Модуляция нейрогенеза у мышей и крыс разных генотипов. анализ поведения
На правах рукописи
ТИМОШЕНКО Татьяна Валерьевна
МОДУЛЯЦИЯ НЕЙРОГЕНЕЗА У МЫШЕЙ И КРЫС РАЗНЫХ
ГЕНОТИПОВ. АНАЛИЗ ПОВЕДЕНИЯ
Специальность 03.00.13 – физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва, 2009
Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики поведения кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета Московского государственного уни верситета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН.
Научные руководители: доктор биологических наук Полетаева Инга Игоревна кандидат биологических наук Ревищин Александр Владимирович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ковальзон Владимир Матвеевич доктор биологических наук, профессор Викторов Илья Васильевич
Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН
Защита состоится «7» декабря 2009 г. в «15.30» часов на заседании диссертационного со вета Д 501.001.93 Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу:
119991, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет, МГУ, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.
М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «6» ноября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Умарова Б. А. Актуальность проблемы. Формирование центральной нервной системы млекопи тающих в онтогенезе происходит под влиянием генотипа и среды, и при взаимодействии этих факторов. Кроме этого, развивающийся мозг может реагировать на значительное число внешних воздействий, иногда чуждых нормальному «набору» средовых факторов, необходимых для нормального развития. В числе таких воздействий могут быть вещества, обладающие способностью стимулировать нейрогенез взрослого мозга. Выявление потен циала для возобновления нервных и глиальных клеток во взрослом мозге заставило нев рологов пересмотреть целый ряд, казалось бы, прочных представлений, касающихся по тенциала восстановительных процессов в центральной нервной системе (Kempermann et al., 2004, Elder et al., 2006 и др.). Иными словами, «переоткрытое» в 80-90-х годах XX ве ка явление нейрогенеза взрослого мозга позволяет по-новому подойти к проблеме регене ративных возможностей ЦНС. Это служит основой для развития новых медицинских тех нологий, позволяющих использовать нейральные стволовые клетки для коррекции и лече ния как нейродегенеративных заболеваний, так и последствий травмы мозга разного гене за (Викторов, 2001).
В последнее время все больший интерес вызывает и теоретический аспект пробле мы нейрогенеза взрослого мозга, т.е. вопрос о том, как можно использовать этот феномен для анализа развития нервной системы в целом (Корочкин и др., 2006). Модуляция интен сивности нейрогенеза взрослого мозга может быть одним из путей экспериментального изучения регенеративных способностей мозга и закономерностей процессов развития (Корочкин, 2001).
Нейрогенез взрослого мозга локализуется в основном в двух областях ЦНС, в них активная пролиферация клеток происходит в течение всей жизни особи. Это субвентрику лярная зона боковых желудочков и зубчатая фасция гиппокамповой формации (Altman, 1965, 1969;
Luskin, 1993;
Palmer, 1995;
Reynolds, Weiss, 1992;
Викторов, 2001).
Вмешательство в ход онтогенеза, например, путем неонатальных воздействий не редко видоизменяет нормальные процессы развития таким образом, что их последствия могут быть обнаружены даже во взрослом мозге. Одним из возможных механизмов реали зации таких отдаленных эффектов ранних воздействий и может быть изменение в темпах нейрогенеза. К факторам, которые модулируют темпы нейрогенеза взрослого мозга, отно сятся: 1) содержание животных в обогащенных условиях среды (Kempermann et al., 2002, Ra et al., 2002);
2) содержание животного в изоляции от сородичей (Ibi et al., 2008);
3) мо дуляция продукции NO;
4) введение BDNF (а также других трофических факторов) (Wag ner et al., 1999 и др.);
5) особенности гормонального статуса, а также 6) генотипические особенности животных исследуемого вида (Kempermann et al., 1997, Almgren et al., 2007, Perfilieva et al., 2001, Hayes, Nowakowski, 2002). Однако данных о том, как эффект подоб ной модуляции (усиление или ослабление нейрогенеза) сказывается на функции ЦНС, практически нет. В связи с этим очевидна необходимость экспериментального исследова ния изменений в мозге и поведении животных, как следствия таких модулирующих ней рогенез воздействий. Полученные в таких работах данные могут способствовать выясне нию механизмов влияния изменения нейрогенеза на функции ЦНС. Подобные исследова ния актуальны как для фундаментальных биологических дисциплин, так и для практиче ской медицины и фармакологии.
Цели и задачи. Целью настоящей работы было выяснить, в какой степени интен сификация клеточной пролиферации в мозге лабораторных мышей и крыс путем введения химических агентов в раннем онтогенезе влияет на число делящихся клеток спустя разные интервалы времени после прекращения таких воздействий, а также каковы их отдаленные эффекты - как изменяется поведение этих животных во взрослом возрасте.
Для выяснения этих вопросов в настоящем исследовании были поставлены сле дующие задачи:
1. Изучить влияние введения новорожденным детенышам мышей и крыс ингибитора NO-синтазы L-NAME (N-omega-nitro-L-arginine methyl-ester – NG-нитро-L аргинин-метил-эфир) и нейропептида семакса (синтетического аналога фрагмента АКТГ4-10) на пролиферативную активность в зубчатой фасции гиппокампа у жи вотных разных генотипов и оценить влияние сроков введения этих веществ на ин тенсивность подобных эффектов.
2. Исследовать отдаленные эффекты неонатального введения L-NAME и семакса де тенышам крыс линии КМ и Вистар на их предрасположенность к аудиогенной эпи лепсии в 1 мес. возрасте.
3. Исследовать отдаленные эффекты неонатального введения L-NAME и семакса де тенышам мышей и крыс разных генотипов на их поведение во взрослом возрасте.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что вве дение L-NAME и семакса детенышам мышей и крыс в течение первых трех недель пост натального развития усиливает уровень пролиферации в зубчатой фасции гиппокампа, в том числе и в периоды после прекращения инъекций (с более четким эффектом введения семакса). Впервые продемонстрировано, что неонатальное введение этих препаратов влияет на формирование реакции тревоги у взрослых мышей и крыс, и этот эффект зави сит от генотипа. Стимулирующий эффект неонатального введения семакса и L-NAME на решение мышами двух линий когнитивных тестов, а также дифференциальное генотип зависимое влияние неонатального введения семакса на аудиогенную эпилепсию взрослых крыс были также показаны впервые. Полученные результаты позволяют расширить пред ставления о механизмах действия данных неонатальных воздействий на ЦНС и могут служить теоретической основой для разработки новых медицинских подходов для кор рекции функций ЦНС, а также для создания новых фармакологических препаратов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены и доложены на международ ной летней школе по нейрогенетике (Москва, 2005), на международной летней школе по поведению животных и нейрогенетике (МГУ-Университет Цюрих-Ирхель, 2006), на кон ференции молодых ученых (Ин-т ВНД, Москва, 2007, 2009), на IV Всероссийской конфе ренции по поведению животных (Москва, 2007), на ХХ съезде физиологического об-ва (Москва, 2007), на VI FORUM FENS (Женева, 2008), на VI международном симпозиуме по экспериментальной и клинической нейробиологии (Кошице, 2008), на III международ ной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008), на международной конференции па мяти О.С. Виноградовой (Пущино, 2009), на 11 Meeting of IBANGS (Дрезден, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация имеет объем 185 страниц, состоит из вве дения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения и выводов, а также списка цитированной литературы (364 источников). В работе содержит ся 14 таблиц и 26 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа проводилась на самцах и самках крыс и мышей, число животных в разных се риях приведено при описании результатов соответствующих экспериментов. Суммарно в работе было использовано 350 мышей и 174 крысы.
Эксперименты проводили с мышами линий 101/HY (инбредная линия, окраска шер сти агути, белобрюхие, генотип Аw, H-2k) и C3H (окраска шерсти агути, генотип +, h-2k) (Бландова и др., 1971) и крысами линии КМ (инбредная линия с высокой предрасполо женностью к аудиогенной эпилепсии) и Вистар (аутбредная линия, низкая предрасполо женность к аудиогенной эпилепсии).
В неонатальный период (в его разные сроки) животным в течение 5 дней вводили подкожно с помощью микрошприца либо L-NAME (доза 50 мкг/кг), либо семакс (доза мг/кг). Контрольную группу составили интактные животные, а также (в ряде серий экспе риментов) животные, которым в те же сроки вводили дистиллированную воду (для кон троля эффекта болевой стимуляции). В период инъекций вес животных опытной группы определяли ежедневно – было показано, что он не отличался от такового контрольных групп (данные не приводятся).
