Исследование морфо-функциональной реакции бактерий на различные воздействия с использованием атомно-силовой микроскопии
На правах рукописи
ВАСИЛЬЧЕНКО Алексей Сергеевич
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ БАКТЕРИЙ
НА РАЗЛИЧНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
03.02.03 – микробиология
Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пермь – 2012
2
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет» на кафедре микробиологии и в Центре коллективного пользования приборным оборудованием «Институт микро- и нанотехнологий»
доктор медицинских наук,
Научный руководитель:
профессор Дерябин Дмитрий Геннадьевич доктор биологических наук,
Официальные оппоненты:
профессор Карпунина Тамара Исаковна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Куюкина Мария Станиславовна ФБУН Государственный научный центр прикладной
Ведущая организация:
микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск
Защита состоится « 02 » марта 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342) 280 92
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://www.vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Автореферат разослан «01» февраля 2012г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования.
Микроскопические методы исследования явились условием для возникновения микробиологии [Antoni van Leeuwenhoek, 1673], а в дальнейшем продолжали играть важную роль в становлении и развитии данного раздела наук о жизни. Так использование световой микроскопии позволило получить представления о разнообразии микроорганизмов в организме человека и природных экосистемах, а также выделить среди них основные морфологические и тинкториальные варианты.
Следующим существенным прорывом явилось создание электронного микроскопа [Ruska, 1932], с использованием которого было описано тонкое строение микробных клеток, обозначенное термином «ультраструктура». Последние же достижения в данной области связаны с созданием туннельного микроскопа [Binnig et al, 1982], ознаменовавшего возникновение принципиально нового метода микроскопических исследований – сканирующей зондовой микроскопии.
Среди широкого спектра вариантов сканирующей зондовой микроскопии наиболее привлекательным для проведения микробиологических исследований стала атомно-силовая микроскопия – АСМ [Binnig et al., 1986], важным преимуществом которой является нетребовательность к электропроводности исследуемых образцов. При этом в основу АСМ положена регистрация силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и наноразмерным острием, располагающемся на конце упругой консоли (кантилевера).
Соответственно, отслеживание частоты и фазы колебаний кантилевера ведет к получению информации об изменении силы взаимодействия, а на ее основе – о трехмерной геометрии поверхности с нанометровым пространственным разрешением, а также о механических свойствах исследуемого объекта.
Указанные возможности позволили АСМ к началу XXI века занять существенную нишу в практике микробиологических исследований [Ignatov et al., 2004;
Dorobantu, Gray, 2010;
Dufrеne, 2011]. В частности, с ее использованием стало возможным изучение морфофункциональных особенностей одиночных бактериальных клеток [Stukalov et al., 2008] как в физиологически активном состоянии [Bolshakova et al., 2000], так и при воздействии различных факторов [Eaton et al., 2008]. При этом в ряде случаев АСМ существенно дополняла иные методы микробиологического исследования, а в других – позволяла получать абсолютно уникальную информацию о свойствах анализируемых объектов. С другой стороны, накапливающийся массив данных по этому вопросу свидетельствует и о возможных ограничениях или искажениях результатов АСМ [Eaton,West, 2010].
Сказанное позволяет рассматривать использование АСМ для исследования механизмов и последствий воздействия различных факторов биогенной и абиогенной природы на микробные клетки как актуальное направление развития современных микробиологических методов исследования. Одновременно прогресс в данном направлении предполагает необходимость оптимизации методических подходов к проведению атомно-силовой микроскопии биологических объектов.
Цель работы – исследование морфо-функциональной реакции бактериальных клеток на различные абиогенные и биотические воздействия с использованием метода атомно-силовой микроскопии.
Задачи исследования:
1. Стандартизация методических подходов к исследованию морфологических и механических характеристик бактериальных клеток с использованием атомно-силовой микроскопии.
2. Использование атомно-силовой микроскопии для исследования характера и последствий контакта бактериальных клеток с углеродными наноматериалами.
3. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфо функциональной реакции бактериальных клеток на воздействие антибиотиков микробного и животного происхождения.
Научная новизна.
Установлена вариативность морфологических и механических свойств бактериальных клеток при изменении относительной влажности окружающей среды (о.в.), при которой осуществляется подготовка препаратов для атомно-силовой микроскопии. Продемонстрирована относительная стабильность регистрируемых параметров грамположительного микроорганизма Bacillus cereus в широком диапазоне значений о.в., в то время как грамотрицательный микроорганизм Escherichia coli характеризуется выраженной реакцией размерных характеристик, шероховатости поверхности и механических свойств при изменении данного параметра. Определены диапазоны значений о.в., позволяющие получать воспроизводимые значения морфо-функциональных характеристик бактериальных клеток при проведении АСМ. Обосновано использование биополимерных пленок на основе агарозы в качестве стандарта эластичности при подготовке атомно-силового микроскопа к исследованию упруго-механических свойств бактериальных клеток.
С использованием АСМ визуализирован характер контакта бактериальных клеток с широким спектром углеродных наноматериалов, представленных одно- и многостенными нанотрубками, нановолокнами и С60-фуллеренами, в том числе функционализированных различными химическими группировками (аддендами).
Показано, что нанотрубки и нановолокна не имеют однозначной ориентации к бактериальной поверхности и не ведут к потере внутриклеточного содержимого, что регистрируется только в случае присутствия в их составе значительных количеств технологических (металлических) примесей. Установлено, что модификация С60-фуллеренов катионоидными, но не анионоидными аддендами существенно повышает степень их сродства к бактериальной поверхности, предположительно определяемого электростатическим взаимодействием между данными объектами.
С использованием АСМ оценена морфо-функциональная реакция бактериальных клеток с различным типом строения клеточной стенки на воздействие антибиотиков микробного и животного происхождения. При воздействии ампициллина зафиксировано формирование выраженной гетерогенности морфологических и механических свойств популяций E. coli и B. cereus, в том числе проявляющихся в нарушении процессов септирования и выраженной дезорганизации поверхностных клеточных структур.
