фиксации молекулярного азота и денитрификации микробными сообществами планктона и перифитона в ряде природных и антропогенных водотоков Камского бассейна.
Научная новизна. Впервые выявлено массовое распространение ПНБ в перифитоне (обрастаниях каменистых субстратов и макрофитов) в условиях быстротекущих вод разного генезиса. Обнаружена ведущая роль ПНБ родов Rhodopseudomonas и Rhodobacter в составе речных эпилитонных сообществ и активного ила биологических очистных сооружений (БОС) г.Перми в процессах биологической денитрификации. В обрастаниях макрофитов и в планктоне рек Предуралья гетероцистным цианобактериям (ЦБ) родов Anabaena, Aphanizomenon и ПНБ принадлежит ведущая роль в процессах азотфиксации.
В природных и антропогенных водотоках Камского бассейна интенсивность и масштабы АФ и потенциальной ДЕН перифитонными и планктонными ПНБ и ЦБ сопоставимы с таковыми в водных массах и донных отложениях загрязненных участков продуктивных озeр и водохранилищ.
Теоретическая и практическая значимость работы. Установлена способность выделенных из перифитонных сообществ культур штаммов Rhodobacter spp. к восстановлению токсичных оксианионов теллура и к внутриклеточной аккумуляции ионов меди. Полученные данные позволяют полагать, что перифитонным ПНБ принадлежит важная роль в процессах самоочищения природных и сточных вод от минеральных и органических загрязняющих веществ. Выделенные штаммы активных денитрифицирующих ПНБ (1-3R) целесообразно использовать для повышения эффективности очистки городских сточных вод. Суспензионные и иммобилизованные культуры активного азотфиксирующего штамма 1R, изолированного из перифитона р.Сылвы, перспективны для промышленного получения водорода за счет органических отходов и энергии света.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В течение летне-осеннего периода в обрастаниях гидрофильной растительности и каменистых субстратов водотоков разного генезиса массовое распространение могут получать ПНБ.
2. Среди ПНБ перифитонных сообществ обычно доминируют Rhodopseudomonas palustris и различные виды рода Rhodobacter.
Все выделенные в чистую культуру штаммы Rhodobacter spp. содержат ген nifH, проявляют повышенную активность азотфиксации на свету.
Из них штаммы R. capsulatus 1R, R. azotoformans 2R и R. sphaeroides 3R обладают способностью к активной денитрификации в темноте, а штаммы R. blasticus 4-9R – к ассимиляционной нитратредукции на свету и в темноте.
3. В планктоне и эпифитоне рек Пермского края ПНБ и гетероцистным ЦБ родов Anabaena и Aphanizomenon принадлежит ведущая роль в азотфиксации. На БОС г.Перми и в речном эпилитоне ПНБ, напротив, способны реализовать свой потенциал к денитрификации.
Апробация работы и публикации. Всего по теме диссертации опубликовано 9 научных работ: 4 статьи, одна из которых в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ, и 5 тезисов. Материалы диссертации доложены на трех Всероссийских конференциях молодых ученых.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах, включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение, выводы и список литературы из 263 наименований: 99 на русском и 164 на английском языках.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при поддержке по Программе фундаментальных исследований Президиума РАН №22 “Молекулярная и клеточная биология”, проект № 01200963684, и гранта РФФИ-Урал № 07-04-96027.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. А.И. Саралову за помощь при подготовке диссертации, сотрудникам лаборатории водной микробиологии ИЭГМ УрО РАН (О.М. Банниковой, П.Г. Беляевой, Н.П. Ковалевской, Е.М. Реутских, А.П. Соломенному) за непосредственное участие в проведении полевых и экспериментальных работ, а также заведующему отдела Центра «Биоинженерия» РАН, Москва, к.б.н. Б.Б. Кузнецову за помощь при выполнении молекулярно-генетических исследований.
Принятые сокращения и обозначения. ПНБ – пурпурные несерные бактерии, ЗПБ – зеленые пурпурные бактерии, ПСБ – пурпурные серные бактерии, СВБ – сульфатвосстанавливающие бактерии, ЦБ – цианобактерии, АФ – активность азотфиксации, ДЕН – активность денитрификации, БОС – биологические очистные сооружения.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пробы воды и перифитона, используемые для изучения интенсивности азотфиксации (АФ) и денитрификации (ДЕН) на уровне микробных сообществ, а также чистых культур ПНБ отбирали в 2004-2005 гг. из природных и сточных вод Камского бассейна (реки Кама, Вишера, Нытва, Сылва, Глотиха;
БОС г.Перми) и Байкальского бассейна (оз.Байкал, реки Баргузин и Селенга, Аллинские и Кучигерские термальные источники). Замеры физико-химических параметров воды в местах отбора проб, включая температуру, рН, Еh, содержание растворенного кислорода и общую минерализацию воды, проводили с помощью портативного анализатора «Экотест-2000т» и кондуктометра TDS-4.
