Воздействие малых доз гамма-облучения на иммунную систему в модельном эксперименте на приматах
На правах рукописи
ИГНАТОВА
Инна Евгеньевна
ВОЗДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ГАММА-ОБЛУЧЕНИЯ
НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ В МОДЕЛЬНОМ
ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ПРИМАТАХ
03.01.01 - Радиобиология
14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Обнинск - 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии РАМН»
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Коноплянников Анатолий Георгиевич, доктор медицинских наук Агрба Виолета Засимовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Вайнсон Адольф Адольфович, доктор медицинских наук Попучиев Виктор Васильевич Ведущее учреждение: ФГУ «Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» Федерального медико-биологического агентства России.
Защита состоится 28 февраля 2012 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медицинский радиологический научный центр»
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 249036, г. Обнинск Калужской области, ул. Королева, 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан «_»_201 года.
Ученый секретарь диссертационного совета Палыга Г.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Успехи научно-технического прогресса способствовали освоению околоземного космического пространства. Человек стал подвергаться воздействию экстремальных условий окружающей среды: измененного барометрического давления, повышенного радиационного фона, гипоксии, температуры и других. Проблемы обеспечения оптимальной жизнедеятельности людей в этих условиях, а также поддержание у них высокой работоспособности, стимулировали проведение многосторонних исследований функционального состояния организма человека. Особенно важное значение эти исследования приобретают в условиях реального космического полета (КП) [Покровский В.И.,2004].
Проблема радиации решается в ходе модельных экспериментов на животных. Ранее использовались мыши, крысы, собаки. Начиная с 1948 г. для решения задач космической физиологии использовались обезьяны – как «лабораторный двойник» человека [Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Фридман, 1987;
Баркая В.С., Тесленко В.М., Бокк М.И., 1997;
Ильин А.Е., 2000]. Хорошо изучено влияние ионизирующего излучения (ИИ) на нервную, мочеполовую, мышечную, кроветворную, эндокринную и другие системы приматов. И вместе с тем, совокупных сведений о влиянии ИИ на иммунную систему нет [Манина А.А., 1961;
Гордеев Ю.В., Бритван И.И., 1987;
Федоров Б.А., Хоравиди Е.М., 1987;
Козловская И.Б., Лапин Б.А., Ильин Е.А. и др., 2004].
Оценка радиационной опасности в Космосе представляет собой многоплановую задачу. Трудности ее решения определяются не только специфическими условиями космического пространства, но и материально техническими возможностями. Сложный состав космического излучения, широкий энергетический спектр входящих в него частиц, возможная модифицирующая роль других факторов КП (невесомости, перегрузки и др.) затрудняют адекватную оценку радиационной опасности космического излучения [Федоренко Б.С.,1991].
Учитывая источники излучения во время межпланетных экспедиций для здоровья космонавтов будут представлять опасность как «малые», так и высокие дозы радиации [Дудкин В.Е., Ковалев Е.Е., Кузнецов В.Г., Смиренный Л.Н., 1967].
В настоящее время достаточно хорошо изучены в клинике и эксперименте эффекты воздействия высоких доз ИИ, проявляющиеся в виде острой или хронической лучевой болезни, либо в виде местных лучевых реакций. Вместе с тем, значительную актуальность представляет проблема оценки эффектов длительного воздействия ИИ в диапазоне «малых» доз, поскольку существует множество неопределенностей относительно направленности и выраженности медико-биологических последствий подобного воздействия. На данном этапе все эффекты «малых» доз рассматриваются как стохастические, которые могут реализовываться либо в виде онкологических заболеваний, либо в виде генетических нарушений.
Однако это далеко не все эффекты, которые можно наблюдать у лиц, подвергающихся воздействию «малых» доз ИИ. К их числу можно отнести описываемый рядом авторов эффект раннего старения, различные метаболические нарушения, заболевания дыхательной системы и т.д.
[Лютых В.П., Долгих А.П., 1998;
Ставицкий Р.В., Гуслистый В.П., Ковальчук И.В. и др., 1999;
Ставицкий Р.В., Лебедев Л.А., Мехеечев А.В. и др., 2003;
Карпов А.Б., Тахауов Р.М., Удут В.В., Семенова Ю.В., Шерстобоев Е.Ю.
и др., 2005;
Pearce L.L., Epperly M.W., Greenberger J.S. et al., 2001].
