Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа а в растениях на поверхности химерных частиц втм: иммуногенные и протективные свойства кандидатных вакцин
На правах рукописи
ПЕТУХОВА Наталья Витальевна
ЭКСПРЕССИЯ КОНСЕРВАТИВНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ГРИППА А
В РАСТЕНИЯХ НА ПОВЕРХНОСТИ ХИМЕРНЫХ ЧАСТИЦ ВТМ:
ИММУНОГЕННЫЕ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА
КАНДИДАТНЫХ ВАКЦИН
03.02.02 – Вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москвa 2013
Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».
Научный руководитель:
Иванов Петр Алексеевич кандидат биологических наук
Официальные оппоненты:
Лунин Владимир Глебович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, лаборатория биологически активных наноструктур, руководитель.
Соловьев Андрей Геннадьевич, доктор биологических наук, профессор, НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», отдел биохимии вирусов растений, лаборатория генной инженерии вирусов, ведущий научный сотрудник.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова» РАМН.
Защита состоится «23» мая 2013 г. в _ часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 12, Биологический факультет, ауд. 389.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).
Автореферат разослан «23» апреля 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.
Актуальность проблемы.
Вирус гриппа является наиболее опасным респираторным заболеванием человека и животных. Сезонный грипп вызывает около 600 миллионов случаев заболеваний человека и тысяч смертей каждый год. Реассортация человеческих, птичьих и свиных штаммов может дать начало новой пандемии, сходной с «Испанкой» 1918 г. (по разным оценкам, от 20 до 50 миллионов жертв). Большинство современных вакцин содержит НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу).
Эти гликопротеины являются высоко иммуногенными, но, одновременно, и высоко вариабельными, поэтому поиски «Священного Грааля» (Rudolph and Ben-Yedidia, 2011) сосредоточены на разработке вакцины широкого спектра действия, содержащей консервативные вирусные антигены. Наибольшее внимание уделяется эктодомену М2е (23 аминокислотных остатка, аа;
практически неизменны у всех изолятов, известных с 1933 года) минорного белка М вируса гриппа А, образующего тетрамерные ионные каналы вириона. Установлено, что антитела к М2е могут обеспечивать защиту против субтипов вируса гриппа со сходной последовательностью пептида (Neirynck et al., 1999). 14 аа пептида слияния (fusion-пептид, fp), расположенного в N терминальной части субъединицы НА2, являются единственной консервативной последовательностью среди всех НА вируса гриппа (Chun et al., 2008). Было показано, что моноклональные антитела к fusion-пептиду могут взаимодействовать практически со всеми вирусными НА (Li et al., 2010).
Экспрессия белков и пептидов в растениях имеет ряд ценных преимуществ:
посттрансляционная модификация белков, как правило, сходна с таковой в животных клетках (Giddings, 2001);
биобезопасность;
быстрота и высокий уровень накопления целевых белков и пептидов;
низкая себестоимость продукта;
возможность создания так называемых «съедобных»
вакцин против различных инфекций (Pascual et al., 2007).
Последовательности целевых пептидов могут быть клонированы в ген белка оболочки (БО) фитовируса, например, вируса табачной мозаики (ВТМ;
Tobacco mosaic virus, TMV), таким образом, чтобы чужеродный пептид был экспонирован на поверхности химерной вирусной частицы (Chimeric Virus Particle, CVP) (Porta and Lomonossoff, 1998). Внесение структурных изменений и модификаций в БО может существенно влиять на биологию вируса и характер развития вирусной инфекции в растениях (Culver et al., 2002). Для успешной вакцинации антигены должны быть представлены иммунной системе в высоко упорядоченном, мультикопийном, квазикристаллическом виде;
CVP является подходящей моделью и способна стимулировать пролиферацию дендритных клеток и других антиген-презентирующих клеток (Smith et al., 2009).
Цели и задачи исследования Основной целью данной работы было получение кандидатной «универсальной» вакцины против вируса гриппа А на основе экспрессии консервативных антигенов М2е и fр в растениях на поверхности частиц ВТМ, а также изучение биологических свойств рекомбинантных вирусов и влияния модифицированных БО на развитие вирусной инфекции, в том числе на системный транспорт.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
1. Создание вирусных векторов, предназначенных для агроинокуляции растений и несущих последовательности консервативных эпитопов вируса гриппа А (M2e и fр) в открытой рамке трансляции БО ВТМ;
мутагенез М2е-антигена.
2. Изучение круга растений-хозяев и особенностей инфекций, вызванных рекомбинантными вирусами.
3. Анализ экспрессии и динамики накопления модифицированных вариантов БО в инокулированных и системных листьях.
4. Исследование генетической стабильности рекомбинантных вирусов.
5. Анализ иммуногенных свойств предполагаемых химерных вирионов: соотношение антител к М2е-эпитопу и к носителю (БО);
профили субклассов специфических иммуноглобулинов;
возможное взаимодействие с белком М2 на поверхности клеток, зараженных вирусом гриппа А.
6. Определение протективных свойств химерных вирусных частиц TMV-M2e при заражении гомологичным и гетерологичным штаммами вируса гриппа А.
Научная новизна и практическая значимость Созданы вирусные векторы TMV-M2e и TMV-fp. На основе консенсусной человеческой последовательности М2е получили два мутантных варианта с заменами остатков цистеина (cys) в 17 и 19 положениях на остатки серина (ser) или аланина (ala). Все векторы были генетически стабильны и способны к эффективной системной инфекции, уровень накопления БО-М2е достигал 4 г/кг верхних листьев. Частицы TMV-M2e состояли из 2-х структурных белков (содержание БО М2е - 90%). Развитие инфекции TMV-M2e-ala существенным образом отличалось от TMV-M2e ser. Соотношение антител (АТ) к эпитопу и носителю (БО) в сыворотках мышей варьировало от 2.7/1 (ser) до 5/1 (ala);
АТ взаимодействовали с белком М2 на поверхности клеток, зараженных вирусом гриппа. Профили иммуноглобулинов IgG1/IgG2a: 0.7/1 (ser) и 3.2/1 (ala). Мыши, вакцинированные TMV-M2e-ala/ser, были устойчивы к заражению 5 летальных доз (LD50) гомологичного вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1);
TMV-M2e-ala обеспечивал высокую степень защиты от 5LD50 гетерологичного вируса A/California/04/09 (H1N1) (4 аа замены в последовательности М2е без учета мутаций цистеинов, уровень выживаемости 70%).
Апробация работы Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.
Результаты работы докладывались на семинарах кафедры вирусологии Биологического факультета, а также на отечественных и международных конференциях: Юбилейная научная конференция «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» к 45-летию НИИ гриппа (Санкт-Петербург, Россия), 2012;
The 4th ESWI Influenza Conference (Malta), 2011;
36th FEBS Congress «Biochemistry for Tomorrow’s Medicine» (Torino, Italy), 2011;
III International Forum Международная конференция «Rusnanotech» (Moscow, Russia), 2010;
«Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология» (Алма-Ата, Казахстан), 2010.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов международных конференций.
Структура работы Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».
Работа изложена на _ страницах, содержит _ рисунков и _ таблиц.