Образцы альго-бактериальных матов, смывы с камней (галька, валуны) или с листьев и стеблей макрофитов (рдесты, уруть) отбирали со стандартной площадки 115см2 в 1.5 л природной воды. Для сравнительной оценки изучаемых показателей в воде и перифитоне их значения рассчитывали на 1м3 объема или 1м2 площади, соответственно. Гидрохимические анализы проб включали определение содержания сульфатов, карбонатов, общего железа, соединений азота и фосфора [Руководство.., 1980].
Общую численность бактерий (Nб) в образцах учитывали методом прямого счета с использованием окраски карболовым эритрозином на мембранных фильтрах Millipore с диаметром пор 0.22 мкм [Романенко, Кузнецов, 1974].
Фильтры просчитывали при увеличении 1500 на микроскопе Biolar (Польша).
Содержание ПНБ в пробах определяли методом предельных разведений на среде Пфеннига с сукцинатом Na (1.0 г/л) [Кузнецов, Дубинина, 1989]. Для выявления способности ПНБ к АФ или ДЕН в культурах использовали безазотистую среду или вместо аммония вносили 3 г/л KNO3. Культуры выращивали в специально оборудованном шкафу со встроенными лампами дневного света при освещенности 3000-5000 люкс, а также в термостате в 26-280С.
темновых условиях при температуре Количественный анализ внутриклеточного белка проводили по методу Лоури [Lowry et al., 1951], нитритов – фотометрически с реактивом Грисса [Руководство.., 1980].
Ультратонкое строение клеток исследовали на электронном микроскопе JEM 100, JEOL (Япония) по стандартной методике в ИБФМ РАН, Пущино [Сузина и др., 2004]. Спектры поглощения бактериохлорофиллов и каротиноидов нативных клеток регистрировали на спектрофотометре UV mini-1240, Shimadzu (Япония) в диапазоне длин волн 350–950 нм. Каротиноиды для спектрального анализа экстрагировали ацетон-метанольной смесью (1:1). Состав внутриклеточных жирных кислот (ЖК) анализировали на хромато масс-спектрометре Agilent 6890/5973N (США) по общепринятой методике [Imhoff, Tiemann, 1991]. Идентификацию ЖК осуществляли с использованием автоматизированной системы обработки масс-спектральных данных AMIDS с поиском целевых компонентов по библиотеке Американского Агентства окружающей среды NIST 98/NISTEPA.MSL с фактором сходства не менее 80%.
Суммарную ДНК выделяли по методике Миллера [Miller et al., 1999].
Содержание ГЦ-пар оснований оценивали по температуре плавления ДНК по общепринятому методу Мармура [Marmur, Doty, 1962]. Амплификацию фрагментов гена nifH (707 пн) проводили на термоциклере MyCycler, Bio-Rad (США) с использованием специфичных праймеров Pmnif-f (5'-ATGGGTCAGAAGATCCT-3') и Pmnif-r (5'-AGCTCTTCCATGGTGAT-3'), разработанных на основании полных последовательностей генов nifH пурпурных несерных бактерий родов Rhodobacteraceae, Bradyrizobiaceae и Rhodospirillaceae, представленных в базе данных GenBank. Режим проведения ПЦР включал: 1 цикл – 940С – 1 мин;
30 циклов – 940С –20 сек, 550С – 20 сек;
720С – 30 сек и финальная достройка при 720С – 5 мин. Гены 16S рРНК амплифицировали на приборе DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad (США) с универсальными праймерами 27f и 1492r [Lane, 1991].
Нуклеотидные последовательности устанавливали на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer 3730, Applied Biosystems (США) с использованием набора реагентов Wizard PCP Preps, Promega (США) по прилагаемому протоколу. Для выравнивания полученных последовательностей генов 16S рРНК использовали программу ClustalX [Tompson et al., 1997], а для последующего их сравнения с последовательностями в базе данных GenBank – программу NCBI BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST].
Таксономическую принадлежность выделенных фототрофных бактерий устанавливали по совокупности фенотипических и генотипических признаков согласно определителя бактерий Берджи [Bergeys Manual.., 2005].
Интенсивность микробиологических процессов АФ и ДЕН определяли газохроматографическим методом по скорости восстановления ацетилена до этилена азотфиксирующим нитрогеназным комплексом микроорганизмов и по скорости накопления закиси азота c использованием ацетилена в качестве специфического ингибитора N2O-редуктазы [Stewart et. al., 1967;
Yoshinari, Knowles, 1976]. Количественный анализ газов проводили на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия): этилен – на пламенно-ионизационном детекторе, а закись азота – на катарометре. При корреляционном анализе полученных данных использовали пакет программ Statistica-6, StatSoft [США].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Физико-химическая и микробиологическая характеристика водотоков Камского и Байкальского бассейнов Содержание растворенного кислорода в местах отбора проб варьировало от 0-0.5 мг О2/л в сероводородных водах реки Глотиха до 9.6 мг О2/л в предгорных реках Сылва (на западном склоне Среднего Урала) и Вишера (на Северном Урале). Широкий диапазон отмечен и по температуре, 4.4-59.20С. Максимальные значения рН (8.5–9.5) зафиксированы в Кучигерском и Аллинском термальных источниках (табл. 1). По уровню минерализации водотоки классифицируются от слабоминерализованных – 51 мг/л в оз.Байкал, до повышенно минерализованных – 785 мг/л в р.Сылве и 1120 мг/л в р.Глотихе с высоким содержанием сульфатов (340-360 мг SO42-/л), поступающих со стоками из очистных сооружений Соликамского целлюлозно-бумажного комбината (ОС ЦБК). В водном балансе р.Сылвы от истоков до среднего течения важную роль играют холодные подземные воды, особенно в районе Мазуевского месторождения стронция. Летом они дают ~ 1/3 общего притока, содержат мало органического вещества и фосфора, но много соединений азота (0.6-1.9 мг..
