Влияние патологии печени матери различного генеза на морфофункциональное становление клеточного иммунитета потомства (экспериментальное исследование)
На правах рукописи
Бирюкова
Татьяна Игоревна
ВЛИЯНИЕ ПАТОЛОГИИ ПЕЧЕНИ МАТЕРИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА
НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СТАНОВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО
ИММУНИТЕТА ПОТОМСТВА
(экспериментальное исследование)
03.00.13 – «Физиология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Челябинск - 2009
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет»
Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Брюхин Геннадий Васильевич.
Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Лихачев Сергей Федорович ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет»
доктор медицинских наук Головнева Елена Станиславовна Челябинский государственный институт лазерной хирургии.
Ведущая организация – ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» (г. Уфа)
Защита диссертации состоится « 23 » октября 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, пр. им. Ленина, д. 69, ауд.
С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки Челябинского государственного педагогического университета.
Автореферат разослан « » сентября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент Ефимова Н.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. На фоне продолжающегося демографического кризиса в России одной из актуальных проблем на сегодняшний день остается воспроизводство здорового потомства.
Здоровье детей в ранний постнатальный период во многом определяется состоянием материнского организма. В настоящее время отмечается увеличение числа женщин фертильного возраста с различными экстрагенитальными заболеваниями, среди которых особое место занимают болезни гепатобилиарной системы, в том числе хронические гепатиты, холециститы, холангиты, циррозы, хроническая жировая дистрофия печени, желчнокаменная болезнь, являющиеся одной из важных причин материнской и перинатальной патологии (Михайленко Е.Е. с соавт., 1991;
Бударина Н.А, 2005). Особое место в ряду этих заболеваний в последнее время занимают вирусные гепатиты, в связи с их нарастающей распространенностью в мире.
Специалисты отмечают, что сейчас в России насчитывается около 5 миллионов носителей вируса гепатита В и около 200 000 случаев заболевания гепатитом А (Арямкина О.Л, 2008;
Онищенко Г.Г., 2005). Согласно литературным данным, беременность, сопровождающаяся патологией печени, относится к беременности с высоким риском, исход которой не всегда однозначен (Jabeen T., 2000;
Heneghan М. А., 2001). Влияние хронических поражений гепатобилиарной системы на течение беременности и здоровье потомства в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем современной физиологии (Егоров А.Ю., 2002).
Многочисленные экспериментальные исследования и клинические наблюдения указывают на нарушение структурно-функционального становления систем жизнеобеспечения у потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы (Брюхин Г.В., 1990 - 2006;
Михайлова Г.И., 1990, 2001;
Грачев А.Ю., 1990, 1994;
Пивень Г.В., 1995;
Бояков А.А., 1999,2001;
Николина О.В., 2000;
Евченко Е.В., 2001;
Вторушина Е.В., 2003;
Пашнина Е.Н., 2002, 2003;
Федосов А.А., 2002, 2004, 2006;
Сизоненко М.Л., 2005, 2006;
Ильиных М.А., 2006), Согласно данным литературы (Ayelet Laronne-Bar-On, 2008;
E. Castermans, 2008), дети матерей с хронической патологией печени предрасположены к различным заболеваниям. Не вызывает сомнения, что одной из причин этих нарушений является изменение иммунологической реактивности организма, которая определяется состоянием иммунной системы организма в целом и характером клеточного иммунитета, центральным органом которого является тимус. Анализ работ современных ученых показывает, что на сегодняшний день недостаточно изучены вопросы влияния поражения печени матери различной этиологии на морфофункциональное становление систем жизнеобеспечения потомства, в частности на систему клеточного иммунитета.
Отмеченное выше, предопределило выбор темы, объекта и предмета исследования, постановку цели и задач, структуру исследования.
Цель оценка влияния патологии печени самок крыс на морфофункциональное становление клеточного звена иммунитета потомства.
Цель исследования обусловила постановку следующих основных задач:
1. провести морфофункциональную оценку клеточного состава внутритимусного микроокружения (макрофагов и тучных клеток) у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза.
2. на основе иммуноферментного метода проанализировать пролиферативную и апоптотическую реакцию тимоцитов у потомства животных с хроническим поражением печени различного генеза.
3. оценить интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени в различные сроки постнатального периода.
4. провести сравнительный анализ морфофункционального состояния тимуса у потомства самок крыс с D(+) – галактозаминовым поражением печени и у потомства самок крыс при поражением печени с использованием фильтрата E. сoli.
Научная новизна:
Выявлена депрессия клеточного иммунитета у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза (D – галактозамин и E.сoli) на 1, 15, 30, 45 и 60 – ые сутки постнатального онтогенеза, что нашло свое проявление в достоверном снижении весового индекса тимуса, делимфатизации, инверсии площадей коркового и мозгового вещества тимусной дольки.