Содержание работы 1. Создание экспериментальной системы презентации М2е-эпитопа и fusion-пептида в составе генома TMV-U1.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие консенсусный вариант М2е-пептида человека (Liu et al., 2005), а также fusion-пептид (fp) гемагглютинина (Chun et al., 2008), были оптимизированы для экспрессии в растениях с помощью вирусных векторов на основе данных о частоте использования различных кодонов у Arabidopsis thaliana, Nicоtiana tabacum и двух вирусных белков оболочки, которые эффективно экспрессируются при инфекции растений вирусами Tobacco mosaic virus, TMV-U1 (ВТМ) (Goelet et al., 1982) и Alternanthera mosaic virus, AltMV-MU (Ivanov et al., 2011). Иногда последовательности оптимальных кодонов совпадали;
рекомендованные кодоны для некоторых аминокислотных остатков, таких как Leu, Thr, Ile и Val, различались, поэтому был выбран компромиссный вариант. Данный подход также обеспечивал эффективную экспрессию в E. coli и высокий уровень накопления соответствующих слитых белков DHFR-M2e и DHFR-fp.
Векторы TMV-М2е и TMV-fp клонировали в бинарный вектор pBin19 между лево й (LB) и правой (RB) границами Т-ДНК (рис.1). Итоговые конструкции содержали полноразмерную кДНК ВТМ с последовательностями эпитопов в гене БО под контролем промотора гена Actin 2 из Arabidopsis thaliana и терминатора гена нопалинсинтазы (nos) и были рассчитаны на последующее использование метода агроинокуляции как наиболее эффективного способа заражения растений вирусным вектором (рис.1) (Fischer et al., 1999).
2. Экспрессия слитых белков DHFR-M2e и DHFR-fp в E. сoli и получение соответствующих антисывороток.
Последовательность М2е-пептида была клонирована в вектор pQE40 (QIAGEN, Германия) в рамку трансляции гена дигидрофолатредуктазы (DHFR) мыши (рис.2А). Белки DHFR-M2e (pQE40-M2e) и DHFR (pQE40) были экспрессированы в E.coli штамма XL-1 Blue. (рис.2В), выделены на колонках с Ni-NTA агарозой и диализованы против тридистиллированной воды при комнатной температуре. DHFR-M2e использовали для внутрибрюшинной иммунизации мышей ( раза по 100 мкг на инъекцию с 2-х недельными интервалами). Полученная антисыворотка (AS) применялась в последующих экспериментах (см. ниже). С помощью Вестерн блот анализа было показано, что мышиная поликлональная антисыворотка (AS DHFR-M2e) против слитого белка DHFR-M2e содержит значительно большее количество антител, специфичных к М2е-пептиду, по сравнению с антителами против белка-носителя (DHFR). Сыворотку AS DHFR-M2e при разведении 1:50000 можно считать специфичной только к М2е-пептиду (рис.2С).
последовательности М2е и fp. Затемненные блоки соответствуют генам репликазы, транспортного белка ( Рис.1. Рекомбинантные вирусные векторы на основе генома ВТМ, содержащие кДа), белка оболочки (СР) и 3’-нетранслируемой области (3’-NTR) генома TMV-U1. RB, LB – правая и левая границы Т-ДНК соответственно. Act2 – Actin2 транскрипционный промотор из Arabidopsis thaliana, nos – терминатор транскрипции гена нопалин синтазы. Указанные последовательности обозначают 3 версии М2е пептида и fusion-пептида, клонированные между аминокислотными остатками 155 и 156 БО ВТМ. Замены в последовательности М2е обозначены подчеркиванием.
Сыворотку к fusion-пептиду (AS DHFR-fp) получали аналогичным образом с AS DHFR-M2e, и анализировали с помощью Вестерн блоттинга, при этом существенной разницы в специфичности к эпитопу и носителю выявить не удалось. При разведении 1:3000 сыворотка взаимодействовала с белками НА0 и НА2 вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1) (результаты не показаны).
3. Характер развития вирусной инфекции при заражении растений рекомбинантными вирусами.
По сравнению с вирусом дикого типа, отличительными симптомами инфекции после агроинокуляции TMV-M2e-cys и TMV-M2e-ser являлись желтые хлорозы верхних листьев, что демонстрирует влияние слитого с БО М2е-пептида на взаимодействие вируса с хозяином. В отличие от TMV-M2e-cys, распространение вирусной инфекции TMV-M2e-ser происходило быстрее, симптомы обнаруживались на несколько дней раньше (10 д.п.и.), а некрозы отсутствовали (рис.3А). Ранее было показано, что даже единичная нуклеотидная мутация в гене БО ВТМ штамма U1, приводящая к аминокислотной замене, может значительным образом влиять на симптомы вирусной инфекции (Banerjee et al., 1995).
(AS). А. Основные элементы плазмидной конструкции, использованной для экспрессии белка DHFR-M2e в Рис.2. Экспрессия слитого белка DHFR-M2e в E.coli и проверка соответствующей антисыворотки E.coli. Обозначения: RBS – ribosome-binding site (сайт посадки рибосомы);
6хHis –участок, предназначенный для очистки на аффинной колонке Ni-NTA. В. Электрофоретический анализ белков E.coli до и после индукции с помощью IPTG (окраска по Кумасси). Анализировали три независимых клона pQE40-M2e (№ 1-3). Штамм E.coli, несущий экспрессионный вектор pQE40 и продуцирующий белок DHFR, использовали в качестве положительного контроля экспрессии. С. Вестерн блот анализ двух выделенных белков с использованием антисыворотки (Antiserum, AS) DHFR-M2e. Каждая проба представляет собой 100 нг очищенного белка.
Положение белковых маркеров отмечено стрелками.
Рис.3. А. Симптомы системной вирусной инфекции, вызванной рекомбинантным вирусом TMV-M2e-ser на N. benthamiana (10 д.п.и.). В. Сравнение симптомов вирусной инфекции, вызванной TMV-M2e-ser (справа) TMV-М2e-ala (слева) на N. benthamiana (24 д.п.и.).
Необходимо отметить существенную разницу в развитии вирусной инфекции, вызванной TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala, отличающихся друг от друга двумя аминокислотными заменами в положениях 17 и 19 последовательности чужеродного пептида М2е. Наличие аланинов в данных позициях М2е-эпитопа приводит к значительно более мягким симптомам инфекции. В частности, инфицированные рекомбинантными вирусами растения Nicotiana benthamiana (рис.3В) или Nicotiana sylvestris (рис.4В) заметно отличаются по высоте;
через 10-12 д.п.и. N. benthamiana, зараженные TMV-M2e-ser, останавливаются в своем развитии, а при инфекции TMV-M2e-ala растения продолжают расти и развиваться. Можно предполагать, что рекомбинантный вирус TMV-M2e-ser, в отличие от TMV-M2e-ala, приобретает способность проникать в апикальную меристему растений за счет возможного фосфорилирования БО и/или вирусных частиц по дополнительным остаткам серина. Оба вируса также вызывают системную инфекцию у растений Nicotiana excelsior и Nicotiana clevelandii. Напротив, при заражении Datura stramonium и Chenopodium murale наблюдали симптомы только на инокулированных листьях: у С. murale возникала крапчатость и локальные очаги инфекции (0,5-1 мм в диаметре), а у D. stramonium обширные желтые хлорозы и некрозы, причем меньше всего некрозов наблюдали при заражении TMV-M2e-ala.