Впервые методом АСМ проведен сравнительный анализ эффектов магаинина и экстракта тромбоцитов человека в отношении морфо-функциональных характеристик модельных микроорганизмов. Значительное сходство результатов действия названных антибиотиков животного происхождения на бактериальные клетки, оцененное с использованием АСМ, позволило отнести их к классу поро формирующих катионных антимикробных пептидов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Обоснована необходимость контроля относительной влажности среды при подготовке препаратов бактериальных клеток для исследования методом атомно силовой микроскопии. Предложенная инкубация образцов при относительной влажности 93 % позволяет минимизировать влияние процесса дегидратации на морфологические и механические параметры клеток, что наиболее значимо для грамотрицательных микроорганизмов.
Разработан алгоритм калибровки атомно-силового микроскопа для исследования упруго-механических свойств бактериальных клеток с использованием в качестве внутреннего стандарта эластичности полимерных пленок с содержанием 2 – 4% агарозы, приготовленных при контролируемых значениях о.в.
Полученные посредством АСМ данные о связи между морфологической организацией, характером функционализации углеродных наноматериалов и наличием обусловленных ими повреждений бактериальных клеток могут быть использованы при оценке потенциальной биотоксичности или антибактериальной активности подобных веществ.
Для оценки методом АСМ известных и вновь синтезируемых соединений, направленных на нарушение синтеза пептидогликана, рекомендовано использование грамположительных микроорганизмов. В свою очередь грамотрицательные бактерии представляются адекватными модельными объектами при оценке посредством АСМ биологической активности различных мембраноповреждающих факторов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Воспроизводимый анализ морфологических и механических свойств бактериальных клеток с использованием атомно-силовой микроскопии требует стандартизации процедуры пробоподготовки исследуемых препаратов с учетом относительной влажности среды, а также калибровки микроскопа с использованием пленок на основе различных концентраций агарозы.
2. Использование атомно-силовой микроскопии демонстрирует вариативный характер контакта углеродных нанотрубок с поверхностью бактериальных клеток, интенсивное повреждение микроорганизмов присутствующими в препаратах углеродных наноматериалов технологическими примесями, а также выраженное сродство к бактериальной поверхности катионоидного, но не анионоидного производного С60-фуллерена.
3. Атомно-силовая микроскопия свидетельствует о существовании межвидовых особенностей и внутрипопуляционной гетерогенности реагирования микроорганизмов на воздействие ампициллина и катионных антимикробных пептидов животного происхождения.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.
Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009 - 2010 годы)» (проект № 2.1.1/3770 «Оценка биологических эффектов углеродных наноматериалов методами биолюминесцентного анализа»), а также гранта РФФИ 08-04-13726 офи-ц «Разработка биолюминесцентной технологии количественного определения катионных антимикробных пептидов в биологических субстратах».
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы и публикации.
Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на XXII Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, 2008), Российской конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009), V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011).
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ и 2 в зарубежной печати.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы из 185 наименований отечественных и зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований.
При проведении исследований использовались бактерии Escherichia coli K TG1 и Bacillus cereus IP5832, выбранные в качестве модельных грамотрицательного и грамположительного микроорганизмов, соответственно. В зависимости от особенностей эксперимента их культивирование проводилось на LB-агаре или в LB бульоне («Sigma-Aldrich», США) при 37 С. Бактериальные клетки осаждались центрифугированием в течении 7-10 минут при 1000 g. Далее, бактериальная масса ресуспендировалась в дистиллированной воде и в объеме 15-20 мкл наносилась на скол слюды до частичного высыхания капли, после чего образцы помещались в эксикаторы на 18-24 часа. Для создания атмосферы с заданным уровнем относительной влажности использовались эксикаторы с насыщенными растворами солей: KNO3 (93 %), KCl (84 %), NaCl (75 %), NaNO2 (65 %), Mg(NO3)2 (53 %).
При проведении микроскопического этапа исследования использовался атомно-силовой микроскоп SMM-2000 («Протон-МИЭТ», Россия), работающий в режиме постоянного контакта. В процессе сканирования использовались кантилеверы MSCT-AUNM («Park Scientific Instruments», США) с жесткостью балки 0,01 Н/м и радиусом кривизны иглы порядка 30 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.
При выполнении фрагмента работы по калиброванию атомно-силового микроскопа с использованием агарозных пленок, в качестве исходного материала для их создания использовали химически чистую агарозу («Panreac», Испания), представляющую собой гетерополисахарид с ярко выраженным свойством гелеобразования. Для получения полимерных пленок готовили 2, 3 и 4 % расплавы агарозы в дистиллированной воде, которые в объеме 20 мкл наносили на подложку из слюды, после чего высушивали в течение 12 часов при температуре 20-24С и контролируемых значениях относительной влажности 53, 65 и 84 %.
Исследование упругих свойств исследуемых образцов проводилось с использованием АСМ в режиме силовой спектроскопии, при котором происходит снятие зависимостей прогиба кантилевера от расстояния между концом иглы и поверхностью образца. Получаемые в процессе измерений данные обрабатывались с последующим расчетом модуля Юнга по алгоритму описанному Salerno et al. [2006].
При исследовании взаимодействия бактериальных клеток с углеродным наноматериалами (УНМ) использованы два образца коммерчески доступных одностенных углеродных нанотрубок («НаноКарбЛаб», Россия), непосредственно изолированных из реакционной зоны (ОУНТ-1), а также их очищенные и укороченные варианты, содержащие 5-10 % концевых COOH-групп (ОУНТ-2). В свою очередь исследованные лабораторные образцы многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ), С60-фуллеренов, а также их производных, функционализированных карбоксильными и аминными группами были представлены препаратами, синтезированными в Институте проблем химической физики Российской Академии наук. Образец углеродных нановолокон (НВ) был любезно предоставлен профессором Э. Г. Раковым (Российский химико технологический университет им. Д.И. Менделеева).