В связи с этим особую актуальность представляют исследования по выявлению нарушений со стороны иммунной системы на доклиническом этапе, определяющие закономерности формирования иммуно-патологических процессов и основных заболеваний у персонала, подвергающегося длительному воздействию ИИ.
Целью исследования явилась оценка степени воздействия различных вариантов «малых» доз гамма-облучения на иммунную систему приматов.
Задачи исследования:
1. Исследовать клеточное звено иммунитета клинически здоровых обезьян вида макака резус в зависимости от возраста, пола и установить показатели нормы, как вариант «иммунологической карты».
2. Подбор моноклональных антител для определения лимфоцитарных антигенов обезьян.
3. Изучить показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у обезьян, подвергшихся хроническому фракционному (пролонгированному) гамма-облучению в «малых» дозах.
4. Оценить показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у обезьян, подвергшихся хроническому фракционному (двукратному) гамма облучению в «малых» дозах.
5. Исследовать показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у обезьян, подвергшихся острому гамма-облучению (имитация солнечной вспышки).
Научная новизна работы.
Впервые показаны особенности иммунного статуса у обезьян в зависимости от возраста и пола. Установлены нормы иммунного статуса клинически здоровых обезьян вида макака резус Адлерского питомника одного из ключевых параметров, определяющих эффективность иммунного ответа.
В ходе выполнения работы в рамках комплексного эксперимента по проекту «Гамма Бриз», у обезьян вида макака резус, подвергшихся острому и хроническому гамма-облучению в «малых» дозах, показаны особенности изменения иммунного статуса, которые определяют последующий запуск иммунологических реакций.
Практическая значимость работы.
Работа выполнена в рамках комплексного эксперимента по проекту «Гамма Бриз». Это исследование, предваряет большой, 500-суточный модельный наземный эксперимент (Марс 500).
Обезьяны, вследствие уникального биологического сходства с человеком и подчас абсолютной незаменимости, особенно для изучения различных патологических и иммунопатологических состояний человека, являются наиболее адекватными экспериментальными объектами для решения многочисленных задач в экспериментальной биологии и медицине.
Установление нормативных показателей иммунной системы обезьян открывает перспективы их использования для моделирования иммунопатологических состояний людей, а также возможность для апробации методов их иммунокоррекции и иммунотерапии. Установление параметров иммунного статуса у обезьян может быть рекомендовано для использования в зооветеринарной практике для выбора и определения тактики и оценки эффективности проводимой терапии. Выявленные изменения в иммунном статусе после воздействия гамма-облучения в «малых» дозах могут быть использованы в радиационной иммунологии с последующей экстраполяцией данных на космонавтов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Показатели иммунного статуса обезьян (клеточное звено иммунитета) близки к таковым у людей.
2. При воздействии хронического, фракционного (пролонгированного) гамма облучения в «малых» дозах у обезьян макака резус происходят изменения в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета.
3. При воздействии хронического, фракционного (двукратного) гамма облучения в «малых» дозах у обезьян происходят изменения в иммунном статусе.
4. Острое гамма-облучение приматов в «малых» дозах оказывает существенное влияние на иммунный статус.
5. Обезьяна, как модель, может быть использована в космической медицине, для изучения радиационного иммунодефицита.
Апробация диссертации.
Материалы диссертации были доложены на I Всероссийской студенческой научно-практической конференции «Студенческие научные исследования в сфере туризма и курортного дела», г. Сочи, 2007;
на V научно практической конференции молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение», г. Анапа, 2007;
на международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», г. Сочи, 2007;
на заседаниях межлабораторной конференции по проекту «Гамма-Бриз», г. Москва 2008, 2009;
на 2-ой международной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской приматологии», г. Сочи, 2011.
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии РАМН» 27 мая 2011 г. (протокол № 6).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, статьи опубликованы в журнале, рекомендованном ВАК МОиН РФ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и указателя литературы, содержащего 91 отечественных и 44 зарубежных источника литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками, 26 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
Для установления нормативных показателей клеточного звена иммунитета были использованы 90 клинически здоровых обезьян вида макака резус (Macaca mulatta), разного возраста и пола (таблица 1).
Таблица 1. Общее количество обезьян, взятых в эксперимент.
Пол Возраст Количество абсолютное % Самцы 2-4 года 32 35, () 4,1-7 лет 43 47, 9-14 лет 3 3, Самки 2-4 года 6 6, () 4,1-7 лет 6 6, Всего 90 Для изучения воздействия малых доз ИИ были отобраны 11 обезьян самцов вида макака резус 3,4-4,7 летнего возраста, массой тела 3-5 кг.