Для сравнения инфекционности рекомбинантных вирусов TMV-M2e и ВТМ дикого типа (TMV-wt) проводили заражение растений Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN, Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc, обеспечивающих гиперчувствительный ответ на инфекцию ВТМ.
Как правило, общее количество некрозов при заражении вирусом дикого типа было несколько больше, чем при инфекции рекомбинантными вирусами, хотя разницу можно, скорее всего, считать несущественной. Размеры некрозов, вызываемые как вирусом дикого типа, так и рекомбинантными вирусами TMV-M2e, в среднем варьировали от 1 до 3 мм в диаметре. В целом, анализ данных о количестве и размерах некрозов позволяет сделать вывод, что некоторые различия в проявлениях гиперчувствительного ответа на инфекцию рекомбинантными TMV-M2e, а также TMV-wt являются незначительными и статистически недостоверными. Аминокислотные замены в чужеродной последовательности БО-М2е (Cys-Ser и Cys-Ala) не оказывают существенного влияния на межклеточный транспорт: размеры некрозов, образующихся в случае заражения всеми вариантами рекомбинантных вирусов TMV-M2e, незначительно отличаются друг от друга и от вируса дикого типа (TMV-U1-wt) (рис.4А).
B.
Рис.4. A. Гиперчувствительный ответ растений на заражение TMV-M2e-cys (левая половина листа) и TMV-wt (правая половина листа) (5 д.п.и.). B. Сравнение системных симптомов инфекции TMV-M2e-ser (слева) и TMV-M2e-ala (справа) на Nicotiana sylvestris (54 д.п.и.).
Симптомы, вызываемые рекомбинантным вирусом у растений TMV-fp Nicotiana benthamiana, заметно отличались от симптомов при заражении различными вариантами TMV M2e: наблюдались обширные системные некрозы, а также выраженная деформация верхних листьев;
некротизация затрагивала и главный стебель растения, что приводило к его «надлому»
(рис.5).
д.п.и). A) Системные некрозы;
B) «Надлом» некротизированного стебля растения.
Рис.5. Системные симптомы, вызванные рекомбинантным вирусом TMV-fp на N. benthamiana ( Ранее было показано, что химерные частицы, несущие на С-конце БО трансмембранные пептиды различного происхождения с высоким содержанием гидрофобных аминокислот не были способны системно инфицировать растения Nicotiana tabacum (Li et al., 2006). Fusion-пептид НА вируса гриппа на 85% состоит из гидрофобных аминокислот и, принимая во внимание его функциональную роль в слиянии мембран после проникновения вируса гриппа в клетку, можно сделать вывод, что, по нашим сведениям, TMV-fp является первым рекомбинантным вирусом с протяженным гидрофобным чужеродным эпитопом, способным вызывать эффективную системную инфекцию растений N. benthamiana.
4. Анализ экспрессии модифицированных БО ВТМ.
БО-М2е. Электрофоретический анализ в ПААГ экстракта системных листьев, зараженных TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala с последующей окраской по Кумасси показал наличие выраженной полосы, соответствующей предполагаемому БО с М2 е-эпитопом (около кДа). Вестерн блоттинг подтвердил, что белок, локализующийся в данной области, взаимодействует с антителами к БО ВТМ и М2 е (рис.6). Следовательно, можно заключить, что векторы TMV-M2e способны к репликации, ближнему и дальнему транспорту в растении и системной экспрессии модифицированного БО без потери чужеродного эпитопа.
вирусами TMV-M2e. 1 - TMV-M2e-cys, - экстракт из верхних симптомных листьев, 14 д.п.и., 0.6 мг Рис.6. Вестерн блот анализ растительных экстрактов после заражения рекомбинантными растительного материала;
2 – TMV-M2e-cys, экстракт инокулированных листьев, 14 д.п.и., 0.6 мг;
3 –TMV-M2e ser, экстракт из симптомных системных листьев, 11 д.п.и., 0.5 мг;
4 – TMV-M2e-ser, экстракт из системных листьев без симптомов, 11 д.п.и., 0.55 мг;
5 - TMV-M2e-ala, экстракт из симптомных системных листьев, д.п.и., 0.1 мг;
6 - TMV-M2e-ala, экстракт из системных листьев без симптомов, 24 д.п.и., 0.2 мг. Обозначены соответствующие рекомбинантные вирусы, As CP-TMV – кроличья антисыворотка к БО ВТМ дикого типа;
As М2е – мышиная сыворотка к DHFR-M2e. Цифрами перед стрелками указаны молекулярные массы белковых маркеров в кДа.
Помимо зоны, соответствующей БО-М2е, при электрофорезе в ПААГ была выявлена дополнительная полоса, приблизительно совпадающая по молекулярной массе с БО без М2е эпитопа – около 20 кДа. Взаимное соотношение белков, соответствующих этим полосам, различалось в инокулированных и системных листьях. Вестерн блот анализ показал, что данная зона взаимодействует с антителами к БО ВТМ, но не реагирует с антителами к DHFR-М2е. Таким образом, можно заключить, что эта область соответствует укороченному варианту БО без М2е эпитопа (рис.6). Уровень накопления модифицированного БО-М2е не зависит от способа инокуляции растений (агроинфильтрация, механическое заражение препаратом выделенного вируса или экстрактом листьев инфицированных растений) (данные не показаны).
При анализе экстрактов других растений рода Nicotiana было показано, что развитие системных симптомов вирусной инфекции также сопровождается накоплением модифицированных БО в соответствующих листьях. В системных листьях растений Chenopodium murale БО TMV-M2e-ser не был обнаружен (рис.7, дорожка 9). По приблизительным оценкам, уровень синтеза БО-М2е-ala в Nicotiana excelsior можно сопоставить с уровнем накопления в Nicotiana benthamiana (около 5 г/кг свежего растительного материала) на день проведения анализа (рис.7, дорожки 7,8).
рекомбинантными вирусами TMV-M2e. 21 д.п.и., окраска по Кумасси. Обозначения: М – белковые маркеры, Рис.7. Электрофоретический анализ в 15% ПААГ экстрактов из листьев растений, зараженных цифрами перед стрелками указаны молекулярные массы в кДа;
1 – Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 2-ого яруса;
2 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 1-ого яруса;
3 Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ser, системный лист 2-ого яруса;
4 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ser, системный лист 1-ого яруса;
5 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-cys, системный лист 2 ого яруса;
6 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-cys, системный лист 1-ого ярус;
7 – Nicotiana excelsior, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 2-ого яруса;
8 - Nicotiana excelsior, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 1-ого яруса;
9 – Chenopodium murale, заражение TMV-M2e-ser, системный лист 2-ого яруса. Ярусы системных листьев отсчитывались от инокулированного листа (0 ярус). На каждую дорожку геля наносили по 5 мг растительного материала.
БО-fp. При анализе экстрактов листьев с различными симптомами вирусной инфекции была обнаружена фракция белка с молекулярной массой около 22 кДа, которая взаимодействовала с антителами к БО-ВТМ дикого типа и не выявлялась в отрицательном контроле (экстракт незараженного растения). Согласно подвижности в ПААГ, молекулярная масса данной белковой фракции превосходила размер БО ВТМ дикого типа на 2 кДа, что совпадает с предсказанным размером fusion-пептида (14 аа). Как и в случае вирусов TMV-M2e, в каждой пробе инфицированных растительных экстрактов наблюдалась зона белка, по размеру совпадающая с БО без эпитопа (20 кДа) (рис.8). Можно заключить, что рекомбинантный вирус TMV-fp также способен к репликации и системному транспорту в инфицированном растении. Так как модифицированный белок удалось обнаружить с помощью Вестерн блоттинга при нанесении на одну пробу большого количества растительного материала, можно сделать вывод, что, несмотря на ярко выраженные симптомы вирусной инфекции, БО с fusion-пептидом накапливается менее эффективно, чем БО-М2е.