Для создания суспензий УНМ их навески в количестве 2 мг (в случае нанотрубок и нановолокон) или 2·10-6 М (в случае фуллеренов) помещали в стеклянные емкости, вносили 1 мл дистиллированной воды, после чего в течение минут обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ» («Сапфир», Россия). Суспензии УНМ и модельных микроорганизмов смешивали в соотношении 1:4 в стеклянных емкостях с последующей инкубацией при 37°С в течение 60 мин. После этого из исходных суспензий УНМ, бактериальных клеток и их смесей готовились препараты для АСМ.
При исследовании эффектов ампициллина («Биохимик», Россия) его навески в количестве 5 мг растворяли в 5 мл LB-бульона, из которого готовили серии двукратных разведений с содержанием антибиотика от 1 мг/мл до 20 пг/мл.
Суспензию модельных микроорганизмов в объеме 5 мкл инокулировали в 2,5 мл LB-бульона с различным содержанием ампициллина, после чего инкубировали в течение 18-24 часов. Определенные суббактериостатические концентрации ампициллина составили 7,8 мкг/мл для E.coli и 0,1 нг/мл для B.cereus. Выращенные в присутствии суббактериостатических концентраций антибиотика (опыт) и в его отсутствии (контроль) микроорганизмы отмывали центрифугированием в течении 10 минут при 1000 g в дистиллированной воде, после чего готовили препараты для АСМ.
Исследование действия антибиотиков животного происхождения на модельные микроорганизмы осуществлялось с использованием коммерчески доступного препарата магаинина 2 («Anaspec Inc.», США) и экстракта тромбоцитов человека (ЭТЧ), лабораторный образец которого был любезно предоставлен Ю.Б.
Ивановым (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург). Для каждого из исследуемых препаратов использование культурального метода позволило рассчитать величины LD 50, в отношении E.coli равные 50 мкг/мл для магаинина 2 и 78 мкг/мл для ЭТЧ. Указанные действующие концентрации использовались при проведении дальнейших исследований, при этом клетки B.cereus обрабатывались аналогичными дозами антибиотиков. После 30 минутной экспозиции в контакте с исследуемыми препаратами катионных антимикробных пептидов клетки E. coli и B.cereus осаждались центрифугированием и дважды отмывались дистиллированной водой, после чего из суспензии бактерий готовились препараты для АСМ.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием модульной программы анализа и обработки данных AttеStat (версия 9.7.2) работающей в среде MS Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проведение атомно-силовой микроскопии бактериальных клеток с воспроизводимым определением их морфологических и упруго-механических свойств требует унификации подходов к пробоподготовке исследуемых образцов, а также проведения стандартной калибровки используемого оборудования.
В этой связи на первом этапе работы с использованием атомно-силовой микроскопии было подробно оценено влияние относительной влажности среды при пробоподготовке препаратов для АСМ на морфологические и механические параметры бактерий.
Полученные результаты свидетельствовали о том, что в диапазоне о.в. 93-75 % длина, ширина, высота и расчетные параметры (периметр, площадь сечения и объем) клеток E.coli и B.cereus были относительно стабильны (таблица 1).
Значимые изменения названных величин наблюдались только при снижении уровня о.в. до 65 %, что вело к уменьшению ширины, а также некоторых других размерных характеристик модельных микроорганизмов.
В свою очередь, анализ шероховатости (Rq) поверхности E.coli и B.cereus выявил, что на ультраструктурном уровне грамотрицательные бактерии при различных значениях о.в. являются значительно более лабильными, чем грамположительные (рис. 1). Так ступенчатое снижение о.в. сопровождалось прогрессирующим увеличением среднеквадратичной шероховатости поверхности бактерий E. coli с 1,7 до 3,4 нм. В случае B. cereus Rq изменялась в узком диапазоне 1,6-1,9 нм.
Таблица Морфологические параметры модельных микроорганизмов, подготовленных для АСМ при различных значениях относительной влажности Штамм о.в. Морфологические характеристики (%) Длина Ширина Высота Периметр Площадь Объем (мкм) (мкм ) (мкм) сечения сечения (мкм) (мкм) (мкм) 93 2,46±0,35 1,25±0,26 0,20±0,02 2,28±0,40 0,20±0,04 0,48±0, 84 2,13±0,33 1,27±0,12 0,20±0,03 2,31±0,19 0,20±0,03 0,42±0, E.coli K 12 TG 75 2,35±0,40 1,27 ±0,17 0,20±0,03 2,31±0,27 0,20±0,04 0,47±0, 65 2,30±0,57 1,10±0,19* 0,21±0,04 2,06±0,32 0,18±0,05 0,42±0, 93 2,97±0,51 1,08±0,10 0,28±0,03 2,14±0,19 0,24±0,04 0,71±0, 84 2,93±0,32 1,09±0,11 0,28±0,02 2,15±0,16 0,24±0,03 0,70±0, B.cereus IP 75 2,89±0,51 1,04±0,05 0,27±0,07 2,06±0,11 0,22±0,03 0,64±0, 65 2,85±0,60 0,96±0,12* 0,27±0,06 1,93±0,20* 0,20±0,04* 0,58±0,18* * - P0,05 (ранговый знаковый критерий Уилкоксона);
± стандартное отклонение.
Другой важной характеристикой бактериальных клеток, также потенциально варьирующей при изменении относительной влажности, являются их механические свойства. При этом количественное исследование данного параметра потребовало предварительной настройки и калибровки оптико-механической системы обратной связи микроскопа, для чего на следующем этапе работы в качестве внутреннего стандарта эластичности была оценена возможность использования полимерных пленок агарозы.