Новыми являются данные об угнетении у потомства самок крыс с хронической патологией печени Т-лимфоцитопоэза на центральном уровне, о чем свидетельствует достоверное увеличение числа малодифференцированных клеток за счет снижения числа зрелых тимоцитов, увеличение их среднего диаметра (р 0,05) и достоверного уменьшения клеточной плотности лимфоцитов тимуса.
В отличие от ранее проведенных исследований новыми являются данные об усилении пролиферативной активности тимоцитов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени, о чем свидетельствует гиперэкспрессия белка Ki-67, а также то, что нарушение Т-клеточного лимфоцитопоэза на центральном уровне сопровождается увеличением числа р53 позитивных лимфоцитов тимуса.
Установлено изменение клеточного состава внутритимусного микроокружения потомства самок крыс с патологией гепатобилиарной системы, обусловленного введением D-галактозамина и E.Coli: снижение числа CD68 позитивных клеток, увеличение числа и секреторной активности тучных клеток.
Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты, выявившее общие и специфические эффекты неблагоприятного влияния гепатобилиарной патологии различного генеза матери на формирование клеточного иммунного ответа у потомства, расширяют представление о роли хронической патологии гепатобилиарной системы матери в нарушении становления клеточного звена иммунитета у потомства и могут быть использованы для обоснования направленной иммунной коррекции.
Результаты проведенного исследования экспериментально обосновывают необходимость выделения потомства матерей с поражением печени различного генеза в группу повышенного риска в связи с нарушением формирования иммуномодулирующих ответов в постнатальном периоде.
Результаты научного исследования внедрены в научно исследовательский и учебный процессы кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»: разделы «Иммунная система», «Нарушение внутриутробного развития человека», а также в учебный процесс биологического факультета Челябинского государственного университета: дисциплины «Физиология человека и животных», «Иммунология» Некоторые аспекты научного изыскания отображены в лекционном курсе и на лабораторных занятиях при изучении иммунной системы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Хроническое экспериментальное поражение печени самок крыс, обусловленное введением D-галактозамина и E.Coli, сопровождается угнетением Т-лимфоцитопоэза у потомства в раннем постнатальном периоде.
2. Основными механизмами угнетения лимфоцитопоэза у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени различного генеза на ранних сроках постнатального онтогенеза является дисбаланс пролиферативной и апоптотической активности тимоцитов.
3. Поражение гепатобилиарной системы различной этиологии у самок крыс приводит к нарушению клеточного иммунного ответа у потомства экспериментальных животных в раннем постнатальном периоде.
Апробация материалов работы Результаты исследования были представлены на IX Международном конгрессе морфологов «Медико – экологические проблемы возрастной морфологии» (Бухара, 2008);
на II Международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2008);
на VI итоговой научно практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2008);
на Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации»
(Оренбург, 2008);
на IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008);
на Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте»
(Тюмень, 2008);
на конференции в рамках 14-ой Российской Гастроэнтерологической неделе (Москва, 2008);
на конференции, посвященной десятилетию биологического факультета Челябинского государственного университета (Челябинск, 2008), на VI Международной конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Троицк, 2009), на заседании Челябинского отделения Всероссийского общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Челябинск, 2009).
Публикации По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Объем и структура диссертации Основное содержание работы
изложено на 222 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, 70 рисунков, из которых микрофотографии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), собственных результатов исследования (глава 3), заключения, списка использованных источников, включающего 347 наименование, в том числе 201 работа зарубежных авторов, 4 приложения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В эксперименте были использованы лабораторные крысы (самки) «Вистар». Всего было использовано 229 животных, из них 69 – взрослые крысы – самки и их разнополое потомство – 160 животных из 69 пометов в равном соотношении полов в различные сроки постнатального онтогенеза (на 1-ые, 15 ые, 30-ые, 45-ые и 60-ые сутки). Сроки исследования согласуются с общепризнанным подразделением возрастных периодов у данной группы животных: 1-5 день – период новорожденности, 5-21 день – подсосный период, 21-45 день – период становления половой зрелости, 60 день соответствует периоду половой зрелости.
Исходя из задач исследования, все экспериментальные животные были разбиты на 3 группы. В первую группу были выделены животные от интактных родителей (контрольная группа животных) – 59 животных из 25 пометов. Во вторую группу вошли животные от матерей с D(+)-галактозаминовым поражением печени (опытная группа 1) – 54 животных из 21 помета. В третью группу вошли животные от матерей, сенсибилизированных фильтратом культуры E. сoli (опытная группа 2) – 55 животных из 20 пометов.
