Влияние природных и антропогенных факторов на активность ферментов сыворотки крови черноморских рыб (на примере морского ерша)
На правах рукописи
РОЩИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА
ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНЫХ И АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ
ЧЕРНОМОРСКИХ РЫБ
(НА ПРИМЕРЕ МОРСКОГО ЕРША)
Специальность экология– 03.00.16
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва, 2010 1
Работа выполнена на базе Государственного предприятия «Севастопольский научно производственный центр стандартизации, метрологии и сертификации»
(Севастополь, Украина) и в отделе ихтиологии Института биологии южных морей им. А.О. Ковалевского НАН Украины (ИнБЮМ НАНУ, Севастополь, Украина)
Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Руднева И.И., ИнБЮМ НАН Украины
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Филенко Олег Федорович Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова доктор биологических наук Голованова Ирина Леонидовна Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН
Ведущая организация: Московский государственный университет технологий и управления
Защита диссертации состоится «26» марта в 14:00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.55 при Московском государственном университете им. М.В.
Ломоносова по адресу: 119889, г. Москва, Ленинские Горы, д. 1, кор. 12, МГУ им.
М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. 389.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ Автореферат разослан «_» 2010г.
Ученый секретарь диссертационного совета, канд. биол. наук Н. В. Карташева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время прибрежные морские экосистемы в наибольшей степени подвержены антропогенному прессингу в результате сброса сточных вод промышленных, сельскохозяйственных и коммунальных предприятий. Эта ситуация характерна и для Черноморского региона. Ежегодно сбросы сточных вод на территории Украины составляют около 7000 млрд. м3, большая часть их которых попадает в Черное море. При этом только 60% являются нормативно очищенными (2-й огляд результативності…, 2008). Как следствие в шельфовой зоне концентрируется множество различных загрязнителей (тяжелые металлы, нефтепродукты, фенолы, пестициды и другие органические соединения). Это приводит к изменению гидрохимического режима, нарушению эволюционно сложившихся связей между различными компонентами сообщества, развитию процессов эвтрофирования, изменению и уменьшению видового разнообразия ихтиофауны, смене доминирующих видов в сторону малоценных (Овен и др., 2001, Руднева и др., 2005). Учитывая тот факт, что на берегах морей и океанов проживает более 2 млрд. населения планеты (Galloway, 2006), особую актуальность представляет анализ состояния морских акваторий, вовлеченных в хозяйственную деятельность.
Качество морской среды определяется наличием различных загрязнителей в воде, в донных отложениях, в гидробионтах. Химические методы измерения количества ксенобиотиков позволяют установить только их соответствие существующим нормативам, однако реальный биологический эффект не учитывается. В связи с этим возникает потребность в разработке достоверных методов и критериев токсикологического контроля (Моисеенко, 2005, Руднева, 2007).
Известно, что рыбы как верхнее трофическое звено водной экосистемы являются индикаторами загрязнения, по изменению их физиолого биохимического состояния можно оценить и прогнозировать последствия наличия токсических веществ в воде (Моисеенко, 2005, Руднева, 2007).
Существование строгой зависимости между уровнем метаболизма и ферментативной активностью позволяет охарактеризовать статус рыб с помощью молекулярных индикаторов (Shulman et al., 1999). В этом отношении наряду с антиоксидантными ферментами наиболее информативными являются аминотрансферазы (аланин- и аспартатаминотрансфераза), щелочная фосфатаза и альдолаза, активность которых характеризует состояние печени, ее биосинтетическую и детоксикационную функции (Oluah, 1999).
В связи с этим поиск и применение биохимических индикаторов для экотоксикологической характеристики водных объектов является перспективным направлением, позволяющим получить адекватную информацию о состоянии среды по откликам биоты. Одновременно при оценке степени тяжести и прогнозировании негативного воздействия на организм необходимо учитывать влияние различных биотических и абиотических факторов для более детального понимания механизмов ответных реакций рыб на действие загрязнителей, а также для корректного применения их в мониторинговых программах.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния природных и антропогенных факторов на активность ферментов аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ), альдолазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крови морского ерша Scorpaena porcus L, обитающего в прибрежных акваториях г. Севастополя и перспективного в качестве биомонитора морской среды.
В соответствие с целью исследования были поставлены следующие задачи:
Установить возрастные и половые особенности активности 1.
ферментов в сыворотке крови морского ерша.
Изучить сезонные изменения активности сывороточных ферментов.
2.
Исследовать электрофоретический спектр АсАТ в сыворотке крови 3.
рыб, обитающих в прибрежной зоне г. Севастополя.
Провести сравнительный анализ ферментов в сыворотке крови 4.
морского ерша, обитающего в бухтах с различной антропогенной нагрузкой.
Определить зависимость между активностью сывороточных 5.
ферментов и содержанием токсичных элементов в мышцах рыб.
В экспериментальных условиях установить токсические эффекты 6.
медьсодержащего пестицида купроксата на морского ерша.
Выявить наиболее информативные ферменты – биоиндикаторы 7.
физиолого-биохимического состояния рыб и среды их обитания с целью использования в мониторинговых программах.
Связь с научными программами, планами, темами. Исследования проводили в рамках договора № 115 от 01.11.2005 г. о научном сотрудничестве ГП «Севастопольский научно-производственный центр стандартизации, метрологии и сертификации» и ИнБЮМ НАНУ, а также работы отдела ихтиологии ИнБЮМ НАНУ по госбюджетной темам НАН Украины «Структурно-функциональные основы биоразнообразия морских сообществ»
(№ государственной регистрации 0199U001388) (2002 г.), «Исследование факторов поддержания устойчивости морских экосистем» (№ государственной регистрации 0103U001048) (2003 - 2005 гг.).
