Влияние импульсно-периодических неионизирующего и ионизирующего излучений на нормальные и опухолевые клетки
На правах рукописи
БУЛДАКОВ МИХАИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ
ВЛИЯНИЕ ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКИХ НЕИОНИЗИРУЮЩЕГО
И ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЙ
НА НОРМАЛЬНЫЕ И ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
03.00.13 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск – 2009
2
Работа выполнена в ГОУ ВПО Томском государственном университете и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно исследовательском институте онкологии СО РАМН
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Большаков Михаил Алексеевич
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Чердынцева Надежда Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Короленко Татьяна Александровна доктор биологических наук Архипов Сергей Алексеевич
Ведущая организация:
Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН, г.
Екатеринбург
Защита состоится «_» _ 2009 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 001.014.01 при НИИ физиологии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 4)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физиологии СО РАМН
Автореферат разослан «» 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Бузуева И.И.
ОБЩАЯ СТРУКТУРА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы активно исследуются реакции различных биологических объектов на такой физический фактор, как низкоинтенсивное импульсное излучение различной природы (Adey W.R., 1981;
Budowsky E.I. et al., 1986;
Venugopalan V. et al., 1995;
Даренская Н.Г. с соавт., 1997;
Humphreys T.R., 1998;
Ульяненко С.Е., 2000;
Чернов З.С. с соавт., 1989;
Riesz P. and Kondo T., 1992;
Большаков М.А. с соавт., 2000;
Feril L.B. et al., 2003;
Dromi S. et al., 2007), вследствие широкого распространения источников такого излучения в промышленности, медицине и в быту (Григорьев Ю.Г. с соавт., 1999).
К настоящему времени установлено, что практически все известные типы клеток реагируют на такое воздействие, при этом ответная реакция может быть зарегистрирована на всех уровнях организации – от молекулярного до организменного (Adey W.R., 1980;
Антипов В.В., 1980;
Григорьев Ю.Г. с соавт, 1999;
Узденский А.Б., 2000;
Степанян Р.С., 2000;
Гапеев А.Б. и Чемерис Н.К., 1994;
2000). Наиболее выраженный биологический ответ на импульсное излучение отмечается у биообъектов, характеризующихся достаточно высокой пролиферативной активностью (Humphreys T.R., 1998;
Sicard-Rosenbaum L. с соавт., 1998).
Для всех типов экспериментальных моделей общей закономерностью является тот факт, что биологические эффекты в ответ на импульсное воздействие существенно отличаются от эффектов, наблюдаемых при воздействии того же вида излучения в непрерывном режиме (Чернов З.С. с соавт., 1989;
Fang H.Y. et al., 2007). Так, Sicard-Rosenbaum L. с соавторами показали, что использование ультразвукового излучения в импульсном режиме приводит к торможению роста опухоли при отсутствии такого эффекта после воздействия непрерывного излучения при сопоставимых интенсивностях (Sicard-Rosenbaum L. et al., 1998). Более того, реакция клетки на импульсное воздействие напрямую зависит от частоты повторения импульсов излучения, т.е. формирование биологического ответа происходит лишь при определенном наборе импульсов в единицу времени (Adey W.R., 1980, 1981;
Большаков М.А.
с соавт., 2000;
Карташев А.Г. и Большаков М.А., 2005). Кроме того, выявлено, что реакция клеток на воздействие импульсных излучений низких интенсивностей связана не с повышением температуры (что характерно для высокоинтенсивных излучений), а с модуляцией внутриклеточных процессов, которые проявляются в изменении конформации биологических молекул и надмолекулярных структур, нарушении физико-химических свойств мембран и активности каналообразующих белков, каталитических свойств ферментов и др.
(Карташев А.Г. и Большаков М.А., 2005).
Однако к настоящему моменту выявить какие-либо общие механизмы действия импульсных излучений на живые объекты не представляется возможным. Это связано с тремя основными недостатками исследований такого рода: 1) использование несопоставимых по физиологическим характеристикам биологических объектов (от бактерий и дрожжей до целостного организма);
2) использование различного диапазона частот повторения импульсов;
3) использование различных по интенсивности воздействий. Для устранения этих недостатков необходимо, во-первых, использовать биологические объекты, обладающие сходными свойствами. В качестве таких модельных объектов могут выступать клетки, характеризующиеся высокой скоростью пролиферации, поскольку способность к росту является самой универсальной функцией всех биологических объектов. В этой связи удобным модельным объектом являются клетки костного мозга и селезенки вследствие их высокой чувствительности к действию различных излучений, а также из-за их непосредственного участия в качестве регуляторов и эффекторов важнейших физиологических функций всего организма. Кроме того, удобной биологической моделью являются опухолевые клетки различного происхождения вследствие крайней степени их иммортализованности, т.е.
способности к неограниченному делению. Во-вторых, необходимо использовать одинаковый диапазон частот повторения импульсов для различных излучений. Так, еще в 80-х годах прошлого века был определен диапазон частот, при использовании которого реакция биологических объектов значительно усиливается – это диапазон от 0 до 40 Гц (Adey W.R., 1980, 1981).
В-третьих, дозовые нагрузки должны находится в области «малых» значений, характерных для данного вида излучений.
Следует отметить, что все вышеизложенное касалось работ, посвященных исследованию реакций биологических объектов на импульсное электромагнитное и ультразвуковое излучения. Это связано с тем, что источники, позволяющие генерировать аналогичное (импульсное излучение при низких значениях дозы) ионизирующее излучение, появились недавно (Артемов К.П. с соавт., 2004). По этой причине в литературе практически отсутствуют какие-либо данные по исследованию их биологического действия.
Однако следует отметить, что использование ионизирующего излучения при малых значениях дозы уже само по себе будет видоизменять биологический эффект в облучаемом объекте, независимо от уровня его организации (Luckey T.D., 1998;
Chen S.L. et al., 2000), а исходя из литературных данных по исследованию других типов излучений, работающих в импульсном режиме (Humphreys T.R., 1998;
Даренская Н.Г. с соавт., 1997;
Большаков с соавт., 2000), можно предположить, что ответные реакции биообъектов, индуцированные воздействием рентгеновского излучения в импульсном режиме, будут видоизменяться еще в большей степени.
Таким образом, научная сторона работы в фундаментальном и прикладном аспектах предполагает сравнительное исследование биологического ответа быстро-пролиферирующих типов клеток различного происхождения на воздействие импульсно-периодических излучений. При этом неотъемлемой частью таких исследований является изучение зависимости биологических эффектов от частоты повторения импульсов.
Цель исследования: изучение общих закономерностей и механизмов действия импульсно-периодического рентгеновского, микроволнового и ультразвукового излучений на нормальные и опухолевые клетки.