Рисунок 1 – Среднеквадратичная шероховатость (Rq) поверхности E. coli (А) и B. cereus (Б) при различных значениях о.в Полученные с использованием АСМ серии изображений поверхности и краевой области агарозных пленок (рис. 2 А) позволили оценить толщину сформированных образцов величиной около 1 мкм, что в заданных условиях эксперимента полностью исключало влияние свойств подложки на последующее измерение их упругих свойств. В свою очередь, основанный на обработке силовых кривых расчет модуля Юнга свидетельствовал о зависимости данного параметра как от концентрации агарозы в пленке, так и от значений относительной влажности, при которой осуществлялось ее формирование.
Повышение концентрации агарозы сопровождалось пропорциональным повышением значений модуля Юнга, предположительно объясняемым увеличением числа поперечных сшивок в структуре формируемого геля, что усиливало его сопротивление при продавливании зондом микроскопа.
Рисунок 2 – АСМ-изображение краевого участка пленки агарозы и профиль поверхности (А);
а также упругие свойства пленок на основе различных концентраций агарозы (при о.в. 53 %;
Б) и относительной влажности ее формирования (на примере 2 % агарозы;
В).
В частности, экспериментально зарегистрированные значения упругости пленки на основе 2% агарозы составили 2,31±0,44 МПа, в то время как увеличение ее концентрации до 3 и 4% вело к росту значений модуля Юнга до 4,66±1,14 МПа и 6,46±1,61 МПа, соответственно (рис. 2 Б).
Изменение относительной влажности среды, при которой происходило формирование пленок агарозы, также оказывало существенное влияние на их итоговые механические свойства (рис. 2 В). При этом исследование пленок на основе 2% агарозы свидетельствовало о том, что увеличение значений о.в. вело к прогрессирующему снижению регистрируемых значений модуля Юнга как следствия гидратации гелевой матрицы. В частности, возрастание относительной влажности среды с 53 до 65 % вело к снижению жесткости агарозной пленки с 2,31±0,44 МПа до 1,74±0,24 МПа, а дальнейшее увеличение о.в. среды снижало модуль Юнга до минимального значения 0,81±0,10 МПа.
При этом полученные значения упругих свойств пленок агарозы находились в характерном для бактериальных клеток диапазоне значений [Perry et al, 2009;
Vadillo-Rodrguez et al., 2011], что свидетельствует в пользу адекватности использования полимерных пленок с подобранными концентрациями агарозы для подготовки атомно-силового микроскопа к исследованию механических свойств микроорганизмов.
В свою очередь использование откалиброванного подобным образом прибора позволило оценить влияние фактора о.в. среды на механические параметры микроорганизмов. При этом была подтверждена взаимосвязь механических свойств микробных клеток и значений о.в. среды, а также установлен неоднозначный характер их реагирования зависимости от особенностей организации клеточной стенки. В частности, для клеток E.coli скачок изменения механических свойств (с 3,44±0,35 МПа до 5,05±0,70 МПа) был достигнут при снижении о.в. до 84 %, после чего дальнейшая дегидратация не вела к значимым изменениям данного параметра. В противоположность этому, клетки B.cereus демонстрировали устойчивое сохранение упругих свойств в диапазоне 7,87±0,92 МПа вплоть до 75 % о.в., значимо увеличивая данный параметр до 9,35±1,01 МПа только при о.в. 65 %.
Таким образом, полученные результаты позволили обосновать необходимость контроля значений относительной влажности при пробоподготовке исследуемых образцов бактериальных клеток, способной оказать существенное влияние на их измеряемые морфо-функциональные характеристики, что более значимо для E. coli по сравнению с B. сereus, не требующего четкой стандартизации данного параметра.
С соблюдением указанных условий на следующем этапе работы метод АСМ был использован для исследования характера и последствий взаимодействия бактериальных клеток с различными по организации и характеру функционализации углеродными наноматериалами.
Первоначально использование метода АСМ позволило детально охарактеризовать морфологические особенности каждого из использованных при проведении настоящего исследования образцов УНМ. Так препарат ОУНТ-1, полученный непосредственно из реакционной зоны, представлял собой достаточно гетерогенный образец, в котором до 40 % составляли удлиненные образования, размерные характеристики которых (диаметр 7,3±4,4 нм) позволили аналогизировать их с одностенными углеродными нанотрубками. Помимо этого до 60 % образца было представлено объектами без характерных морфологических особенностей, имеющими размер от 20 нм до 2 мкм и предположительно являющимися фрагментами использованных в технологии производства ОУНТ металлических катализаторов или их смесей. В свою очередь препарат ОУНТ-2 был представлен нанотрубками длиной 0,5-1,0 мкм с одновременным содержанием не более 20-30 % неструктурированных частиц (рис. 3 А). Представленный на рис. 3 Б препарат МУНТ включал сходное количество аморфных образований, находящихся в пространственной связи с углеродными нанотрубками, в данном случае имеющими значительно больший диаметр 16,3±10,5 нм. Образец нановолокон представлял собой достаточно гомогенный препарат, содержащий скрученные лентовидные объекты шириной 101,58±23,32 нм (рис. 3 В). Наконец, использованные препараты С60-фуллеренов и их производных (рис. 3 Г), были представлены округлыми образованиями диаметром от 20 до 240 нм (в среднем 40,9±52,7 нм), предположительно являющимися нанокластерами состава n C60, при отсутствии детектируемых количеств аморфного углерода или иных примесей.
Рисунок 3 – АСМ-изображения одностенных укороченных (А) и многостенных нанотрубок (Б);
нановолокон (В);
С60-фуллеренов (Г). Шкала – 500 нм.
Использование атомно-силовой микроскопии для регистрации факта контакта каждого их исследованных углеродных наноматериалов с бактериальными клетками, описания характера подобного взаимодействия и его последствий для микроорганизма позволило зафиксировать разнообразные эффекты УНМ.