Научная новизна полученных результатов. Впервые проведена комплексная оценка влияния физиологических, природных и антропогенных факторов на активность ферментов аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ), альдолазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крови морского ерша, обитающего в прибрежной зоне г. Севастополя. Установлены сезонные, возрастные и половые различия активности данных энзимов. Изучен электрофоретический спектр АсАТ в сыворотке крови морского ерша и проведено его сопоставление с активностью. В природных условиях проанализировано влияние комплексного загрязнения акваторий и отдельных загрязнителей (токсичных элементов) на исследуемые параметры. Показано их модифицирующее действие на половые, возрастные и сезонные особенности активности энзимов. Выявлена зависимость между уровнем накопления токсичных элементов в мышечной ткани морского ерша и ответными реакциями сывороточных ферментов. В экспериментальных условиях исследовано влияние медьсодержащего пестицида купроксата на данные показатели. Обнаружено наличие четкой ответной реакции активности сывороточных ферментов рыб на увеличение уровня меди в среде. Полученные результаты имеют теоретическое значение, так как вносят вклад в понимание механизмов адаптации водных организмов, а также в физиологию, биохимию, экологию и экотоксикологию рыб.
Практическое значение. Результаты работы представляют интерес для разработки мониторинговых программ, в частности для биотестирования и биоиндикации водных объектов с помощью биохимических индикаторов рыб. В настоящее время такой подход широко применяется в странах Европы, что позволяет гармонизировать отечественные разработки со стандартами и директивами Европейского Сообщества.
Критерии анализа состояния рыб, основанные на измерении активности сывороточных ферментов, дают возможность получить адекватную информацию о здоровье популяций гидробионтов в условиях хронического загрязнения морских акваторий и оценить степень риска, прогнозировать и корректировать хозяйственную деятельность, обосновать критерии загрязнения водоемов, разрабатывать мероприятия по их оздоровлению, осуществлять промысловый прогноз.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является самостоятельным научным исследованием. Автором была разработана методология исследования, проведены лабораторные эксперименты, выполнен анализ, обобщение и статистическая обработка полученных результатов, а также сопоставление их с литературными источниками.
Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всеукраинской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы современного естествознания»
(Симферополь, 2003г.), на 2-м съезде токсикологов России (Москва, 2003), на международной конференции «30 th Pacem in Maribus» (Киев, 2003), на 6-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения»
(Харьков, 2004), на международной конференции молодых ученых «Комплексные исследования биологических ресурсов южных морей и рек»
(Астрахань, 2004 г.), на международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004), на научно-практической конференции «Экологические проблемы Азово Черноморского бассейна: вклад Крыма и прилегающих регионов в их решение» (Керчь, 2004), на научной конференции «Заповедники Крыма»
(Симферополь, 2005), на конференции молодых ученых по проблемам Черного и Азовского морей «Понт Эвксинский» IV, V (Севастополь, 2005), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы оценки соответствия в условиях интеграции систем управления качеством и безопасностью пищевых продуктов» (Севастополь, 2005), на Всероссийской конференции с участием специалистов из стран Ближнего и Дальнего зарубежья «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005), на II международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной имени И.И. Мечникова «Биоразнообразие. Экология.
Эволюция. Адаптация» (Одесса, 2005г.), на международной научно практической конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов – 2» (Борок, 2007), на международной конференции «Современные проблемы морской инженерной экологии (изыскания, ОВОС, социально-экономические аспекты)» (Ростов-на-Дону, 2008);
на международной конференции «Современные проблемы гидробиологии. Перспективы, пути и методы решения» (Херсон, 2008), на Всероссийской конференции по водной токсикологии, посвященной памяти Б.А. Флерова «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы», на конференции по гидробиологии «Критерии оценки качества вод и методы нормирования антропогенной нагрузки», на школе-семинаре «Современные методы исследования и оценки качества вод, состояния водных организмов и экосистем в условиях антропогенной нагрузки» (Борок, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 21 научная работа, в том числе 13 статей, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России, и 8 тезисов;
16 работ написано без соавторов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 источников. Текст иллюстрирован таблицей, 22 рисунками.
ФЕРМЕНТЫ КАК ИНДИКАТОРЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА РЫБ. ВЛИЯНИЕ МЕДИ НА ОРГАНИЗМ РЫБ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
В разделе 1 подробно освещены вопросы о роли ферментов, в том числе сывороточных (аминотрансфераз, альдолазы, щелочной фосфатазы), для оценки физиолого-биохимического статуса рыб. Приведены литературные данные о влиянии физиологических (пол, возраст особей, стадия годового цикла) и экологических (природных и антропогенных) факторов на ферментативную активность. Показаны примеры воздействия различных токсикантов, в том числе тяжелых металлов, на исследуемые параметры. Отдельно рассмотрено влияние меди на организм рыб, в частности на его ферментативные системы. Обсуждаются нерешенные проблемы и перспективы развития данного направления.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследований – морской ерша Scorpaena porcus L, обитающий в прибрежной зоне г. Севастополя.
Рыб отлавливали в бухтах Мартынова и Карантинная (г. Севастополь) с помощью донных ставников в период 2002-2005г.
Согласно данным, полученным отделом санитарной гидробиологии ИнБЮМ НАН Украины (г. Севастополь), Инспекцией по охране Черного и Азовских морей (г. Севастополь), ГП «Крымским региональным научно производственным центром стандартизации, метрологии и сертификации»
(г. Симферополь), районы исследования характеризуются различной экологической обстановкой. Б. Мартынова считается более загрязненной по сравнению с б. Карантинной, хотя она в меньшей степени подвержена непосредственному антропогенному влиянию. Однако в результате изоляции данной акватории и ограниченному водообмену с открытой частью моря многие загрязняющие вещества накапливаются в донных отложениях и служат источником вторичного загрязнения как воды, так и биоты (Игнатьева и др., 2003, Осадчая и др., 2004, Руднева и др., 2008).
В работе использованы морфофизиологические, физико-химические, электрофоретический, токсикологические и статистические методы.
Биологический анализ рыб, включавший измерение общей и стандартной длины, замеры массы рыбы, тушки, гонад и печени, определение пола, стадии зрелости, проводили по общепринятым методикам (Правдин, 1966, Шварц и др., 1968). Возраст рыб определяли по отолитам (Правдин, 1966). Особей группировали по полу, возрасту, учитывали сезонность и местообитание.