N-NH4+/л и/или 0.9-2.7 мг..N-NO3/л). Постоянно высоким содержанием азота аммония и нитратов (1-15 мг N-NH4+/л, 1-10 мг N-NO3/л) характеризуется проточная система БОС г.Перми.
Таблица 1. Основные характеристики исследованных проб и изолятов ПНБ рода Rhodobacter BLAST-сходство № изолята Г+ Ц, по гену 16S рРНК Место отбора проб Т, С рН NПНБ и морфотип мол.% с R.blasticusT, % Эпифитон Myriophyllum spicatum в р.Сылве, 8 км ниже г.Кунгура 19.4 8.0 433 1, R. capsulatus 69.5 95% Эпилитон на гальке в ручье на стоке с термального поля “Алла” (Бурятия) 13.0 8.7 9 2, R. azotoformans 68.3 95% Эпилитон на гальке в ручье термального источника “Кучигер” (Бурятия) 19.5 8.5 452 3, R. sphaeroides 66.5 95% Эпилитон на галке в скважине сероводородного источника санатория “Ключи” (Пермский край) 4.4 7.4 3000 4, R. blasticus 66.2 99% Эпилитон на валунах литорали оз.Байкала, 3 км севернее г. Гремячинск (Бурятия) 5.6 7.9 1 5, R. blasticus 66.2 98% Активный ил аэротенка II ступени БОС (г.Пермь) 21.9 6.8 700000 6, R. blasticus 66.1 98% Эпилитон на гальке в прибрежье р.Камы напротив БОС (г.Пермь) 19.8 7.4 185 7, R. blasticus 66.1 99% Эпилитон на валунах, 0.6 м от излива термального источника “Алла” (Бурятия) 59.2 9.5 6 8, R. blasticus 65.6 98% Альго-бактериальные маты в р.Глотихе, 31.4 7.2 850 9, R. blasticus 64.5 100% 2.2 км ниже ОС ЦБК (г.Соликамск) Примечание. NПНБ – численность ПНБ, млрд. кл в 1 м3 воды или в обрастаниях на 1 м2 проекции на дно.
В водотоках Прикамья широко варьировала и численность ПНБ:
в планктоне – 0.01–11 млрд. кл/м3, в обрастаниях подводных субстратов – 20–3000 млрд. кл/м2 и достигала максимальных значений в альго-бактериальных матах – до 4350 млрд. кл/м3. При этом доля ПНБ в составе микробных перифитонных сообществ составляла от 0.5 % Nб (обрастания рдестов в р.Нытве) до 40 % (обрастания гальки в холодном ручье на территории санатория “Ключи”). В эпилитоне оз.Байкала и его притоков (рек Селенга и Баргузин) содержание ПНБ ограничено 1–5 млрд. кл/м2, но значительно выше в эпилитоне теплых ручьев от термальных источников, до 450 млрд. кл/м2 или 16 % от Nб.
Максимальная численность ПНБ выявлена в активных илах БОС г.Перми, 100-700 млн. кл/мл (или 20-70 % от Nб).
2. Описание чистых культур пурпурных несерных бактерий При изучении морфо-физиологических особенностей и спектральном анализе пигментного состава накопительных культур доминирующих в перифитоне ПНБ, полученных при пересеве из крайних разведений красных колоний внутри агаровых столбиков в условиях непрерывного искусственного освещения, были выявлены представители двух родов: Rhodopseudomonas (R. palustris) и Rhodobacter spp. Для дальнейших исследований было отобрано 9 штаммов морфотипа Rhodobacter с Г+Ц в ДНК 64.5-69.5 мол.% (табл. 1), воспроизводимо растущих на среде Пфеннига с сукцинатом и малатом. Сравнительный BLAST-анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал высокий уровень сходства 6 штаммов (№№ 4-9R) к типовому штамму Rhodobacter blasticus АТСС 33485Т DQ342322 (98-100 %). Эти штаммы являются пресноводными нейтрофилами, но растут в широком диапазоне рН среды 5.0-9. (оптимум 6.5-7.5), содержат бактериохлорофилл а, каротиноиды сфероиденовой серии, внутриклеточные мембранные системы и жирные кислоты с четным числом атомов углерода (преимущественно мононенасыщенную октадеценовую С18:1). Все они активно развиваются в фотоорганотрофных условиях на органических кислотах (ацетат, бутират, лактат, малат, пируват, пропионат, сукцинат, фумарат, цитрат), на углеводах (глюкоза, маннит, фруктоза), продуцируют кислоты из глюкозы и ксилозы, растут под газовой смесью Н2 + СО2, в условиях азотфиксации и с глутаматом, проявляют способность к активной нитратредукции и ассимиляционной сульфатредукции, восстанавливают оксианионы теллура и аккумулируют ионы меди. При анаэробном росте на свету эти ПНБ (в противоположность Rhodopseudomonas palustris и пурпурным серным бактериям) не используют в качестве доноров электронов тиосульфат и элементную серу.