При осмотре и взятии материла у животных, использовали транквилизаторы (калипсол, кетамин), которые вводили внутримышечно из расчета 0,1 мг/кг массы тела животного.
При выполнении исследования руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» [Бургасов П.Н.
«Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 6.04.1973, № 1045-73, приложение 8].
Методы.
В ходе исследования использованы: иммунологические методы - метод проточной цитофлуориметрии, метод радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини и гематологические методы.
Метод проточной цитометрии. Забор крови для иммунофенотипирования осуществлялся утром, натощак. Для иммунофенотипирования использовали моноклональные антитела (МаТ) (производство фирмы «Becton Dickinson», США), в стандартной комбинации.
К 100 мкл цельной, гепаринизированной крови добавляли 20 мкл МаТ.
Инкубировали в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре.
Реакция проводилась в строгом соответствии с рекомендациями фирмы производителя («Becton Dickinson»). Образцы анализировали на проточном цитометре Epics XL-MCL («Beckman Coulter», США) и на проточном цитометре Becton Dickinson FACSCalibur («Becton Dickinson», США) в тот же день. На клетках, исследовали уровни экспрессии молекул CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD45 RA, HLA-DR.
Определение количества IgA, IgG, IgM в сыворотке методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Использовали стандартный набор реактивов («Институт иммунологии», Москва) для определения иммуноглобулинов А, G, М человека. Подготовка реагентов, проведения метода и учет результатов производили по инструкции производителя.
Общий анализ крови. Для изучения структуры клеток, определения лейкоцитарной формулы делали мазок крови по стандартной методике.
Модель облучения.
Облучение проводилось на базе Государственного научного центра «Институт медико-биологических проблем РАН».
Воздействие радиации на обезьян проводилось в наземных условиях и осуществлялось в соответствии с режимом радиационного воздействия, типичным для условий межпланетных полетов. Этот режим был сформирован с помощью разработанных математических программ, учитывающих наиболее вероятные сценарии радиационного воздействия, и реализовывался с использованием гамма-установок. Облучение проводилось на установке УПГД 2М с источником излучения цезий Cs137. Активность источника 7,4х1012Бк, или 200 Кюри.
Обезьяны облучались тотально и равномерно. Обезьяны первой группы («Гамма 25») находились на расстоянии 5 метров от источника излучения.
Обезьяны второй группы («Гамма 66») на расстоянии 1,5 метров от источника.
Схема облучения подразумевала два этапа:
Первый этап:
Группа 1 ("Гамма 25") – хроническое, фракционное (пролонгированное) облучение: пять облучений по 25 сГр, перерыв два дня и еще пять облучений по 25 сГр.
Группа 2 ("Гамма 66") – хроническое фракционное (двукратное) облучение:
одно облучение в дозе 66 сГр, перерыв шесть дней и еще одно облучение - сГр.
Группа 3 – контрольная, не подвергавшаяся облучению.
Второй этап облучения проводился через три месяца однократно в дозе сГр. (имитация солнечной вспышки) для обеих групп.
Методы статистической обработки данных.
Для статистической обработки данных проводили анализ доступных сведений литературы об иммунологических показателях. Также был проведен анализ нормальности распределения по Колмогорову-Смирнову и Шапиро Уилку.
Для сравнения значений иммунологических показателей 3 групп между собой использовался однофакторный дисперсионный анализ. Значимыми считались различия между группами при уровне значимости (p) не превышавшем 0,05.
Для оценки динамики между иммунологическими показателями в одной группе использовался парный t-критерий Стьюдента.
Проведен анализ как преобразованных, так и не преобразованных данных.
Для преобразования использовалось логарифмирование по основанию 10.
Для статистического анализа использовался пакет прикладных программ SPSS/PASW Statistics 18.0.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Предварительно, до начала исследования клеточного звена иммунитета у обезьян вида макака резус, была подобрана панель МаТ к дифференцировочным антигенам лейкоцитов обезьян («Becton Dickinson»).
Иммунный статус клинически здоровых обезьян вида макака резус.
В качестве объекта исследований была отобрана группа макак резус разного возраста (подростковый, юношеский, зрелый) и пола [Чалян В.Г., Мейшвили Н.В., 1989] с целью оценки влияния возрастного и полового фактора на показатели клеточного звена иммунитета.