Взятие проб проводили утреннее время суток. Кровь у рыб брали из хвостовой артерии при помощи пастеровской пипетки. В индивидуальных образцах сыворотки, полученной методом отстаивания на холоду, активность аминотрансфераз определяли унифицированным колориметрическим методом Райтмана и Френкеля (микрометод), альдолазы – методом В.И.Товарницкого и Е.Н.Волуйской в модификации В.А.Ананьева и В.Р.Обуховой и щелочной фосфатазы – методом Кинга-Амстронга (Иванов и др., 1972). Измерение ферментативной активности осуществляли на спектрофотометре Spekoll – 211 (фирма Carl Zeiss, Iena Германия) при комнатной температуре, так как исследования пойкилотермных организмов принято проводить в физически адекватных условиях (Хочачка и др., 1977).
Для выявления изоферментного спектра АсАТ использовали вертикальный электрофорез в тонком слое 7% полиакриламидного геля (ПААГ) с последующим гистохимическим окрашиванием (Рекомендации…, 1980).
В мышцах рыб определяли медь атомно-абсорбционным (ГОСТ 30178 96, ГОСТ 26931-86) и вольтамперометрическим (МВВ 081-12/05-98, МВВ 081/12-4631-00) методами в 3-5 повторностях для каждого суммарного образца, полученного от 5- 7 особей.
Изучение влияния медьсодержащего пестицида купроксата на активность исследуемых ферментов в сыворотке крови морского ерша проводили в экспериментальных условиях. Рыб помещали в аэрируемые аквариумы с профильтрованной морской водой из расчета 1 особь на 5 л воды и акклимировали к условиям эксперимента в течение суток. На основании того, что утвержденное на Украине ПДК меди для морской воды составляет 0,001 мг/л, в среду добавляли следующие концентрации купроксата в пересчете на медь: 1 ПДК, 10 ПДК и 100 ПДК. Контролем служили особи, содержащиеся в воде без добавления токсиканта. Образцы крови и мышц отбирали через 1, 2 и 3 суток после начала эксперимента.
Сравнительный анализ данных осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными в случае, если р0,05. С целью выявления зависимости между исследуемыми параметрами рассчитывали коэффициент корреляции для каждой пары значений с помощью стандартной программы EXCEL. При этом считали, что коэффициентам корреляций 0r0,3 соответствует слабая связь, 0,3r0,5 – умеренная, 0,5r0,7 – значительная, 0,7r0,9 – сильная (Лакин, 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В данной главе проведена комплексная оценка влияния совокупности физиологических (пол, возраст особей, стадия годового цикла) и экологических (природных и антропогенных) факторов на биохимические параметры морского ерша, обитающего в прибрежных акваториях г. Севастополя. Схема анализа представлена ниже.
Изучение физиолого биохимического статуса рыб Анализируемые параметры:
Активность сывороточных ферментов (АлАТ, АсАТ, альдолазы, щелочной фосфатазы) Анализ влияния Анализ влияния физиологического экологических факторов состояния Природные Антропогенные Пол Возраст факторы факторы Токсичные Сезонность элементы Генетический стутус Природные Экспериментальные исследования исследования 1. Влияние физиологических факторов на активность ферментов в сыворотке крови морского ерша 1.1. Электрофоретический анализ сывороточной АсАТ В связи с существованием определенных генетических различий у особей одной из первостепенных задач исследования явилось изучение электрофоретического спектра АсАТ сыворотки крови морского ерша, обитающего в прибрежной зоне г. Севастополя.
Результаты показали, что сывороточная АсАТ морского ерша из данного района является гетерогенной и представлена тремя электрофоретическими типами (рис. 1):
быстрым (F, представленный одной фракцией с Kэф= 0,6);
медленным(S, представленный одной фракцией с Kэф= 0,5);
смешанным(FS, присутствуют обе фракции).
+ _ _ _ – типы S F FS Активность АсАТ 8,38 ± 0,92 5,56 ± 0,77 3,84±0, (мкмоль/час·мл, M ±m ) Рис. 1. Схема электрофоретических типов АсАТ сыворотки крови морского ерша (n= 69) Особи, обладающие смешанным электрофоретическим типом АсАТ, составили большинство в выборке – 75 % от общего количества рыб, в то время как с быстрым и медленным – 21 и 3,4 % соответственно.
Отдельно проанализированы электрофоретические спектры АсАТ ерша из б. Карантинной и б. Мартынова. В обоих районах доминировали особи со смешанным типом фермента (72-73 % от общего количества особей), что соответствует общей тенденции. Вероятно, совокупность особей морского ерша из данных бухт является единой.
В ходе исследования выявлены различия активности АсАТ, соответствующей различным электрофоретическим типам. Отмечено последовательное увеличение показателя в ряду FSFS. Все рассмотренные различия достоверны (p0,05). У особей, обладающих смешанным электрофоретическим типом, активность фермента наименьшая и соответствует среднему значению, которое установлено для морского ерша, обитающего в прибрежных акваториях г. Севастополя.
Совершенно очевидно, что присутствие обеих фракций обеспечивает наиболее оптимальный уровень активности АсАТ, который необходим для функционирования организма в данных условиях.
1.2. Возрастные особенности активности ферментов Установлено, что активность сывороточных ферментов (АлАТ, АсАТ и альдолазы) морского ерша подвержена определенным возрастным колебаниям в течение онтогенеза (табл. 1). Возраст отловленных рыб варьировал от 2 до 8 лет. Доминирующая группа представлена 4-летними особями, которая составила 33,7 % от общего количества.
Таблица Возрастная динамика активности ферментов в сыворотке крови морского ерша (мкмоль/час·мл, M ± m) Возраст, годы АлАТ АсАТ Щелочная фосфатаза 1,77 ± 0,35 3,10 ± 1,53 0,63 ± 0, 2 (n=6) 3,40 ± 0,24* 4,75 ± 0,51 0,74 ± 0, 3 (n=27) 2,87 ± 0,20 4,27 ± 0,42 0,82 ± 0, 4 (n=30) 2,85 ± 0,28 4,17 ± 0,44 1,37 ± 0, 5 (n=18) 3,65 ± 1,16 3,92 ± 0,78 1,95 ± 0, 6(n=7) 2,14 ± 0,86 3,08 ± 1,03 1,17 ± 0,15** 7-8 (n=2) Примечание: * - различия достоверны по сравнению со значениями 2-летних особей;
** - различия достоверны по сравнению со значениями 6-летних особей (р0,05);
n - количество особей.
Обнаружено значительное увеличение активности аминотрансфераз в сыворотке крови 3-летних ершей, что связано с интенсификацией общего метаболизма организма в связи с началом репродуктивной деятельности.