Вплоть до настоящего времени задача эффективной экспрессии fusion-пептида оставалась нерешенной. Следует упомянуть успешный синтез in vitro 14-ти N-концевых аминокислотных остатков fusion-пептида вируса гриппа и его последующее присоединение к белку-носителю (Chun et al., 2008). Таким образом, химерные частицы TMV-fp, полученные в настоящей работе при заражении Nicotiana benthamiana, являются первой созданной системой экспрессии fusion-пептида вируса гриппа в растениях.
Рис.8. Анализ эспрессии БО-fp в растительных инфекции TMV-fp. 22 д.п.и. Сверху: Вестерн блот анализ с экстрактах листьев с системными симптомами вирусной мышиными антителами к БО-ВТМ (AS CP TMV wt). Снизу:
Вестерн блот анализ с мышиными антителами к DHFR-fp (AS DHFR-fp). 1 – экстракт некротизированных листьев, мг;
2 – экстракт верхних деформированных листьев, 6.25 мг (проба 1);
3 – экстракт верхних деформированных листьев, 6.25 мг (проба 2);
4 - экстракт верхних деформированных листьев, 5 мг (16 д.п.и.);
-К – отрицательный контроль, экстракт незараженного растения N. benthamiana, 5 мг;
К – положительный контроль - БО ВТМ, 0.4 мкг. Фигурными стрелками обозначены соответствующие фракции белков (БО-fp и БО-wt). Цифры у стрелок указывают молекулярные массы белковых маркеров в кДа.
5. Динамика накопления рекомбинантных вирусов TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala в растениях Nicotiana benthamiana.
При исследовании динамики накопления TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala было показано, что модификации БО не влияют на репликацию рекомбинантных вирусов, что подтверждается одинаковым накоплением БО-М2е в инокулированных листьях (рис.9А). Основные отличия TMV M2e-ser и TMV-M2e-ala были обнаружены при системной инфекции. Вирусспецифические белки эффективно накапливались в системных симптомных листьях к 12-19 д.п.и., при этом количество БО-М2е-ala значительно превышало количество БО-М2е-ser (рис.9С). В бессимптомных листьях экспрессия модифицированного БО наблюдается на более поздних стадиях вирусной инфекции (20-22 д.п.и.) (рис.9В,D). Кроме того, после 20 д.п.и. уровень накопления БО-М2е-ser снижается, а к 24-25 д.п.и. растение гибнет. На поздних стадиях развития вирусной инфекции высокий уровень экспрессии БО-М2е-ala наблюдается как в симптомных, так и бессимптомных системных листьях (рис.9D), при этом рост и развитие растения не нарушаются. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что две аминокислотных замены в чужеродной последовательности М2е в составе БО ВТМ существенным образом влияют не только на развитие внешних симптомов вирусной инфекции (см.выше), но и на уровень накопления модифицированных БО. Количество БО-М2е-ser можно приблизительно оценить как 1 г/кг свежего растительного материала, а БО М2е-ala – как 4 г/кг свежего растительного материала.
рекомбинантными вирусами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala. Электрофоретический анализ в 15% ПААГ Рис.9. Динамика накопления БО-М2е в растениях Nicotiana benthamiana при заражении экстрактов инокулированных (А) и системных (В, С, D) листьев (окраска по Кумасси). На каждую дорожку гелей нанесено по 3,33 мг соответствующего растительного материала. Цифры перед стрелками указывают молекулярные массы в кДа. Обозначено: ser – TMV-M2e-ser;
ala – TMV-M2e-ala;
dpi – days post inoculation (дни после инокуляции);
К – БО ВТМ, 1 мкг;
-К - отрицательный контроль – экстракт из незараженного листа N.
benthamianа. Фигурная стрелка указывает на предполагаемый БО-М2е.
6. «Конкурентоспособность» рекомбинантных вирусов TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala между собой.
Предыдущие эксперименты показали заметную разницу в развитии вирусной инфекции, вызываемой рекомбинантными вирусами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala (см.3,4). Далее проводили опыты по определению степени «конкурентноспособности» этих двух вирусо в друг с друго м.
Одно растение Nicotiana benthamiana одновременно заражали двумя агробактериальными культурами, кодирующими TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala. Вне зависимости от способа инокуляции растений, наблюдали характерные системные симптомы, которые варьировали даже в рамках одного растения: желтые листья, крапчатость и хлорозы, а также деформация верхних листьев (рис.10).
M2e-ser и TMV-M2e-ala (32 д.п.и.). Стрелками указаны выраженные симптомы.
Рис.10. Смешанная инфекция растений Nicotiana benthamiana рекомбинантными вирусами TMV Для того чтобы выяснить, какой из двух рекомбинантных вирусов преобладает в верхних системных листьях, выделяли тотальную РНК из листьев с разными симптомами, которую анализировали методом обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР) с праймерами, специфичными к участкам ДНК ВТМ, фланкирующим область клонирования последовательности эпитопа. Все полученные ПЦР-продукты были секвенированы, в каждой из проб обнаружили рекомбинантные вирусы TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala в разных соотношениях, при этом вируса дикого типа обнаружено не было. Анализ полученных в результате секвенирования хроматограмм показал, что пики, соответствующие триплетам серина и аланина в положениях 17 и 19 М2е пептида накладываются друг на друга;
высота пиков на хроматограмме позволяет судить о преобладании того или иного рекомбинантного вируса в пробе. Стоит отметить, что соотношение мутантных вирусов может варьировать в разных симптомных листьях: например, в пробе из хлорозных и деформированных листьев пик «G» в триплете аланина (GCT) преобладает над пиком «С» в триплете серина (TCT) (рис.11В), то есть доминирует TMV-M2e-ala, а в пр о б из желтых е листьев величины соответствующих пиков для обоих триплетов практически совпадают (рис.11А), что свидетельствует о примерно одинаковом соотношении рекомбинантных вирусов.
Таким образом, можно сделать вывод, что при совместной инфекции рекомбинантные вирусы TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala одновременно обнаруживаются в системных листьях растениях N. benthamiana, при этом ни один из мутантов не может вытеснить другой в ходе совместного заражения, а скорость их распространения по сосудистой системе растения примерно одинакова. Можно предположить, что существенная разница в уровнях накопления TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala в верхних листьях (рис.9) обусловлена процессами, происходящими на стадии выхода вируса из флоэмы в клетки мезофилла.
Рис.11. Хроматограммы, полученные при секвенировании продуктов ОТ-ПЦР анализа тотальной вирусами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala (смешанная инфекция). Красная рамка обозначает РНК, выделенной из разных листьев растений, одновременно зараженных двумя рекомбинантными последовательность М2е-пептида в БО ВТМ. Желтыми рамками указаны триплеты, у которых наблюдалось наложение разных пиков (Tct=ser;
Gct=ala). A. Равное соотношение пиков. В. Преобладание одного из вариантов (в данном случае пик «G» в триплете аланина превышает пик «С» в триплете серина).