Достаточно детально отдельные параметры контакта были документированы в случае взаимодействия препарата ОУНТ-2 с клетками E. coli. Так 64,5±17,4 % присутствующих в нем укороченных одностенных углеродных нанотрубок формировали пространственный контакт с клетками E. coli, оставаясь в качестве свободного компонента суспензии в 35,5±17,6 % случаев. Возникающие же при этом взаимодействия оказывались достаточно разнообразны и варьировали от параллельного до перпендикулярного поверхности модельного микроорганизма расположения ОУНТ-2 (рис. 4 А). При этом проведенный морфометрический анализ не позволил выявить какой-либо преимущественной ориентации нанотрубок, оцениваемой углом контакта их концевых участков с клеточной поверхностью и свидетельствующей о достаточно вероятностном характере подобных событий. В частности, 38,2±18,0 % укороченных одностенных углеродных нанотрубок, установивших контакт с поверхностью E. coli, располагались к ней по касательной или под углом от 0 до 25, в то время как перпендикулярно поверхности или под углом от 65 до 90 находилось до 23,9±12,1 % от визуализированных ОУНТ-2 (рис.
4 Б).
Сходная картина была зарегистрирована и при исследовании взаимодействия модельных микроорганизмов с препаратами многостенных углеродных нанотрубок и нановолокон, вновь не выявившем избирательности формирующихся контактов и свидетельствующем о вероятностном характере расположения МУНТ и НВ относительно поверхности E. coli.
В свою очередь, морфометрия самих бактериальных клеток после контакта с ОУНТ-2, МУНТ и НВ, не позволила зафиксировать достоверных изменений их размерных свойств по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствовало об отсутствии повреждающего действия названных УНМ.
Иной характер контакта и его последствий были установлены при исследовании взаимодействия бактериальных клеток с препаратом одностенных углеродных нанотрубок ОУНТ-1, характеризующимся низкой степенью очистки от технологических примесей.
Рисунок 4 - АСМ-изображение пространственных контактов укороченных одностенных нанотрубок с клетками E. coli (А). Результаты статистического анализа угла контакта ОУНТ-2 с поверхностью бактериальных клеток (Б). Шкала – 500 нм.
При этом проведенная визуализация не выявила контакта клеток E. coli с какими-либо удлиненными структурами, которые на основе своих морфологических характеристик могли бы быть идентифицированы как нанотрубки. С другой стороны, на поверхности модельных микроорганизмов детектировалось появление образований неправильной формы размером от 111 и до 250 нм (средний диаметр 202,4±69,7 нм), в ряде случаев интегрируемых под наружную мембрану (рис. 5А, Б).
В свою очередь, итоговым результатом подобного взаимодействия являлось излитие части клеточного содержимого в окружающую среду, что сопровождалось значимыми изменениями размерных и упруго-механических характеристик модельных микроорганизмов. Так клетки E. coli инкубированные в контакте с ОУНТ-1 имели свободные от внутриклеточного содержимого уплощенные фрагменты, а также характеризовались сниженными на 12 % значениями высоты (P0,05). Следствием потери внутриклеточного содержимого являлось и значимое снижение упругих свойств с 1,09±0,14 (в контроле) до 0,06±0,01 МПа (рис. 5 В).
Таким образом, полученные методом АСМ результаты позволили констатировать повреждение поверхностных структур бактериальных клеток при их контакте с препаратом ОУНТ-1, но не связанное с собственной биологической активностью наноуглерода. Ограничение метода АСМ в данном случае связано с его неспособностью к более детальной характеристике образований, установивших контакт с поверхностью модельного микроорганизма. При этом, наиболее вероятным вариантом является их отнесение к частицам металлических катализаторов, использованных при синтезе нанотрубок, что и было показано в отдельной серии экспериментов с использованием масс-спектрального и атомно эмиссионного методов.
Рисунок 5 - АСМ-изображение клеток E. coli (А), профиля их сечения (Б) и диаграмма упругих свойств бактерий (В) инкубированных в контакте с препаратом ОУНТ-1.
Обозначения: 1 – частица, расположенная на поверхности бактериальной клетки;
2 – частица, интегрированная под наружную мембрану;
3 – фрагмент клетки, свободный от внутриклеточного содержимого;
4 – зона излития внутриклеточного содержимого во внешнюю среду. Шкала – мкм.
В свою очередь, исследование производных С60-фуллерена, имеющих не менее 99 % степень очистки от технологических примесей, позволило констатировать зависимость вероятности их контакта с поверхностью модельных микроорганизмов от характера проведенной функционализации.
Так выполненное АСМ-исследование свидетельствовало об интенсивном взаимодействии с клетками E. coli тетрааминофуллерена, в результате присоединения четырех диссоциирующих аддендов приобретшего высокую водорастворимость и катионоидные свойства. При этом следствием вероятного электростатического взаимодействия данного соединения с отрицательно заряженной поверхностью E. coli стало появление на ней характерной «зернистости» из наночастиц диаметром 33,6±24,0 нм (рис. 6 А), что сопровождалось статистически достоверными изменениями длины, ширины и высоты клеток, но без признаков излития их содержимого во внешнюю среду. При этом о высоком сродстве частиц С60-фуллерена к поверхности модельного микроорганизма говорит и тот факт, что 96,8 % из них формировали пространственный контакт с клетками E. coli, оставаясь в качестве свободного компонента суспензии лишь в 3,2 % случаев.
Рисунок 6 – АСМ-изображения и профили сечения клеток E. coli, инкубированных в контакте с катионоидными (А) и анионоидными (Б) производными С60-фуллерена. Шкала – мкм.
В свою очередь, функционализация С60-фуллерена пятью карбоксильными аддендами, ведущая к формированию у него анионоидных свойств, полностью исключала контакт с клетками E. coli (рис. 6 Б).
Таким образом, полученные результаты АСМ-исследования позволяют констатировать, что характер биологических эффектов, проявляемых препаратами углеродных наноматериалов в отношении модельных микроорганизмов, с одной стороны определяется наличием в их составе технологических металлических примесей, ведущих к повреждению барьерных структур бактериальных клеток. С другой стороны, важным фактором является характер функционализации УНМ, в значительной степени изменяющей их сродство к бактериальным клеткам – мишеням.