Уровень пролиферации в зубчатой фасции гиппокампа. Оценку интенсивности пролиферации в зубчатой фасции гиппокампа проводили на срезах мозга крыс и мышей в разные сроки после окончания инъекций семакса или L-NAME (табл. 1, 2). Фиксацию мозга проводили путем транскардиальной перфузии (PBS, 4% раствор параформальдеги да) после введения животному летальной дозы уретана. Мозг извлекали и на заморажи вающем микротоме получали фронтальные срезы в области дорсального отдела зубчатой фасции гиппокампа. Для выявления пролиферирующих клеточных элементов (оценки ин тенсивности делений в зубчатой фасции гиппокампа) проводили иммуногистохимическую окраску на маркерный белок делящихся клеток Ki67, а также на предварительно инъеци рованный бромдеоксиуридин (BrdU). Для выявления вновь появившихся нейрональных предшественников срезы окрашивали на маркерный белок нейробластов – даблкортин (DCX). Далее на 5 фронтальных срезах (в области дорсального отдела зубчатой фасции) подсчитывали окрашенные клетки под визуальным контролем (микроскоп Olympus CX- c флуоресцентной насадкой, оснащенный цифровой фотокамерой Olympus Camedia C 4000 ZOOM).
Тестирование поведения взрослых животных. Тестирование предрасположенно сти к аудиогенной эпилепсии. Тест проводили с крысами КМ и Вистар в возрасте 1 мес.
Животное помещали в звукоизолирующую камеру и в течение 1 мин подвергали дейст вию сильного звука (звонок, 90 дБ). Регистрировали наличие или отсутствие аудиогенного судорожного припадка (АП). АП проявлялся в виде двигательного возбуждения, а затем клонических и тонических судорог. Регистрировали время начала самого АП и его от дельных фаз, а также его интенсивность в условных баллах. Интенсивность вздрагивания животных на включение звука (стартл-реакции), которое предшествовало развитию АП (или не сопровождалось АП) также оценивали в условных баллах.
Тест «открытое поле» (эксперименты с крысами и мышами). Использовали круг лую арену: d=1 м., сторона квадрата – 10 см (для мышей), 20 см (для крыс), 25 отверстий – «норок», длительность теста – 3 мин. Регистрировали число пересеченных сторон квадра тов на периферии и в центре арены, число вставаний на задние лапы и заглядываний в от верстия, число и длительность эпизодов груминга и замирания, а также число фекальных болюсов.
Тест приподнятого крестообразного лабиринта (эксперименты с крысами и мы шами). Лабиринт - это крестообразная платформа, приподнятая на 73 см от пола (2 откры тых и 2 закрытых рукава, размером 50x10 см для крыс и 35 x 7 см для мышей, высота стенок 30 см для крыс и 25 – для мышей). Длительность теста 3 мин. Вручную оценивали число выходов животного в светлые рукава и время, там проведенное, число «свешива ний» с открытых рукавов, переходов «темный рукав-темный рукав», выглядываний из них, вертикальных стоек и число фекальных болюсов.
Тест «закрытого крестообразного лабиринта» (эксперименты с мышами) - прово дили с помощью камеры с центральным и 4 боковыми отсеками (15х15 см. каждый).
Мышь помещали в центральный отсек и давали возможность сделать 13 заходов в боко вые отсеки. В ходе эксперимента в полуавтоматическом режиме регистрировали число, и последовательность заходов в боковые отсеки. Использованная компьютерная программа (автор д.б.н. Р.М. Салимов) позволяла оценить ряд временных показателей поведения, по следовательность посещения отсеков, а также общую длительность теста, т.е. время, кото рое потребовалось мыши, чтобы совершить 13 заходов в боковые отсеки.
Акустическую «стартл-реакцию» в ответ на короткий щелчок (эксперименты с мы шами) оценивали в баллах по условной шкале.
Тест «неизбегаемая скользкая воронка» (эксперименты с мышами) (стеклянная во ронка, наружный диаметр 27 см, внутренний - 5 см., температура воды + 200 C). Мышь помещали в горло воронки в воду на 3 мин., в полуавтоматическом режиме регистрирова ли время и число эпизодов следующих типов реакций – 1) активного избавления (попытки выпрыгнуть), 2) пассивного избегания (поза над водой в горловине воронки), 3) иммоби лизация - состояния неподвижности. Первые две реакции относились к «активным» стра тегиям поведения, третья – к пассивным.
Способность к экстраполяции направления движения пищевого стимула (опыты с мыша ми) оценивали в специальной камере после 18 часов питьевой и пищевой депривации. В камере мышь начинала пить молоко через центральное отверстие, после чего корм пере мещали вправо или влево и он скрывался из поля зрения животного. Правильным решени ем был подход к тому боковому отверстию, в направлении которого исчез корм. Успеш ность выполнения теста оценивали по доле (%) правильных решений при первом его предъявлении, а также при многократных (6-18) предъявлениях.
Тест «поиск входа в укрытие». Тест основан на стремлении животного избегать ярко освещенное пространство. Его проводили в специальной камере, разделенной на светлый и темный отсек с лазом между ними, который после знакомства животного с ним в даль нейшем маскировали, насыпая стружку. Данные теста приведены в диссертации.
Статистическая обработка данных. Использовали пакет статистических про грамм Statistica 6. Оценку различий числа клеток в зубчатой фасции гиппокампа крыс и мышей после неонатального введения семакса и L-NAME проводили с помощью t критерия Стьюдента или критерия Манна-Уитни. При сравнении поведения взрослых животных (отличие показателей опытных групп от контрольных) использовали ANOVA, с post hoc оценкой по LSD, а также критерий 2. Отличие долей животных, способных к решению теста на экстраполяцию, от случайного 50 % уровня проводили с помощью ме тода 2 (критерий Фишера).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние неонатального введения семакса и L-NAME на пролиферацию и нейрогенез в мозге крыс и мышей.
Пролиферативную активность в мозге крыс оценивали в трех сериях опытов, мышей – в четырех, различавшихся по возрасту начала введения веществ, а также по возрасту жи вотных, когда им была проведена перфузия мозга (табл. 1, 3).
Пролиферативная активность в мозге крыс. Клетки, окрашенные иммуногистохимиче ски с помощью антител к белку Ki-67 располагались в субгранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа крыс (рис. 1). Ki-67 используют как маркер, поскольку он экспресси руется в клетке, вступившей в митотический цикл (Schluter et al., 1993). Сроки введения семакса и сроки перфузии мозга представлены в табл.1.
А Б Рис. 1. Микрофотографии срезов зубчатой фасции гиппокампа крыс КМ, окраска на Ki-67. А - крыса в воз расте 14 дней, инъекции семакса с 7-го по 11 дни жизни, Б - интактная крыса того же возраста. Масштаб 100 микрометров.
В трех сериях экспериментов с крысами линии КМ число маркированных клеток на срезах мозга животных опытных групп было достоверно выше, чем в контроле (табл.1).
Наибольшие различия между группами наблюдали в 3-й серии, когда интервал между окончанием введения семакса и перфузией мозга составлял 9 суток. В этой серии значения чисел клеток для опытных крыс превышали контрольные почти в 2 раза.