ПЦР-анализ nifH-генной последовательности (707 пн) показал наличие гена нитрогеназной системы – nifH в клетках всех исследуемых штаммов Rhodobacter (рис.1).
Активность фотовосстановления ацетилена нитрогеназой в культурах Rhodobacter варьирует от 64 нМ C2H4/(мин · мг белка) у штамма 9R до 130 нМ C2H4/(мин · мг белка) у штамма 1R (табл. 2). Наряду с этим в культурах Rhodobacter в условиях азотфиксации обнаружено значительное внутриклеточное накопление ионов меди. Через 24 часа инкубации на свету остаточная концентрация Cu2+ в среде составляла 15-50 % от исходной (5 ПДК).
При этом лишь штаммы 2R и 8R из эпилитона термального поля “Алла” сохраняли активность нитрогеназы на сравнительно прежнем уровне (рис. 2).
Для выявления способности культур восстанавливать нитраты в питательную среду вместо NH4Cl вносили 3 г/л KNO3. Результаты химического анализа 5-дневных культур, выращенных на свету и в темноте, показали накопление нитритов в средах всех штаммов ПНБ, что свидетельствует о проявлении у них нитратредуктазной активности (табл. 2). При газохроматографическом анализе накопления закиси азота в присутствии ацетилена – ингибитора N2O-редуктазы было обнаружено накопление N2O в культуральных средах только у штаммов 1R, 2R и 3R. Только эти три штамма оказались способны к восстановлению нитратов в темноте по пути денитрификации. При этом штамм 1R существенно отличается от других по ряду важных признаков: наибольшее значение Г+Ц в ДНК (69.5 мол.%) и способность к восстановлению высоких концентраций теллурита (минимальная ингибирующая концентрация (МИК) K2TeO3 – 1800 мг/л), Рис..1. Результаты ПЦР амплификации гена nifH: Рис..2. Изменение нитрогеназной 1-9 – штаммы Rhodobacter spp.;
активности штаммов 1- K – E. coli К12;
М – маркер ДНК под действием ионов меди, мг C2H4 / (л · час) на ед. ОП Таблица 2. Характеристика нитратредуктазной и нитрогеназной активностей теллурит-восстанавливающих штаммов Rhodobacter spp.
Максимум Нитрогеназная Активность ДЕН Белок, МИК накопления активность (накопление N2O % от Штамм, NO2, мкг N/л K2TeO3, (фотовосстановление сухого в присутствии C2H2), № мг/л (при 3 г/л KNO3 C2H2 до С2Н4), веса нМ/(мин · мг белка) в среде) нМ/(мин · мг белка) 1 67 1800 300 285 2 66 1800 280 161 3 54 1200 150 68 4 54 800 100 — 5 54 1200 120 — 6 54 1200 110 — 7 55 800 80 — 8 47 800 50 — 9 48 800 60 — аномально высокое содержание внутриклеточного белка (67 % в сухой биомассе), наиболее высокий уровень накопления нитритов в среде, максимальные удельные активности азотфиксации и денитрификации (табл. 2).
Cогласно выявленным фенотипическим и генотипическим признакам штаммы 1R, 2R, 3R предварительно идентифицированы нами как R..capsulatus..1R,R. azotoformans 2R и R. sphaeroides 3R. Так, клетки R. capsulatus 1R, R. azotoformans 2R, R. sphaeroides 3R имеют овоидную форму, полярно расположенные жгутики, размножаются бинарным делением и несут систему внутриклеточных мембран везикулярного типа (рис. 3а).
В спектрах поглощения все культуры ПНБ in vivo имеют полосы поглощения бактериохлорофилла а с максимумами поглощения (max) около 378, 590, 800 и 850-860 нм, а также каротиноиды сфероиденового ряда с max сфероидена, сфероиденона и их производных при 450-455, 478-480 и 510-512 нм (рис. 4).
Рис. 3. Ультраструктура клеток СВМ штаммов Rhodobacter spp.
2R (a), 9R (b). СВМ – система внутриклеточных мембран.
Масштабная линейка – 1 мкм.
СВМ b а Рис...4. ВЭЖХ анализ состава каротиноидов экстракта из клеток штамма 1R в петролейном эфире. Пики: 1 – ОН-сфероиденон, 2 – производное сфероиденона, 3,5,6 – производные сфероидена, 4 – сфероиденон, 7 – сфероиден, 8 – нейроспорен, Бхл – бактериохлорофилл, Бфео – бактериофеофитин.