Достигая определенного уровня, данные показатели стабилизируются. С возрастом происходит подавление активности ферментов, что, вероятно, обусловлено снижением обмена. В это же время отмечено подавление коэффициента де Ритиса свидетельствует об увеличении функциональной нагрузки на печень у стареющих особей. В наибольшей степени возрастным изменениям подвержена щелочной фосфатазы (r= 0,62) Проведен анализ активности сывороточных аминотрансфераз у разновозрастных рыб из каждого района исследования. Следует отметить, что возрастной ряд морского ерша в б. Мартынова уже по сравнению с таковым из б. Карантинной. Возраст доминирующей группы составил 5 лет, а 4-летние особи, преобладающие в б. Карантинной, – только 19,1% от общего количества.
Возрастные изменения активности аминотрансфераз в сыворотке морского ерша, обитающего в обеих бухтах, подвержены общим закономерностям, рассмотренным выше. При этом коэффициент де Ритиса у молодых особей из б. Мартынова снижен приблизительно в 2 раза по сравнению с таковым у рыб из б. Карантинной. Очевидно, это связано с более напряженным функционированием организма в условиях большего загрязнения б. Мартынова.
1.3. Половые особенности активности ферментов Выявлено существование определенных половых особенностей активности ферментов в сыворотке крови морского ерша, обитающего в прибрежных акваториях г. Севастополя (табл. 2). Активность АлАТ и щелочной фосфатазы у самок выше по сравнению с таковой у самцов. Для активности АсАТ и коэффициента де Ритиса характерна противоположная тенденция. Обнаруженные различия биохимических параметров самок и самцов, вероятно, определяются их гормональным статусом. В тоже время они могут быть связаны с особенностями накопления ксенобиотиков в гонадах и специфическими физиологическими реакциями разнополых рыб (Schreck et al., 2001). Согласно полученным ранее данным максимальные количества токсикантов аккумулируются в печени и гонадах рыб, что может модифицировать их гормональный статус (Руднева и др., 1994). Обращает на себя внимание и тот факт, что в уловах из обоих районов исследования преобладали самки, которые составили 59-75% от общего количества рыб.
Таблица Половые особенности активности сывороточных ферментов и коэффициент де Ритиса морского ерша (мкмоль/час·мл, M ± m) Показатель Самки (n= 94) Самцы (n= 46) Щелочная фосфатаза 2,20 ± 0,25 1,76 ± 0, АлАТ 3,27 ± 0,31 2,78 ± 0, АсАТ 4,15 ± 0,29* 5,05 ± 0,47* Коэффициент де Ритиса 1,27 1, Примечание: * - достоверные отличия между самками и самцами (р0,05);
n- количество особей.
При рассмотрении половых особенностей активности ферментов в сыворотке крови особей, обитающих в бухтах Мартынова и Карантинная, выявлены тенденции, согласующиеся с полученными ранее. Однако значения коэффициента де Ритиса как у самок, так и у самцов из б. Мартынова ниже по сравнению с таковыми у особей из б. Карантинной. Очевидно, это связано с большей функциональной нагрузкой на печень рыб из более неблагополучного района обитания. Другими исследователями было показано, что у 2-4-летних самок, а также у 2-3-летних самцов в период покоя масса печени была выше у особей из б. Мартынова (Кузьминова и др., 2008). Это может служить косвенным подтверждением наших предположений.
2. Влияние экологических факторов на активность ферментов в сыворотке крови морского ерша 2.1. Сезонные особенности активности ферментов Большинство показателей метаболизма у рыб, в том числе ферментативная активность, характеризуются значительной сезонной изменчивостью. Одним из ключевых факторов, определяющих интенсивность обмена у рыб в течение года, является температура воды (Shulman et al., 1999). На этом основании исследованы изменения активности ферментов в сыворотке крови морского ерша в различные периоды года, учитывая среднюю сезонную температуру воды (рис. 2).
Рис. 2. Активность сывороточных ферментов морского ерша в разные сезоны года (M + m, АлАТ, АсАТ и АЛД: n= 74, щелочная фосфатаза: n= 139) Обнаружено значительное увеличение активности АсАТ летом, когда вода в акваториях максимально прогревается (+ 22,5С). Значения остальных показателей находятся также на достаточно высоком уровне. Следует отметить, что морской ерш относится к группе летне-нерестящихся черноморских рыб с непрерывным типом созревания ооцитов и многопорционным икрометанием. Генеративный рост наблюдается на протяжении всего летнего периода, хотя массовый нерест приходится на июль месяц (Овен, 1976). Таким образом, возрастание активности сывороточных ферментов обусловлено усилением общего метаболизма во время нереста ерша, так как репродуктивный процесс энергоемок и требует значительной доли внутренних ресурсов организма. При этом происходит перераспределение энергетического и пластического материала и соответственно интенсификация процессов кровообращения (Shulman et al., 1999), о чем свидетельствует высокое значение коэффициента де Ритиса в этот период.
Осенью с понижением температуры воды (+18,4С) установлено снижение активности всех исследуемых ферментов. В то же время в середине сентября завершается нерест морского ерша (Овен, 1976), происходит прекращение генеративных процессов, а также наблюдается стабилизация роста, уменьшение интенсивности питания, что приводит к снижению уровня общего обмена (Shulman et al., 1999).
Далее зимой, в связи с падением температуры воды (+7,8С), метаболизм у рыб понижен, питание прекращено полностью или в значительной мере сокращено, рыбы малоактивны, энергозатраты минимальны, окислительные процессы замедлены (Shulman et al., 1999). В это время отмечено значительное уменьшение активности исследуемых ферментов. Исключение составила активность АлАТ, так как наибольшее ее значение зафиксировано зимой. Известно, что печень является основным депонирующим органом морского ерша, хотя составляет всего 2,5% от массы тела. В ней содержится более 50% всех резервных углеводов и липидов, которые в основном используются при голодании, значительных энергетических тратах зимой (Shulman et al., 1999). Повышение активности АлАТ в сыворотке, вероятно, связано с увеличением функциональной нагрузки на печень в данный период. Подтверждением служит снижение коэффициента де Ритиса в зимнее время.