Таблица Число пролиферирующих клеток в субгрануляной зоне зубчатой фасции гиппокампа крыс линий КМ и Вистар после неонатального введения семакса Семакс# Контроль# Семакс& Контроль& Линия № серии, возраст инъекций и перфузии, число животных (n) * КМ 1. Семакс с 7-го по 11-й дни, пер- 281+16 207,7+11,9 195,13+7, 280,43+7, фузия – 13 день, опыт - n=2, кон- 231,8+10,4 199,9+7, троль – n=2 328,5+15,1 177,8+7, * 2. Семакс с 13-го по 17-й дни, 108,9+5,2 53,7+5,2 58,93+ 106,73+3, перфузия – 18-й день, опыт - n=3, 111,1+6 58,9+5, контроль – n=3 100,2+6 64,2+4, * 3. Семакс с 10-го по 14-й дни, 120,1+9,4 57,6+3,4 58,6+2, 99,62+7, перфузия -23-й день, опыт - n=4, 89,2+5,5 53,7+5, контроль – n=4 86,1+9,9 58,9+5, 103,1+2,4 64,2+4, * Вистар 4. Семакс – с 10-го по 14-й дни, 141,1+8,5 90,8+6,9 94,77+3, 146,37+7, перфузия - 17-й день, опыт - n=5, 130,7+8,5 86,1+8, контроль – n=4 172,2+11,6 102,6+ 141,5+10,4 99,6+6, * 5. Семакс - с 14-го по18-й дни, 69,8+7,2 41,6+2,3 35,75+4, 71,7+4, перфузия – 25-й день, опыт - n=4, 62,4+5,1 22,2+4, контроль – n=4 69,3+5,6 42,3+5, 85,4+7,8 36,9+5, 6. Семакс с 10-го по 14-й дни, 86,5+11,6 44,5+7 89,5+3,2 51,4+6, перфузия -15-й день, опыт - n=3, 96+5,4 58,3+ контроль – n=3 86,1+ # - среднее количество клеток на срезе у одного животного данной группы, & - среднее количество клеток на срезе у всех животных данной группы, * - достоверно отличается от значений контрольной группы при р 0, Сходное соотношение между контрольными и опытными животными было получено и во второй серии экспериментов, когда мозг животных был фиксирован на следующий день после окончания введения семакса. Можно, таким образом, заключить, что стимули рующее влияние введения семакса новорожденным крысам на пролиферацию клеток в зубчатой фасции гиппокампа продолжается, по крайней мере, 9-10 дней после окончания введения этого вещества. Наименьшие различия между опытом и контролем были полу чены в 1-й серии, в которой семакс вводили животным в течение 5 дней, начиная с 7-го дня жизни. В этот период постнатального онтогенеза абсолютные значения чисел проли ферирующих клеток в этой области мозг у животных этого возраста были наивысшими.
Ранее было показано (Faiz et al., 2005), что уровень пролиферации в зубчатой фасции гип покампа новорожденных крыс максимален в период с 9-го по 12-й дни жизни, а затем бы стро снижается. Возможно, что ввиду этого стимулирующее влияние введения веществ в данном возрасте оказалось менее выраженным. У крыс Вистар (табл.1) реакция на введе ние семакса была такой же, как и у крыс линии КМ - число делящихся клеток в опытных группах после инъекций семакса было достоверно выше, чем в контроле (p0,05, крите рий Манна-Уитни). Более четким это различие было у крыс Вистар в той серии, когда се макс вводили с 10-го по 14-й дни, а перфузию осуществляли на 17-й день (серия 4, табл.1).
Таким образом, уровень пролиферации в зубчатой фасции гиппокампа у крыс КМ и Вистар, которым вводили семакс, был существенно выше, чем у контрольных животных.
Отметим, что значимых межлинейных различий в этом эффекте выявлено не было.
Таблица Число новых клеток в субгрануляной зоне зубчатой фасции гиппокампа крыс линий КМ и Вистар после неонатального введения L-NAME L-NAME# Контроль# L-NAME& Контроль& Линия № серии, возраст инъекций и перфузии, число животных (n) 64,5+3,2 46,3+ КМ, L-NAME с 7-го по 11-й дни, перфузия – 15 день, опыт - n=3;
* 54,4+3 20,9+2,7 30,4+7, 61,2+3, контроль – n= 64,7+4,8 24,2+3, 53+3,8 49,3+5, Вистар L-NAME с 9-го по 13-й дни, пер фузия – 18-й день, опыт - n=4;
* 61,9+7,8 38,5+2,6 44,7+2, 60,3+2, контроль – n= 60,25+4,1 43,5+5, 65,9+5,9 47,5+4, # - среднее количество клеток на срезе у одного животного данной группы, & - среднее количество клеток на срезе у всех животных данной группы, * - дост. отличается от значений контрольной группы при р 0,05.
Эксперименты с неонатальным введением L-NAME показали, что влияние этого воз действия на нейрогенез было сходным с таковым семакса. Число пролиферирующих кле ток в мозге крыс, которым в раннем возрасте вводили L-NAME, было выше, чем в кон трольной группе (табл. 2). Различия между суммарными числами клеток в зубчатой фас ции крыс контрольных и опытных групп были достоверны (р0,05, критерий Манна Уитни). Устойчивых межлинейных различий в числе пролиферирующих клеток в мозге крыс линий КМ и Вистар после неонатального введения ингибитора оксида азота, как и при введении семакса, обнаружено не было.
Стимулирующее влияние введенных препаратов может затронуть и формирование нейробластов (клеток-предшественниц нейронов). Клетки, которые в дальнейшем будут дифференцироваться в нейроны, начинают экспрессировать специфический для них бе лок, ассоциированный с микротрубочками - даблкортин (DCX). Эти нейрональные клет ки-предшественницы начинают производить DCX вскоре после входа в клеточный цикл с затуханием экспрессии через 2-3 недели, ко времени окончательного превращения их в зрелые нейроны. Такая картина экспрессии DCX позволяет использовать его в качестве маркера собственно нейрогенеза (Gleeson et al., 1999).
Для выявления нейробластов было проведено иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга с использованием антител к даблкортину - DCX (Couillard-Despres et al., 2005). Использование этого маркера показало, что у крыс число клеток, иммунопозитив ных к DCX (т.е. нейробластов) в зубчатой фасции гиппокампа мозга после введения се макса было достоверно выше (р 0,05), чем в контроле. При этом у крыс линии Вистар этот эффект был выражен более четко, чем у крыс линии КМ (данные приводятся в дис сертации).
Таким образом, вследствие использованных в работе воздействий, по всей видимо сти, в гиппокампе изменилось и число новых клеток, дифференцирующихся в нейроны.
Таблица Число пролиферирующих клеток в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа мышей ли ний 101/HY и С3Н после неонатального введения семакса Семакс # Семакс & Контроль & Линия № серии, возраст инъекций и Контроль # перфузии, число животных (n) 1. 5 - 10 дни, перфузия – 11 185,25+10,4 115+6, день, опыт - n=4, контроль - 168,4+6,7 104,4+10, * n=4 130,7+7,7 113+5,9 109,3+2, 153,5+13, 129,9+3,8 104,7+6, 101/HY 2. 7 - 11 дни, перфузия – 22 37,2+3 23,8+3, * день, опыт - n=3, контроль - 36,5+2,2 30,5+2,5 26,2+2, 35,8+ n=3 33,84+3 24,5+1, 3. 7 - 11 дни, перфузия – 14 54,2+4,1 43,7+4, * день, опыт - n=3, контроль - 52,3+6,9 34+4,3 38,8+2, 53,2+0, n=3 53,1+2,6 38,7+2, 4. 11 - 15 дни, перфузия – 24 24,8+2,6 16,3+ ** дня, опыт - n=6, контроль - 37,6+4,9 8,1+1,2 11+1, 30,1+ n=6 26,2+2,6 8+1, 34,3+3,3 13,1+1, 29,7+3 12,2+1, 28,3+3,2 8,4+1, 5. 5 - 11 дни, перфузия – 11 124,2+10,9 114,9+11, * день, опыт - n=3, контроль - 139,5+9,6 119,9+10,1 116,6+1, 135,1+5, n=3 141,6+14,3 115+6, 6. 7 - 11 дни, перфузия – 20 44,7+2,5 29,4+ * день, опыт - n=3, контроль - 50,3+7,3 38+3,9 32+2, 47,7+1, n=3 48,18+5,3 28,8+2, C3H 7. 16 - 20 дни, перфузия – 22 50,24+4,7 34,2+4, * день, опыт - n=3, контроль - 50,33+6,7 37,9+4,1 35,8+ 50+0, n=3 49,5+6,5 35,3+4, 8. 10 - 14 дни, перфузия – 23 24,4+2,4 21,6+1, дня, опыт - n=5, контроль - 27,35+2,8 24+3, ** n=5 31,2+2,8 25,5+2,4 22,9+0, 31,3+2, 36,2+3,9 23,2+2, 37,5+2,1 20,4+2, # - среднее количество клеток на срезе у одного животного данной группы, & - среднее количество клеток на срезе у всех животных данной группы, * - достоверно отличается от значений контрольной группы при ** р 0,05;
- при р 0,01.
Пролиферативная активность в мозге мышей. Эксперименты по неонатальному введению семакса и L-NAME мышам линии 101/HY и С3Н также обнаружили стимули рующее влияние этих воздействий на пролиферативную активность клеток в зубчатой фасции гиппокампа. На срезах мозга мышей, получавших инъекции семакса, обнаружива ется некоторое увеличение числа клеток, иммунопозитивных к Ki67, по сравнению с кон трольными животными (табл. 3). Отметим, что число таких клеток на срезах мозга мышей обеих линий в сериях 1 и 5 (при перфузии сразу после окончания инъекций семакса) было значительно выше, чем в случаях, когда мозг был перфузирован в более поздний срок.