Все выделенные штаммы Rhodobacter spp. при аналогичном фотогетеротрофном росте на сукцинате (рН 7.2;
280С) имеют примерно одинаковый состав внутриклеточных жирных кислот (% от суммы ЖК):
С18:1 (75-80), С18: 0 (7-10), С16: 0 (5-6), С16: 1 (4-5), С19: 0 cycl (3-4).
Штаммы R..blasticus 4-9R (в отличие от штаммов R..capsulatus 1R, R. azotoformans 2R и R. sphaeroides 3R) обладают пониженной активностью АФ и не осуществляют процесс ДЕН, хотя восстанавливают нитраты до нитритов на свету и в темноте. Они представлены неподвижными палочковидными клетками с ламеллярной структурой внутренних мембран (рис.//3b), размножаются неравномерным делением или почкованием. При фотосинтезе в качестве доноров электронов не используют сульфид (H2S) и формиат. Однако ПНБ вида R. blasticus очень широко распространены в эпилитоне водотоков разного генезиса (4-600С, рН 6.8-9.5), в аэрируемых и сероводородных природных и техногенных проточных системах, в активных илах БОС г.Перми, в альго бактериальных матах. В естественных перифитонных сообществах R..blasticus вполне может принимать непосредственное участие в процессах АФ, а также благодаря способности к нитратредукции – в процессах и ДЕН.
3.…Активность процессов цикла азота в природных и техногенных водотоках Прикамья 4.1. Азотфиксация и денитрификация в сточных водах На БОС г.Перми выявлено массовое распространение ПНБ и исключительно высокая скорость восстановления нитратов до N2O и N (табл. 3). В резервуарах БОС г.Перми, особенно в аэротенках и возвратном иле, численность ПНБ достигала 70% от Nб (0.2-1.0 млрд. кл/мл). При этом обнаружена значимая положительная корреляционная связь скорости ДЕН с общим количеством бактерий (r = 0.51–0.70) и численностью ПНБ (r = 0.60–0.88, р 0.05). Тогда как интенсивность азотфиксации в проточной системе очистки городских сточных вод, содержащих высокие концентрации азота аммония и нитратов, оказалась очень низкой.
Таблица 3. Азотфиксация и денитрификация в воде и активном иле БОС г.Перми (август, 2005г.) Место отбора проб О2, мг/л Nб ПНБ, % Nб АФ ДЕН Вход на БОС 23.2 0.004 0.9 3. Отстойники:
1 ступени 44.6 0.2 1.3 1. 2 ступени 18.5 0.3 0.3 3. 3 ступени 3.3 0.3 0.2 5. Аэротенки:
1 ступени 213 47.0 0.4 1. 2 ступени 1023 68.4 0.6 6. Возвратный ил 870 57.5 0.9 2. Примечание..Nб…–..общая..численность..бактерий,..млн...кл/мл;
АФ и ДЕН – интенсивности азотфиксации и денитрификации, мкг N/(л · сут).
В реке Глотиха, вбирающей в себя стоки с очистных сооружений Соликамского ЦБК с высоким содержанием растворенных сульфатов, распространены сульфатвосстанавливающие (СВБ) бактерии, а также зеленые и пурпурные серные бактерии морфотипов Chlorobium, Pelodyction и Thiocapsa (табл. 4). В этих сероводородных водных массах с низким содержанием растворенного кислорода наблюдалась активная ДЕН, до 40–90 мкг N/(л..·..сут).
Таблица 4. Азотфиксация и денитрификация в воде р. Глотихи (август, 2005 г.) ЗПБ и ПНБ СВБ SO42- ПСБ Место отбора проб АФ ДЕН мг/л % Nб 2.2 км ниже 341 0.1 14.8 3.7 9.8 39. ОС ЦБК Напротив стока из оз. Щучье 283 0.3 0.3 0.1 4.4 14. Низовье реки, 240 0.1 0.1 0.2 18.7 90. 1 км до р. Кама Примечание. ЗПБ и ПСБ – зеленые и пурпурные серные бактерии;
СВБ – сульфатвосстанавливающие бактерии;
АФ и ДЕН – как в табл. 3.
Кроме того, в отличие от БОС г.Перми, в водных массах р.Глотихи отмечалась и довольно активная АФ, до 10-19 мкг N/(л · сут). Здесь вклад ПНБ в процессы АФ и ДЕН явно уступает фототрофным серным бактериям, СВБ и другим гетеротрофным микроорганизмам.
3.2. Сезонная динамика азотфиксации и денитрификации в р. Кама В течение летне-осеннего периода 2005 г. в обрастаниях каменистых субстратов вдоль побережья р.Камы напротив буферных прудов БОС г.Перми наблюдалось увеличение Nб и ПНБ (от 0.1 до 4 % Nб), что сопровождалось значительным усилением ДЕН, от 25 до 227 мг N/(м2 · сут) и АФ, от 3 до 32 мг N/(м2 · сут) (табл. 5). Для всего периода наблюдений выявлена достоверная положительная корреляционная связь между интенсивностью процесса ДЕН и различными показателями встречаемости клеток ПНБ в эпилитоне: r = 0,95, р 0,05 (рис. 5). Однако ДЕН не регистрировалась Таблица 5. Сезонные изменения активности азотфиксации и денитрификации в прибрежье р.Кама напротив БОС г.Перми в 2005 г.