При анализе данных (таблица 2) привлекает внимание весьма широкий диапазон разбросов каждого из изученных показателей иммунограммы.
Минимальные и максимальные значения показателей у отдельных особей в группах могут существенно различаться, что, по-видимому, отражает индивидуальные особенности каждого животного. Отмечено, что число CD3+ клеток не претерпевает существенных изменений с возрастом и не зависит от пола исследованных обезьян. В популяции клеток, экспрессирующих CD4+ у самцов и самок, не было отмечено существенных колебаний данного показателя. Вместе с тем у всех животных с возрастом наблюдается тенденция к увеличению CD8+ - клеток. Эта тенденция у самцов выражена больше, чем у самок. В содержании CD20+ - клеток наблюдается обратная тенденция, к 9- годам показатели несколько снижаются, причем содержание CD20+ - клеток у самок выше, чем у самцов. Что касается CD16+ - клеток, то этот показатель не претерпевает существенных изменений и не зависит ни от пола, ни от возраста.
Таблица 2. Содержание лимфоцитов с разными мембранными маркерами в периферической крови клинически здоровых обезьян.
№ пол возраст кол-во мембранные маркеры (% клеток) животных CD 3 CD 4 CD 8 CD 16 CD 1. 2-4 32 50,0-77,7 22,0-52,0 17,5-36,0 4,5-21,0 12,0-38, года 58,3±6,8 30,5±6,9 23,5±5,1 12,4±4,8 22,7±8, 6 40,0-77,6 18,5-37,2 16,2-48,3 3,0-23,9 13,0-47, 56,1±17,2 26,7±7,6 27,8±14,2 12,1±8,6 28,0±12, 2. 4,1-7 43 53,6-69,3 22,0-42,5 17,5-38,9 3,9-24,2 12,6-28, лет 61,9±5,0 34,0±5,3 28,4±7,4 13,5±6,4 21,4±5, 6 43,8-69,8 20,0-39,2 25,6-35,8 6,0-24,0 12,7-47, 56,8±9,8 27,9±7,0 30,1±3,8 12,8±7,2 27,1±13, 3. 9-14 3 51,0-68,1 28,5-34,3 25,2-46,5 11,8-21,3 16,0-20, лет 59,7±8,6 31,3±2,9 37,2±10,9 16,3±4,8 18,0±2, Таким образом, проведенные исследования иммунного статуса клинически здоровых обезьян вида макака резус позволило сделать вывод, что иммунный статус этих животных приближен к таковому у клинически здоровых людей (таблица 3). Полученные результаты подтверждают возможность использования обезьян в качестве модели для адекватного моделирования на них различных иммунопатологических состояний людей.
Таблица 3. Содержание лимфоцитов с разными мембранными маркерами в периферической крови клинически здоровых людей.
данные авторов мембранные маркеры (% клеток) CD 3 CD 4 CD 8 CD 16 CD Хаитов, 2000 г. 61-84 32-58 11-36 6,6-30 5- Хайдуков, 2001 г. 61-85 35-55 19-35 8-18 7- Никулин, 2007 г. 58-76 36-55 17-37 6-26 8- Иммунный статус обезьян, подвергшихся воздействию «малых» доз гамма-облучению.
Проведенное исследование было разделено на три этапа. Первый этап – изучение иммунного статуса до облучения. Было проведено три обследования.
Второй этап – изучение иммунного статуса обезьян после хронического облучения (пролонгированного и двукратного) в течение трех месяцев. Третий этап – изучение иммунного статуса в течение шести месяцев, после острого облучения (имитация солнечной вспышки).
Первостепенную практическую значимость в иммунограмме имеют относительные показатели популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток (ИКК), а не их абсолютные значения, в силу существенного колебания последних, что совпадает с данными других авторов [Лебедев К.О., 1990].
Первый этап – иммунный статус до облучения.
Таблица 4. Содержание лимфоцитов в периферической крови обезьян до облучения.