Работа с экспериментальными животными проводилась с учетом суточных и сезонных колебаний, все животные содержались в стандартных условиях вивария с идентичным пищевым рационом. Работа с экспериментальными животными проводились в полном соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР).
Модель хронического поражения печени путем введения D(+) – галактозамина. Моделирование D(+) – галактозаминового поражения печени осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения взрослым половозрелым самкам гепатотропного яда D(+) – галактозамина гидрохлорида (“Sigma – G0500”, США) в дозе 250 мг/кг массы тела. (Сугробова Н.П., 1992).
По совокупности морфологических и биохимических критериев данная модель поражения печени соответствует острому вирусному гепатиту В человека (Венгеровский А.С., 1988).
Модель поражения печени путем введения E. сoli. Моделирование экспериментального гепатита с использованием культуры E. Coli (штамм АТСС 25922) проводили в два этапа. Сначала взрослым половозрелым крысам самкам вводили 0,2 мл фильтрата шестидневной культуры E. Coli в три участка печени – по одной с обеих сторон у основания мечевидного отростка и справа у края реберной дуги по срединно – ключичной линии. В течение 24 часов после введения сенсибилизирующей инъекции животные получали только воду.
Затем в хвостовую вену животным вводили фильтрат шестидневной культуры E. Coli из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного (Сааков Б.А., 1967). По совокупности биохимических и морфологических изменений данная модель поражения печени с использованием культуры E. сoli соответствует вирусному гепатиту А человека (Сааков Б.А., 1967).
Морфологические и гистохимические методы исследования.
Отпрепарированный тимус взвешивали на торзионных весах. Затем фиксировали в 10% забуференном формалине (рН=7,0) и жидкости Карнуа (100% спирт – 6 мл, хлороформ – 3 мл, уксусная кислота – 1 мл).
Одновременно готовили навеску (10 мг) для подсчета количества кариоцитов в камере Горяева. К приготовленной навеске добавляли 1 мл физиологического раствора и гомогенизировали в гомогенизаторе по общепринятой методике (Фримель Г., 1987). Затем к 0,1 мл взвеси добавляли 1,9 мл раствора Тюрка (0,01% раствор генцианового фиолетового в 3% растворе уксусной кислоты). С помощью камеры Горяева производили подсчет числа кариоцитов в клеточной суспензии тимуса в 100 больших квадратах при увеличении 740.
Одновременно определяли жизнеспособность клеток с помощью раствора трипанового синего (0,2%). Количество ядросодержащих клеток в тимусе определяли по формуле:
К=МmVHP2,51000, где К – число кариоцитов в органе (109), М – масса органа, мг, m – масса навески, мг, V – объем среды в которой гомогенезировали навеску, мл, Н – число ядер в 100 больших квадратах камеры Горяева, Р – разведение в растворе, 2,5 и 1000 – коэффициенты для перерасчета объема камеры.
Изготовленные гистологические срезы тимуса окрашивали: гематоксилин – эозином, толуидиновым синим для выявления гранул тучных клеток, альциановым голубым для идентификации тучных клеток, метиленовым синим, азур II – эозином по Романовскому – Гимзе для метахроматического окрашивания кислых гликозаминогликанов в тучноклеточной популяции, по Май-Грюнвальду на выявлении коркового и мозгового вещества тимуса, окрашивание волокон соединительной ткани по Малори, окрашивание соединительной ткани по Ван-Гизону (Кононский А.И., 1976;
Саркисов Д.С., 1996;
Семченко В.В., 2006). Морфометрический анализ срезов тимуса проводили с помощью квадратичной сетки (Автандилов Г.Г. 1990).
Абсолютную площадь коркового и мозгового вещества тимуса подсчитывали с помощью квадратичной сетки Автандилова. Объемную плотность коркового и мозгового вещества подсчитывали с помощью точечной сетки Автандилова при увеличении окуляра 10, и объектива 10. Производили подсчет суммарного числа тимоцитов на единицу площади (клеточная плотность). Также производили подсчет числа малых, средних и больших тимоцитов на единицу площади (1 мм2). Вычисляли средний диаметр клеток в субкапсулярной зоне, корковом и мозговом веществе тимуса.
Для анализа тучноклеточной популяции депарафинированные серийные гистологические срезы окрашивали толуидиновым синим (рН = 4.9), альциановым голубым и по Романовскому – Гимзе. Для комплексной оценки тучноклеточной популяции использовали следующие критерии: метод цитограмм, степень гранулярного насыщения, индекс гранулярного насыщения, степень дегрануляционной активности, индекс дегрануляции тучных клеток.