7. Стабильность рекомбинантных вирусных геномов.
Для определения стабильности вирусных векторов в ходе инфекции, а также объяснения возможного механизма образования укороченного варианта БО без эпитопа, из полученных вирусных препаратов TMV-M2e (Cys, Ser, Ala) и TMV-fp была выделена РНК. Кроме того, из системных листьев растений, зараженных рекомбинантными вирусами, была выделена фракция тотальной РНК. Полученные препараты РНК были использованы для ОТ-ПЦР с праймерами, использованными ранее (см. раздел 6). Анализ подтвердил наличие последовательностей, кодирующих все варианты М2е-эпитопа и fusion-пептид как в геномной, так и в тотальной РНК (рис.12). Разница в подвижности между кДНК фрагментами TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser, TMV M2e-ala, TMV-fp и ВТМ дикого типа соответствует длинам последовательностей введенных эпитопов (69 нт для всех вариантов М2е-эпито па и 4 2 нт в случае fusion-пептида) (рис.12). Все ОТ-ПЦР продукты были выделены, очищены и секвенированы, при этом не было обнаружено ни одной мутации ни в одной из исследуемых последовательностей. Эти данные указывают на то, что все варианты вектора TMV-M2e, а также TMV-fp генетически стабильны;
реверсии к дикому типу вируса не происходит. Следовательно, укороченный вариант БО, не взаимодействующий, в частности, с сывороткой к М2е, появляется в результате посттрансляционных изменений, например, протеолиза свободного белка или сформированных вирусных частиц. Повторная инфекция выделенными препаратами химерных вирусных частиц приводит к появлению таких же белковых продуктов, что и заражение растения с помощью агроинфильтрации исходной бинарной плазмидой (данные не показаны).
Рис.12. Электрофоретический анализ в 2% агарозном геле ОТ-ПЦР продуктов TMV-fp. ОТ-ПЦР анализ выделенных РНК: 1 – TMV-fp (РНК из вирусного препарата);
2 – TMV-fp (тотальная РНК);
3 – TMV-U1-wt (РНК из вирусного препарата);
4 - TMV-M2e-ala (тотальная РНК). М – маркеры, цифры перед стрелками указывают молекулярные массы в нт. Фигурными стрелками указаны зоны, соответствующие кДНК TMV-M2e, TMV-fp и ВТМ дикого типа.
10. Характеристика химерных вирусных частиц.
Наличие остатка цистеина в чужеродном пептиде, независимо от положения в аминокислотной последовательности, существенно влияло на морфологию и стабильность рекомбинантного ВТМ (Li et al., 2007). Наши исследования подтверждают данный феномен:
несмотря на то, что модифицированный белок БО-М2е-cys в достаточно больших количествах обнаруживался в системных зараженных листьях Nicotiana benthamiana, выделить химерные частицы TMV-M2e-cys без потери эпитопа так и не удалось (рис.13, дорожка 1). В препаратах вирусных частиц и были обнаружены два белка с TMV-M2e-ser TMV-M2e-ala электрофоретической подвижностью в ПААГ около 20 и 24 кДа;
такие размеры белков соответствуют рассчитанным молекулярным массам БО-wt и БО-М2е соответственно (рис.13А, дорожки 1-3). С помощью Вестерн блот анализа вирусных препаратов было показано, что 24К белок является единственным, способным реагировать с сывороткой к М2е-пептиду. Сыворотка к БО ВТМ взаимодействовала с обоими вариантами белка (рис.13В). Таким образом, препараты химерных вирусных частиц, выделенные из растений, зараженных рекомбинантными вирусами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala, содержат оба варианта БО: с М2е-эпитопом и без него.
Минимальная доля модифицированного БО-М2е составляла около 50% (рис.13А, дорожка 2), в то время как стандартное содержание БО с эпитопом достигало 80-90% от общего количества белка в препарате (рис.13А, дорожки 4,5). Мы не обнаружили значительной разницы между TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala с точки зрения соотношения белков 24:20 кДа. Ни один из выделенных препаратов не содержал только 24 кДа белок без его укороченного варианта. Можно предполагать, что некоторое количество БО без эпитопа необходимо для эффективной сборки химерных вирионов.
С другой стороны, с помощью иммуноэлектронной микроскопии было показано, что в препаратах присутствуют отдельные вирусные частицы, которые не реагируют с первичными антителами к М2е-эпитопу (рис.15В, см. ниже), то есть, по-видимому, содержат только укороченную форму БО.
Время от времени электрофорез в ПААГ выявлял присутствие дополнительных минорных белковых продуктов, расположенных между маркерами 20 и 24 кДа (рис.13, дорожки 4,5).
Наиболее вероятным объяснением их появления является частичный протеолиз М2е-пептида и/или С-концевых аминокислотных остатков БО ВТМ (аа 156-159 для использованного в данной работе изолята TMV-U1).
системных листьев N. benthamiana. А. Электрофоретический анализ в 15% ПААГ препаратов химерных Рис.13. Характеристика белков в препаратах химерных вирусных частиц TMV-M2e, выделенных из вирусных частиц (окраска по Кумасси). В. Вестерн блот анализ выделенных препаратов химерных вирионов с соответствующими сыворотками к БО ВТМ дикого типа (кроличья антисыворотка CP TMV) и М2е-эпитопу (мышиная антисыворотка к DHFR-M2e). Сверху приведены названия препаратов соответствующих химерных вирионов. Цифры со стрелками указывают молекулярные массы белковых маркеров в кДа.
11. Электронная микроскопия химерных вирусных частиц.
Для вектора, созданного на основе полноразмерного генома ВТМ, существуют ограничения в размере вставки последовательности в ген БО, что затрудняет использование БО для экспрессии длинных пептидов (Beach et al., 1996;
Wu et al., 2003). Длина М2е-пептида (23 аа) превышает ранее утверждавшийся предел размера вставляемой чужеродной последовательности (20 аа) в изначальную ОРТ БО ВТМ без С-концевых делеций или использования дополнительных пептидных линкеров (Jiang et al., 2006;
Werner et al., 2006;
Wu et al., 2003). Насколько нам известно, М2е-ser и являются самыми длинными чужеродными пептидами, M2e-ala экспрессированными в растениях с использованием исходной последовательности поверхностной петли БО 155/156 (154/155 для некоторых изолятов ВТМ) и вектора на основе ВТМ. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии было показано, что все химерные вирионы ВТМ, несущие на своей поверхности как эпитоп из 14 аа (fusion-пептид) (рис.14), так и состоящий из аа М2е-антиген (рис.15), не отличались по морфологии от ВТМ дикого типа, что говорит об отсутствии проблем при сборке химерных вирусных частиц.
частиц TMV-fp. А. Увеличение 100,000 раз. В. Увеличение 60, Рис.14. Электронные микрофотографии препарата вирусных раз. Масштаб линейки указан в верхнем левом углу.
Контрастирование с использованием 1,5% фосфовольфрамовой кислоты.