Задачи исследования:
1. Исследовать функциональные показатели клеток костного мозга и селезенки при тотальном облучении здоровых мышей низкодозовым импульсно-периодическим рентгеновским излучением.
2. Исследовать влияние низкодозового импульсно-периодического рентгеновского излучения на рост опухоли при тотальном облучении мышей, а также на уровень пролиферативной активности опухолевых клеток in vitro.
3. Оценить способность низкодозового импульсно-периодического рентгеновского излучения индуцировать процесс апоптоза в опухолевых клетках.
4. Исследовать изменение уровня пролиферативной активности и апоптоза нормальных и опухолевых клеток в ответ на воздействие низкоинтенсивного импульсно-периодического микроволнового излучения in vitro.
5. Исследовать выживаемость и механизм гибели опухолевых клеток in vitro после воздействия низкоинтенсивного импульсно-периодического ультразвукового излучения.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние импульсно периодического рентгеновского, микроволнового и ультразвукового излучений на различные типы нормальных (клетки селезенки и костного мозга) и опухолевых клеток (мастоцитома Р-815, карцинома Эрлиха, рак шейки матки He-La, лейкемия человека U 937), т.е. клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью. Впервые показано, что реакция нормальных и опухолевых клеток в ответ на импульсно-периодическое воздействие различна:
выявлено снижение уровня пролиферации опухолевых клеток, при отсутствии повреждений нормальных клеток. При этом показано, что механизм гибели опухолевых клеток связан с индукцией в них процесса апоптотической гибели, сопровождающегося увеличением продукции активных форм кислорода, экспрессии гена р53, выходом цитохрома С в цитоплазму и активацией каспазы-3.
Установлено, что при использовании низкоинтенсивного или низкодозового импульсно-периодических излучений характер биологического ответа зависит от частоты повторения импульсов, при этом такая зависимость является нелинейной – наибольший эффект наблюдается при использовании следующих частот повторения импульсов: 10, 13 и 16 Гц.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о закономерностях биологических эффектов, индуцируемых импульсно периодическим рентгеновским, микроволновым и ультразвуковым излучениями, при условии, что дозовые нагрузки за сеанс облучения остаются в области «малых» значений, характерных для данного вида излучения. Для этих условий установлены общие закономерности и механизмы биологического ответа клеток, характеризующихся высокой скоростью пролиферации, на воздействие импульсно-периодических излучений.
Показанный в работе высокий эффект ингибирования пролиферативной активности на различных экспериментальных моделях опухолевого роста при отсутствии повреждающего действия на нормальные клетки, указывает на перспективность разработки методов низкодозовой лучевой терапии злокачественных новообразований с использованием источников импульсно периодических ионизирующих и неионизирующих излучений.
Положения, выносимые на защиту.
• Биологические эффекты, индуцирующиеся в клетках с высокой пролиферативной активностью воздействием низкодозового или низкоинтенсивного импульсно-периодического излучения, зависят от частоты повторения импульсов, причем такая зависимость является нелинейной. Биологическая реакция клеток наблюдается лишь на определенных «эффективных» частотах 3, 10, 13 и 16 Гц и существенно отличается от биологического ответа клеток на воздействие в непрерывном режиме.
• Общее количество нормальных клеток при тотальном облучении здоровых мышей низкодозовым импульсно-периодическим рентгеновским излучением, в зависимости от использованной частоты повторения импульсов, не изменяется, либо снижается, но при этом активируются процессы репарации за счет усиления клеточной пролиферации. Такое же воздействие на опухолевые клетки приводит к значительному торможению их роста.
• Механизм гибели опухолевых клеток после воздействия низкодозового или низкоинтенсивного импульсно-периодического излучения связан с индукцией в них процесса апоптотической гибели, инициатором которой является усиленная продукция в клетках активных форм кислорода.
Апробация работы. Результаты научно-исследовательской деятельности доложены и обсуждены на Третьей международной конференции «Электромагнитные поля и здоровье человека» (2002 г., Москва – Санкт Петербург);
XLI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2003 г., Новосибирск);
на конференции молодых ученых ТГУ «Старт в науку» (2004 г., Томск);
на конференции молодых ученых ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (2004 г., Томск);
на 47-м Съезде радиационных исследований Японии (2004 г., Нагасаки, Япония);
на 12 м Международном съезде по повышению эффективности терапии рака (2006 г., Тоямя, Япония);
на 2-ом Европейском симпозиумоме по изучению импульсных источников излучения (2004 г., Гамбург, Германия);
на V Конгрессе молодых ученых и специалистов СибГМУ (2004 г., Томск);
на конференции молодых ученых ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (2005 г., Томск);
на VI Конгрессе молодых ученых и специалистов СибГМУ (2005 г., Томск);
на Х Всероссийском онкологическом конгрессе (2006 г., Москва);
на Всероссийской конференции «Механизмы индивидуальной адаптации» (2006 г., Москва);
на IV Международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения» (2007 г., Москва);
на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (2007 г., Москва);
на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (2007 г., Москва);
на обществе онкологов ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (2007 г., Томск);
на конференции «Старт в науку», аккредитованной по программе «У.М.Н.И.К.» (2008 г., Томск).
По теме диссертационной работы имеется 25 публикации, из которых статьи входят в перечень журналов, рекомендованных ВАК, 3 статьи в зарубежных журналах, 17 тезисов в материалах конференций, в том числе 3 в тезисах зарубежных конференций и один патент на изобретение.
Объем и структура работы. Работа изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственно результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, включающего 261 источников, в том числе 136 иностранных. Работа иллюстрирована 27 рисунками и таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовано 1136 мышей разводки лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН (сертификат имеется) обоего пола в возрасте 8 – 14 недель массой 18 – 20 г, следующих линий: С57Bl/6j (Н-2b) и DBA/2j (H-2d).
Животных содержали на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде, в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Для получения исследуемого материала мышей забивали методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом.
В работе использовались следующие клеточные модели:
• клетки селезенки интактных мышей • клетки костного мозга интактных мышей • асцитный вариант карциномы Эрлиха (Банк клеточных линий РОНЦ им.
Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва);
• асцитный вариант мастоцитомы Р-815 (Банк клеточных линий РОНЦ им.
Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва);
• опухолевые клетки рака шейки матки человека He-La (Банк клеточных линий Центра естественных исследований, г. Токио, Япония);
• опухолевые клетки лейкемии человека U937 (Банк клеточных линий Центра естественных исследований, Токио, Япония).