Задачей третьего этапа работы стало исследование особенностей морфо функциональной реакции бактерий на воздействие антибиотиков различного происхождения и механизмов действия. В качестве таковых были использованы ампициллин (антибиотик микробного происхождения, нарушающий синтез пептидогликана) и катионные антимикробные пептиды (антибиотики животного происхождения) взаимодействующие с мембранными структурами бактериальных клеток – мишеней.
Таблица Морфологические параметры модельных микроорганизмов, выращенных в контакте с суббактериостатическими концентрациями ампициллина Морфологические характеристики клеток Исследуемые Длина Ширина Высота Площадь Объем Штамм группы сечения (мкм 3) (мкм) (мкм) (мкм) (мкм ) Контроль 2,46±0,34 1,24±0,27 0,20±0,03 0,20±0,07 0,48±0, E. coli Объекты 1 типа 3,40±0,72 1,00±0,34 0,20±0,02 0,16±0,06 ** 0,54±0, K 12 TG Объекты 2 типа 18,52±8,66** 1,30 ±0,19 0,21±0,03 0,21±0,05 3,88±2,18** Объекты 3 типа 11,87±8,01** 1,42±0,20 ** 0,08±0,03** 0,09±0,03** 1,07±0,83** Контроль 4,40±0,94 1,53±0,39 0,47±0,06 0,57±0,17 2,50±0, B. cereus Объекты 1 типа 2,59±0,59 ** 3,04±0,72 ** 0,88±0,18** 2,14±0,82** 5,55±2,72** IP Объекты 2 типа 3,54±0,80 ** 2,32±0,61 ** 0,37±0,09** 0,68±0,30 2,40±1,45* *- Р 0,05;
**-P0,01 (ранговый знаковый критерий Уилкоксона);
± стандартное отклонение.
АСМ-исследование морфологических и упруго-механических свойств клеток E. coli (таблица 2), выросших в присутствии суббактериостатической концентрации ампициллина, выявило выраженную гетерогенность бактериальной популяции по характеру ее реагирования на подобное воздействие (рис. 7 А, Б).
Так 92,04±4,3% клеток (на рис. 7 А и в таблице 2 обозначены как объекты 1-го типа) в значительной степени сохраняли свою морфологию, по сравнению с интактными микроорганизмами, оказываясь менее широкими (1,00±0,34 мкм;
P0,01), но удлиненными до 3,40±0,72 мкм (P0,01) образованиями, в результате чего несколько увеличивающими свой объем до 0,54±0,23 мкм3. При этом возможной причиной зарегистрированных изменений могло являться «растягивающее» действие внутреннего осмотического давления на клеточную стенку, снизившую свою ригидность под действием ампициллина. Этим же может объясняться и более низкая остаточная упругость инкубированных в контакте с антибиотиком клеток E. coli, в данном случае характеризуемая величиной 2,03±1, МПа, против 2,74±1,79 МПа в контроле. В то же время, шероховатость подобных объектов (Rq =2,06±0,56 нм) существенно не отличалась от контрольных величин (Rq =2,26±0,59 нм), что может быть объяснено отсутствием молекулярных мишеней для ампициллина на наружной мембране исследуемого грамотрицательного микроорганизма.
На этом фоне до 7,96±4,3% визуализированных клеток E. coli было представлено аномально удлиненными образованиями с признаками нарушения септирования (на рис. 7 А и в таблице 2 обозначены как объекты 2-го типа). В данном случае при относительной неизменности ширины и высоты, их длина (18,52±8,66 мкм) и объем (3,88±2,18 мкм3) в 6,7-7,7 раз превышали таковые в контроле (P0,01). При этом природа зарегистрированных изменений может быть обусловлена высоким сродством ампициллина к пенициллин-связывающему белку типа, контролирующему процесс формирования межклеточных перегородок при делении клеток E. coli.
Рисунок 7 - АСМ-изображения клеток E. coli (А, Б) и B. cereus (В, Г), инкубированных в контакте с суббактериостатическими концентрациями ампициллина. Шкала – 2 мкм.
Наконец, еще одним проявлением гетерогенности популяции E. coli при воздействии ампициллина являлись обнаруживаемые на единичных сканах структуры, на рис. 7 Б и в таблице 2 обозначенные как объекты 3-го типа. При проведении АСМ они визуализировались в виде заполненных гранулярным материалом уплощенных образований, по высоте (0,08±0,03 мкм;
P0,01) и площади сечения (0,09±0,03 мкм2;
P0,01) более чем в два раза уступающих сохранившим свою целостность бактериальным клеткам. Кроме того, их дополнительными особенностями являлись значительно более высокие показатели шероховатости (13,32±4,85 нм;
P0,01), а также характеризуемая модулем Юнга выраженная жесткость (6,66±5,11 МПа;
P0,01), что позволяло предполагать утрату данными структурами жидкой фракции цитоплазматического содержимого. При этом значительная длина объектов 3-го типа свидетельствовала в пользу их происхождении от описанных выше аномально удлиненных клеток, имеющих нарушение процесса септирования при воздействии ампициллина.
Иной, но не менее выраженной при культивировании в контакте с суббактериостатической концентрацией ампициллина, оказывалась и гетерогенность популяции B. cereus. При этом клетки, находящиеся в одной микроколонии могли быть представлены как частично сохранившими свою морфологию удлиненными палочковидными формами, так и существенно изменившими ее клетками, форма которых стремилась к шаровидной (на рис. 7 В и в таблице 2 обозначены как объекты 1-го типа). С использованием АСМ у них зарегистрировано достоверное уменьшение длины (до 2,59±0,59 мкм;
P0,01) при одновременном увеличении ширины и высоты до 3,04±0,72 мкм и 0,88±0,18 мкм соответственно (P0,01), что обуславливало выраженное увеличение величин площади сечения и объема подобных объектов, более чем в два раза превысивших таковые у интактных клеток. При этом в качестве возможной причины подобных изменений вновь может быть названо растяжение изменившей свою ригидность клеточной стенки под действием внутреннего осмотического давления.