Исходя из данных иммуноэлектронной микроскопии, не удалось оценить распределение и количество М2е-эпитопа на поверхности вирионов TMV-M2e-cys в растительных экстрактах, так как слой первичных антител к М2е-пептиду на поверхности частиц был неравномерным, взаимодействие носило частичный характер, что подтверждалось небольшим содержанием вторичных антител, коньюгированных с золотом (данные не представлены). Это может свидетельствовать о том, что содержание субъединиц БО, несущих слитый пептид, незначительно, что подтверждают данные о возможном влиянии цистеинов в чужеродной последовательности на сборку химерных вирионов (Li et al., 2007). При анализе препаратов TMV-M2e удалось показать, что чужеродные М2е-эпитопы равномерно расположены и плотно упакованы на поверхности химерных частиц. Оказалось возможным отличить морфологию комплексов TMV-M2e-ser и TMV M2e-ala с антителами друг от друга (рис.15В,С). Комплексы TMV-M2e-ser выглядели «неряшливо», боковые поверхности были неровными и связывали большее количество фосфовольфрамовой кислоты. Предположительно, данный эффект проявляется из-за разницы в поверхностном заряде вирусных частиц ТMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala: дополнительные остатки серинов в М2-пептиде на поверхности вирионов TMV-M2e-ser могут быть фосфорилированы.
Вирионы ВТМ дикого типа, использованные как отрицательный контроль, не взаимодействовали ни с первичными, ни со вторичными антителами (рис.15D).
12. Соотношение антител к эпитопу и носителю в сыворотках, полученных при иммунизации мышей химерными частицами TMV-M2e.
Иммунизацию мышей BALB/c (n=11/группа) вирусными препаратами TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala проводили внутрибрюшинно в присутствии неполного адьюванта Фрейнда на 0, 14, 28 дни. В качестве отрицательного контроля использовали фосфатно-буферный солевой раствор (phosphate buffered saline, PBS). Полученные данные показывают, что внутрибрюшинное введение препарата TMV-M2e-ala не влияет на массу тела животных опытной группы (различия с контрольной группой статистически не достоверны, р0.05), что может свидетельствовать о безопасности препарата (данные не представлены).
A B C D Рис.15. Электронные микрофотографии препаратов вирусных частиц TMV-M2e с использованием TMV-M2e-ala;
B. TMV-M2e-ser;
D. TMV-U1-wt (отрицательный контроль). Масштаб линейки указан в нижнем антител, коньюгированных с золотом (6 нм). Первичные антитела – к М2е-эпитопу (AS DHFR-M2e). А, C.
левом углу. Контрастирование с использованием 1.5% фосфовольфрамовой кислоты. Увеличение: A – 80, раз;
B – 200,000 раз;
C – 150,000 раз;
D – 100,000 раз.
Вестерн блот анализ. Сыворотки, полученные при иммунизации мышей химерными частицами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala, были использованы в Вестерн блот экспериментах для определения разницы во взаимодействии антител с экспонированными М2е-эпитопами и их носителем (БО ВТМ). Белки DHFR и DHFR-M2e служили контролем. Три пула сыворотки, специфичной к TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala, полученных после третьей (последней) иммунизации мышей, были смешаны и исследовались при разведении 1:15000. Для электрофореза в ПААГ использовали по 200 нг белков и вирусных препаратов (рис.16А). При взаимодействии сывороток с белком DHFR-M2e был зарегистрирован интенсивный сигнал, сравнимый с сигналом при реакции с каждой из версий БО TMV-M2e. Оба варианта химерного белка БО-М2е эффективно взаимодействовали с соответствующими сыворотками, в то время как БО ВТМ дикого типа вызывал слабый сигнал;
видимо, основная часть эпитопов носителя (БО ВТМ) в составе химерных вирионов TMV-M2e «спрятана» от иммунной системы за счет экспонированных на поверхности М2е-антигенов. Кроме того, частично данный эффект может быть связан с более высокой аффинностью М2е-специфических антител. Также можно предположить, что химерные частицы TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala сохраняют стабильность после инъекции, в том числе в крови и лимфоидных органах. Необходимо отметить, что слабый дополнительная сигнал, проявляющийся при Вестерн блоттинге препарата TMV-M2e-ala между 20 и 25 кДа белковыми маркерами (рис.16А), вероятнее всего соответствует минорному белку, который выявляется при электрофорезе в ПААГ с окраской по Кумасси препарата частиц TMV-M2e-ala (рис.13А, дорожка 5). Денситометрия Вестерн блотов показала, что соотношение антител к эпитопу и носителю составляет примерно 7:1 (результаты не представлены).
мышей химерными частицами TMV-M2e. A. Анализ содержания антител с помощью Вестерн блоттинга Рис.16. Соотношение титров антител к эпитопу и носителю в сыворотках после иммунизации химерных вирионов и контрольных белков. Цифры перед стрелками указывают молекулярные массы белковых маркеров в кДа. В. Характеристика антител, специфичных к М2е-эпитопу и носителю (вириону ВТМ) с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Разведение обеих сывороток к соответствующим химерным частицам (AS TMV-M2e-ser и AS TMV-M2e-ala) равно 1:15000. Показаны типичные результаты нескольких повторных экспериментов. Ось ординат указывает значения абсорбции, измеренной при 405 нм.
Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА). Сыворотки к TMV-M2e-ser и TMV-M2e ala, были исследованы с помощью непрямого ИФА с целью сравнения иммунологических свойств химерных БО-М2е в нативном (ИФА) и денатурированном состоянии (Вестерн блоттинг). Белки DHFR, DHFR-M2e, химерные вирионы ВТМ и вирус ВТМ дикого типа (wt) (по 200 нг каждого) наносились в лунки планшета для ИФА и инкубировались с мышиными сыворотками, полученными при иммунизации химерными вирусными частицами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala (рис.16В), а также с сыворотками к DHFR-M2e и к ВТМ дикого типа (использовались в качестве контролей;
результаты не представлены). Все сыворотки исследовали в разведении 1:15000.
Инкубацию со вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена, проводили в течение 60 мин. Уровни значений фонового (неспецифического) сигнала (антиген без первичных антител) вычитались из полученных опытных значений. На рис.16В показано, что химерные частицы эффективно реагируют с сывороткой, специфичной к соответствующим вирионам (TMV M2e-ser или TMV-M2e-ala), а вирионы дикого типа умеренно взаимодействуют с обеими сыворотками. Соотношение TMV-M2e/TMV-wt варьировало от 2.7:1 (в случае TMV-M2e-ser) до 5:1 (в случае TMV-M2e-ala). Данные наблюдения согласуются с результатами Вестерн блот анализа (рис.16А) и подтверждаются различиями в структурах комплексов антиген-антитело, наблюдаемыми при иммуноэлектронной микроскопии (рис.15B,C). Можно предположить, что аминокислотные остатки аланинов, расположенные на поверхности частиц TMV-M2e, обеспечивают более эффективный иммунный ответ на чужеродный пептид в составе химерных вирионов.