По степени гранулярного насыщения выделяют 4 группы клеток (Линднер Д.П., 1980).
клетки с 1 степенью гранулярного насыщения – малое количество гранул в цитоплазме, клетки очень светлые;
2-ая степень гранулярного насыщения – увеличивается количество гранул в цитоплазме, клетки светлые;
3-ья степень гранулярного насыщения – достаточное количество гранул в цитоплазме клетки, сами клетки темные;
4-ая степень гранулярного насыщения – большое количество гранул в цитоплазме, клетки очень темные.
Индекс гранулярного насыщения тучных клеток отражает отношение суммы всех темных клеток к сумме всех светлых клеток.
Функциональная активность тучноклеточной популяции оценивалась по способности клеток к дегрануляции. Выделяли 4 группы клеток - клетки с нулевой, первой, второй и третьей степенью дегрануляции.
Индекс дегрануляции (ИД) высчитывали по формуле (Линднер Д.П., 1980):
ИД = А0+Б1+В2+Г3/n, где А – число неактивных клеток нулевой степени дегрануляции;
Б – слабодегранулирующие тучные клетки, (1-ая степень);
В – клетки с умеренной степенью дегрануляции, (2-ая степень);
Г – клетки с сильной степенью дегрануляции, (3-я степень);
n – общее число тучных клеток.
Иммуноморфологические методы исследования.
Для иммуногистохимического исследования органы фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 9 часов. Полученные срезы прикрепляли на обработанные белком срезы и ставили в термостат на ночь при температуре 370 С. После этого проводили депарафинирование и обработку 3% перекисью водорода. Затем проводилась механическая и термическая обработка в цитратном и ТРИС буферах в водяной бане при температуре 950С.
В дальнейшем использовали систему детекции и вторичных антител Novocastra. Для анализа количества макрофагов использовали первичные моноклональные антитела СD68 в разведении 1:30. Ядра клеток докрашивали гематоксилином (Bobrow M., 1989).
За положительную иммуногистохимическую реакцию на антитела CD принимали коричневую окраску цитоплазмы клетки. Подсчитывали количество СD68 – положительных клеток в единице площади (1 мм2) в корковом и мозговом веществе тимуса.
Апоптотическую активность лимфоцитов тимуса оценивали с использованием моноклональных антител Bcl-2 и р53. Белок Bcl-2 является антиапоптотическим белком и присутствие его на мембранах клетки говорит о том, что она не вступает в процесс апоптоза. В эксперименте использовали моноклональные антикрысиные антитела Bcl-2 (BioVision). За положительную иммуногистохимическую реакцию на антитело принимали коричневое окрашивание цитоплазмы клетки. Подсчитывали индекс Bcl-2 как отношение клеток с окрашенной цитоплазмой к общему числу клеток в единице площади (1 мм2).
В эксперименте использовали моноклональные антитела р53 (BioVision) в разведении 1:200. За положительную иммуногистохимическую реакцию принимали коричневое окрашивание ядра клетки. Подсчитывали индекс р как отношение числа окрашенных ядер к общему числу ядер в единице площади Пролиферативную активность лимфоцитов тимуса оценивали с использованием моноклональных антител Ki – 67 (Monoclonal Mouse Anti-Rat Ki – 67 Antigen Clone MIB-5, Daco) по общепринятой методике (Bobrow M., 1989). За положительную иммуногистохимическую реакцию на Кi – 67 антиген принимали интенсивное желто-коричневое окрашивание ядра тимоцита, которое в ряде случаев выходило за его пределы. Подсчитывали индекс Ki- тимоцитов в субкапсулярной зоне, корковом и мозговом веществе тимуса, который является отношением числа окрашенных ядер к общему количеству ядер в единице площади (1 мм2).
Иммунологические методы исследования. Индукцию гиперчувствительности замедленного типа проводили по методу Langrange P.H.
(1974). Животным внутрибрюшинно вводили стандартный антиген – эритроциты барана в дозе 210 на 1 г массы тела путем внутрибрюшинного введения. Через 3-ое суток после иммунизации, животным в подушечку правой задней лапки вводили разрешающую дозу эритроцитов барана (2* эритроцитов барана в объеме 2 мкм на 1 г живого веса). В другую заднюю лапку (левую) вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.
Реакцию гиперчувствительности замедленного типа оценивали через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена. Интенсивность кожной реакции оценивали по разности толщины стоп левой и правой задних лапок, определяемой с помощью инженерного микрометра МК-0-25.
Статистические методы исследования.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программного обеспечения;
Microsoft Excel 2003, AtteStat for Microsoft Excel, SPSS 13.0, Statistica 6.0. При сравнительном анализе данных использовали непараметрический критерий Манна – Уитни (Реброва О.Ю., 2002).