Повышение активности щелочной фосфатазы и альдолазы весной в преднерестовый период морского ерша может быть обусловлено активизацией процессов гаметогенеза, соматического роста, повышением мышечной активности (Эмеретли и др., 2001).
Таким образом, активность исследуемых ферментов в сыворотке крови рыб подвержена сезонным изменениям, обусловленным эволюционно сформированными физиологическими ритмами в течение года. В то же время температура окружающей среды оказывает непосредственное влияние на активность ферментов, активируя или подавляя обмен веществ у рыб.
Наиболее чувствительными к температурным колебаниям воды являются АсАТ и коэффициент де Ритиса (r=0,79 и r=0,96, р0,05 соответственно), в меньшей степени альдолаза и щелочная фосфатаза.
3. Ответные реакции морского ерша на загрязнения среды обитания 3.1. Влияние загрязнения бухт на активность ферментов Как известно загрязнение среды может существенным образом модифицировать естественные процессы в организме рыб, что прежде всего проявляется на молекулярном уровне, в частности на изменении ферментативной активности. В связи с этим проведен анализ особенностей активности ферментов в сыворотке крови морского ерша, обитающего в бухтах, характеризующихся различным уровнем антропогенной нагрузки (б. Мартынова и б. Карантинной) (табл. 3).
Установлено, что летом активность АлАТ выше у рыб из более загрязненного района обитания (б. Мартынова). В зимний период отмечено подавление активности АсАТ на фоне активации щелочной фосфатазы и альдолазы у ерша из данного района. Как зимой, так и летом значения коэффициента де Ритиса почти в 2 раза ниже у ерша из б. Мартынова по сравнению с таковыми у особей из б. Карантинная (лето 0,97 и 3,44, зима 0,45 и 1,60 соответственно). Выявленные различия, вероятно, связаны с хроническими токсическими нагрузками на печень, как на основной орган детоксикации ксенобиотиков у рыб из более загрязненного района обитания б. Мартынова.
Таблица Сезонная динамика активности ферментов в сыворотке крови морского ерша из б. Мартынова и б. Карантинная (мкмоль/час·мл, M ± m) б. Мартынова (n= 55) б. Карантинная (n= 120) Сезон Щелочная Щелочная АлАТ АсАТ АЛД АлАТ АсАТ АЛД фосфатаза фосфатаза Зима 2,37±0,51 1,08±0,46 0,69±0,17 2,64 ± 0,54 2,49±0,44 2,44±0,37 0,96±0, 0,204±0, Весна 1,72±0,52 1,68±0,11 1,22±0,22 1,03±0,35 0,538±0,06 3,34±0, -- Лето 2,67±0,48 4,45±0,35* 0,34±0,05 1,42±0,30 4,88±0,37* 0,305±0,06 3,17±0, Осень 1,72±0,43 2,42 ± 0,37 2,66 ± 0,54 1,96±0,35 2,21±0,37 0,148±0,02 1,37±0, - Примечание: * - различия достоверны между значениями активности АсАТ летом и в другие сезоны;
n- количество особей.
Ранее было показано, что коэффициент де Ритиса как у самок, так и у самцов из б. Мартынова ниже по сравнению с таковым у рыб из б. Карантинной. Аналогичная тенденция характерна для молодых особей ерша. Более того в данном районе наблюдается сокращение возрастного ряда морского ерша и доминирование в уловах самок. Наши результаты согласуются с данными, полученными другими исследователями. Так у особей из б. Мартынова отмечено возрастание индекса печени и активация антиоксидантных ферментов как в крови, так и в печени (Руднева и др., 2005, Скуратовская, 2005, Кузьминова и др, 2008, Вахтина и др., 2005), а также повышенное содержание токсичных элементов (ТЭ) в тканях (Омельченко, 2005).
На основании корреляционного анализа установлено, что наиболее чувствительными к изменениям условий обитания, не связанным с колебаниями температуры воды, является активность АлАТ, менее чувствительна альдолаза и щелочная фосфатаза. При этом коэффициент де Ритиса, выступая в качестве интегрального показателя, характеризует функциональное статус печени, его изменения, обусловленные как особенностями физиологического состояния организма в различные сезоны года, так и действием загрязняющего фактора.
3.2. Влияние содержания токсичных элементов в мышцах морского ерша на активность сывороточных ферментов (природные исследования) Одними их основных загрязнителями прибрежных акваторий г. Севастополя являются тяжелые металлы (Овсяный и др., 2001, Осадчая и др, 2004, Зубаченко, 2004), многие из которых обладают биологической активностью и, в отличие от органических соединений, не подвергаются трансформации в организме гидробионтов, крайне медленно покидая биологический цикл (Моисеенко и др., 2004). Для процессов их поступления, накопления и выведения у рыб характерны колебания в течение года (Руднева и др., 2008).
Результаты исследований показали наличие сезонной зависимости между уровнем накопления токсичных элементов в мышечной ткани ерша и ответными реакциями сывороточных ферментов (табл. 4).
Таблица Степень зависимости между содержанием токсичных элементов в мышцах морского ерша и активность сывороточных ферментов и коэффициентом де Ритиса Токсичный Коэффициент Щелочная АлАТ АсАТ Альдолаза элемент де Ритиса фосфатаза Cu ++ - - ++ ++ Pb - ++ ++ + + Cd + ++ - ++ + Zn - ++ ++ ++ As - - - + + Hg + + - + Примечание: – - слабая связь (0r0,3);
+ - умеренная (0,3r0,5);
+ + - сильная (0,7r0,9) Установлено, что исследуемые параметры в наибольшей степени зависят от концентрации меди и цинка в тканях. Это, очевидно, связано с высокой биофильностью данных элементов (Скальный, 2004, Моисеенко и др., 2006). Степень чувствительности ферментов к присутствию ТЭ в мышечной ткани выражается следующей последовательностью: АсАТ, альдолазакоэффициент де РитисаАлАТ, щелочная фосфатаза.
Таким образом, содержание токсичных элементов и ответные реакции сывороточных ферментов морского ерша имеют определенную сезонную зависимость, которая может быть обусловлена годовыми циклами рыб, связанными с репродукцией, особенностями питания, а также загрязнением среды обитания.