В предыдущих работах, описывающих химерные частицы ВТМ, за некоторыми исключениями (Fitchen et al., 1995;
Koo et al., 1999), не проводили сравнения иммуногенной активности чужеродного эпитопа и ВТМ-платформы. Очевидно, что такие данные важны как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. В частности, наши исследования показывают, что TMV-M2e-ala и TMV-M2e-ser обеспечивают выработку значительно большего количества антител, специфичных к М2е-пептиду, чем к БО ВТМ, поэтому перспективы практического применения кандидатных вакцин, основанных на химерных частицах TMV-M2e, выглядят многообещающими. В работе Palmer et al., 2006 были сформулированы несколько возможных критериев «для признания химерных частиц в качестве вакцины»: (1) более 90% субъединиц капсида должны содержать чужеродный пептид, экспонированный на поерхности химерных вирионов;
(2) чистота вирусного препарата должна превышать 95%. В дополнение, мы предлагаем принимать во внимание сравнение иммуногенной активности эпитопа и носителя с помощью Вестерн блоттинга и/или иммуноферментного анализа (ИФА) (предположительно, приемлемое соотношение должно превышать 1:1).
13. Иммуногенность TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala.
Уже на 28 день после иммунизации мышей частицами TMV-M2e-ala было показано интенсивное взаимодействие М2е-специфичных IgG с гомологичной последовательностью синтетического М2е-пептида (G-18;
совпадает с последовательностью М2е A/PR/8/34 (H1N1)), уровень которого был значительно выше, чем у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ser (р0.05) (рис.17А). На 28 и 42 день взаимодействие IgG к М2е с гетерологичной последовательностью другого синтетического М2е-пептида (G-26, 4 аа замены;
соответствует последовательности М2е A/California/04/09 (H1N1)) было в 4 и 1.5 раз слабее у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ser, и в 10 и 3 раза слабее у мышей, иммунизированных с TMV M2e-ala (рис.17В).
Рис.17. Иммуногенность химерных вирусных частиц TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala. Мыши BALB/c (n=11/группа) были иммунизированы внутрибрюшинно на 0, 14, 28 дни инъекцией 50 мкг вирусных препаратов TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala. PBS буфер служил в качестве отрицательного контроля. Через две недели после второй и третьей иммунизаций титры М2е-специфических IgG оценивались методом ИФА с использованием синтетических пептидов G-18 (A) G-26 (В). Титры специфических IgG к М2е-пептиду составляли 1:200 в контрольной группе мышей (иммунизация с PBS). Представлены средние величины из четырех пулов сыворотки в каждой группе. (С) Анализ субклассов IgG, специфических к М2е-эпитопу, против G 18 в сыворотках мышей, иммунизированных TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala методом ИФА, через две недели после третьей иммунизации. Представлены средние величины из четырех пулов сыворотки в каждой группе. (D) Продолжительность иммунного ответа. Содержание IgG в М2е-специфической сыворотке, полученной при иммунизации группы мышей с TMV-M2e-ala, определялось по взаимодействию с G-18 на 42, 176 и 211 дни после третьей (последней) иммунизации. Необходимо отметить, что линии графика для 176 и 211 дней перекрываются по ходу серий разведений.
Кроме того, исследовали профили субклассов М2е-специфичных IgG у мышей после третьей иммунизации химерными вирионами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala (рис.17С). Сравнимые уровни IgG1 и IgG2a наблюдали у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ser (IgG1/IgG2a = 0.7, достоверность p0.05). Уровень иммуноглобулинов субкласса IgG1 в сыворотке был заметно выше уровня IgG2a у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ala (IgG1/IgG2a = 3.2). Титры IgG у мышей при иммунизации химерными вирионами TMV-M2e-ala были примерно в 4 раза выше, чем у мышей, иммунизированных вирусным препаратом TMV-M2e-ser, при этом титры иммуноглобулинов субкласса IgG2a были практически одинаковыми. Наши результаты демонстрируют незначительное снижение уровня М2е-специфических IgG на протяжении семимесячного периода наблюдения (рис.17D).
14. Взаимодействие сывороток, полученных при иммунизации мышей химерными частицами TMV-M2e, с белком М2 на поверхности эпителиальных клеток, зараженных вирусом гриппа.
Анти-М2е антитела, образующиеся при иммунизации мышей препаратами TMV-M2e-ser и эффективно связываются с синтетическим пептидом, соответствующим TMV-M2e-ala, консенсусной человеческой последовательности М2е (G-18). Для того чтобы определить, способны ли такие антитела распознавать тетрамер белка М2 в ходе природной инфекции, был использован метод ИФА целых эпителиальных клеток Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), зараженных вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1).
мышей, полученной после иммунизации TMV-M2e-ser (A) и TMV-M2e-ala (B). Линия PBS на графике Рис.18. Распознавание эпителиальных клеток MDCK, зараженных вирусом гриппа, сывороткой подразумевает контрольную группу мышей, иммунизированных внутрибрюшинно буфером PBS. Через две недели после третьей иммунизации сыворотка была проверена на способность к связыванию с незараженными (контроль) и инфицированными вирусом A/PR/8/34 клетками MDCK in vitro. Результаты представлены как разница в измерениях OD450 при ИФА целых клеток (инфицированные клетки минус контрольные).
Сыворотки к и специфично TMV-M2e-ser (рис.18А) TMV-M2e-ala (рис.18В) взаимодействовали с инфицированными клетками, при этом не связываясь с клетками, инокулированными буфером PBS (отрицательный контроль). Таким образом, можно заключить, что антитела к М2е, полученные при иммунизации мышей рекомбинантными вирусами TMV M2e-ser и TMV-M2e-ala, способны распознавать как линейный синтетический М2е-пептид, так и нативный тетрамерный М2е-эпитоп, расположенный на поверхности клеток млекопитающих, зараженных вирусом гриппа.
15. Протективное действие кандидатных вакцин TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala при заражении мышей гомологичным и гетерологичным штаммами вируса гриппа А.
Для изучения протективных свойств кандидатных рекомбинантных вакцин TMV-M2e были использованы модели сублетальной (1LD/50) и летальной (5LD/50) гриппозной инфекции. Как видно из рис.19А, все мыши (100%), иммунизированные TMV-M2e-ser, выжили при заражении 1LD/50 гомологичного вируса гриппа А/PR/8/34 (H1N1) и 90% животных выжило после заражения 5LD/50 этого же вируса (различия мышей опытной группы с контрольными животными были достоверными, р0.05). Полученные результаты демонстрируют, что у иммунизированных мышей наблюдались значительно более слабые симптомы заболевания и меньшая потеря массы тела, чем у мышей в контрольной группе (р0.05) (данные не представлены).
заражении гомологичным вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Мыши BALB/c (n=11/группа) были Рис.19. Эффективность иммунизации мышей частицами TMV-M2e-ser (А) и TMV-M2e-ala (В) при иммунизированы 50 мкг TMV-M2e-ser на 0, 14, 28 дни. На 42 день иммунизированные мыши интраназально заражались 1LD/50 и 5LD/50 дозами вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Динамика гибели мышей (по оси ординат - % выживших мышей, по оси абсцисс - дни наблюдения);
процент выживших животных в опытных группах был значительно выше, чем в контрольных (р0.05).