Корреляционный анализ проводили с использованием программы SPSS 13. (метод корреляции по Спирману). Учитывались только сильные корреляционные связи с коэффициентом корреляции от 0,7 до 1,0 и достоверностью р 0,05. Применен метод диспресионного анализа, отражающий влияние двух независимых критериев (возраста животных и наличия поражения гепатобилиарной системы матери) на исследуемые показатели. Также использовали метод ранжирования, который состоит в определении места (ранга) объектов проводимого исследования (Гринчель Б.М.
с соавт., 2003;
Медик В.А. с соавт., 2003).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Для оценки структурно-функционального состояния тимуса нами использовались морфологические, гистохимические, иммунологические и иммуногистохимические методы. Был проведен подсчет абсолютной массы тимуса и его весового коэффициента. Установлено, что у экспериментальных животных 1-ой опытной группы абсолютная масса тимуса в период новорожденности снижена на 46,3%, а у животных 2-ой опытной группы на 32,4% по сравнению с контрольными животными и увеличена в период становления половой зрелости на 18,03% и 23,93% соответственно в первой и второй группах подопытных животных (таб. 1).
При исследовании массы тимуса у потомства самок крыс с хронической экспериментальной патологией печени нами учитывалось также изменение интенсивности прироста массы исследуемого органа. Было выявлено, что до периода половой зрелости прирост массы тимуса у подопытных животных превышает контрольные значения (р0,05).
Выявленные изменения массы тимуса указывают на нарушение эмбрионального развития органа, как следствие стрессорных воздействий, оказываемых на плод в связи с патологией печени матери.
Таблица Абсолютная масса тимуса экспериментальных животных Абсолютная масса тимуса, мг (М±m) Группа Возраст животных, сутки экспериментальных 1 15 30 45 животных 11,250 ± 67,300 ± 120,900± 136,000 ± 293,300 ± Контроль 0,786 1,527 1,760 5,208 8, 6,000 ± 53,000± 202,5± 223,700 ± 240,400 ± Опытная группа 0,333 2,016 3,703 5,204 5, р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0, 7,600 ± 65,400 ± 153,700 ± 193,000 ± 223,100 ± Опытная группа 0,520 1,771 2,875 5,114 5, р = 0,001 р = 0,436 р 0,001 р 0,001 р 0, Наиболее чувствительным критерием изменения массы исследуемого органа является весовой индекс тимуса. Установлено, что у потомства подопытных животных весовой индекс тимуса на ранних этапах постнатального онтогенеза достоверно снижен по сравнению с контрольными животными, что указывает на нарушение эмбрионального развития органа, как следствие стрессорных воздействий, оказываемых на плод в связи с патологией печени матери.
Таблица Абсолютная площадь коркового вещества тимуса экспериментальных животных Группа Абсолютная площадь коркового вещества тимуса (M±m), мм экспериментальных животных Возраст животных, сутки 1 15 30 45 0,243 ± 0,436 ± 0,420 ± 0,393 ± 0,391 ± Контроль 0,002 0,005 0,004 0,004 0, 0,258 ± 0,410 ± 0,382 ± 0,369 ± 0,374 ± Опытная группа 0,003 0,002 0,002 0,007 0, р = 0,009 р 0,001 р 0,001 р = 0,007 р = 0, 0,247 ± 0,405 ± 0,377 ± 0,364 ± 0,370 ± Опытная группа 0,007 0,002 0,003 0,006 0, р = 0,631 р 0,001 р 0,001 р = 0,001 р = 0, Наиболее информативными критериями для оценки морфо функционального состояния вилочковой железы являются показатели, характеризующие площадь функциональных зон тимуса и их клеточный состав (S. E. Prockop, 2002;
S. A. Elmore, 2006;
M. S. Spoor, 2008). У потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением гепатобилиарной системы имеет место изменение площадей коркового и мозгового вещества тимуса в сторону снижения абсолютной и относительной площади коркового вещества (таб.2) и увеличения площади мозгового вещества тимуса.
Особенно четко это проявляется в изменении коэффициента, отражающего отношение площадей коркового и мозгового вещества, а также в снижении объемной площади коркового вещества тимуса и увеличении объемной площади мозгового вещества. У потомства экспериментальных животных данный коэффициент достоверно снижен по сравнению с контролем на всех сроках исследования.
Нами был проведен подсчет содержания клеток как в единице площади в различных функциональных зонах органа, так и в установленном объеме, с использованием камеры Горяева. Было выявлено, что у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени отмечается достоверное снижение количества кариоцитов в органе и тимоцитов в единице площади функциональных зон тимуса на всех исследуемых сроках.