Неонатальное введение L-NAME мышам обеих линий также увеличивало число делящих ся клеточных элементов в этой зоне мозга, что можно было обнаружить спустя разные сроки после прекращения воздействий. Это было показано главным образом при иммуно гистохимическом окрашивании на Ki67, но также и в экспериментах с BrdU и рибонукле отидредуктазой (данные приводятся в диссертации). Окрашивание на Ki67 выявило стати стически достоверные различия между животными контрольной и опытной групп. При этом межлинейных различий выявлено не было.
При количественной оценке числа клеток, дифференцирующихся по нейрональному пути, в гиппокампе мышей линии C3H, как и в мозге крыс (см. выше) было обнаружено достоверное (р0,01) увеличение числа молодых нейробластов (иммуногистохимическая окраска на DCX) в опытной группе по сравнению с контролем (данные в автореферате не приводятся). Мозг мышей линии 101/HY в экспериментах с DCX исследован не был. В целом в мозге мышей различия числа маркированных клеток между опытными и кон трольными группами были слабее, чем у крыс. Это, по всей видимости, является проявле нием межвидовых различий по этому признаку.
Наши данные показали, что при интенсификации пролиферативной активности в зубчатой фасции после введения новорожденным мышам семакса и L-NAME происходит достоверное увеличение по сравнению с контролем и числа молодых нейробластов. Сле довательно, неонатальное введение семакса и L-NAME, увеличивает уровень нейрогенеза в этой структуре Таким образом, введение семакса и L-NAME в раннем периоде онтогенеза вызыва ет усиление пролиферативной активности в субгранулярном слое зубчатой фасции гиппо кампа мышей и крыс спустя разные сроки после прекращения непосредственного дейст вия этих соединений. При этом наибольший стимулирующий эффект был в случаях, когда вещества вводились в более ранние сроки постнатального развития. В экспериментах по казано, что действие активирующих нейрогенез веществ, использованных в нашей работе, является пролонгированным, эффект их введения на деление клеток в пролиферативной зоне гиппокампа сохраняется как минимум до 2 недель.
Заключая изложение морфологической части работы, следует отметить, что описа ние активирующего пролиферацию в зубчатой фасции гиппокампа действия неонатально введенного семакса дано впервые, а описанный ранее такой же эффект L-NAME - под твержден (Peunova, Enikolopov, 1995;
Virgili et al., 1999;
Matarredona et al., 2003).
Влияние неонатального введения семакса и L-NAME на поведение Эксперименты на крысах. Аудиогенная эпилепсия. Крысам линии КМ и Вистар в воз расте от 7 до 11 дн. ежедневно вводили либо L-NAME (доза 50 мг/кг, КМ, n=32, Вистар, n=14), либо семакс (доза 50 мг/кг, КМ, n=9, Вистар, n=12). Контрольными служили ин тактные крысы КМ (n=25) и Вистар (n=13) и крысы после неонатальной болевой стиму ляции, КМ (n=12) и Вистар (n=5). Аудиогенную эпилепсию тестировали в возрасте 1 мес, поскольку у крыс КМ в этом возрасте интенсивность АП еще не достигла максимума, и это давало возможность наблюдать возможное усиление и ослабление данного признака (Семиохина и др., 2006). Достоверных различий в показателях АП между самцами и сам ками выявлено не было, поэтому данные рассматриваются суммарно.
Двухфакторный ANOVA (факторы «линия» и «воздействие») для условного балла АП (как показателя его интенсивности) показал достоверное влияние линии (F1-96=74.585, p=0.0000) и тенденцию к взаимодействию влияния факторов линии и воздействия (F1 96=2.578, p=0.0804). Это означает, что неонатальное введение семакса и L-NAME вызвало разнонаправленные изменения среднего балла АП у крыс двух линий. LSD анализ пока зал, что интенсивность АП была достоверно (p=0.0008) выше у крыс КМ с ранним введе нием семакса по сравнению с интактной контрольной группой (2.16±0.15 и 1.46±0.13, со ответственно). Непараметрический тест медианы выявил достоверность усиливающего эффекта раннего введения семакса у крыс КМ (2=15.27, df = 2, р=0.0005). После неона тального введения L-NAME балл АП у крыс КМ был также выше, чем у интактных, но не достоверно. У крыс Вистар средний балл АП был достоверно (р=0.0000) ниже, чем у крыс КМ (для групп интактного контроля - 0.31±0.23 и 1.46±0.13, соответственно), а изменения интенсив ности АП у крыс Вистар после неонатальных воздействий были недостоверными (рис. 2, А).
Двухфакторный ANOVA величин ЛП развития АП выявил достоверность влияния обоих факторов (линии - F1-96=76.01, p=0.0000 и воздействия - F=12.26, p=0.0000), а также их взаимодействия (F1 96= 18.74, р=0.0000). У крыс КМ (тест LSD) была выявлена лишь тенденция к укорочению ЛП как последствие ранних воздействий. По тесту медианы у крыс Вистар после неонатального введения семакса и L-NAME ЛП был достоверно длиннее (тест 2= 6,00, df = 2, p =0.05), чем у интактных крыс этой линии (рис. 2, Б).
А Б Рис. 2. Аудиогенная эпилепсия у крыс КМ и Вистар в возрасте 1 мес после неонатального введения семакса и L-NAME в возрасте от 7 до 11 дней жизни. На этом рис. и далее: белые столбики - интактные жи вотные, косая штриховка – неонатальное введение физиологического раствора (болевая стимуляция), серые столбики – неонатальное введение семакса, черные – неонатальное введение L-NAME. А – средняя интен сивность аудиогенного приступа в условных баллах (± ошибка среднего), Б – средний латентный период аудиогенного приступа, в с, (± ошибка среднего). * - достоверно отличается от показателя крыс после не онатального введения семакса, p0.05, # - достоверно отличается от интактной группы и групп с неонаталь ным введением L-NAME и с неонатальной болевой стимуляцией p0.01.
Неонатальное введение семакса и L-NAME вызвало также изменения и в интенсив ности реакции вздрагивания, возникавшей в ответ на включение звонка. Двухфакторный ANOVA выявил достоверное влияние фактора линии (F=11.30, p=0.0010), фактора воздей ствия (F=9.19, p=0.0002) и достоверное взаимодействие этих факторов (F=5.40, р=0.0058).
Стартл-реакция была более интенсивной у крыс Вистар, но у опытной группы крыс в ре зультате ранних воздействий она практически не изменилась (2.08±0.28, 2.28±0.27, 2.00±0.29). У крыс КМ раннее введение семакса вызвало достоверное усиление этой реак ции (по сравнению с интактной группой, р=0.0089), а введение L-NAME – вызвало ее дос товерное ослабление (р=0.0002). Можно сказать, что изменения стартл-реакции у иссле дованных групп животных были, в целом, параллельны различиям в показателях АП.
Таким образом, после неонатального введения семакса и L-NAME реакция на силь ный звук (АП и стартл-реакция) у 1 мес крыс КМ и Вистар была изменена, причем были обнаружены как межлинейные различия в интенсивности реакций, так и разное «направ ление» этих изменений.
В то же время в картине отдаленных эффектов воздействий обоих типов был выяв лен и общий компонент – изменение фенотипической картины припадка. В эксперимен тальных группах крыс включение звука вызывало типичное для АП двигательное возбуж дение, а затем после клонических мышечных сокращений, судороги приобретали ано мальный характер – в них проявлялся отчетливый каталептический компонент - животное застывало в вычурной позе при сохранении мышечных судорог. В ряде случаев судороги протекали при положении животного «на спине», чего никогда не наблюдалось ни у ин тактных крыс разных генотипов, ни после введения каких-либо фармакологических пре паратов.
Эксперименты на крысах. Тест «открытое поле». Анализ данных этого теста, проведенно го у 2 мес. животных, показал, что у взрослых крыс неонатальное введение семакса и L NAME повлияло и на уровень локомоторной активности (рис. 3), а также на показатели состояния страха-тревоги (при попадании на открытое пространство арены).
Рис. 3. Тест «открытое поле». Уровень двигательной активности крыс КМ и Вистар на периферии арены по минутам теста. По оси ординат – число пересечений сторон квадратов. Обозначения как на рис.2.