Группы Кластеры дифференцировки, МаТ BD CD 3 CD 4 CD 8 CD4/CD8 CD 16 CD 1-я 41,9-74,3 20,0-45,6 16,0-32,0 0,9-2,1 3,0-25,5 12,5-48, группа 56,5±8,8 32,4±7,3 22,7±4,6 1,5±0,4 10,6±8,9 30,3±11, 2-я 45,4-70,1 26,9-36,0 15,5-44,0 0,6-1,9 2,0-12,0 18,0-49, группа 55,4±8,1 29,6±2,8 23,6±8,3 1,3±0,4 7,5±3,1 35,1±8, 3-я 54,9-79,9 31,0-55,0 19,0-30,0 1,1-2,3 3,0-15,0 11,0-32, группа 66,8±8,9 41,0±9,1 23,8±3,6 1,7±0,5 10,2±4,2 21,5±6, В таблице 4 приведены полученные результаты до облучения по группам.
Во всех группах отмечался широкий разброс полученных показателей иммунограммы. Поэтому в дальнейшем все показатели будут представлены как среднестатистические величины. Оценивая иммунологический статус групп, было отмечено, что все показатели соответствуют нормам, установленным ранее. Так же отмечалось, что данные первой и второй экспериментальных групп максимально соответствуют друг другу. Что же касалось третьей – контрольной группы, - то показатели: CD3 и CD4 – несколько завышены, по CD20, наоборот, занижены, в сравнении с данными экспериментальных групп.
Второй этап – изучение иммунного статуса при первом облучении, когда для групп использовались разные программы. Для первой группы – фракционное, пролонгированное, для второй группы – фракционное, двукратное облучения.
Для анализа иммунного статуса были определены критические точки после облучения – 4 день, 24 день, 50 день, 85 день после облучения.
Третий этап. На 90 сутки после хронического облучения был проведен следующий этап эксперимента – острое облучение, имитация солнечной вспышки. Обе экспериментальные группы получили одинаковую дозу облучения, однократно в дозе 120 сГр. Анализ проводился на 8 (98)-, 57 (147)-, 85 (175) дни и через 180 (270) дней после второго облучения.
На рисунке 1 показана динамика количества В-лимфоцитов до и после облучений. Было отмечено снижение как относительного, так и абсолютного количества В-лимфоцитов во всех экспериментальных группах.
Рис. 1. Количество В-лимфоцитов (CD 20) до и после облучений.
Примечание: * - Р 0,05 по отношению к фоновым показателям ** - Р 0,01 по отношению к фоновым показателям.
*** - Р 0,001 по отношению к фоновым показателям.
Так, через 4 дня (острый период) после облучения отмечается резкое (статистически достоверное р0,01) падение их числа как в первой, так и во второй группах. В первой группе с 30,3% до 7,6%, а во второй с 35,1% до 16,3%. Спустя 24 дня показатели по-прежнему достоверно снижены (р0,05) и составляют 11,0% и 16,3% в первой и второй группах, соответственно. Через дней наблюдалась тенденция В-лимфоцитов к восстановлению, но, тем не менее их число оставалось ниже таковых своих исходных аналогов примерно в 1,5 и 1,3 раза (1 и 2 группы). По истечению 85 дней динамика роста В лимфоцитов сохранилась и их количество составило в первой группе – 21,3% (30,3 – до облучения), а во второй группе – 33,3% (35,1 – до облучения). После острого облучения было отмечено, что в острый период (98 день эксперимента) относительное и абсолютное количество В-лимфоцитов достоверно уменьшилось (р0,01-0,001 по отношению к фоновым показателям и 0,05-0, по отношению к 85 дню после первого облучения) в первой группе с 21,3 до 7,4%, а во второй с 33,3 до 8,5%. На 147 день эксперимента в количестве В лимфоцитов наметилась тенденция к восстановлению в обеих группах. По истечению 270 дней эксперимента показатели максимально приближены к фоновым, в первой группе - 27,9% (до облучения 30,3%), а во второй группе 35,8% (до облучения 35,1%).
На рисунке 2 показана динамика уровня Т-лимфоцитов до и после облучения. В острый период (через 4 дня) произошло увеличение относительного количества Т-лимфоцитов (CD3+) в обеих экспериментальных группах. В первой группе с 56,5 до 70,1%, во второй группе с 55,4 до 71,5% (р0,01). Повышенные показатели сохранялись на протяжении 50 дней после пролонгированного и двукратного хронического облучения. На 85 день в первой группе количество Т-лимфоцитов по-прежнему было выше исходных данных и составило 64,4%, а во второй группе показатели практически вернулись к исходным – 59,7%. На 98 день эксперимента было отмечено максимальное увеличение относительного содержания Т-лимфоцитов (р0,05 0,01 по отношению к фоновым показателям и р0,05 по отношению к 85 дню после первого облучения). В дальнейшем, начиная со 147 дня, имелась тенденция к восстановлению показателя. На 270 день обследования уровень Т лимфоцитов в первой группе составил 59,7 при исходных данных – 56,5%, а во второй группе наблюдалось восстановление показателей – 53,1 при исходных данных 55,4.