Другой особенностью эффекта ампициллина на клетки B. cereus явилось существенное изменение показателя шероховатости поверхности, объясняемое экспонированием на ней основной мишени для действия данного антибиотика. При этом обусловленное воздействием ампициллина нарушение трехмерной пространственной организации пептидогликана результировалось в более чем трехкратном увеличении шероховатости клеток B. cereus (до 8,72±2,66 нм, против 2,71±0,75 нм в контроле, P0,01). Кроме того, на тех же изображениях (рис. 7 Г) до 45,37±22,6% клеток, обозначены как объекты 2-го типа, визуализировались в виде уплощенные до 0,37±0,09 мкм (P0,01) образований со сниженными упруго механическими свойствами, что позволяло оценивать их как структуры, утратившие значительную часть внутриклеточного содержимого. При этом дополнительными особенностями подобных объектов являлась еще более выраженная шероховатость поверхности (11,37±3,54 нм;
P0,01), сопровождающаяся расположением вокруг них гранулярных структур размером 261,2±139,0 нм, предположительно представляющих собой фрагменты пептидогликана, освобожденные во внешнюю среду при нарушении целостности клеточной стенки.
Предметом следующего фрагмента работы стало АСМ-исследование биологических эффектов катионных антимикробных пептидов (КАМП) – антибиотиков животного происхождения, механизм действия которых предполагает взаимодействие с поверхностными структурами бактериальных клеток. При этом действие малоизученного препарата экстракта тромбоцитов человека (ЭТЧ) оценивалось в сравнительном аспекте с аналогичной активностью магаинина 2 – катионного антимикробного пептида, особенности биологической активности которого к настоящему времени хорошо охарактеризованы [Meincken et al., 2005].
Проведенное АСМ-исследование E. coli, инкубированных в контакте с препаратами КАМП, в первую очередь позволило визуализировать наличие уплощений на апикальных частях клеток (рис. 8 А, Г), что было выявлено у 76,19 % бактерий обработанных магаинином 2 и у 89,44 % после воздействия ЭТЧ.
Изменение общей морфологии модельного грамотрицательного микроорганизмапри воздействии магаинина 2 и ЭТЧ также включало увеличение ширины и уменьшение высоты бактериальных клеток.
Рисунок 8. – АСМ-изображения клеток E. coli (A, Г), их клеточной поверхности (Б, Д) и гистограмма распределения ширины пороподобных повреждений при действии магаинина 2 (A, Б, B) и экстракта тромбоцитов человека (Г, Д, Е). Шкала: 1 мкм (А, Г);
250 нм (Б, Д).
Кроме того, в отношении обработанных ЭТЧ клеток дополнительно зафиксировано уменьшение их площади сечения и объема (таблица 3).
Последующее более детальное АСМ-исследование поверхности клеток E. coli (рис. 8 Б, Д, соответственно), позволило зафиксировать пороподобные повреждения наружной мембраны, ранее описанные в качестве характерной особенности действия магаинина 2 [Imura et al., 2008].
Таблица Морфологические параметры модельных микроорганизмов, инкубированных в контакте с катионными антимикробными пептидами Штамм Группы Морфологические характеристики клеток сравнения Длина Ширина Высота Площадь Объем Rq сечения (мкм) (мкм) (мкм) (мкм) (нм) (мкм) Контроль 2,71±0,67 1,33±0,18 0,25±0,03 0,26±0,05 0,70±0,23 2,01±0, Действие E. coli 2,68±0,40 1,48±0,23** 0,20±0,04** 0,24±0,07 0,68 ±0,21 5,03±1,01** K12 TG1 магаинина Действие 2,64±0,66 1,38±0,23 0,21±0,04** 0,22±0,06* 0,59 ±0,21** 5,73±2,24** ЭТЧ Контроль 3,65±0,98 1,33±0,19 0,34±0,06 0,35±0,08 1,29±0,44 0,98±0, B. cereus Действие 3,66±1,11 1,31±0,30 0,27±0,01** 0,28±0,12** 0,99±0,50* 4,15±1,78** магаинина IP Действие 3,59±1,10 1,42±0,24* 0,31±0,14* 0,33±0,12 1,24±0,70 4,88±1,73** ЭТЧ * - P0,05;
** - P0,01 (ранговый знаковый критерий Уилкоксона);
± стандартное отклонение.
При этом, сходство подобных изменений как в случае воздействия магаинина 2, так и ЭТЧ, позволило подтвердить принадлежность последнего к классу катионных антимикробных пептидов, а также детализировать механизмы его биологической активности.
Так средний диаметр поровых комплексов при использовании ЭТЧ, равный 165,96±62,75 нм, оказывался существенно больше, чем в случае действия магаинина 2 (39,74±15,64 нм) (рис. 8 В, Е), следствием чего стали и различия значений среднеквадратичной шероховатости поверхности клеток после воздействия исследуемых препаратов. В частности, если действие магаинина 2 вело к увеличению параметра шероховатости на 150 % (Rq=5,03±1,01нм), то в случае ЭТЧ уже на 185% (Rq=5,73±2,24нм) в сравнении с контрольными клетками (Rq=2,01±0, нм). В свою очередь исследование упруго-механических свойств E. coli зафиксировало сходное снижение значений модуля Юнга: на 25,89 % при воздействии магаинина 2 и на 25,50 % при воздействии ЭТЧ.