* - достоверно (р0.05) отличается от группы интактных крыс, ** - достоверно отличается (p0.01) от ин тактных крыс и крыс после неонатального введения семакса.
Двухфакторный ANOVA для показателя «активность на периферии арены» в 1-ю минуту теста (1-й фактор – генотип, 2-й фактор – воздействие) показал достоверность влияния фактора генотипа (F1-96=24,9759, p=0,0000). Во вторую минуту теста этот показа тель находился под влиянием обоих факторов (линия – F 1-96=7.16, p=0.009, воздействие F1-96=3.26, p=0.045), а их взаимодействие также было достоверным (F1-96=3.27, p=0.0441).
LSD post hoc анализ показал, что как по отдельным минутам теста, так и суммарно у крыс Вистар уровень локомоторной активности (число пересеченных квадратов на периферии арены) был достоверно (p0.05) выше в группе животных, которым в неонатальном воз расте вводили семакс. Хотя влияние фактора «пол» по данным трехфакторного ANOVA не было достоверным, после неонатального введения семакса у всех самок (но не у сам цов) локомоторная активность этих животных во взрослом возрасте была выше, чем у ин тактных крыс. По непараметрическому тесту медианы это влияние было достоверным (2=8,618182, df=2, p=0,0134). Число квадратов, пересеченных в центре арены, как «обрат ный» показатель проявления тревожности, за 3 мин. теста суммарно у интактных групп КМ и Вистар было приблизительно одинаковым (и, в целом, невысоким - крысы редко выходили в центр арены). Неонатальное введение L-NAME вызвало у крыс КМ незначи тельное увеличение этого показателя по сравнению с контролем в первую минуту теста и резкое (достоверное, р0,05) его снижение в дальнейшем, т.е. по ходу теста произошло усиление состояния тревоги.
Уровень исследовательской активности (число «стоек») также обнаружил отдален ные эффекты неонатальных воздействий. У крыс КМ после неонатального введения се макса (но не L-NAME) число стоек было достоверно (р=0.0434) ниже, чем у интактных, а у крыс Вистар - их было достоверно больше (р=0.0022). Поскольку число «стоек» в тесте «открытого поля» в целом бывает обратно пропорционально показателям страха-тревоги, то изменение их числа после неонатального введения семакса может свидетельствовать об ослаблении тревожности у крыс Вистар и о ее усилении у крыс КМ. Число стоек значимо изменялось после неонатальных воздействий у самцов и самок крыс обеих линий в проти воположных направлениях. Об этом говорят данные трехфакторного ANOVA (факторы:
линия, пол и воздействие) - достоверное влияние фактора «линия» (F1-90=10.90, p=0.0014), пола (F1-90=5.38, р=0,0226) и взаимодействия трех факторов (F1-90=5.,90, р=0.0040).
Таким образом, введение семакса и L-NAME в ранний период жизни оказало влия ние и на уровень локомоторной активности, и на проявление страха открытого простран ства (квадраты в центре), и на число «стоек» спустя более 1,5 мес. после прекращения инъекций. Это означает, что тест «открытое поле» выявил межлинейные различия в эф фектах неонатального введения двух соединений. Противоположный характер изменений ряда показателей этого теста у крыс двух генотипов является, по нашему мнению, прояв лением генетических особенностей крыс КМ, поскольку им свойственна не только пред расположенность к развитию рефлекторных эпилептических припадков, но и некоторые особенности поведения (Семиохина и др., 2006).
Эксперименты на крысах. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ). В тесте приподнятого крестообразного лабиринта у взрослых крыс КМ и Вистар также был выяв лен ряд отдаленных эффектов введения семакса и L-NAME в неонатальном возрасте снижение исследовательского поведения (число «свешиваний»), а также изменения в ре акции испуга, которые данный тест позволяет четко регистрировать. Двухфакторный ANOVA выявил достоверное влияние только фактора «воздействие» (F1-90=6.98, р=0.0015), с наибольшим числом «свешиваний» с открытых рукавов ПКЛ у крыс интакт ных групп. Их среднее число было несколько (недостоверно) выше у Вистар. В группах после неонатального введения семакса и L-NAME этот показатель был ниже, причем у КМ достоверные отличия от интактных животных были и после семакса (р=0.0075), и по сле L-NAME (р=0.0341), тогда как у Вистар достоверными были только отличия интакт ной группы от группы с неонатальным введением L-NAME (р=0.0199).
Изменения в показателях этого теста, отражающих состояние страха-тревоги, выра зились в резком и высоко достоверном снижении времени пребывания в светлых частях лабиринта у крыс линии КМ. Двухфакторный ANOVA для признака «время в открытых рукавах» выявил достоверное влияние только фактора «воздействие» (F1-90=7.47, р=0.0010). Это время было максимальным у крыс интактных групп и достоверно (р=0.0164) выше у линии КМ по сравнению с Вистар. Неонатальные воздействия отчетли во снизили стремление крыс находиться на свету в период теста, и это снижение у крыс КМ было высоко достоверным (р=0.0049 для семакса и р=0.0008 для L-NAME). Избега ние светлых участков ПКЛ считается одним из наиболее надежных и устойчивых показа телей высокой тревожности животных. Число переходов между темными рукавами лаби ринта (которое является показателем уровня локомоторной активности животных в ПКЛ) было очень мало у крыс обеих линии, с практически полным их отсутствием у крыс КМ.
Возможно, что именно низкие величины этого признака у КМ не позволили выявить влияния неонатальных воздействий. По двухфакторному ANOVA было выявлено лишь влияние фактора «линия» (F1-90=3.25, р=0.0746).
Таким образом, данные двух тестов – и «открытого поля», и ПКЛ - позволили вы явить генотип-зависимые отдаленные эффекты введения крысам двух линий в неонаталь ный период семакса и L-NAME, выразившиеся в изменениях тревожности и исследова тельской активности животных.
Эксперименты на мышах. Данные о влиянии неонатального введения семакса на по ведение мышей двух линий в батарее тестов были получены в двух сериях опытов. В 1-й было использовано 50 мышей (самцов и самок) линии 101/HY (интактный контроль - 13, неонатальная болевая стимуляция – 12, семакс – 25, L-NAME - 15) и линии С3Н (интакт ные - 3, болевая стимуляция – 18, семакс – 18, L-NAME - 18). Во 2-й серии было 58 мы шей (самцов и самок) линии 101/HY (интактные - 18, болевая стимуляция – 8, семакс – 34, L-NAME - 8) и линии С3Н (интактные - 9, болевая стимуляция – 10, семакс – 4, L-NAME 8).
Эксперименты на мышах. Тест «открытое поле». Некоторые показатели поведения в этом тесте (например, уровень локомоции на периферии арены) обнаружили устойчивые межлинейные различия (рис. 4). После неонатального введения семакса мыши линии С3Н по данным двухфакторного ANOVA двигались достоверно больше, чем мыши 101/HY ( серия – F=4.41, р0.039, 2 серия – F=11.59, p=0.001).
После введения семакса уровень локомоции в центре арены за 2-ю мин теста обнару жил достоверное влияние фактора «линия» (F=6.14, p=0.021), с его более высоким уровнем у мышей С3Н. В обеих сериях опытов характер различий между экспериментальными группами мышей внутри каждой из линий был одинаковым. Число стоек снизилось после неонатальной болевой стимуляции по сравнению с интактной группой, а введение семакса сопровождалось подъемом этой величины, т.е. неонатально введенный семакс имел неко торый «нормализующий» эффект (рис. 5, Б).
В экспериментах по неонатальному введению L-NAME была иная картина. Число «стоек» за 2-ю мин теста обнаружило влияние обоих факторов – линии (F=6.71, p=0.016) и воздействия (F=4.80, p=0.039). Число «стоек», более высокое в контроле, после неонаталь ного введения L-NAME было ниже у мышей обеих линий (у С3Н – достоверно по LSD тесту, р0.05).
Рис. 4. Тест «открытое поле». Уровень локомоторной активности в последовательные минуты теста (число пересеченных сторон квадратов на периферии арены). Обозначения, как на рис.2. * - достоверное отличие (р0,05) от интактной группы мышей линии 101/HY А Б Рис. 5. Тест «открытое поле». А - число эпизодов груминга за 3 мин теста суммарно. Б - число «стоек» за мин теста суммарно. Обозначения: белые столбики - интактные мыши, косая штриховка - неонатальная бо левая стимуляция, серые - неонатальное введение семакса. * - достоверное отличие (р0,05) от интактной группы.