4. Влияние купроксата на активность ферментов в сыворотке крови морского ерша (экспериментальные исследования) Согласно данным последних лет неоднократно отмечено высокое содержание меди, часто превышающее нормативные значения, в водах Азовского и Черного морей (Фащук и др, 1999, Зубаченко, 2004). В то же время, как было продемонстрировано выше, данный элемент, являясь биофильным, оказывает влияние на активность сывороточных ферментов рыб.
На этом основании в экспериментальных условиях проведено моделирование влияния меди на активность ферментов в сыворотке крови морского ерша, содержащегося в течение 3-х суток в среде с различной концентрацией медьсодержащего пестицида– купроксата (1, 10, 100 ПДК в пересчете на медь, что соответствует 0,001;
0,01;
0,1 мгCu/л), и после прекращения его действия.
Выявлено, что содержание меди в мышечной ткани рыб при действии купроксата незначительно варьировало в течение всего эксперимента (табл. 5).
Отмечено снижение е концентрации к концу экспозиции, что, очевидно, обусловлено инициированием механизмов выведения металла, связанное с активацией синтеза цистеин-обогощенных белков– металлотионеинов (Моисеенко и др., 2006, Голованова, 2008).
Таблица Содержание меди в мышечной ткани морского ерша (мг/кг, M ± m, n= 5-7) Концентрация меди Экспозиция, сутки 1 2 Контроль 1,02 ± 0,08 0,95 ±0,27 1,02 ± 0, 1 ПДК 0,70 ± 0,28 0,74 ± 0,25 0,75 ± 0, 10 ПДК 0,92 ±0,06 0,69 ± 0,08 0,70 ± 0, 100 ПДК 0,98 ± 0,06 0,48 ± 0,31 0,62 ±0,008* Примечание: * – достоверные отличия по отношению к контролю (р 0,05);
n – количество особей После прекращения действия токсиканта и перемещения рыб в чистую воду не установлено существенных изменений в уровне меди в мышечной ткани ерша (табл. 6). Вероятно, это связано с перераспределением Cu в организме рыб, так как данный элемент является эссенциальным и задействован во многих метаболических формах (Моисеенко и др., 2006). Только у особей, подвергнутых воздействию купроксата в концентрации 100 ПДК, наблюдали постепенное выведение меди из мышечной ткани, что, очевидно, связано с продолжением процесса синтеза металлотионеинов (Моисеенко и др., 2006, Голованова, 2008).
Таблица Содержание меди в мышечной ткани морского ерша после прекращения действия купроксата (мг/кг, M ± m, n= 5-7) Концентрация меди Экспозиция, сутки 1 2 Контроль 0,53 ± 0,10 0,67 ± 0,15 0,79 ± 0, 1 ПДК 0,71 ± 0,07* 0,83 ± 0,05 0,99 ± 0, 10 ПДК 0,94 ± 0,2* 0,62 ± 0,04 0,94 ± 0, 100 ПДК 0,82 ± 0,04* 0,58 ± 0,05 0,67 ± 0, Примечание: * – достоверные отличия по отношению к контролю (р 0,05);
n – количество особей Динамика активности сывороточных ферментов при действии малых концентраций купроксата соответствует классической картине адаптационного синдрома (табл. 7).
На начальном этапе действия токсиканта (фаза 1, стадия первичных нарушений или стадия инициации ответа), характеризующемся повреждением молекулярных структур и проницаемости мембран (Филенко, 2001), отмечено подавление активности аминотрансфераз, что свидетельствует об изменениях в регуляции белкового обмена в сторону увеличения содержания свободных аминокислот, в том числе и аспарагиновой, служащей субстратом для глюконеогенеза. В то же время установлено возрастание активности альдолазы и щелочной фосфатазы.
Таким образом, на данной стадии энергетический обмен осуществляется в основном за счет углеводов и липидов, обеспечивая адаптивную реакцию организма к действию токсиканта.
На 2-м этапе (фаза 2, стадия реагирования или нарастания ответа) при продолжении действия токсиканта инициируются процессы, направленные на компенсацию возникших нарушений, требующие значительных затрат энергии (Филенко, 2001, Миронюк и др., 2008). Так при более длительном воздействии купроксата отмечено постепенное возрастание активности аминотрансфераз в сыворотке крови морского ерша, что, очевидно, связано с интенсификацией энергетического обмена за счет включения дополнительных резервов белкового происхождения.
Когда объем деструктивных изменений выходит за пределы компенсаторного потенциала в системе опять преобладает дальнейшее возрастание проявлений токсикоза (фаза 3, стадия напряженности) (Филенко, 2001). В наших исследованиях снижение коэффициента де Ритиса на 3-и сутки эксперимента может быть связано с усилением нагрузки на печень как на основное место детоксикации ксенобиотиков.
Таблица Изменение активности ферментов в сыворотке крови морского ерша, содержащегося в среде с купроксатом (мкмоль/час·мл, M ± m, n= 5-7) Экспозиция, сутки Концентрация меди 1 2 Активность АлАТ Контроль 2,07 ± 0,22 2,48 ± 0,21 2,03 ± 0, 1 ПДК 0,72 ± 0,15* 1,91 ± 0,31 1,85 ± 0, 10 ПДК 1,33 ± 0,14* 1,73 ± 0,26 4,05 ± 0,69* 100 ПДК 2,57 ± 0,39 2,55 ± 0,16 1,95 ± 0, Активность АсАТ Контроль 1,64 ± 0,11 1,55 ± 0,21 1,72 ± 0, 1 ПДК 0,95 ± 0,05* 1,87 ± 0,57 2,82 ± 0,22* 10 ПДК 2,55 ± 0,27* 2,57 ± 0,48 2,49 ± 0, 100 ПДК 1,65 ± 0,30 1,48 ± 0,2 1,46 ± 0, Активность альдолазы Контроль 0,62 ± 0,08 0,71 ± 0,11 1,05 ± 0, 1 ПДК 0,56 ± 0,08 1,13 ± 0,15* 0,95 ± 0,14* 10 ПДК 1,14 ± 0,12* 0,47 ± 0,10 1,18 ± 0, 100 ПДК 1,32 ± 0,0.24* 1,09 ± 0,15* 0,81 ± 0, Активность щелочной фосфатазы Контроль 0,51±0,14 0,78 ± 0,26 0,40 ± 0, 1 ПДК 0,53 ± 0,10 0,57 ±0,18 0,19 ± 0,03** 10 ПДК 1,22 ± 0,23* 0,47 ± 0,06 0,66 ± 0, 100 ПДК 0,41 ± 0,10 0,29 ± 0,09 0,51 ± 0, Примечание: * - достоверные отличия значений активности фермента по отношению к контролю (р0,05);
** - достоверные отличия значений активности фермента по отношению к контролю (р0,01);
n – количество особей После прекращения действия купроксата и содержания рыб в чистой воде в течение 3-х суток не происходит полного восстановления параметров системы до исходного состояния, за исключением активности щелочной фосфатазы (табл. 8). Очевидно, несмотря на отсутствие токсиканта в среде, процессы, направленные на снижение негативного последствия данного воздействия, продолжаются и требуют значительных затрат энергии.