Рис. 2. Количество Т-лимфоцитов (CD 3) до и после облучения.
Примечание: ** - Р 0,05 - 0,01 – по отношению к фоновым показателям.
Что касалось субпопуляций Т-лимфоцитов, то было отмечено следующее: в острый период (через 4 дня) произошло увеличение относительного количества Т-хелперов (CD4+) в обеих экспериментальных группах. В первой группе с 32,4 до 41,1%, во второй группе с 29,6 до 38,0% (р0,05). Повышенные показатели в первой группе сохранялись на протяжении 85 дней после пролонгированного хронического облучения. Во второй группе на 24 день отмечается достоверное снижение результата (р0,05). На 50 день отмечена тенденции к восстановлению показателя, которая сохранялась и на 85 день и составило 30,7 при фоновых показателях 29,6%. После острого облучения, на 8 сутки в обеих группах произошло увеличения относительного количества Т-хелперов. При оценки иммунограммы на 57 день после острого облучения во второй группе показатели максимально приближены к фоновым и на 180 день соответствовали им. Что же касалось первой группы, то на 57, 85 дни обследования количество Т-хелперов все еще оставалось сниженным, в сравнении с фоновыми, и лишь к 180 дню было отмечено их восстановление.
В острый период (через 4 дня) произошло увеличение относительного количества Т-супрессоров (CD8+) в обеих экспериментальных группах. В первой группе с 22,7 до 31,0%, во второй группе с 23,6 до 32,8,%. В первой группе на 24 сутки показатели достоверно снизились (р0,05) с 31 до 28,5% и на протяжении всего периода наблюдения показатели имели тенденцию к снижению и на 85 день составили 22,8%, что равно фоновым показателям (22,7%). Что касалось второй группы, то повышенные показатели наблюдались на протяжении 24 дней наблюдения. К 50 дню наметилась тенденция к уменьшению результатов, и на 85 день количество CD8+ составило 27,6% при фоновых 23,6%. После острого облучения, на 8 сутки в обеих группах произошло увеличения относительного количества Т-супрессоров. Начиная с 57 дня эксперимента, количество Т-супрессоров понижается в обеих экспериментальных группах. И на 180 день отмечалось восстановление данного показателя.
На рисунке 3 показана динамика естественных киллеров до и после облучения. Изменение количества естественных киллеров зависело от характера облучения. Так, в первой группе (хроническое, пролонгированное облучение) относительное и абсолютное количество естественных киллеров увеличилось. Было отмечено, что в острый период (4 дня) количество естественных киллеров увеличилось в 2 раза, и составило 21,2% при исходных данных 10,6%. Через 24 дня наблюдалась тенденция к их восстановлению. И к 85 дню с момента облучения количество НК -клеток достигло исходных значений 11,2%. После острого облучения в первой группе статистически достоверных изменений не отмечалось. Были отмечены некоторые колебания на 57 и 85 сутки, которые не выходили за рамки нормативных пределов, установленных нами ранее. И на 270 день показатель соответствовал фоновым данным. Что же касается картины содержания естественных киллеров во второй группе, то в острый период количество этих клеток увеличилось в 1, раза и составило 10,3% (исходные данные 7,5%). На 24 день после облучения их количество по-прежнему увеличивается (р0,05), и составило 13,3%.
Начиная с 50 дня показатели естественных киллеров практически равны исходным. После острого облучения отмечалось двукратное увеличение числа клеток, с восстановлением на 175 день (сравнение с 85 днем после хронического облучения) и на 270 день количество естественных киллеров соответствовало фоновым показателям.
При воздействии ИИ на иммунную систему следует учитывать не только дозу, но и вид облучения. В ходе эксперимента было показано, что в группе, которая подверглась хроническому фракционному (двукратному) облучению показатели иммунограммы к 85 дню максимально приблизились к исходным данным. Особенности поражающего действия ИИ определяются в первую очередь физическими характеристиками условий облучения: видом, энергией и величиной дозы излучения, характером его пространственного и временного распределения. Однако и при одинаковых условиях облучения радиочувствительность организма варьирует в широких пределах.
Рис. 3. Количество естественных киллеров (CD 16) до и после облучения.