Отметим, однако, что изменения такого показателя состояния конфликта между со стоянием тревоги и исследовательской мотивацией, как число эпизодов груминга, подоб ному «правилу» не подчинялись. У мышей 101/HY оба воздействия уменьшили число эпи зодов умывания, тогда как у мышей С3Н этот показатель был повышен после неонаталь ной болевой стимуляции и остался выше, чем у интактных, после неонатального семакса (рис. 5, А). При этом в экспериментах с неонатальным подавлением активности NO синтазы суммарное число эпизодов груминга за все 3 мин теста (фактор «воздействие»
F=8.2, p=0.009), было выше у интактных мышей обеих линий по сравнению с группой по сле неонатального введения L-NAME.
Отмеченные выше изменения в числе эпизодов груминга (а также и времени, занято го грумингом, данные не приводятся), свидетельствуют не только об изменении реакции ЦНС на новую обстановку у взрослых мышей, но и о межлинейных различиях в направ лении этих эффектов. Выявились и межлинейные различия в направлении таких сдвигов двухфакторный ANOVA показал достоверность эффекта взаимодействия факторов (линии и воздействия). Примером может служить уровень локомоторной активности мышей в центре поля, т.е. число пересечений сторон квадратов в этой части арены (F=10.18, p= 0.0000). Таким образом, в экспериментах со взрослыми мышами после неонатальных воз действий в тесте «открытого поля» были выявлены генотип-зависимые изменения поведе ния.
Эксперименты с мышами. Тест приподнятого крестообразного лабиринта. Двухфак торный ANOVA выявил достоверное влияние фактора «воздействие» (F=4.41, p=0.038) на число выходов в открытые лучи лабиринта – один из показателей тревожности. В целом у мышей обеих линий наиболее эффективным (и снижающим тревожность по этому показа телю) было неонатальное болевое раздражение, тогда как эффект семакса был направлен в сторону снижения числа выходов в открытые рукава у мышей 101/HY (т.е. имело место усиление тревожности). Время, проведенное в открытых рукавах ПКЛ, у мышей после не онатального введения семакса в линии 101/HY было также достоверно короче (рис. 6).
Этот эффект отсутствовал у мышей С3Н.
А Б Рис. 6. Тест приподнятого крестообразного лабиринта. Неонатальное введение семакса. Обозначения, как на рис.2. А - число выходов в светлые рукава лабиринта. Б – время пребывания в открытых рукавах.
*,***- достоверно отличается от показателей интактной группы, p0.01, p0.001.
Эксперименты с мышами. Тест «закрытый крестообразный лабиринт». Данные этого теста свидетельствовали о межлинейных различиях в обследовании мышами этого лаби ринта. В целом их можно описать как более медленное и «менее эффективное» обследо вание среды лабиринта мышами линии 101/HY, по сравнению с С3Н (рис. 7). Мыши С3Н в целом совершали большее число патрулирований (за 13 «разрешенных» заходов), а один цикл патрулирования у них происходил за достоверно (р0.05) меньшее время, чем у мы шей 101/HY. В ряде показателей было выявлено несколько более эффективное обследова ние лабиринта самками. Неонатальное введение семакса вызвало у взрослых мышей обеих линий снижение эффективности обследования этой среды. В частности, у мышей линии 101/HY были достоверно (р0.05) более высокие, чем у интактных животных, показатели стереотипии в поведении (в частности, «число отставленных повторных заходов», р0.01), а также выше такие показатели как длительность цикла патрулирования и время, прове денное в центральном отсеке лабиринта. Изменения после неонатальных воздействий большого числа других показателей поведения были недостоверными и во многих случаях имели сходную направленность у обеих линий. А Б * * *** * * Общее время в Общее время в Время первого центре рукавах выбора Рис. 7. Тест «закрытый крестообразный лабиринт». Влияние неонатального введения семакса на показатели поведения. А - мыши линии С3Н, Б – мыши линии 101/HY. Обозначения, как на рис.2. *, *** - достоверно отличается от показателей группы после неонатального введения семакса при р 0.05 и 0.001, соответствен но.
Эксперименты на мышах. Стартл-реакция. Отдаленные эффекты неонатальных воздействий были обнаружены и в некоторых пробах при тестировании стартл-реакции.
Двухфакторный ANOVA обнаружил достоверное влияние фактора линии (в 1-й и с 3-й по 5-ю пробы, F15, p0.0001) с большей интенсивностью реакции у мышей С3Н. В первой пробе достоверным было также взаимодействие факторов (F=4.36, р=0.015), что отражает противоположное направление изменений у мышей двух генотипов. В то же время в двух пробах у мышей линии 101/HY после неонатальной болевой стимуляции интенсивность стартл-реакции была выше, чем у интактной группы. У мышей линии С3Н неонатальное введение семакса имело результатом снижение интенсивности стартл-реакции (достовер ное в сравнении с интактной группой), тогда как у линии 101/HY отдаленного эффекта семакса не выявлено. Интенсивность стартл-реакции после неонатального введения L NAME обнаружила мало различий между группами. В целом она была выше у мышей ли нии С3Н (достоверное влияние фактора «линия» для 3-й пробы, F=4.81. р=0.039), но не онатальное введение L-NAMЕ не вызвало достоверных изменений этого показателя.
Эксперименты с мышами. Тест «неизбегаемой скользкой воронки». Этот тест был предложен (Salimov et al., 1996) как аналог теста Порсолта, он оценивает соотношение разных стратегий поведения при реакции на стрессогенную обстановку, и, следовательно, по мнению авторов, и предрасположенность к развитию состояния депрессии. Изменения в поведении мышей двух линий могут свидетельствовать о некотором усилении тенден ции к депрессии (усилению выраженности пассивной стратегии) у мышей линии С3Н и некотором снижении ее - у 101/HY. У взрослых мышей С3Н неонатальное введение се макса и L-NAME достоверно (р0.05) усилило состояние иммобилизации, тогда как у ли нии 101/HY неонатальное введение семакса и L-NAME усилило активные способы реак ции на обстановку теста. В этом тесте были также обнаружены различия в некоторых по казателях теста между самцами и самками – у самцов обеих линий после неонатального семакса увеличилось иммобилизации (однофакторный ANOVA, F1=7.13, p=0.008).
Эксперименты на мышах. Способность к решению задачи на экстраполяцию на правления движения стимула. Эксперименты по определению способности к экстраполя ции проводили со взрослыми мышами обеих линий после неонатального введения L NAME и семакса в сопоставлении с показателями контрольных животных. В этих опытах использовали и животных с неонатальной болевой стимуляцией, но поскольку их показа тели решения теста не отличались от таковых интактных мышей, далее показатели обеих контрольных групп рассматриваются суммарно.
А Б Рис. 8. Тест на способность к экстраполяции у мышей двух линий после неонатального введения семакса.
Обозначения, как на рис.2. По оси ординат – доля правильных решений теста (в %). А - доля правильных решений теста при первом предъявлении, Б – тот же показатель по данным 6 предъявлений теста. *- досто верно отличается от 50% случайного уровня, p0.05. Число животных – контроль: 101/HY -26, С3Н – 18, Неонатальное введение семакса: 101/HY – 10, С3Н - 13.
Успешность выполнения теста на экстраполяцию направления движения (доля пра вильных решений, %), взрослыми мышами С3Н и 101/HY после неонатального введения семакса и L-NAME изменилась и обнаружила межлинейные различия в этом эффекте.
Кроме того, несмотря на небольшой объем выборок экспериментальных и контрольных животных двух линий можно предположительно говорить о различиях в направлении эф фектов неонатального введения семакса и L-NAME у мышей двух линий.
Так, после неонатального введения семакса у мышей линии 101/HY доля правильных решений теста достоверно превышала 50% случайный уровень (как по данным однократ ного предъявления теста, так и при его многократных применениях), тогда как у мышей линии С3Н эффекта неонатального введения семакса обнаружено не было (рис. 8). В то же время после неонатальных инъекций L-NAME доля правильных решений по данным мно гократных предъявлений теста достоверно превышала 50% случайный уровень, и эта доля была достоверно выше таковой у мышей контрольной группы. У мышей линии 101/HY доля правильных решений теста недостоверно (тенденция) отличалась от 50% уровня (рис. 9).