Для исследования реакции нормальных клеток in vivo на воздействующий фактор использовались интактные мыши линии С57Bl/6j. Для этого животных помещали в пластиковую камеру, пропускающую рентгеновское излучение и проводили тотальное облучение животных в течение 10 минут. Для получения клеток селезенки и костного мозга мышей забивали на 5-е сутки после облучения и извлекали селезенку и бедренную кость. Далее проводили подсчет общего количества клеток с помощью трипанового синего, а также оценивали пролиферативную активность клеток.
Для исследования реакции опухолевых клеток in vivo на воздействующий фактор использовали опухолевые клетки мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха, поддерживаемые in vivo на мышах линий DBA/2j и С57Bl/6j соответственно методом внутрибрюшинной трансплантации (5 млн. кл/мышь).
Животных помещали в пластиковую камеру и облучали в область живота. В случае использования клеток мастоцитомы Р-815 формировались следующие группы животных: группа «ложного облучения», подвергавшаяся всем процедурам, что и группы «облученных животных» за исключением самого воздействующего фактора;
а также группы, облученные при частоте повторения импульсов 13 и 16 Гц. При исследовании реакции опухолевых клеток карциномы Эрлиха формировались следующие группы животных:
группа «ложного облучения»;
группа животных, облученных в день трансплантации;
группа, облученная на 3-й день после трансплантации;
группа, облученная на 7-е сутки после трансплантации;
а также группа, облученная трехкратно – в день трансплантации, на 3-и и 7-е сутки после нее. Во всех случаях мышей забивали на 10-е сутки после трансплантации и проводили подсчет общего количества клеток в асците с помощью трипанового синего.
В экспериментах in vitro использовались опухолевые клетки карциномы Эрлиха и мастоцитомы Р-815, поддерживаемые как описано выше, а так же клетки рака шейки матки человека (He-La) и лейкемии человека (U937), поддерживаемые методом культивирования в чашках Петри. Формировались следующие исследуемые группы: группа «контроля» - находившаяся в стационарных условиях (37 °С, 5% уровень СО2), по которой оценивали состояние клеточной культуры;
группа «ложного облучения» - подвергавшаяся всем процедурам, что и группа «облучения», кроме самого облучения;
группа «облучения» - непосредственно подвергавшаяся облучению. Для поддержания заданной температуры во время сеанса облучения рентгеновским излучением, флаконы с культурой опухолевых клеток размещали в открытом термостате.
Облучение микроволновым излучением проводили в безэховой камере, а при использовании ультразвука чашку Петри с культурой клеток помещали на излучатель, смоченный водой для равномерной передачи энергии излучения.
Пролиферативную активность клеток оценивали радиоизотопным методом.
Для этого клетки инкубировали в течение суток с добавлением меченого по атому водорода тимидина (Н3-тимидин) («Изотоп», г. Москва), включающегося в ДНК пролиферирующих клеток. Уровень включенного Н3-тимидина оценивали с использованием планшетного микро--счетчика («Wallac», Голландия), определяя остаточную радиоактивность (импульсов/мин). По уровню включенной метки судили о процессе клеточной пролиферации – чем больше значение остаточной радиоактивности, тем больше метки включилось в ДНК и тем выше пролиферативная активность.
Количество клеток с признаками апоптоза верифицировалось тремя способами: морфологически, с помощью окрашивания по Гимза (Sigma-Aldrich Inc.);
методом проточной цитофлуориметрии с помощью аннексина V;
а так же флуоресцентным методом с помощью специфического субстрата к каспазе-3 – АС-DEVD-АМС («Pharmingen», San Diego, CA). Продукцию супероксид аниона в клетках определяли спектрофотометрически с помощью нитросинего тетразолия (НСТ) (Sigma-Aldrich Inc.), обладающего способностью восстанавливаться пероксидами до формазана с изменением окраски, а так же методом электронно-парамагнитного резонанса с помощью «ловушки»
свободных радикалов 2,2,6,6-тетраметил-4-пипиридона (TMPD) (Sigma-Aldrich Inc.), образующего при окислении комплекс 2,2,6,6-тетраметил-4-пипиридон-N оксил (TAN). Кроме того, оценивалась экспрессия гена р53 методом обратно транскриптазной ПЦР, а так же уровень цитохрома С в цитоплазме клетки спектрофотометрическим методом.
Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и ошибку. Статистическую значимость различий ежду группой «облучения» и группой «ложного облучения» оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Для реализации статистических процедур использовали пакет программ Statistica 6.0 (лицензия имеется).
Для генерации импульсно-периодического излучения использовались разработанные в Институте сильноточной электроники СО РАН (г. Томск) источник низкодозового рентгеновского излучения «СИНУС-150» (суммарная доза 0,2 – 282 мГр) и низкоинтенсивного микроволнового излучения «МИ-505»
(пиковая плотность потока мощности 0,88 - 5,71 кВт/см2, при отсутствии нагрева облучаемого образца). В качестве источника импульсно периодического ультразвукового излучения использовался генератор низкоинтенсивного ультразвука KUS-2S (0,3 – 0,8 Вт/см2) (ITO Ultrasonic Co, Ltd, Токио, Япония). Для создания непрерывного рентгеновского излучения использовался аппарат RUM-17 (суммарная доза 22 – 90 мГр). Во всех экспериментах in vivo в качестве воздействующего фактора использовалось рентгеновское излучение, а в исследованиях in vitro – микроволновое, рентгеновское и ультразвуковое излучение.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения на нормальные клетки in vivo. На 5-е сутки после тотального облучения интактных мышей импульсно-периодическим рентгеновским излучением не наблюдается изменения общего количества клеток костного мозга ни на одной из использованных частот повторения импульсов, в то время как показатель клеточной пролиферации в группах «облучения» значительно отличается от группы «ложного облучения». Так, пролиферативная активность клеток костного мозга снижается в среднем на 50% при использовании частот 13 Гц и 16 Гц, и увеличивается на 36% при 10 Гц (таблица 1). Физиологический ответ клеток селезенки на тотальное облучение здоровых мышей проявляется следующим образом. На 5-е сутки после воздействия (при 13 Гц и 16 Гц) происходит статистически значимое снижение клеточности селезенки (на 30%) по сравнению с группой «ложного облучения». Однако пролиферативная активность спленоцитов на этих же частотах увеличивается в среднем на 50%.
При этом не отмечается ответной реакции клеток костного мозга или селезенки при облучении мышей с частотой повторения импульсов 10 Гц (таблица 1).
Таблица 1 – Общее количество клеток и включение Н3-тимидина в ДНК клеток костного мозга и селезенки после облучения мышей импульсно периодическим рентгеновским излучением Включение Н3 Частота повторения Общее количество тимидина, импульсов, Гц клеток, млн импульс/мин «ложное облучение» 6,1±0,5 88895± Костный 10 5,0±0,6 121211±9278 * мозг 13 7,0±1,7 47167±5194 * 16 6,3±1,2 42166±4089 * «ложное облучение» 106±5,6 3850± селезенки Клетки 10 106±11 5042± 13 76±5,5 * 6536±734 * 16 74±5,6 * 5697±826 * Примечание: стрелками обозначено изменение исследуемого показателя относительно группы контроля;
* - различия статистически значимы, р 0,05.