ПНБ, Место отбора проб Дата Nб Nцб АФ ДЕН % Nб Вода в прибрежье 20.VI 4.8 0.02 0.1 0.6 27.VII 2.7 0.04 0.7 2.5 29.VIII 2.3 0.4 2.5 18.4 30.IX 2.1 0.5 2.4 16.3 Potamogeton spp. 20.VI 3.7 0.01 0.3 0.9 27.VII 4.7 0.9 5.0 33.6 29.VIII 7.6 5.7 10.1 87.5 11. 30.IX 5.5 7.9 4.6 42.9 12. Галька 20.VI 5.0 0.1 0.4 2.6 25. 27.VII 6.2 0.7 3.3 21.4 44. 29.VIII 7.1 2.6 7.2 56.8 169. 30.IX 10.7 4.1 3.8 31.9 226. Примечание. Здесь и в табл. 6,7: Nб – общая численность бактерий, 1012 кл в 1 м3 воды или в обрастаниях на 1 м2 дна;
Nцб – общая численность цианобактерий (Anabaena, Aphanizomenon), 109 кл/м3 или на 1 м2;
АФ и ДЕН, мг N/(м3..·..сут) или на 1 м2 ·..сут.
Рис. 5. Корреляция между численностью ЦБ и ПНБ, 109 кл/м3 или на 1 м2, и АФ (а, b) в планктоне и перифитоне, а также между численностью ПНБ, 109 кл/м2, и ДЕН (c) в эпилитоне р.Камы напротив БОС г.Перми.
в прибрежных водах, а в обрастаниях макрофитов, несмотря на достаточно высокую численность ПНБ, ДЕН отмечалась лишь осенью и оказалась в 15– раз ниже, чем в эпилитоне.
В планктоне и перифитоне, напротив, наблюдалась активная АФ, которая значительно возрастала в течение лета и коррелировала с повышением численности ПНБ (r = 0.76) и гетероцистных цианобактерий (ЦБ) родов Anabaena и Aphanizomenon (r = 0.99) (рис. 5).
3.3...Азотфиксация и денитрификация в планктоне и перифитоне рек Камского бассейна На участке р.Камы от устья р.Вишеры до Нытвенского водохранилища отмечалось одновременное повышение интенсивности АФ и численности ЦБ.
При этом прослеживалась положительная корреляционная связь между интенсивностью АФ и численностью гетероцистных ЦБ Anabaena spp. и Aphanizomenon spp. (табл. 6). ДЕН не регистрировалась в поверхностных слоях воды, но отмечалась у дна глубоководных станций. Кроме того, повышенный уровень ДЕН (особенно по сравнению с АФ) выявлен в всплывающих местами альго-бактериальных матах в р.Вишере ниже г.Красновишерска, где разнообразные фототрофные серные и несерные пурпурные бактерии явно доминировали в составе бактериального сообщества.
Таблица 6. Азотфиксация и денитрификация в планктоне и перифитоне рек Вишера, Нытва и Кама ПНБ, Место отбора проб Nб Nцб АФ ДЕН % Nб Р.Вишера, 40 км выше г.Красновишерска:
3.7 0.003 0.02 0.4 - вода 6.4 6.7 0.06 16.2 - Potamogeton spp.
12.3 3.6 0.05 14.5 46. - галька (диаметр 1–5 см) Р.Вишера, 0.5 км ниже г.Красновишерска:
- вода 4.4 0.02 0.05 0.6 - галька (диаметр 1–4 см) 9.6 4.5 0.04 13.7 55. - альго-бактериальные маты 8.5 51.1 1.13 31.9 200. Смешение вод рр.Вишера и Кама:
- вода поверхностная 2.2 0.005 0.21 2.7 - вода придонная (глубина 6 м) 2.3 0.05 0.08 1.4 12. Р.Кама, 12 км ниже устья р.Вишеры:
- вода поверхностная 1.9 0.002 0.15 2.5 - вода придонная (глубина 9 м) 1.8 0.006 0.05 1.1 10. Верховье Нытвенского водохранилища:
- вода 6.2 0.01 14.4 163.6 - Potamogeton perfoliatus L. 5.4 0.1 5.1 56.4 Устье р.Нытвы перед Воткинским водохранилищем:
- вода 6.6 0.02 1.6 32.2 - Potamogeton spp. 5.1 0.5 2.4 45.6 - галька (диаметр 1–4 см) 12.2 17.8 0.9 62.7 225. Р. Кама напротив устья р.Нытвы:
- вода поверхностная 3.2 0.003 5.7 73.5 - вода придонная (глубина 9 м) 5.4 0.2 0.2 2.5 16. В обрастаниях каменистых субстратов и АФ, и ДЕН одинаково положительно коррелировали с частотой встречаемости ПНБ.