Таблица Изменение активности ферментов в сыворотке крови морского ерша после прекращения действия купроксата (мкмоль/час·мл, M ± m, n= 5-7) Экспозиция, сутки Концентрация меди 1 2 Активность АлАТ Контроль 2,46 ± 0, 1,16 ± 0, 2,72 ± 0, 1 ПДК 0,95 ± 0,13* 0,76 ± 0, 2,09 ± 0,01* 10 ПДК 1,06 ± 0,17* 1,52 ± 0, 2,38 ± 0, 100 ПДК 1,56 ± 0,10* 1,18 ± 0, 1,60 ± 0,23* Активность АсАТ Контроль 3,03 ± 0, 1,42 ± 0, 3,89 ± 0, 1 ПДК 0,73 ± 0,21* 1,03 ± 0, 4,61 ± 0, 10 ПДК 1,12 ± 0,25* 1,84 ± 0, 2,68 ± 0, 100 ПДК 1,65 ± 0,24* 1,46 ± 0, 2,15 ± 0,15* Активность альдолазы Контроль 0,84 ± 0,11 0,59 ± 0,13 0,62 ± 0, 1 ПДК 1,12 ± 0,23 0,74 ± 0,13 1,62 ± 0,15** 10 ПДК 0,93 ± 0,05 0,97 ± 0,09* 1,18 ± 0,07** 100 ПДК 0,56 ± 0,16 0,78 ± 0,16 1,21 ± 0,19* Активность щелочной фосфатазы Контроль 0,89 ± 0,05 0,88 ± 0,13 0,48 ± 0, 1 ПДК 1,34 ± 0,11* 0,37 ± 0,06* 0,37 ± 0, 10 ПДК 1,60 ± 0,28** 1,91 ± 0,50 1,34 ± 0, 100 ПДК 0,86 ± 0,14 0,28 ± 0,07** 0,46 ± 0, Примечание: * - достоверные отличия значений активности фермента по отношению к контролю (р0,05);
** - достоверные отличия значений активности фермента по отношению к контролю (р0,01);
n – количество особей В результате проведения модельного эксперимента установлено наличие четкой ответной реакции молекулярных параметров рыб на увеличение содержания меди в среде. Даже при достаточно низком уровне Cu в воде, который не вызывают значительного накопления элемента в тканях рыб, происходят изменения активности сывороточных ферментов, зависящие от времени воздействия и концентрации купроксата. Наличие высокой корреляционной связи между исследуемыми параметрами подтверждает данные, полученные в природных условиях.
Таким образом, результаты наших исследований могут иметь практическое значение и представляют интерес для разработки мониторинговых программ. Так оценка качества морской среды по состоянию ее обитателей позволяет получить адекватную информацию об уровне антропогенного воздействия, установить степень экологического риска, обосновать критерии загрязнения водоемов и определить систему мероприятий по восстановлению биоресурсов. Анализ с применением биохимических индикаторов может быть использован при обосновании ПДК, разработке технических регламентов и их применении, позволяя скорректировать хозяйственную деятельность человека в прибрежных акваториях.
ВЫВОДЫ Активность ферментов в сыворотке крови морского ерша 1.
характеризуется возрастными и половыми особенностями. Активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы максимальна у половозрелых особей, у стареющих рыб с паданием уровня метаболизма происходит ее снижение. Активность АлАТ и щелочной фосфатазы выше у самок, а АсАТ– у самцов. В условиях повышенной антропогенной нагрузки данные показатели снижаются.
Сывороточная АсАТ у морского ерша из обследуемого региона 2.
гетерогенна и представлена тремя электрофоретическими типами (быстрым, медленным и смешанным). Доминирует смешанный тип, которому соответствует наименьшая активность.
Активность АсАТ в сыворотке морского ерша возрастает летом, 3.
во время нереста, щелочной фосфатазы и альдолазы– весной, в преднерестовый период, снижение активности ферментов (за исключением АлАТ) происходит зимой.
Антропогенная нагрузка на морскую среду модифицирует 4.
ферментативную активность. У особей, обитающих в более загрязненной бухте, активность АлАТ выше летом, щелочной фосфатазы и альдолазы– зимой, в то же время значение коэффициента де Ритиса в данные периоды ниже по сравнению с таковым у рыб из менее загрязненного района.
Обнаружена сезонная зависимость между содержанием 5.
токсичных элементов в мышечной ткани морского ерша и активностью сывороточных ферментов, которая наиболее чувствительна к накоплению эссенциальных элементов – меди и цинка.
Не выявлены различия в накоплении меди в мышечной ткани 6.
ерша при экспонировании его в среде с медьсодержащим пестицидом купроксатом и после прекращения его действия.
Реакции сывороточных ферментов на действии малых 7.
концентраций купроксата имеют характерные фазы, зависящие от времени и концентрации пестицида и отражающие стадии адаптивного ответа, которые соответствуют классической картине адаптационного синдрома.
После прекращения действия купроксата не происходит полного 8.
восстановления исследуемых параметров до исходного состояния, за исключением активности щелочной фосфатазы. Это свидетельствует о необратимых изменениях молекулярных параметров рыб и требует пересмотра степени токсичности препарата.
Активность сывороточных ферментов, в частности 9.
аминотрансфераз, может быть использована в качестве индикаторов для оценки физиолого-биохимического статуса рыб и среды их обитания. При этом необходимо учитывать биологические особенности исследуемых объектов, возрастные, половые и сезонные вариации биохимических параметров.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Рощина О.В. Влияние естественных и антропогенных факторов 1.