По-видимому, воздействие импульсно-периодического рентгеновского излучения (с частотами повторения импульсов 13 Гц и 16 Гц) на целостный организм приводит к небольшим сдвигам в функционировании нормальных клеток организма, что отражается в изменении общего количества клеток.
Однако такие изменения, по-видимому, восстанавливаются за счет активации репарационных систем – усиления клеточной пролиферации. Отсутствие изменений общего количества клеток костного мозга может свидетельствовать в пользу того, что процесс восстановления в этом органе уже завершился, в то время как в селезенке процесс репарации еще продолжается, поскольку пролиферативная активность клеток увеличилась на 50%, а общее количество клеток еще не восстановилось до уровня контрольной группы.
Следует отметить, что на одной из использованных частот (10 Гц) не наблюдается статистически значимых различий исследуемых показателей для клеток селезенки и общего количества клеток костного мозга. При использовании этой частоты отмечается только изменение пролиферативной активности клеток костного мозга. Вероятно, что при тотальном облучении мышей с частотой повторения импульсов 10 Гц, возникающие после облучения повреждения незначительны и репарируются очень быстро, либо такие повреждения отсутствуют вообще. Таким образом, воздействие рентгеновским излучением в импульсно-периодическом режиме при малых дозовых нагрузках, не приводит к существенному повреждению здоровых клеток организма мышей.
Влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения на опухолевые клетки in vivo. Проведенные исследования показали, что однократное облучение мышей с трансплантированной асцитной мастоцитомой Р-815 рентгеновским излучением в импульсно-периодическом режиме приводит к статистически значимому снижению количества опухолевых клеток в асците (70,2±6,2 млн. клеток в асците) на 10-е сутки после воздействия по сравнению с группой «ложного облучения» (93±4,65 млн. клеток в асците).
Тотальное облучение мышей с трансплантированной карциномой Эрлиха также приводило к снижению общего количества клеток в асците (рисунок 1). Так, в группе животных, облученных в день трансплантации опухоли, торможение роста опухоли составляет 16 % по сравнению с группой «ложного облучения».
В группе животных, облученных на седьмые сутки и группе животных, облученных трехкратно (в день трансплантации, на третьи и седьмые сутки), ингибирование роста опухолевого узла составляет 21 % и 23 % соответственно.
* * * * 0 3 Контроль трехкратно Рисунок 1 – Общее количество клеток карциномы Эрлиха в асците после тотального облучения мышей импульсно-периодическим рентгеновским излучением с частотой повторения импульсов 13 Гц Примечание: по оси абсцисс обозначен день, когда проводили облучение (сутки после трансплантации опухоли);
по оси ординат – количество опухолевых клеток в асците (млн);
* - различия статистически значимы с группой контроля (р0,05).
Таким образом, реакция опухолевых клеток на воздействие импульсно периодического рентгеновского излучения отличается от реакции нормальных клеток. Опухолевые клетки оказываются более чувствительными к воздействующему фактору, поскольку приблизительно третья часть клеток гибнет и не восстанавливается, как это было характерно для клеток костного мозга и селезенки, даже к 10-м суткам после облучения.
Влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения на опухолевые клетки in vitro. Полученные данные об ингибировании роста опухолевых клеток в условиях тотального облучения организма послужили основой для проведения более детальных исследований реакции биологических объектов на действие импульсного излучения на клеточном уровне. Поскольку в литературе отсутствуют какие-либо данные о клеточном ответе на действие импульсного рентгеновского излучения, то было проведено исследование изменения уровня пролиферативной активности опухолевых клеток в ответ на воздействие импульсно-периодического рентгеновского излучения в диапазоне доз от 0,2 мГр до 160 мГр.
С помощью теста включения меченого по тритию тимидина в ДНК было показано, что облучение культуры опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха приводит к ингибированию процесса клеточной пролиферации (рисунок 2). Эффект оказывается более выраженным (снижение уровня включенного Н3-тимидина на 95-99% по сравнению с группой «ложного облучения»), чем при исследованиях in vivo. Более того, в пределах указанного диапазона изменение дозы не влияет на степень выраженности эффекта, а за пределами используемого диапазона доз эффект исчезает.
А Б СТ ЛО ЛО 40000 20000 ОБ ОБ 0 0,2 0,8 7 12 43 96 0,2 22 28 50 85 Рисунок 2 – Включение Н3-тимидина в ДНК опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 (А) и карциномы Эрлиха (Б) через сутки после облучения импульсно-периодическим рентгеновским излучением.
Примечание: по оси абсцисс обозначена доза облучения (мГр);
по оси ординат – остаточная радиоактивность, (имп/мин);
линия «К» - группа «ложного облучения»;
линия «ОБ» - группа облучения в импульсном режиме (рис. А - 10 Гц;
рис. Б - 13 Гц);
линия «СТ» - группа облучения в непрерывном режиме;
значения представлены как среднее и ошибка средней (Х ± m).
Необходимо отметить, что непрерывное рентгеновское излучение в этом же диапазоне доз оказывает стимулирующее влияние на процесс пролиферации клеток мастоцитомы Р-815 (рисунок 2). Это явление исследовано достаточно давно и носит название «гормезиса» (Luckey T.D., 1991). Однако некоторые данные литературы свидетельствуют, что малые дозы непрерывного ионизирующего излучения способны тормозить рост опухолевых клеток в среднем на 15-50% (Suzuki N. and Mizukoshi Т., 1987;
Cheda A. et al., 2004;
Kojima S. et al., 2004;
Yu H.S. et al., 2004), причем этот эффект связан не с прямым повреждающем действием излучения на клетки, а опосредуется через активацию иммунной системы. Однако, как видно из рисунка 2, торможение роста опухолевых клеток после воздействия импульсно-периодического рентгеновского излучения может достигать 95% и осуществляться за счет прямого повреждающего действия. Таким образом, реакция опухолевых клеток на воздействие импульсно-периодического рентгеновского излучения является более выраженной, по сравнению с клеточным ответом на непрерывное низкодозовое рентгеновское излучение.
При сравнении биологической реакции различных типов опухолевых клеток на импульсное воздействие отмечается зависимость эффекта ингибирования клеточной пролиферации от частоты повторения импульсов импульсно-периодического рентгеновского излучения. Можно выделить несколько частот, которые вызывают наиболее сильный биологический эффект:
13, 16 и 25 Гц для мастоцитомы Р-815 (рисунок 3а), 6, 8, 13, 16, 35 и 40 Гц для карциномы Эрлиха (рисунок 3б) и 8, 10, 13, 16 и 22 Гц для рака шейки матки (Не-La).