Данные многократных предъявлений теста в течение 2-3 опытных дней. Мыши линии С3Н. Суммарно за 3 дня опытов у мышей линии C3H (обеих групп) за 18 предъяв лений теста доля правильных решений достоверно превысила 50 % уровень. При этом в группе после неонатального введения L-NAME ко второму и третьему опытам эта доля возрастала и была достоверно выше, чем у контрольной группы (рис. 10). Эти данные оз начают, что мыши С3Н в достоверном большинстве случаев искали корм в том боковом отверстии, в направлении которого он перед этим переместился, исчезнув из поля зрения.
В то же время у мышей 101/HY в группе после неонатального введения L-NAME в тече ние двух опытных дней доля правильных решений не увеличивалась и оставалась на слу чайном уровне.
А Б Рис. 9. Тест на способность к экстраполяции. Мыши линий 101/HY и С3Н после неонатального введения L NAME. Обозначения, как на рис. 2. По оси ординат – доля правильных решений теста (в %). А - доля пра вильных решений теста при первом предъявлении, Б – тот же показатель по данным 6 предъявлений теста.
Число животных: контроль: 101/HY – 7, С3Н – 17, L-NAME: 101/HY -8, С3Н – 18. *** - достоверно отлича ется от 50% случайного уровня правильных решений, p0.001.
А Б Рис.10. Тест на экстраполяцию направления движения пищевого раздражителя. Данные многократных предъявлений задачи на экстраполяцию мышам линий С3Н (А) и 101/HY (Б) по дням опыта (ось ординат доля правильных решений, %). Обозначения, как на рис.2. *- достоверно отличается от 50% случайного уровня правильных решений;
# - достоверно отличается от показателя контрольной группы мышей.
Таким образом, успешность решения элементарной логической задачи на экстра поляцию направления движения взрослыми мышами С3Н и 101/HY после неонатального введения семакса и L-NAME обнаружила как отдаленные эффекты неонатальных воздей ствий, так и межлинейные различия. Кроме того, несмотря на небольшой объем выборок экспериментальных и контрольных животных двух линий можно предположительно го ворить об относительно большей эффективности неонатального введения L-NAME по сравнению с семаксом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В соответствии с целями, поставленными перед выполнением данной работы, были получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что неонатальные инъ екции семакса и L-NAME сопровождаются усилением пролиферативной активности в субгранулярной зоне зубчатой фасции как у крыс, так и у мышей. Эффект усиления про лиферации в мозге крыс был слабее выражен, когда инъекции производили в течение 3-ей недели жизни. Последствия данных воздействий обнаруживаются в поведении (и пред расположенности к аудиогенной эпилепсии) в период, отдаленный от момента воздейст вий значительным интервалом времени – от 3 до 9 недель. Использованные в работе тес ты позволили выявить изменения уровня тревожности животных, а также их способности к решению когнитивного теста на экстраполяцию направления движения стимула. Важно отметить, что в ряде случаев как выраженность эффекта, так и его «направление» (сниже ние или усиление показателя поведения) зависели от генотипа.
В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал о влиянии на нейрогенез множества факторов различной природы. Воздействия, использованные в на шей работе в виде неонатальных инъекций крысам и мышам семакса и блокада NO синтазы посредством L-NAME – лишь малая часть из этого списка.
На основании полученных в работе данных можно заключить, что неонатальное вве дение семакса и L-NAME в течение первых трех недель постнатального развития крыс и мышей, после прекращения непосредственного действия этих соединений, вызывает не только усиление пролиферативной активности в субгранулярной зоне зубчатой фасции, но и образование новых нейронов. Увеличение числа вновь появившихся клеток (в том числе и нейробластов) в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа наблюдается и спус тя 7-14 дней после прекращения инъекций. Поскольку экспериментально показано, что такие вновь образовавшиеся нейроны могут в большом проценте случаев включаться в синаптические цепи (Kempermanm et al., 2003, Nacher et al., 2001), поэтому можно пред положить возможное влияние этого феномена в качестве одной из причин отдаленных по времени изменений поведения животных.
В настоящее время конкретные механизмы, по которым снижение продукции оксида азота усиливает деление клеток-предшественниц нейронов и глии, еще полностью не про анализированы, хотя некоторые звенья этого механизма уже известны. К ним относится усиление продукции ростовых факторов (Estrada et al., 1997;
Murillo-Carretero et al., 2002 и др.). Усиление клеточной пролиферации в гиппокампе в ответ на введение обоих исполь зованных веществ имеет, по всей видимости, как минимум одно общее звено, а именно усиление продукции BDNF (brain-derived neurotrophic factor) и других нейротрофинов (Wagner et al., 1999).
Раннее введение семакса и L-NAME крысам и мышам вызвало также изменения ряда показателей поведения, как крыс, так и мышей. Были обнаружены и межлинейные разли чия, и разное направление изменений в интенсивности эпилептиформных приступов в от вет на сильный звук у крыс. Они выражались в усилении среднего балла припадка и уко рочении его латентности у крыс КМ и в некотором ослаблении интенсивности АП и уве личении латентности у крыс Вистар (после инъекций семакса). Противоположный харак тер изменений АП у крыс двух линий не позволяет объяснить эти эффекты «впрямую» влиянием усиленного нейрогенеза. В то же время в картине эффектов воздействий обоих типов был и общий компонент – изменение фенотипической картины припадка. Эти об щие для крыс обеих линий отдаленные эффекты неонатальных воздействий можно, по крайней мере, частично, объяснить интенсификацией нейрогенеза после использованных воздействий и влиянием этого на собственно «архитектуру» приступа.
Изменения ряда показателей поведения у взрослых крыс и мышей двух генотипов после неонатального введения семакса и L-NAME также нередко имели противоположное направление.
После неонатальных воздействий и у крыс, и у мышей наблюдалось достоверное повышение уровня двигательной активности у животных (по результатам теста «открытое поле»), в то время как уровень ориентировочно-исследовательской активности – снижал ся. Изменения уровня локомоции в центре арены (как «отрицательный» показатель тре вожности) зависели и от генотипа, и от эффекта вводимого препарата, и от пола;
при этом обнаруживалось также достоверное взаимодействие факторов «генотип» и «воздействие».
Последнее означало, что у крыс неонатальное введение семакса почти не изменило этот показатель у КМ, но достоверно усилило его у Вистар. Поскольку оба вещества усиливали нейрогенез у обеих линий, подобные расхождения в эффектах могут, возможно, означать различия в реакции развивающегося мозга крыс двух линий на повышение продукции BDNF и других нейротрофинов (а возможно и на снижение уровня NO).
Неонатальные воздействия вызвали резкие изменения также и уровня тревожности у взрослых животных. Так, по результатам теста «открытое поле» и «приподнятый кре стообразный лабиринт» введение семакса приводило к усилению этого показателя у крыс КМ и к его снижению у Вистар. По результатам данных тестов уровень тревожности по сле неонатального введения семакса повышался у мышей 101/HY и снижался – у C3H.
Поскольку проявления страха-тревоги могут быть следствием (помимо других эффектов) снижения функции серотонинергической системы, одной из рабочих гипотез, объясняю щих полученные данные, может быть дифференциальное влияние изменяющих продук цию BDNF неонатальных воздействий на серотонинергическую, глутаматергическую и другие трансмиттерные системы мозга.
Ноотропный эффект неонатальных инъекций семакса и L-NAME, обнаруженный в тесте на способность к экстраполяции, выявился у мышей после инъекций L-NAME и се макса, более устойчиво проявился у мышей линии С3Н. У них было высоко достоверное превышение доли правильных решений задачи на экстраполяцию над 50% случайным уровнем (по данным многократных предъявлений теста). У взрослых мышей линии 101/HY более высокий уровень правильных решений (достоверно выше 50% случайного уровня) этого теста при первом его предъявлении наблюдался после неонатального введе ния семакса. Это совпадает с картиной изменения этих показателей после введения мы шам ноотропных препаратов (Перепелкина и др., 2006). Кроме того, мыши линии 101/HY после неонатального введения L-NAME более успешно решали тест на «поиск входа в укрытие» (данные приведены в диссертации).
Таким образом, исследование поведения и физиологических реакций взрослых мышей и крыс разных генотипов после введения им в новорожденном возрасте семакса и L NAME позволяет говорить о том, что отдаленные эффекты этого воздействия, возможно, связаны с усилением нейрогенеза и сказываются на поведении взрослых животных. По следствия неонатальных инъекций препаратов, усиливающих нейрогенез, показали, что этому фактору (собственно образованию новых клеток) можно приписать только часть обнаруживаемых отдаленных эффектов. В основе таких эффектов может быть спровоци рованное нейрогенезом усиление экспрессии трофических факторов, в частности BDNF.