При заражении гомологичным вирусом гриппа мышей, A/PR/8/34 (H1N1) иммунизированных рекомбинантным TMV-M2e-ala, были получены сходные результаты (рис.19В). Процент выживших мышей при заражении 1LD/50 дозой гомологичного вируса гриппа составил 100%, в то время как при заражении 5LD/50 гетерологичного вируса гриппа выжило 84% мышей. Данные результаты демонстрируют высокую степень выживаемости иммунизированных мышей по сравнению с контрольными животными (р0.05). Мыши, иммунизированные рекомбинантным TMV-M2e-ala, также проявляют значительно более слабые клинические симптомы заболевания и меньшую потерю массы тела при заражении 1LD/50 дозой вируса по сравнению с контрольной группой (р0.05), однако, различия в потере веса и проявлении симптомов заболевания после заражения дозой 5LD/50 дозой вируса были статистически недостоверными (p0.05) (данные не представлены). Это может быть связано с преобладанием IgG1 иммунного ответа, который является менее эффективным, чем IgG2a иммунный ответ при антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC).
Несмотря на существенные различия в последовательностях человеческого консенсусного М2е и М2е-пептида вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1) (4 аминокислотных остатка из 23, без учета двух замен цистеинов), заражение дозой 5LD/50 гетерологичного вируса гриппа показало, что у вакцинированных мышей наблюдается высокий уровень защиты против инфекции при иммунизации кандидатными вакцинами TMV-M2e-ser (46% выживаемости) и особенно TMV M2e-ala (70% выживаемости) (рис.20). Различия в процентах выживаемости иммунизированных животных и контрольной группы были статистически достоверными (р0.05), чего нельзя сказать о разнице в потере веса мышей (данные не представлены).
заражении гетерологичным вирусом гриппа A/California/04/09 (H1N1). Мыши BALB/c были Рис.20. Эффективность иммунизации мышей частицами TMV-M2-ser (А) и TMV-M2e-ala (В) при иммунизированы 50 мкг TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala на 0, 14, 28 дни. На 42 день иммунизированные мыши интраназально заражались дозой 5LD/50 вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1). Динамика гибели мышей (по оси ординат - % выживших мышей, по оси абсцисс - дни наблюдения);
процент выживших животных в опытных группах был значительно выше, чем в контрольных (р0.05).
Выводы 1. Получены рекомбинантные вирусы TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser, TMV-M2e-ala и TMV-fp, несущие в гене белка оболочки (БО) последовательности консервативных антигенов М2 белка (М2е) и гемагглютинина (fp) вируса гриппа А. Вирусы TMV-M2e отличаются друг от друга заменами аминокислотных остатков цистеина в положениях 17 и 19 на остатки серина или аланина, соответственно. Доказана системная экспрессия данных антигенов в растениях Nicotiana benthamiana, Nicotiana excelsior, Nicotiana sylvestris, Nicotiana clevelandii.
2. В экспериментах на растениях, обеспечивающих гиперчувствительный ответ на заражение вирусом табачной мозаики (ВТМ), было показано, что модификация гена БО за счет различных вариантов М2е не влияет на межклеточный транспорт рекомбинантных вирусов.
3. Накопление БО-М2е-ala в растениях Nicotiana benthamiana (4 г/кг верхних листьев) превышает содержание БО-M2e-ser (1 г/кг) без нарушения роста и развития растений. При совместной инфекции оба вируса одновременно обнаруживаются в системных листьях.
4. Доказана генетическая стабильность рекомбинантных вирусов TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser, TMV-M2e-ala и TMV-fp.
5. Химерные вирусные частицы TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala состоят из двух структурных белков, содержание БО с эпитопом достигает 90% от общего количества белка.
6. Вирионы TMV-M2e и TMV-fp представляют собой жесткие палочковидные структуры.
Методом иммуноэлектронной микроскопии было показано, что М2е-эпитоп в составе химерных частиц равномерно распределен на поверхности вирионов, при этом морфология комплексов TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala с антителами отличалась друг от друга.
7. Показана высокая иммуногенность химерных вирионов TMV-M2e-ser и TMV-М2e-ala.
Профили субклассов иммуноглобулинов существенно отличались: для TMV-M2e-ser соотношение IgG1/IgG2a составляло 0.7;
для TMV-M2e-ala IgG1/IgG2a - 3.2. Высокий уровень титра специфических иммуноглобулинов у мышей, иммунизированных TMV-M2e-ala, сохранялся в течение 7 месяцев. Обе сыворотки взаимодействуют с белком М2 на поверхности эпителиальных клеток, зараженных вирусом гриппа А.
8. Количество антител, специфичных к М2е-эпитопу, значительно превышает содержание антител к носителю (частицы ВТМ). Соотношение TMV-M2e-ser/TMV-wt равно 2.7:1, а TMV-M2e ala/TMV-wt – 5:1.
Мыши, вакцинированные частицами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala, были устойчивы к 9.
заражению пятью летальными дозами (5LD50) гомологичного вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1).
При инфекции 5LD50 гетерологичного вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1) (четыре аминокислотных замены в последовательности М2е без учета мутаций цистеинов) уровни выживаемости мышей составляли 46% и 70%, соответственно.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Petukhova N.V., Gasanova T.V., Stepanova L.A., Rusova O.A., Potapchuk M.V., Korotkov A.V., Skurat E.V., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ivanov P.A. and Atabekov J.G. Immunogenicity and protective efficacy of candidate universal influenza A nanovaccines produced in plants by tobacco mosaic virus-based vectors. // Current Pharmaceutical Design. 2013. V. 19. Е-pub Feb 1;
doi:
10.2174/13816128113199990337. P. 1-14.
2. Петухова Н.В., Иванов П.А., Мигунов А.И. Вирусоподобные частицы – новая стратегия для создания противогриппозных вакцин. // Вопросы вирусологии. 2013. Т.58. №2. С. 10-15.
3. Иванов П.А., Гасанова Т.В., Петухова Н.В. Получение кандидатных универсальных противогриппозных вакцин на основе химерных частиц вируса табачной мозаики. // Юбилейная научная конференция «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» к 45 летию НИИ гриппа. Санкт-Петербург. Россия. 2012. С. 4.
4. Stepanova L., Potapchuk M., Kupriyanov V., Kotlyarov R., Petukhova N., Ivanov P., Rusova O., Repko I., Korotkov A., Tsybalova L. Candidate M2e-based vaccines against human and avian influenza viruses, produced in plant: immune response and protection. // The 4th ESWI Influenza Conference. Malta. Section SPA2 "Vaccines: Current and novel approaches", 2011. А203Р.
5. Petukhova N., Gasanova T., Skurat E., Ivanov P., Atabekov J. Modifications of conservative Influenza antigen expressed on the surface of chimeric virions do not affect the immunogenic properties of epitopes but dramatically increase their production by plant viral vector. // 36th FEBS Congress “Biochemistry for Tomorrow’s Medicine”. Torino. Italy. FEBS Journal. 2011. V. 278.
Supplement 1. P.161.
6. Petukhova N.V., Gasanova T.V., Skurat E.V., Ivanov P.A., Atabekov J.G. Systemic expression of Influenza epitope in plants on the surface of chimeric nanoparticles of tobacco mosaic virus. // III International Forum “Rusnanotech – 2010”. Moscow. Russia. 2010. 3-7-Nanobiotechnology, f29, P.1 3.
7. Петухова Н.В., Гасанова Т.В., Скурат Е.В., Иванов П.А., Атабеков И.Г. Системная экспрессия М2е-эпитопа вируса гриппа в растениях в составе химерных вирионов на основе ВТМ. // Сборник статей по материалам международной конференции «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология». Алма-Ата. Казахстан. 2010. C.76-78.