160000 а б 80000 0 3 6 8 10 13 16 19 22 25 28 35 3 6 8 10 13 16 19 22 25 28 35 Рисунок 3 – Включение Н3-тимидина в ДНК мастоцитомы Р-815 (а), в карциномы Эрлиха (б) и рака шейки матки He-La (в) через сутки после воздействия импульсно-периодическим рентгеновским излучением Примечание: по оси абсцисс обозначена частота повторения импульсов (Гц);
по оси ординат остаточная – радиоактивность (имп/мин);
прямая линия - группа «ложного облучения».
8 10 13 16 19 Можно выделить несколько частот, при использовании которых можно зарегистрировать значительно выраженную биологическую реакцию опухолевых клеток – 10, 13 и 16 Гц. Можно предположить, что и другие типы опухолевых клеток будут реагировать на импульсное воздействие частотами повторения импульсов из используемого диапазона схожим образом, что свидетельствует о ключевой роли этого параметра в формировании биологических эффектов.
Механизм действия импульсно-периодического рентгеновского излучения на опухолевые клетки. В литературе есть сведения о том, что реакция клеток на воздействие ионизирующего излучения в низких дозах может быть связана с индукцией процесса программируемой клеточной гибели (Jiang Y. et al., 2003). Мы предположили, что механизм гибели опухолевых клеток после воздействия импульсно-периодическим излучением может быть связан именно с индукцией апоптоза. Мы выяснили, что процент апоптотических клеток после облучения значительно увеличивается и составляет в среднем 86% (рисунок 4). Более того, количество опухолевых клеток с морфологическими признаками апоптоза коррелирует с процессом ингибирования клеточной пролиферации (рисунок 4).
8 10 13 16 19 Рисунок 4 – Процент клеток карциномы Эрлиха с морфологическими признаками апоптоза и процент ингибирования клеточной пролиферации через сутки после воздействия импульсно-периодическим рентгеновским излучением Примечание: по оси абсцисс обозначена частота повторения импульсов (Гц);
по оси ординат – процент клеток;
серыми столбцами обозначается процент ингибирования клеточной пролиферации, белыми столбцами – процент клеток с морфологическими признаками апоптоза.
Известно, что процесс апоптоза может запускаться различными путями, имеющими, однако, одинаковые конечные этапы активацию – протеолитических ферментов семейства каспаз (Самуилов В.Д., 2001;
Скулачев В.П., 2001). Мы исследовали активацию ключевых участников апоптотической гибели в опухолевых клетках карциномы Эрлиха. В ответ на воздействие импульсно-периодического излучения уже в первый час в исследуемых клетках происходит усиление продукции активных форм кислорода (группа «облучения» при 16 Гц – 2,21±0,36 нмоль/мл;
группа «ложного облучения»
0,98±0,15 нмоль/мл). В течение первого часа также происходит накопление в цитоплазме одного из факторов, участвующего в запуске дальнейшей цепочки реакций программируемой клеточной гибели – цитохрома С (группа «облучения» при 16 Гц – 1,68±0,22 нмоль/мл;
группа «ложного облучения»
0,42±0,09 нмоль/мл). Через 4 часа после воздействия в клетках наблюдается увеличение экспрессии гена р53, играющего ведущую роль в реализации процессов репарации или апоптоза и активирующегося на различные стрессовые воздействия (Копнин Б.П., 2002). Активация каспазы-3 происходит в 2 этапа – через 2 (группа «облучения» при 16 Гц – 2186± ед.флуоресценции/час/мг;
группа облучения»
«ложного – 938± ед.флуоресценции/час/мг) и через 6 (группа «облучения» при 16 Гц – 2594± ед.флуоресценции/час/мг;
группа «ложного облучения» – 1043± ед.флуоресценции/час/мг) часов после воздействия. В результате, через 8 часов после облучения процесс клеточной пролиферации ингибируется на 50%.
По-видимому, усиленная продукция АФК в опухолевой клетке в течении первого часа после воздействия может играть ключевую роль в формировании дальнейшей цепочки реакций внутри клетки. Высокий уровень АФК будет приводить к образованию неселективных пор во внутренней мембране митохондрий, в результате чего цитохром С окажется в цитоплазме уже через час после облучения. Это будет приводить к расщеплению неактивной прокаспазы-3 в активную каспазу-3 уже через 2 часа после воздействия. Через часа активность каспазы-3 падает. Зафиксированная повторно активация протеолитического фермента очевидно обусловлена усилением экспрессии гена р53, которое происходит через 4 часа поле облучения.
Влияние импульсно-периодического микроволнового излучения на нормальные и опухолевые клетки. При исследовании реакции клеток на импульсно-периодическое микроволновое воздействие отмечаются биологические эффекты, схожие с таковыми после импульсно-периодического рентгеновского излучения. При облучении культуры клеток селезенки in vitro отмечается либо усиление пролиферативной активности клеток, либо отсутствие статистически-значимых различий по сравнению с группой «ложного облучения» (таблица 2). В двух случаях отмечается снижение этого показателя в среднем на 40% - при использовании частоты повторения импульсов 19 Гц и 22 Гц (таблица 2).
Таблица 2 – Включение Н3-тимидина в ДНК спленоцитов через 24 часа после воздействия импульсно-периодическим микроволновым излучением Пиковая плотность потока мощности, кВт/см Частота повторения импульсов, Гц 1,1 3, «ложное облучение» 1135± 1811±382 * 8 1340± 1604±81 * 10 1103± 4119±473 * 13 1236± 1639±291 * 16 834± 2954±504 * 619±88 * 724±187 * 22 1227± Примечание: стрелками обозначено увеличение или уменьшение исследуемого показателя относительно группы контроля;
представленные значения – остаточная радиоактивность, имп/мин;
* - различия статистически значимы с группой контроля (р 0,05).
Это свидетельствует о двух типах клеточного ответа. В одном случае реакция нормальных клеток на импульсный характер воздействия различных излучений не связана с возникновением повреждений в клетках, а в другом – может быть связана с активацией системы репарации, о чем свидетельствуют данные таблицы 2. Ключевая роль в формировании той или иной клеточной реакции отводится частоте повторения импульсов. Т.е. изменяя этот параметр, можно существенно видоизменить биологический ответ клеток – подавить или стимулировать клеточную пролиферацию.