Таблица Содержание больших тимоцитов в различных зонах тимусе экспериментальных животных Количество больших тимоцитов в различных функциональных зонах тимуса (М±m) Возраст животных, сутки Функцио Название 1 15 30 45 нальная группы зона 10,11 ± 6,08 ± 0,291 4,68 ± 5,78 ± 5,18 ± Субкапс Контроль 0,310 0,317 0,262 0, улярная зона 16,82 ± 9,79 ± 0,166 12,76 ± 11,29 ± 12,51 ± Опытная 0,280 р 0,001 0,344 0,214 0, группа р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0, 14,21 ± 15,17 ± 15,46 ± 15,31 ± 16,60 ± Опытная 0,463 0,711 0,519 0,442 0, группа р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0, 9,30 ± 7,78 ± 0,287 5,82 ± 7,61 ± 8,02 ± Корко Контроль 0,498 0,301 0,348 0, вое вещест 13,25 ± 8,19 ± 0,241 10,28 ± 9,97 ± 10,55 ± Опытная во 0,424 Р = 0,218 0,287 0,367 0, группа р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0, 11,75 ± 11,47 ± 12,71 ± 12,23 ± 13,65 ± Опытная 0,241 0,272 0,406 0,533 0, группа Р = 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0, Выделяют три субпопуляции тимоцитов – субкапсулярные, кортикальные и медуллярные тимоциты, отличающиеся размерами и степенью зрелости.
Нами было установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальной патологией гепатобилиарной системы наблюдается достоверное увеличение количества больших (незрелых) тимоцитов (таб.3) и уменьшение числа малых тимоцитов в единице площади на всех сроках постнатального онтогенеза во всех функциональных зонах тимуса. Количество средних тимоцитов в субкапсулярной зоне тимуса на начальных периодах онтогенеза достоверно превышает контрольные значения, а затем снижается, как и в других функциональных зонах органа.
Вместе с изменением субпопуляционного состава тимоцитов в различных функциональных зонах изменяется и средний диаметр клеток. Установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением гепатобилиарной системы происходит увеличение среднего диаметра тимоцитов во всех функциональных зонах тимуса на всех сроках постнатального онтогенеза (8,37 ±0,017 – в группе контроля на 60-ые сутки исследования, 10,4 ± 0,025 – у животных опытной группы 1 и 9,26 ± 0,018 – у животных опытной группы 2). К этому привело описанное выше увеличение в органе числа крупных, функционально незрелых тимоцитов, и снижение числа зрелых тимоцитов с малым диаметром клеток.
Иммуногистохимическим методом мы оценивали пролиферативную активность тимоцитов подопытных животных по числу Ki-67 положительных клеток в единице площади тимуса. Антиген Ki-67 предположительно относят к регуляторным белкам, поскольку его появление в клетке совпадает с ее вступлением в митотический цикл. Нами было выявлено, что наибольшее количество Ki-67 положительных клеток содержится как в субкапсулярной зоне, так и в корковом веществе тимуса экспериментальных животных, в то время как в мозговом веществе их число ниже (рис. 1).
А В контроль опытная группа опытная группа 100 90 80 70 60 индекс индекс 50 40 15 15 возраст, сутки возраст, сутки Рис. 1. Индекс Ki-67 в корковом (А) и мозговом (В) веществе тимуса.
Это соответствует литературным данным о том, что основные процессы пролиферации протекают в тимусе именно в этих функциональных зонах (S.
Perwez Hussain, 2008). Также, было отмечено, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы число активно пролиферирующих тимоцитов в единице площади достоверно превышает контрольные значения во всех функциональных зонах тимуса и на всех исследуемых сроках (15-ые и 60- ые сутки) постнатального онтогенеза. При этом необходимо отметить и тот факт, что с возрастом у животных опытных групп происходит увеличение числа пролиферирующих тимоцитов, в то время как в группе интактных животных данный показатель снижается. Также отмечается, что наибольшее отклонение от контрольных значений выявлено у животных опытной группы 2.
Апоптотическую активность лимфоцитов коркового и мозгового вещества тимуса исследовали иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител р53 (BioVision). Было выявлено, что у потомства самок крыс обеих экспериментальных групп число р положительных клеток как в корковом, так и в мозговом веществе тимуса превышает контрольные значения на всех исследуемых сроках (р0,05). На 15 ые сутки исследования в корковом веществе у животных опытной группы исследуемый показатель выше на 70%, а у животных опытной группы 2 на 86%. Однако, интересен тот факт, что в группе контрольных животных интенсивность апоптотических процессов с возрастом увеличивается, в то время как у подопытных животных наблюдается обратная динамика и с возрастом число р53 позитивных клеток снижается.