на активность ферментов в сыворотке крови скорпены// Ученые записки ТНУ. Серия: Биология.– 2003.—Т. 16(55).– № 2.– С.152-156.
Рощина О. В. Влияние естественных и антропогенных факторов 2.
на активность ферментов в сыворотке крови скорпены// Актуальные вопросы современного естествознания. Тезисы Всеукраинской конференции молодых ученых (Симферополь, 11-13 апреля 2003г.).— Симферополь, 2003г. – 76 С.
Руднева И.И., Шевченко Н.Ф., Овен Л.С., Залевская И.Н., Шайда 3.
В.Г., Кузьминова Н.С., Скуратовская Е.Н., Вахтина Т.Б., Рощина О.В.
Биологический мониторинг прибрежных экосистем Черного моря// Тезисы докладов 2-го съезда токсикологов России (10-13 ноября 2003г., Москва).— Москва. – 2003г. – С. 227-228.
4. Roshina Olga V. Biochemical markers for evaluating the health of Black Sea fish within their annual life cycle// International Conference 30 th Pacem in Maribus (October 27-30, 2003, Kiev, Ukraine). – P. 121 -122.
Рощина О.В. Активность некоторых ферментов сыворотки крови 5.
черноморских рыб в течение годового цикла//Материалы первой международной конференции молодых ученых «Комплексные исследования биологических ресурсов южных морей и рек» (7-9 июля 2004 г., Астрахань).
– Астрахань: Издательство КапсНИРХ.– 2004.– С.169-172.
Руднева И.И., Рощина О.В., Васина О.Л. Активность некоторых 6.
ферментов сыворотки крови черноморского ерша в различные периоды годового цикла//Вісник Одеського національного університету.– Т.9.– Выпуск 5, 2004. Биология.– С. 111-114.
Рощина О. В. Биохимические маркеры при оценке 7.
физиологического состояния черноморских рыб в течение их годового цикла// Материалы международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (6-9 сентября 2004г., Петрозаводск). – Петрозаводск. – 2004. – С.117-118.
Руднева И.И., Залевская И.Н., Скуратовская Е.Н., Вахтина Т.Б., 8.
Рощина О.В. Динамика возрастных изменений активности некоторых ферментов крови рыб// Материалы IV международного симпозиума «Биологические механизмы старения» ()26-29 мая 2004г., Харьков).— Харьков. – 2004г. – С.25-26.
Вахтина Т.Б., Рощина О.В., Скуратовская Е.Н. Использование 9.
биохимических индикаторов рыб в биомониторинге прибрежной части черного моря// Заповедники Крыма: заповедное дело, биоразнообразие, экообразование. Материалы III научной конференции (22 апреля 2005г., Симферополь, Крым).– Ч. II. Зоология беспозвоночных. Зоология позвоночных. Экология.– Симферополь: КРА «Экология и мир».– 2005. – С.198-204.
10. Рощина О. В. Активность некоторых ферментов в сыворотке крови скорпены// Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация.:
Материалы II Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной им. И.И. Мечникова (28 марта – 1 апреля 2005г.). – Одесса, 2005. – C.148.
11. Рощина О. В. Ферменты сыворотки крови рыб как маркеры их физиологического состояния// Тезисы IV Всеукраинской научно практической конференции молодых ученых по проблемам Черного и Азовского морей «Понт Эвсинский- 2005» (24-27 мая 2005г.). – Севастополь, 2005 – 122-123 С.
12. - Рощина О.В. Поиск биомаркеров для оценки физиологического статуса рыб// Материалы международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (20-24 сентября 2005 г., Борок). – Борок. – 2005. – С.113-114.
13. Рощина О.В. Активность сывороточных АлАТ и АсАТ как показатель здоровья рыб в условиях антропогенного загрязнения// Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов – 2.
Расширенные материалы международной научно-практической конференции.– Борок-Москва.– 2007.– С. 222-224.
14. Рощина О.В. Активность сывороточных аминотрансфераз как показатель здоровья рыб в условиях антропогенного загрязнения// Рибне господарство України. – 2007. – № 6. – С. 31-33.
15. Рощина О.В. Оценка качества вод с помощью молекулярных индикаторов рыб// Современные проблемы морской инженерной экологии (изыскания, ОВОС, социально-экономические аспекты). Материалы межд.
научной конференции г. Ростов-на-Дону, 9-11 июня 2008г. – Ростов-на-Дону.
– 2008.– С. 217-220.
Рощина О.В. Применение сывороточных аминотрансфераз рыб 16.
для оценки экологического состояния акваторий// Современные проблемы гидробиологии. Перспективы, пути и методы решения– 2. Материалы международной научной конференции. Херсон, 26-29 августа 2008г.– Херсон.– 2008.–С. 374-378.
17. Рощина О.В. Влияние фунгицида купроксата на активность сывороточных аминотрансфераз морского ерша// Материалы III Всероссийской конференции по водной токсикологии, посвященной памяти Б.А. Флерова «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы», конференции по гидробиологии «Критерии оценки качества вод и методы нормирования антропогенной нагрузки», школы-семинара «Современные методы исследования и оценки качества вод, состояния водных организмов и экосистем в условиях антропогенной нагрузки», 11-16 ноября 2008г.– Борок.
– 2008.– Часть 2.– С. 136-139.
18. Руднева И.И., Рощина О.В., Омельченко С.О., Залевская И.Н.
Применение биоиндикаторов рыб для анализа сезонной динамики экологического состояния акваторий// Экологическая химия.– 2008.–17(3).– С. 24 – 29.
19. Руднева И.И., Рощина О.В. Оценка уровня антропогенного воздействия на морские экосистемы с помощью биоиндикаторов рыб// Вода и экология.–2008.– 2(35).–С. 30-38.
20. Рощина О.В., Руднева И.И. Анализ возрастной динамики сывороточных ферментов рыб для оценки экологического состояния среды их обитания// Экологические системы и приборы.– 2009.– № 8.– С. 18-22.
21. Рощина О.В., Руднева И.И. Оценка токсичности фунгицида купроксата с помощью биомаркеров рыб// Токсикологический вестник.– 2009.– № 4.– С 26-31.