Реакция опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 на воздействие импульсно-периодического микроволнового излучения, в отличие от реакции нормальных клеток, в большинстве случаев направлена в сторону снижения исследуемого показателя (рисунок 5). При этом биологический эффект, как и в предыдущих экспериментах с ионизирующим излучением, зависит от частоты повторения импульсов. Уровень пролиферативной активности снижается в среднем на 20 – 40 % (рисунок 5). Биологический ответ другой модельной линии клеток, карциномы Эрлиха, также связан со снижением уровня клеточной пролиферации по сравнению с группой «ложного облучения», при этом эффект также зависит от частоты повторения импульсов (данные не представлены).
ЛО ОБ 180000 * * * 140000 * * * 3 6 8 10 13 16 19 22 28 35 Рисунок 5 – Включение Н3-тимидина в ДНК опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 через сутки после воздействия импульсно-периодическим микроволновым излучением Примечание: по оси абсцисс обозначена частота повторения импульсов (Гц);
по оси ординат – остаточная радиоактивность (импульс/мин);
«ЛО» – группа «ложного облучения», * - различия с группой «ложного облучения»
статистически значимы (р0,05);
значения представлены как среднее и ошибка средней (Х ± m).
Следует отметить, что согласно данным литературы, биологическая реакция клеток на воздействие импульсного микроволнового излучения может быть результатом либо повышения температуры, либо активации внутриклеточных процессов без нагрева (Григорьев Ю.Г. 1998). В проведенных нами исследованиях не было отмечено роста температуры биологических объектов, что свидетельствует об активации внутриклеточных реакций, в частности активации процесса апоптоза. В опухолевых клетках карциномы Эрлиха в ответ на такое воздействие отмечается статистически значимое увеличение активности каспазы-3 (3472±143 ед.флуоресценции/час/мг при Гц) по сравнению с группой «ложного облучения» (2792± ед.флуоресценции/час/мг) через 6 часов после облучения.
Таким образом, для биологического ответа клеток на воздействие импульсного излучения характерны следующие закономерности. Во-первых, реакции нормальных и опухолевых клеток существенно различаются. Эти различия проявляются в том, что процесс клеточной пролиферации в здоровых клетках, как правило, усиливается или не изменяется, а в опухолевых – в значительной мере ингибируется. Во-вторых, во всех экспериментах зависимость проявления эффекта от частоты повторения импульсов носит нелинейный характер. Для того, чтобы проверить универсальность такой биологической реакции клеток на импульсное воздействие, были проведены исследования с использованием импульсного ультразвука.
Влияние импульсно-периодического ультразвукового излучения на опухолевые клетки. Биологический ответ опухолевых клеток лейкемии человека (U937) на импульсно-периодическое ультразвуковое излучение связан с возникновением повреждений внутри клетки, поскольку отмечается уменьшение общего количества клеток после воздействия (рисунок 6). При этом эффект как и в предыдущих экспериментах, зависит от частоты повторения импульсов нелинейно. Следует отметить, что биологический эффект в ответ на непрерывное ультразвуковое излучение (рисунок 6, столбец «СТ») кажется более выраженным по сравнению с реакцией на импульсное воздействие такой же интенсивности, поскольку исследуемый показатель по отношению к группе «контроля» снижается более чем на 90 %. Однако, при морфологической верификации жизнеспособности клеток с трипановым синим в группе «СТ» наблюдается большое количество клеточных «обломков», тогда как в остальных исследуемых группах такие фрагменты клеток практически отсутствуют.
Это свидетельствует в пользу того, что в группе «СТ» клетки гибнут за счет механического разрушения клеточных мембран, т.е. гибель клеток является следствием физического процесса, а не биологической внутриклеточной реакции. В остальных группах отмечается именно биологический ответ, связанный с индукцией процесса апоптоза, т.к. с помощью метода проточной цитофлуориметрии (с аннексином V) было показано, что через 6 часов после облучения опухолевых клеток лейкемии человека процент апоптотических клеток по сравнению с группой контроля увеличивается в среднем на 15%. Следует отметить, что, как и в предыдущих экспериментах, эффект нелинейно зависит от частоты повторения импульсов.
* * * * * * 0.5 1 3 5 10 50 Контроль СТ Рисунок 6 – Общее количество опухолевых клеток лейкемии человека U 937 после воздействия импульсно-периодического ультразвукового излучения с интенсивностью 0,3 Вт/см Примечание: по оси абсцисс обозначена частота повторения импульсов (Гц), по оси ординат – процент клеток относительно группы контроля;
«СТ» – группа облучения в непрерывном режиме;
* - различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (р 0,05);
значения представлены как среднее и ошибка средней (Х ± m).
Поскольку было показано, что одним из инициаторов внутриклеточных реакций опухолевых клеток в ответ на воздействие являются АФК, то и при действии импульсно-периодического ультразвука должна наблюдаться генерация этого компонента. Методом ЭПР было показано, что облучение образца, содержащего дистиллированную воду, приводит к формированию в растворе АФК (использование водного раствора вместо суспензии клеток связано с методическими особенностями данного метода) (рисунок 7), что свидетельствует о возможности образования АФК и в клетках в ответ на воздействие импульсного ультразвука (L.B. Feril et al., 2005).
Проведенные исследования показали, что биологический ответ опухолевых клеток на импульсно-периодическое ультразвуковое воздействие зависит от частоты повторения импульсов, а гибель клеток осуществляется за счет активации процесса апоптоза. При этом важную роль может играть образование активных форм кислорода в клетке.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,5 1 3 5 10 50 Рисунок 7 – Формирование комплекса TAN в дистиллированной воде после ультразвукового воздействия в импульсно-периодическом режиме с интенсивностью 0,8 Вт/см Примечание: По оси абсцисс обозначена частота повторения импульсов (Гц);
по оси ординат – условные единицы;
значения представлены как среднее и ошибка средней (x ± m);
контроль (группа без воздействия) принят за ноль.
Таким образом, общий механизм реализации повреждающего действия импульсно-периодических неионизирующих и ионизирующих излучений на опухолевые клетки представляется нам следующим образом (рисунок 8).
Импульсно периодическое воздействие Рисунок 8 – Общая схема реализации апоптотической гибели после воздействия импульсно-периодических источников излучений Импульсно-периодическое излучение приводит к образованию АФК в цитоплазме клетки. Дальше возможно развитие нескольких клеточных реакций.
В одном случае концентрации АФК оказывается недостаточно для повреждения клетки, либо эти повреждения незначительны и очень быстро репарируются. В этом случае общее функционирование клетки не изменяется, что характерно для нормальных клеток. Для опухолевых клеток более характерна другая реакция в ответ на воздействие. В этом случае АФК могут образовывать поры в мембране митохондрий, что будет приводить к выходу цитохрома С в цитоплазму клетки. С другой стороны, АФК могут приводить к повреждениям ДНК, что будет незамедлительно усиливать экспрессию гена р53.