С помощью иммуногистохимического метода нами была исследована активность экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 лимфоцитами тимуса в корковом и мозговом веществе. Было выявлено, что у потомства самок крыс с хронической экспериментальной патологией печени число Bcl- положительных клеток в единице площади с возрастом увеличивается, в то время как у контрольных животных наблюдается обратная динамика изменения количества Bcl-2 положительных клеток. При этом содержание Bcl- положительных клеток у потомства самок крыс с поражением гепатобилиарной системы достоверно снижено (на 15-ые сутки исследования на 50% у животных опытной группы 1, и на 70% у животных опытной группы 2). Это свидетельствует об увеличении активности апоптотических процессов у этой группы экспериментальных животных.
Согласно современным представлениям (М. De Smedt, 2005), специфическое микроокружение тимуса играет важную роль в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и созревания Т лимфоцитов. Нами был проведен анализ содержания и функционального состояния тучных клеток тимуса. Для идентификации субпопуляционного состава тучноклеточной популяции тимуса мы использовали общепринятые критерии оценки тучных клеток – определение степени гранулярного насыщения цитоплазмы, интенсивности дегрануляции, а также определение индекса гранулярного насыщения и индекса дегрануляции, которые являются наиболее чувствительными показателями функционального состояния тучных клеток. Нами было установлено, что у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением гепатобилиарной системы различного генеза количество тучных клеток достоверно снижено в период новорожденности, а на последующих этапах постнатального онтогенеза выше, чем у интактных животных (таб. 4).
Анализ субпопуляционного состава тучных клеток по степени гранулярного насыщения цитоплазмы показал, что у подопытных животных процент тучных клеток с низкой степенью гранулярного насыщения цитоплазмы достоверно снижен по сравнению с контрольными животными на ранних сроках постнатального онтогенеза (1, 15, 30- ые сутки) и превышает контрольные значения на поздних этапах (45 –ые и 60 –ые сутки).
Таблица Содержание тучных клеток в тимусе экспериментальных животных Количество тучных клеток в единице площади, мм2 (М±m) Группа Возраст животных, сутки животных 1 15 30 45 25,5 ± 0,22 17,0 ± 0,36 21,1 ± 0,43 21,9 ± 0,73 19,0 ± 0, Контроль 20,5 ± 0,34 21,6 ± 0,42 30,0 ± 0,68 31,7 ± 1,09 35,8 ± 0, Опытная р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0, группа 19,0 ± 0,47 34,1 ± 0,48 29,4 ± 1,36 26,5 ± 0,50 23,7 ± 0, Опытная р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0, группа Процент тучных клеток с сильной степенью гранулярного насыщения достоверно превышает таковые в контроле на ранних сроках постнатального онтогенеза, и снижен в период полового созревания.
Необходимо отметить, что наблюдается изменение процентного соотношения тучных клеток по степени дегрануляционной активности.
Выявлено, что у потомства животных с хронической экспериментальной патологией печени матери процент тучных клеток с низкой степенью активности дегрануляции достоверно снижен по сравнению с контрольными значениями, а процент тучных клеток с высокой степенью дегрануляции увеличен по сравнению с интактными животными.
Данные показатели находятся в полном соответствии с изменением индекса гранулярного насыщения и индекса дегрануляции. У подопытных животных индекс гранулярного насыщения снижен по сравнению с контрольными животными, а индекс дегрануляции на всех сроках постнатального онтогенеза превышает контрольные значения (рис. 2).
Таким образом, можно говорить о повышении секреторной активности тучных клеток тимуса у подопытных животных, что может интерпретировать как проявление компенсаторно-приспособительной реакции тучных клеток на действие стрессирующих факторов, связанных с патологией печени матери.
Тучные клетки тимуса также могут оказывать влияние на такой важный компонент микроокружения как макрофаги.
С помощью иммуногистохимического метода с использованием антител CD68 (Novocastra) мы исследовали количество макрофагов в корковом и мозговом веществе тимуса. В мозговом веществе тимуса экспериментальных животных количество макрофагов выше, чем в корковом. При этом, с возрастом во всех экспериментальных группах происходит достоверное увеличение количества макрофагов во всех группах животных (на 15-ые сутки исследования в корковом веществе тимуса) исследуемый показатель снижен на 30% в опытной группе и на 55% в опытной группе 2). Также можно сделать заключение о том, что в тимусе потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением гепатобилиарной системы происходит снижение контрольная группа опытная группа опытная группа 2, индекс дегрануляции 1, 1 15 30 45 возраст, сутки Рис. 2. Изменение индекса дегрануляции тучных клеток тимуса потомства экспериментальных животных.