В верховьях р.Сылвы, где от истоков до среднего течения важную роль в водном балансе играют холодные подземные воды, ЦБ немногочисленны, что обусловливало сравнительно низкую интенсивность АФ (табл. 7).
На участке среднего течения р.Сылвы АФ закономерно увеличивалась, что, по-видимому, было связано в основном с ростом численности перифитоне: r = 0.96 – 0,99, р 0.05.
гетероцистных ЦБ, особенно в Таблица 7. Азотфиксация и денитрификация в планктоне и перифитоне р.Сылвы (август 2005 г.) ПНБ, Место отбора проб Nб Nцб АФ ДЕН % Nб 12 км выше г.Суксун:
- вода 0.6 0.02 0.01 0.2 - Potamogeton spp. 6.1 0.7 0.01 10.2 - галька (диаметр 1–4 см) 9.4 4.7 0.01 14.3 76. 7 км ниже г.Суксуна, напротив водопада подземных вод:
- вода 0.7 0.15 0.01 0.3 - Potamogeton perfoliatus L. 5.9 7.4 0.02 18.5 - валуны (диаметр 10–25 см) 1.1 2.0 0.01 13.4 164. 0.3 км ниже устья р.Мазуевки:
- вода в зоне родников на дне 1.1 0.1 0.02 0.3 - Potamogeton spp. 5.5 4.0 0.22 22.3 - галька (диаметр 1–4 см) 8.5 2.4 0.06 18.6 217. 12 км выше г. Кунгура:
- вода 0.9 1.1 0.01 0.5 - Potamogeton spp. 4.7 4.6 6.5 56.4 - галька (диаметр 1–4 см) 7.9 5.5 5.8 46.6 82. Русло на участке смешения с водами рек Шаква, Ирень (г.Кунгур):
- вода 1.8 0.6 0.01 0.5 - Potamogeton spp. 6.7 6.5 0.01 16.6 - галька (диаметр 1–4 см) 9.1 4.8 0.01 15.7 135. 8 км ниже г.Кунгура, перед устьем р.Бабки:
- вода поверхностная 2.1 0.5 0.7 35.1 - вода придонная (глубина 10 м) 2.4 0.4 0.1 5.4 16. - Myriophyllum spicatum L. 5.7 7.6 11.3 105.8 14. - галька (диаметр 1–3 см) 7.6 6.9 7.4 57.1 153. Кроме того, в перифитоне отмечалась положительная корреляционная связь АФ с численностью ПНБ. Активность ДЕН, напротив, отсутствовала в аэрируемых поверхностных водах и омываемых ими макрофитах, но регистрировалась локально в придонных слоях воды и значительно повышалась вниз по течению в обрастаниях каменистых субстратов. При этом уровень активности ДЕН в эпилитоне низовьев р.Сылвы был соизмерим с ДЕН в устьях других рек Предуралья.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В перифитонных сообществах и альго-бактериальных матах ряда текучих вод обнаружено массовое распространение ПНБ преимущественно родов Rhodopseudomonas (R. palustris) и Rhodobacter spp., где их численность обычно в 40-100 раз превышает таковую в речном планктоне и может достигать 10-50 % от Nб. Эти водотоки являются пресноводными с относительно низким содержанием сульфатов и сульфидов. Однако в анаэробных сероводородных водных массах р.Глотихи, вбирающей в себя сульфатсодержащие стоки, ПНБ вытесняются на второй план сульфатвосстанавливающими бактериями, фототрофными зелеными и пурпурными серобактериями.
У выделенных в чистую культуру 9 штаммов рода Rhodobacter выявлена способность к восстановлению токсичных оксианионов теллура, к внутриклеточной аккумуляции ионов меди, фиксации N2 на свету и к нитратредукции на свету и в темноте. Эти пресноводные нейтрофильные ПНБ содержат бактериохлорофилл а, каротиноиды сфероиденовой серии, внутриклеточные мембранные системы, своеобразные жирные кислоты мембран, при фотосинтезе и дыхательном метаболизме используют широкий спектр органических веществ. У R. capsulatus 1R, R. azotoformans 2R и R. shaeroides 3R выявлена способность к активной денитрификации в темноте.
С июня по сентябрь 2005 года (122 сут.) поступление связанного азота за счет биологической азотфиксации (в основном за счeт ЦБ и ПНБ) в прибрежье р.Камы напротив БОС не превышает 10 г N/м2 в год: 12% – в планктоне, 36% – в эпилитоне и 52% – в эпифитоне. Потери соединений азота при биологической ДЕН составили 15 г N/м2 в год: 5% – в эпифитоне и 95% – в эпилитоне.
Чрезвычайно высокая скорость ДЕН (до 1.9 мг N/(л · сут)) обнаружена в активных илах БОС г.Перми и коррелировала с массовым развитием ПНБ.
Таким образом, в природных и антропогенных водотоках Камского бассейна интенсивность и масштабы АФ и ДЕН планктонными и перифитонными сообществами ПНБ и ЦБ сопоставимы с таковыми в водных массах и донных отложениях загрязняемых участков продуктивных озeр и водохранилищ [Triska, Oremland, 1981;
Кузнецов и др., 1985;
Костяев, 2004].