В случае B. cereus проведенная АСМ визуализация не выявила характерных особенностей действия исследуемых КАМП на данный грамположительный микроорганизм, популяция которого, однако, вновь оказывалась неоднородной. Так большая часть клеток (75,96% и 66,40% от общего количества обработанных магаинином 2 и ЭТЧ, соответственно) не имели выраженных морфологических отличий от интактных бактерий контрольной группы. В тоже время в оставшейся части обработанной КАМП бактериальной популяции, АСМ зафиксировала снижение высоты и уменьшение объема клеток с одновременным увеличением их ширины (таблица 3). Детальное исследование поверхности клеток B. cereus, обработанных магаинином 2 и ЭТЧ, на этот раз не позволило зафиксировать каких либо характерных повреждений, раскрывающих особенности биологической активности названных антибиотиков в отношении грамположительных бактерий.
Тем не менее, шероховатость их поверхности оказалась в 4-6 раз больше, чем у контрольных микроорганизмов. Дополнительной особенностью опытного воздействия стало снижение значений модуля Юнга на 41,44% при воздействии магаинина 2 и на 64,18% при действии ЭТЧ в сравнении с контрольными клетками, что также соответствовало аналогичным данным, полученным для E. coli.
Таким образом, использование атомно-силовой микроскопии позволило детально охарактеризовать гетерогенность популяции E. coli и B. cereus после контакта с ампициллином или КАМП, а также оценить спектр изменений морфологических и механических свойств бактериальных клеток при подобном воздействии. При этом, полученные результаты, свидетельствуют в пользу необходимости выбора адекватного модельного объекта для АСМ-исследования веществ с различными механизмами действия. В частности, в случае тестирования факторов направленных на нарушение структуры пептидогикана, для этой цели могут быть рекомендованы грамположительные микроорганизмы. С другой стороны, грамотрицательные бактерии представляются подходящими модельными объектами для оценки посредством АСМ-исследования веществ с потенциальным мембраноповреждающим механизмом действия.
ВЫВОДЫ 1. Выявлена чувствительность морфологических и механических свойств клеток грамотрицательного микроорганизма Escherichia coli к изменениям относительной влажности (о.в.) при подготовке препаратов для атомно-силовой микроскопии (АСМ), что явилось основанием для стандартизации данного параметра на уровне 93% о.в. В свою очередь относительная стабильность морфологических и механических свойств клеток грамположительного микроорганизма Bacillus cereus при изменении относительной влажности позволила проводить подготовку препаратов для АСМ в диапазоне 75-93 % о.в.
2. При проведении исследования механических свойств биологических объектов с использованием АСМ обосновано использование внутреннего стандарта эластичности, в качестве которого предложены полимерные пленки с различным содержанием агарозы.
3. С использованием АСМ визуализирован характер контакта микроорганизмов с углеродными нанотрубками и нановолокнами, заключающийся в их вероятностной ориентации относительно клеточной поверхности. Выраженные изменения структуры микробных клеток с признаками излития внутриклеточного содержимого зафиксированы только при их взаимодействии с морфологически отличными от нанотрубок частицами, относящимися к технологическим (металлическим) примесям.
4. Показано, что модификация С60-фуллеренов катионоидными, но не анионоидными аддендами повышает степень их сродства к микробным клеткам, что с использованием АСМ визуализируется как формирование наноразмерных кластеров на бактериальной поверхности.
5. Методом АСМ зафиксирована гетерогенность морфологических и механических свойств клеток в популяциях Escherichia coli и Bacillus cereus при воздействии ампициллина. Показано, что у грамотрицательных бактерий данный антибиотик ведет к элонгации клеток и появлению аномально удлиненных форм с признаками нарушения септирования, а у грамположительных микроорганизмов к выраженной дезорганизации поверхностных структур.
6. С использованием АСМ визуализированы пороподобные повреждения наружной мембраны грамотрицательных бактерий при воздействии магаинина 2 и экстракта тромбоцитов человека, свидетельствующие о существенном сходстве механизмов биологической активности данных катионных антимикробных пептидов.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ * и зарубежной печати 1. Nikiyan H.N., Vasilchenko A.S., Deryabin D.G. Humidity-dependent bacterial cells functional morphometry investigations using atomic force microscope // International Journal of Microbiology. – 2010. - doi:10.1155/2010/704170.
2.* Дерябин Д.Г., Васильченко А.С., Алешина Е.С., Тлягулова А.С., Никиян А.Н. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии // Российские нанотехнологии. – 2010. – Т.5. (11-12). – С. 103-108.
3. Nikiyan H., Vasilchenko A., Deryabin D. AFM investigations of various disturbing factors on bacterial cells // Microscopy: science, technology, applications and education (Microscopy book series – ISBN (13). 978-84-614-6189-9). – 2010. – №4. – V.1– P. 523-529.
4.* Васильченко А.С. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфофункциональной реакции бактерий на различные воздействия // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2011. - № 4/1. – С.24.
5.* Дерябин Д.Г., Васильченко А.С., Никиян А.Н. Исследование воздействия ампициллина на морфологические и механические свойства клеток Escherichia coli и Bacillus cereus с использованием метода атомно-силовой микроскопии // Антибиотики и химиотерапия. – 2011. - № 7-8. – С.7-12.
6.* Васильченко А.С., Никиян А.Н., Дерябин Д.Г. Использование пленок на основе агарозы в качестве модельных структур для подготовки атомно-силового микроскопа к исследованию упругих свойств бактериальных клеток // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2011. – № 12. – С. 324-326.
Публикации в других журналах и сборниках 1. Никиян А.Н., Васильченко А.С. Атомно-силовая микроскопия как метод морфометрического анализа бактериальных клеток // Материалы XXII Всероссийской конференции по электронной микроскопии. – Москва. - 2008. – С.
301.
2. Никиян А.Н., Васильченко А.С., Агапова Н.А., Татлыбаева Е.Б., Дерябин Д.Г. Применение атомно-силовой микроскопии в микробиологических исследованиях // Бюллетень московского общества испытателей природы. Отдел биологический. – 2009. – Т.114.(2). – С. 181-183.
3. Васильченко А.С., Никиян А.Н. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки реакции бактерий на различные воздействия // V Всероссийская конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». – Саратов. - 2010. – С. 41.