Примечание: ** - Р 0,05 – по отношению к фоновым показателям.
Так, при проведении эксперимента была отмечена одна обезьяна из первой группы, у которой на протяжении 85 дней наблюдения до и после хронического облучения не наблюдалось увеличения количества Т лимфоцитов, в то время как у трех животных количество Т-клеток резко увеличилось. После острого облучения у одного из животных произошло уменьшения числа естественных киллеров, в то время как у других показатели либо не изменились, либо незначительно повысились.
Важнейшим фактором иммунной системы является фракция растворимых сывороточных белков гамма-глобулинов, выполняющих функцию антител, специфических к определенным антигенам.
У обезьян, которые были взяты в эксперимент «Гамма Бриз», оценивали концентрацию иммуноглобулинов, методом Манчини. Изучалась концентрация IgG, IgA и IgM.
В таблице 5 показана динамика IgМ до и после хронического облучения.
Было отмечено, что разные режимы облучения оказывают различные эффект на уровень IgМ. Так, у обезьян 1 группы (пролонгированное облучение) уровень IgМ повышается с 0,45 до 0,576 г/л на 4 день после облучения, достигнув максимальных величин на 24 сутки (0,64 г/л) и практически соответствовал исходным данным к 85 дню. Во 2 группе (двукратное облучение) было отмечено понижение данного показателя на 4 день (с 0,85 до 0,562 г/л). Однако за период наблюдения за животными, на протяжении 85 дней, максимальное падение уровня IgМ наблюдалось на 85 день исследования и составило 0,45 г/л.
Исследование уровня иммуноглобулина G показало, что до облучения показатели варьировали в широких пределах. Так, уровень IgG находился в пределах от 13,6 до 25,4 г/л. (таблица 5). Было отмечено, что независимо от групповой принадлежности у всех животных на 4 сутки после хронического облучения имелась тенденция к понижению уровня IgG. У обезьян 1 группы пониженный уровень IgG относительно исходных значений сохранялся на протяжении всего периода наблюдения с максимальным падением на 85 сутки.
Во 2 группе пониженный уровень IgG сохранялся до 24 дня, затем отмечается некоторое увеличение данного показателя. После острого облучения на 8 сутки в обеих экспериментальных группах концентрация IgG практически соответствовала фоновым показателям. Начиная с 57 дня была отмечена тенденция к уменьшению концентрации Ig, которая сохранилась и на 180 сутки эксперимента.
Выраженную реакцию на облучение проявили иммуноглобулины класса А, причем угнетение синтеза данного класса наблюдалось как после хронического (двукратного и пролонгированного), так и после острого облучения (таблица 5). Достоверное снижение IgА во второй экспериментальной группе после хронического облучения наблюдалось на 24 и 85 сутки (р0,05), с максимальным падением на 24 день. Что касалось первой группы, то имелась тенденция к понижению данного показателя с критической точкой – 85 сутки, когда концентрация IgА составила 6,09 г/л при исходных данных 11,9 г/л. Достоверное снижение IgА в первой группе после острого облучения наблюдалось на 57, 85 и 180 сутки эксперимента (р0,05-0,01), с критической точкой - 57 сутки. Достоверное снижение концентрации IgА во второй группе после острого облучения наблюдалось на 57, 85 и 180 сутки эксперимента (р0,01), с критической точкой - 85 сутки. После окончания наблюдения за животными, на 180 день уровень IgА был снижен в 3,4 и 3,5 раза в первой и второй группах, соответственно. Итак, IgА оказался наиболее радиочувствительным в сравнении с другими классами иммуноглобулинов, хотя изначально показатели IgА были значительно выше (10,64-12,25 г/л), предлагаемых норм для человека (0,7-5,0 г/л).
Таблица 5. Уровень иммуноглобулинов М, G, A до и после облучения.