Однако в целом обнаруженным различиям можно дать два взаимно не исключающих объ яснения. Во-первых, возможно, что стимулирующие эффекты семакса и L-NAME, сход ные на начальных этапах (усиление экспрессии BDNF), могут зависеть от генотипа на следующих этапах сигнальных путей, когда молекулы этого и других ростовых факторов начинают быть активными в нейронах и глии разных структур мозга. Во-вторых, можно предположить, что у семакса и L-NAME могут быть другие, зависимые от генотипа меха низмы влияния на развивающийся мозг, например, непосредственно на нейроны разных нейротрансмиттерных систем.
Усиление проявлений тревожности и страха у крыс и мышей после неонатальных инъекций семакса представляются парадоксальными. Однако этот феномен нуждается в более детальном анализе. В частности необходимо уточнить, в какой степени оказывается усиленным нейрогенез в другой пролиферативной зоне мозга – в субвентрикулярной об ласти. Известно, что новые клетки, происходящие из этой области мозга, формируют так называемый «передний миграционный путь», который заканчивается в обонятельных лу ковицах. Нельзя исключить предположения, что повышение числа таких клеток мигрантов может способствовать изменению чувствительности обонятельного анализато ра. Это, в свою очередь, может спровоцировать более настороженное и тревожное состоя ние грызунов обоих видов – и крыс, и мышей.
Полученные в работе данные на экспериментальном материале демонстрируют как усиление нейрогенеза в гиппокампальной пролиферативной зоне, так и отдаленные эф фекты неонатальных воздействий на поведение. Очевидно, что подобные факты следует учитывать и в клинических исследованиях. Полученные данные имеют значение как для бурно развивающейся области медицины – технологий использования стволовых клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний человека, так и для клинических исследо ваний, связанных с оценкой отдаленных последствий влияния на ЦНС в раннем возрасте.
ВЫВОДЫ Введение семакса и L-NAME в неонатальном возрасте мышам и крысам достовер 1.
но увеличивает число вновь появившихся клеток в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа как непосредственно после прекращения инъекций, так и спустя 14 дней по сле их прекращения;
при этом происходит увеличение числа молодых нейробластов. 2. Неонатальные инъекции семакса и L-NAME видоизменили картину аудиогенных судорог и изменили их интенсивность у 1 месячных крыс - у линии КМ произошло уси ление, а у Вистар – ослабление припадка. 3. Неонатальные инъекции семакса и L-NAME вызвали изменения уровня тревожно сти, двигательной и исследовательской активности у крыс линий КМ и Вистар. Величина этих изменений зависела от генотипа. 4. Неонатальное введение семакса и, в особенности, L-NAME вызвало генотип зависимые изменения исследовательского поведения у мышей линий С3Н и 101/HY и усилило проявления тревожности.
5. Неонатальное введение L-NAME и семакса вызвало у мышей увеличение способ ности к решению теста на экстраполяцию направления движения пищевого стимула (ноо тропный эффект), которое было сильнее выражено у мышей линии С3Н, по сравнению с линией 101/HY.
6. Обнаруженные отдаленные эффекты неонатального введения L-NAME и семакса на физиологию ЦНС различались у животных разных линий. Одной из причин этих эф фектов может быть усиление нейрогенеза в зубчатой фасции гиппокампа, последствия ко торого могут зависеть от генотипа.
Выполнение работы было поддержано РФФИ грант № 07-04-01287, Швейцарским на циональным фондом SCOPES project IB74BO-111081, грант Миннауки № 02-512-112335.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах (список ВАК) 1. Т.В. Тимошенко, И.И. Полетаева, Г.В. Павлова, А.В. Ревищин. Влияние неонатально го введения пептида семакса на пролиферативную активность клеток в зубчатой фас ции гиппокампа крыс двух генотипов. ДАН, 2009, т. 424, № 6, с. 846-848.
2. Т.В. Тимошенко, О.В. Перепелкина, Н.В. Маркина, А.В. Ревищин, Г.В., Павлова, И.И.Полетаева, Г.Т. Сухих. Аудиогенная эпилепсия у крыс двух генотипов после не онатальных воздействий, усиливающих нейрогенез в зубчатой извилине. Бюлл. эксп.
биол. мед., 2009, т. 147, № 4, с. 458-461.
Тезисы конференций 1. Pinigina E., Timoshenko T. Influence of nitric oxide synthase inhibition on the neurogenesis and behavior in two mouse strain. Abstr. International, summer school in behavioural neuro genetics. Abstr., Moscow, Russia, September, 12-16, 2005, p.78-79.
2. Полетаева И.И., Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Бояршинова О.А., Пинигина Е.А., Тимошенко Т.В. Экспериментальный анализ отдаленных последствий неонатальных воздействий/ Матер. Международного Симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине. Тезисы, 2006, Судак. 17 - 27 сент. c. 3. Перепелкина О.В., Маркина Н.В., Пинигина Е.А., Ревищин А.В., Тимошенко Т.В., Полетаева И.И. Селекция лабораторных мышей на большой и малый вес мозга – раз личия в поведении и морфологии переднего мозга, влияние обогащенных условий со держания. Матер. ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы, Москва, 2007, с. 370.
4. Полетаева И.И., Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Федотова И.Б., Пинигина Е.А., Ти мошенко Т.В. Отдаленные последствия ранних фармакологических воздействий на ЦНС лабораторных грызунов различного генотипа – возможная модель патологиче ских состояний человека. Матер. ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Пав лова. Тезисы, Москва, 2007, с. 378.
5. Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Тимошенко Т.В., Полетаева И.И. Изменения пове дения взрослых мышей разных линий как результат неонатального введения ряда фар макологических препаратов. Тезисы IV Всероссийской конференции по поведению животных. ИЭЭ РАН, Москва, 2007, с.79-80.
6. Перепелкина О.В., Тимошенко Т.В., Маркина Н.В., Ревищин А.В., Полетаева И.И.
Генетические различия в отдаленных эффектах неонатальных воздействий на ЦНС ла бораторных грызунов. International Conference, Current Evolutionary Thinking in Biol ogy, Medicine, and Sociology. Тезисы, Новосибирск, 2007, August, 7-9.
7. Тимошенко Т. Неонатальная модуляции нейрогенеза и ее возможное влияние на по ведение взрослых мышей и крыс различных генотипов. Конференция молодых уче ных. Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Тезисы, Моск ва, 2007, с. 47.
8. Timoshenko T., Revishchin A., Pavlova G., Poletaeva I. Modulation of neurogenesis in the dentate area of rat and mouse brain by neonatal injections of heptapeptide Semax and L NAME.6-th FENS Meeting. Abstr., Geneve, 2008, July 12-16. N 175.15.
9. T. Timoshenko, A. Revishchin, G. Pavlova, I. Poletaeva. Modulation of neurogenesis in adult brain of rats and mice after neonatal treatments. 6-th International Symposium on Ex perimental and Clinical Neurobiology. Kosice, Slovakia, Аbstr., 2008, September, 8-11, p.
97.
10. Т.В. Тимошенко, И.И. Полетаева, Г.В. Павлова, А.В. Ревищин. Неонатальная модуля ция пролиферации стволовых клеток мозга и ее влияние на поведение взрослых мы шей и крыс. IV Международная конференция по иммунотерапии. Москва, 15-17 сен тября, 2008, Аллергология и иммунология (список ВАК), 2008, том 9, №3, с. 269-270.
11. О.V. Perepelkina, O.S. Boyarshinova, Т.V. Timoshenko, I.I. Poletaeva H.-P. Lipp, H-S.
Shin Cognitive task solution in laboratory mice: the ways to enhance this ability. 11-th An nual Meeting of International Behavior and Neurogenetic Society. Abstr., 2009, Dresden, June, 4-6, p. 104.
12. О.В. Перепелкина, Т.В. Тимошенко, А.В. Ревищин, И.И. Полетаева. Влияние условий «обогащенной среды» на уровень нейрогенеза в зубчатой фасции гиппокампа у мы шей, селектированных на большой и малый относительный вес мозга. Всероссийская конференция с международным участием памяти О.С. Виноградовой «Гиппокамп и память: норма и патология». Материалы конференции, 25-28 июля, Пущино, 2009, с.
51-52.
13. Тимошенко Т.В. Модуляция нейрогенеза у мышей и крыс разных генотипов. Анализ поведения. Конференция молодых ученых, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Тезисы, 2009, октябрь, с. 35.