В конечном итоге, описанные процессы будут активировать каспазу-3. В результате клетка гибнет за счет активации апоптоза.
Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что, варьируя частоту повторения импульсов воздействующего фактора, можно вызвать любую из описанных клеточных реакций, как для нормальных, так и для опухолевых клеток. Т.е. биологический эффект зависит от частоты повторения импульсов, причем такая зависимость является нелинейной, поскольку не отмечается нарастания или снижения эффекта с увеличением этого параметра излучения. Это может быть связано с тем, что акт взаимодействия энергии излучения с клеточным компонентом («мишенью») будет наиболее эффективным при совпадении частот повторения импульсов излучения с собственными частотами колебаний внутриклеточных процессов - мишенью.
На основе проведенных исследований можно выделить определенные частоты повторения импульсов, которые будут инициировать одинаковый биологический эффект в клетках (например, 10, 13 и 16 Гц). Одинаковая клеточная реакция на такие «эффективные» частоты позволяет сделать предположение о наличии универсальных механизмов, индуцирующихся в клетках после воздействия различных типов импульсно-модулированных излучений. Более того, реакции клеток на непрерывное и импульсное воздействие значительно различаются. В частности, непрерывное ультразвуковое излучение приводит к гибели клеток за счет механического разрушения клеток, в то время как импульсное излучение активирует внутриклеточный механизм гибели.
Детальное изучение механизмов клеточной гибели после воздействия импульсно-периодических излучений различных видов показало, что ключевую роль в реализации повреждающего действия играет индукция образования свободных радикалов в клетке уже в первые минуты после воздействия.
Дальнейшая цепочка реакций, приводящих клетку к гибели, включает в себя различные клеточные компоненты, активирующиеся либо непосредственно излучением, либо сигналами от активированных клеточных компонентов.
После усиленной продукции АФК в клетке разрушается мембрана митохондрий, в результате прямого повреждения излучением, либо за счет изменения митохондриального потенциала, в результате чего в цитоплазму клетки будет выходить цитохром С, а также происходит экспрессии гена р53. В конечном итоге, активация описанных структур будет приводить к накоплению в клетке активной формы основного протеолитического фермента апоптотической гибели – каспазы-3. Таким образом, механизм действия всех исследуемых видов импульсно-модулированных излучений на опухолевые клетки связан с индукцией процесса апоптотической гибели.
Выводы 1. Тотальное облучение здоровых мышей низкодозовым импульсно периодическим рентгеновским излучением приводит к снижению общего количества клеток селезенки, которое восстанавливается за счет усиления процесса клеточной пролиферации. Общее количество клеток костного мозга после воздействия в таком же режиме не изменяется.
2. При тотальном облучении мышей с асцитной опухолью низкодозовым импульсно-периодическим рентгеновским излучением происходит торможение роста опухоли. Облучение взвеси опухолевых клеток in vitro в таком же режиме приводит к снижению пролиферативной активности.
3. Механизм повреждающего действия импульсно-периодического рентгеновского излучения на опухолевые клетки связан с индукцией процесса апоптотической гибели за счет продукции в них АФК, выхода цитохрома С из митохондрий и активации экспрессии гена р53.
4. Реакция клеток на низкоинтенсивное импульсно-периодическое микроволновое излучение, связана с усилением пролиферативной активности клеток селезенки и снижением этого показателя в опухолевых клетках за счет активации в них процесса апоптотической гибели.
5. Низкоинтенсивное импульсно-периодическое ультразвуковое излучение приводит к повреждению опухолевых клеток за счет активации программы апоптотической гибели.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи Литвяков, Н.В. / Н.В. Литвяков, М.А. Булдаков, Н.В. Чердынцева, В.В.
1.
Ростов, А.И. Климов, М.А. Большаков / Влияние импульсно периодического СВЧ-излучения на синтез нуклеиновых кислот в опухолевых клетках // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2005. – Т. 45. – № 4. – С. 460-463.
2. Litvyakov, N.V. Apoptosis-inducing effect of pulse periodics X-rays on tumor cells / N.V. Litvyakov, V.V. Rostov, M.A. Bolshakov, M.A. Buldakov, K.V.
Afanasiev, A.N. Astapenko, O.P. Kutenkov, N.V. Cherdyntseva // Biophysics.
– 2005. – Vol. 50. – N. 1. – Р. 51-58.
Литвяков, Н.В. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток 3.
импульсно-периодическим рентгеновским излучением / Н.В. Литвяков, В.В. Ростов, М.А. Булдаков, Н.В. Литвяков, Н.В. Чердынцева, М.А.
Большаков, К.В. Афанасьев, С.Д. Коровин, О.П. Кутенков, С.Ю. Семенов // Сибирский онкологический журнал. – 2006. – Т. 17. – № 1. – С. 24- 4. Yoshida, T. Molecular therapy using ultrasound: mechanisms involved in drug activation, apoptosis induction, gene transfer, and alterations of gene expression T. Yoshida, T. Kondo, R. Ogawa, Q.-L. Zhao, M.A. Hassan, A.
Watanabe, I. Takasaki, Y. Tabuchi, M. Shoji, N. Kudo, L.B. Feril, K.
Tachibana, M.A. Buldakov, T. Honda, K. Tsukada, P. Riesz // Thermal Medicine. – 2007. – Vol. 23. – No. 3. – Р. 113-122.
5. Buldakov, М.А. Dual role of low-dose ionizing radiation / M.A. Buldakov, L.B. Feril // Philippine Physics Journal. – 2008. – Vol. 30. – Р. 1-8.
6. Buldakov, М.А. Influence of changing pulse repetition frequency on chemical and biological effects induced by low-intensity ultrasound in vitro / M.A.
Buldakov, M.A. Hassan, Q.-L. Zhao, L.B. Feril, N. Kudo, T. Kondo, N.V.
Litvyakov, M.A. Bolshakov, V.V. Rostov, N.V. Cherdyntseva, P. Riesz // Ultrasonics Sonochemistry. – 2009. – Vol. 16. – Р. 392–397.
Патент на изобретение 7. Пат. 2326707 Способ подавления пролиферации опухолевых клеток / Н.В.
Литвяков, В.В. Ростов, М.А. Булдаков, Н.В. Чердынцева, М.А. Большаков, К.В. Афанасьев, О.П. Кутенков. – №2006133668/14 Заявлено 20.09.06;
Опубл. 20.06.08, Бюл. № 17.
Тезисы в материалах конференций 8. Булдаков, М.А. Эффект воздействия СВЧ-излучения с импульсами субмикросекундной длительности на опухолевые клетки мастоцитомы Р 815 / М.А. Булдаков, Н.В. Литвяков, Н.В. Чердынцева, В.В. Ростов, А.И.