Ig группы Дни эксперимента Хроническое облучение Острое облучение фон 4 день 24 85 8 день 57 85 день день день день день IgM 1 группа 0,45 0,576 0,64 0,52 Не проводилось 2 группа 0,85 0,562 0,67 0, 3 группа 0,99 0,456 1,28 0, IgG 1 группа 14,335 12,6 10,27 8,56 13,8 9,8 11,4 10, 2 группа 25,4 15,5 11,7 12,6 24,6 10,9 18,3 15, 3 группа 13,6 8,8 11,2 5,6 22,4 5,27 23,2 15, IgA 1 группа 11,9 7,7 7,33 6,09 6,44 2,63 3,73 3, 2 группа 12,25 6,96 4,01 5,57 3,17 3,43 1,63 3, 3 группа 10,64 7,35 9,73 2,66 6,23 2,47 1,8 3, Таким образом, в ходе проведенных исследований нами впервые были установлены величины показателей клеточного звена иммунитета обезьян Адлерского питомника, с определением следующих показателей: CD3 – основной маркер Т-лимфоцитов, CD4 – Т-хелперы, CD8 – цитотоксические Т лимфоциты, CD16 – маркер естественных киллеров, CD20 – основной маркер В-лимфоцитов, а также маркеры активации HLA-DR и CD25.
Важным и наиболее трудным вопросом любого экспериментального исследования является экстраполяция его результатов на человека. Однако анализ литературы и полученные данные еще раз показали возможность использования обезьян как модели для разработки методов адекватной профилактики и защиты космонавтов от космического излучения в условиях межпланетного полета.
ВЫВОДЫ 1. Установлены нормативные показатели клеточного звена иммунитета здоровых макаков резус. Показано, что показатели клеточного звена иммунитета у клинически здоровых низших обезьян приближены к таковым у людей.
2. Действие на организм обезьян ионизирующего излучения вызывает угнетение гуморального иммунного ответа, выражающееся в уменьшении абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов и уровня иммуноглобулинов А, IgG и IgМ.
3. Показано, что относительное количество Т-лимфоцитов увеличивается в независимости от дозы и вида облучения;
субпопуляции зрелых Т лимфоцитов CD4+ и CD8+ практически не отличались между собой по радиочувствительности.
4. Установлено, что относительное количество естественных киллеров увеличивается как при двукратном, так и при пролонгированном облучении и существенно не изменяется после острого облучения.
5. Степень иммунологических сдвигов в иммунном статусе обезьян находится в прямой зависимости от характера и длительности воздействия ионизирующего излучения. Показано, что более быстрое восстановление клеточного звена иммунитета происходит после двукратного облучения в сравнении с пролонгированным.
6. Установлены выраженные индивидуальные особенности в показателях клеточного и гуморального звеньев иммунитета у обезьян в процессе облучения.
7. Полученные результаты свидетельствуют о том, что обезьяны могут, служить адекватной биомоделью для воспроизведения различных иммунодефицитных состояний людей, и для отработки эффективных методов профилактики и лечения космонавтов от космического излучения в условиях межпланетного полета.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Игнатова И.Е., Агрба В.З. Изучение клеточного звена иммунитета после воздействия гамма-облучения // Студенческие научные исследования в сфере туризма и курортного дела. Материалы I Всероссийской студенческой научно-практической конференции 5-8 февраля 2007, г.
Сочи. – С. 322-323.
2. Игнатова И.Е. Состояние иммунитета у обезьян, подвергшихся хроническому гамма-облучению // Медицинская наука и здравоохранение. Материалы V научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России, 23-26 апреля 2007, г. Анапа. – С. 20-24.
3. Корольков В.И., Лапин Б.А., Петров В.М., Лазарев А.О., Агрба В.З., Игнатова И.Е. и др. Итоги первого этапа проекта «Гамма Бриз» // Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах. Материалы международной научной конференции 19-22 сентября 2007, г., Сочи-Адлер. – С. 229-236.
4. Игнатова И.Е., Агрба В.З., Яковлева Л.А., Борунова А.А., Лазарев А.О. и др. Клеточный и гуморальный иммунитет у обезьян подвергшихся хроническому гамма-облучению // Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах. Материалы международной научной конференции 19-22 сентября 2007 г., Сочи Адлер. – С. 237-243.
5. Игнатова И.Е., Агрба В.З. Показатели клеточного звена иммунитета у приматов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010. – Т. 149, № 1. – С. 93-96.
6. Игнатова И.Е., Агрба В.З., Лапин Б.А. Влияние малых доз гамма облучения на содержание иммунокомпетентных клеток в модельном эксперименте на приматах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010. – Т.150, № 7. – С. 90-93.
7. Игнатова И.Е., Агрба В.З., Гварамия И.А., Кутовой М.С. Состояние клеточного и гуморального иммунитета у макаков резус, подвергшихся ионизирующему облучению // Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской приматологии. Материалы второй международной научной конференции 8-10 августа 2011 г., Сочи-Адлер. Т. 2. – С. 23-32.