ВЫВОДЫ 1. Выявлено широкое распространение фототрофных пурпурных несерных бактерий в обрастаниях подводных субстратов пресноводных водотоков разного генезиса Камского и Байкальского бассейнов.
Среди ПНБ перифитонных сообществ обычно доминируют Rhodopseudomonas palustris и различные виды рода Rhodobacter.
2. Все выделенные в чистую культуру штаммы, имеющие по совокупности фенотипических и генотипических признаков высокий уровень сходства с Rhodobacter capsulatus, R. sphaeroides, R. azotoformans и R. blasticus, содержат ген nifH, проявляют повышенную активность азотфиксации на свету. Штаммы R. capsulatus 1R, R. azotoformans 2R и R. sphaeroides 3R обладают способностью к денитрификации в темноте, а штаммы R. blasticus – к ассимиляционной нитратредукции на свету и в темноте.
3. В планктонных и эпифитонных сообществах низовьев рек Пермского края гетероцистным цианобактериям родов Anabaena, Aphanizomenon и ПНБ принадлежит ведущая роль в фиксации N2. В речном эпилитоне ПНБ, напротив, реализуют свой потенциал к денитрификации in situ.
4. Наиболее массовое распространение ПНБ обнаружено в составе агрегированных частиц активного ила БОС г.Перми (до 100-700 млн.
клеток/мл). Именно они обусловливали здесь аномально высокую интенсивность денитрификации (до 900–1900 мкг.N/(л.·.сут)), которая в десятки раз превышала максимальные показатели в речном эпилитоне и была сопоставима с активностью чистых культур денитрифицирующих изолятов Rhodobacter spp.
5. ПНБ играют важную роль в процессах самоочищения исследуемых природных и сточных вод от соединений углерода, азота и металлов.
В частности, все культуры фототрофных ПНБ рода Rhodobacter обладают способностью к поглощению и детоксикации/восстановлению оксианионов теллура, причем в концентрациях в несколько раз превышающих таковую для других грамотрицательных гетеротрофных бактерий.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ 1. Саралов А.И., Галямина В.В., Беляева П.Г., Мольков Д.В. Азотфиксация и денитрификация в планктоне и перифитоне водотоков Камского бассейна // Биология внутр. вод. 2010. № 2. С. 13-19.
Публикации в других сборниках и журналах 2. Галямина В.В. Распространение несерных пурпурных бактерий в перифитоне рек Камы и Сылвы // Сб. трудов молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии».
Пермь, ИЭГМ УрО РАН. 2004. С. 29-37.
3. Галямина В.В., Бурюхаев С.П. Распространение несерных пурпурных бактерий в планктоне и перифитоне ряда водных экосистем Забайкалья // Матер. конф. молодых ученых «Экология: от генов до экосистем».
Екатеринбург, ИЭРиЖ УрО РАН. 2006. С. 37- 41.
4. Галямина В.В., Мольков Д.В., Антонова О.Ю., Ковалевская Н.П.
Влияние тяжелых металлов на активность процессов азотфиксации и денитрификации несерной пурпурной бактерии Rhodopseudomonas palustris // Матер. I (XIV) молодеж. научной конф. «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар, Институт биологии Коми НЦ УрО РАН. 2007. С. 49-52.
5. Антонова О.Ю., Галямина В.В., Ковалевская Н.П. Разработка биосенсора для определения тяжелых металлов // Матер. конф. молодых ученых «Экология: от Арктики до Антарктики». Екатеринбург, ИЭРиЖ УрО РАН.
2007. С. 8-9.
6. Галямина В.В., Мольков Д.В., Антонова О.Ю., Ковалевская Н.П.
Изменение интенсивности азотфиксации и нитратредукции культур Rhodopseudomonas palustris // Матер. конф. молодых ученых «Экология:
от Арктики до Антарктики». Екатеринбург, ИЭРиЖ УрО РАН. 2007.
С. 54-55.
7. Галямина В.В., Саралов А.И., Ковалевская Н.П. Способность к азотфиксации и денитрификации пурпурных несерных бактерий рода Rhodobacter, распространенных в перифитоне пресноводных водотоков разного генезиса // Тез. докл. IV молодеж. школы-конф. с междунар.
участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. 2008. С.10-11.
8. Беляева П.Г., Галямина В.В., Саралов А.И. Структура и функциональная роль фототрофных альго-бактериальных сообществ перифитона и планктона водотоков Камского бассейна // Тез. докл. Междунар. научно практич. конф. «Перифитон и обрастание: теория и практика». Санкт Петербург, Зоологический институт РАН. 2008. С. 18-21.
9. Беляева П.Г., Галямина В.В., Саралов А.И. Структура и функциональная роль цианобактерий и фототрофных несерных пурпурных бактерий перифитонных сообществ природных и техногенных вод Камского бассейна // Тез. докл. V Молодеж. школы-конф. с междунар. участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. 2009. С. 71-72.