Климов, М.А. Большаков, С.Д. Коровин // Материалы третьей международной конференции. «Электромагнитные поля и здоровье человека. Фундаментальные и прикладные исследования», 17-24 сентября, Москва – Санкт- Петербург. – 2002. – С. 54-56.
9. Булдаков, М.А. Оценка влияния мощного импульсного СВЧ-излучения на процесс транскрипции РНК в опухолевых клетках в зависимости от частоты повторения импульсов / М.А. Булдаков // Материалы XLI международной научной студенческой конференции «Студент и научно технический прогресс», Новосибирск. – 2003. – С. 97.
10.Булдаков, М.А. Влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения на опухолевые клетки М.А. Булдаков, Н.В. Литвяков, В.В.
Ростов // Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М.
Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск, СибГМУ. – 2004. – С. 272-274.
11.Булдаков, М.А. Исследование механизмов действия импульсно периодического рентгеновского излучения на опухолевые и нормальные клетки Н.В. Литвяков, М.А. Булдаков, Н.В. Чердынцева, В.В. Ростов, М.А. Большаков // Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, 24-25 июня. Ч. II. – Томск: Изд-во НТЛ. – 2004. – С.113-114.
12.Litvyakov, N.V. Supression of division of tumor cells exposured to nanosecond powerful microwave or X-ray pulse trains / N.V. Litvyakov, M.A.
Buldakov, N.V. Cherdyntseva, V.V. Rostov, A.I. Klimov, M.A. Bolshakov, K.V. А.А. Elchainov, S.D. Korovin // 2nd European Pulsed Power Symposiium, Hamburg, Germany, 20-23 september. – 2004. – Р. 62-66.
13.Litvyakov, N.V. Effect of impulse low dose X-ray irradiation on tumor and normal cells / N.V. Litvyakov, M.A. Buldakov, N.V. Cherdyntseva, V.V.
Rostov, M.A. Bolshakov // Proceedings of the 47th annual meeting of the Japan radiation research society, November 25-27. – 2004. – Р. 64.
14.Булдаков, М.А. Влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения на опухолевые и нормальные клетки и некоторые механизмы его действия / М.А. Булдаков, К.В. Афанасьев // Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск, СибГМУ. – 2005. – С. 111-112.
15.Булдаков, М.А. Перспективы разработки методов низкодозовой лучевой терапии злокачественных новообразований / М.А. Булдаков, Н.В.
Литвяков, Н.В. Чердынцева, В.В. Ростов, М.А. Большаков // Материалы VI Всероссийского съезда онкологов «Современные технологии в онкологии», Том II, г.Ростов-на-Дону. – 2005. – С. 362-363.
16.Булдаков, М.А. Влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения в низких дозах на нормальные и опухолевые клетки и рост опухоли in vivo / М.А. Булдаков, Н.В. Литвяков, К.В. Афанасьев, А.Н.
Астапенко // Сборник научных работ молодых специалистов-онкологов Уральского федерального округа «Лечение рака в XХI веке», г.Челябинск.
– 2006. – С. 16-17.
17.Булдаков, М.А. Effect of low-dose repetitive pulsed X-ray on tumor and normal cells in vivo / М.А. Булдаков, Н.В. Литвяков, Н.В. Чердынцева, В.В.
Ростов, А.Н. Астапенко // 12th Annual meeting on the sensitization of cancer treatment, Toyama, Japan. – 2006. – Р. 22.
18.Булдаков, М.А. Импульсно-периодические СВЧ и рентгеновское излучения: влияние на клетки костного мозга и селезенки / М.А.
Булдаков, Н.В. Литвяков, Н.В. Чердынцева, В.В. Ростов, М.А. Большаков, К.В. Афанасьев, А.Н. Астапенко // Вестник Томского государственного университета. Приложение: Материалы международных, всероссийских, региональных научных конференций, семинаров, симпозиумов, школ, проводимых в ТГУ, г.Томск. – 2006. – № 21. – С. 23-24.
19.Булдаков, М.А. Низкодозовое импульсно-периодическое рентгеновское излучение: действие на нормальные и опухолевые клетки / М.А. Булдаков, Н.В. Литвяков, Н.В. Чердынцева, В.В. Ростов, М.А. Большаков, К.В.
Афанасьев, А.Н. Астапенко // Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения: материалы IV международной научно практической конференции, 11-12 апреля, Северск-Томск. – 2007. – С.
196-197.
20.Булдаков, М.А. Механизм действия низкодозового импульсно периодического рентгеновского излучения на опухолевые клетки / М.А.
Булдаков, Н.В. Литвяков, Н.В. Чердынцева, В.В. Ростов, М.А. Большаков, К.В. Афанасьев // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях» 3-4 июля, Барнаул. – 2007. – С. 81.
21.Булдаков, М.А. Способность низкодозового импульсно-периодического рентгеновского излучения тормозить рост опухолевых клеток / М.А.
Булдаков, Н.В. Литвяков, К.В. Афанасьев, А.Н. Астапенко // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии», г.Москва. – 2007. – С.
22.Булдаков, М.А. Оценка перспективности нового подхода к низкодозовой лучевой терапии опухолей / М.А. Булдаков, Н.В. Литвяков, К.В.
Афанасьев, А.Н. Астапенко // Тезисы докладов конференции молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии», г.Москва. – 2007. – С. 96-97.
23.Булдаков, М.А. Влияние импульсно-периодического ультразвукового излучения на опухолевые клетки. Механизм действия / М.А. Булдаков // Сибирский онкологический журнал. Приложение №1 «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии». – 2008. – С.20-22.
24.Kondo, T. Roles of microbubbles on molecular therapy using pulsed ultrasound / T. Kondo, M.A. Hassan, Y. Furusawa, R. Ogawa, Q.-L. Zhao, A.
Watanabe, A. Morii, H. Fuse, Y. Tabuchi, M.A. Buldakov, I. Takasaki // // Тhe 10th International Symposium on Ultrasound Contrast Imaging. – 2008. – Р.48-49.
25.Buldakov, М.А. Chemical and biological effects of changing pulse repetition frequencies of low intensity pulsed ultrasound in vitro / M.A. Buldakov, M.A.
Hassan, Q.-L. Zhao, L.B. Feril, N. Kudo, T. Kondo // Тhe 10th International Symposium on Ultrasound Contrast Imaging. – 2008. – Р.82.
Автор выражает глубокую признательность д-ру физ.-мат. наук, проф.
Ростову В.В., канд. биол. наук Литвякову Н.В., канд. биол. наук Иванову В.В., профессору Т. Кондо и профессору Т. Кагия за помощь при проведении исследований и обсуждении результатов.