количества макрофагов в единице площади как в корковом, так и в мозговом веществе тимуса.
Одним из критериев интенсивности клеточного иммунного ответа является реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (S. G.
Trivedi, 2006).
Для оценки состояния клеточного иммунитета у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза мы исследовали интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа Установлено, что у подопытных животных интенсивность кожной реакции на стандартный антиген (эритроциты барана) достоверно снижена в период новорожденности, а на последующих этапах постнатального онтогенеза наблюдается усиление активности гиперчувствительности замедленного типа (рис. 3).
На основании полученных результатов можно сделать заключение о том, что патология гепатобилиарной системы матери в условиях эксперимента сопровождается замедлением формирования иммунологических реакций клеточного типа в раннем постнатальном периоде плода, а на последующих этапах онтогенеза наблюдается напряжение клеточного иммунитета потомства, проявляющееся в интенсификации реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Для сравнительной оценки влияния поражения печени самок крыс с использованием D(+)-галактозамина и E.сoli на морфофункциональное контрольная группа опытная группа опытная группа 0, 0, величина отека, мм 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 15 30 45 возраст, сутки Рис. 3. Интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа (на введение стандартного антигена – эритроцитов барана) у экспериментальных животных.
состояние тимуса и клеточного иммунитета у потомства был применен ранговый метод анализа. Результаты которого позволяют сделать заключение о том, что наибольшее влияние хронической патологии печени матери на становление клеточного иммунитета потомства отмечается у экспериментальных животных 2-ой опытной группы (поражение печени обусловленное введением E. сoli), по сравнению с животными опытной группы 1. При этом, необходимо также отметить, что критическим сроком, как у 1-ой так и 2-ой опытной группы животных является период начала полового созревания, на котором отмечаются наибольшие изменения морфофункционального состояния тимуса по сравнению с контрольными животными. Интересен тот факт, что у экспериментальных животных опытной группы 1 наиболее выраженные изменения затрагивают в основном морфологические характеристики лимфоцитов тимуса, в то время как у животных опытной группы 2 более ярко выражены изменения морфофункционального состояния тучных клеток, т.е. специфического микроокружения тимуса.
Иммунная система плода функционирует в сложной ситуации. С одной стороны, она обеспечивает внутренний гомеостаз самого плода, с другой стороны, будучи еще незрелой, но подвергающейся антигенному воздействию организма матери, она должна быстро адаптироваться и реагировать на эти воздействия. Естественно, что в этих условиях ее структура и морфофункциональные свойства должны отличаться от таковых взрослого организма. При этом, наличие каких либо патологий со стороны материнского организма (в частности поражения гепатобилиарной системы) в антенатальный период развития приводит к усилению нагрузки на не достигшую окончательной зрелости иммунную систему, как через антигенное воздействие, так и через нарушение становления органов иммуногенеза ввиду поражения одноименного органа – печени, который является первым кроветворным органом у плода (Савченко Ю.И., Лобынцев К.С., 1980;
Брюхин Г.В., Евченко Е.В., 2001).
Проанализировав общие и специфические изменения тимико лимфатической системы у потомства самок крыс с поражением гепатобилиарной системы различного генеза (холестатической, токсической, аутоиммунной, алкогольной, соответствующей гепатиту А и В) можно сделать вывод о том, что разные формы патологии печени у матери приводят к формированию морфологических и функциональных нарушений различных компонентов данной функциональной системы.
На основании данных литературы (Пшенникова М.Г., 2000) и результатов настоящего исследования предполагаемые механизмы, лежащие в основе дисфункции системы клеточного иммунитета у потомства самок крыс с экспериментальной хронической патологией печени различного генеза, нам представляются следующим образом. При патологии печени матери происходит сбой ряда гомеостатических систем материнского организма, опосредованный прежде всего повреждением основных функциональных систем печени: дезинтоксикационной, поглотительно-экскреторной, инактивационной, белково-секреторной и др. Вследствие этого, в материнском организме происходит нарушение различных видов обмена веществ, результатом чего является накопление в организме экзо- и эндотоксикантов, циркулирующих иммунных комплексов, а также гормональный дисбаланс и другие изменения, затрагивающие практически все функциональные изменения организма. Данные дисфункции материнского организма обусловливают развитие плода в условиях постоянных стрессовых реакций. Кроме того, необходимо отметить, что плод находится под постоянным антигенным воздействием со стороны организма матери, связанным в том числе с выработкой антител как на выделение печеночных антигенов при повреждении гепатобилиарной системы матери, так и на иммуноглобулины, поступающие через гемоплацентарный барьер. При этом материнские антитела несут определенную опасность для зародыша, так как наряду с иммуноглобулинами через плацентарный барьер могут транспортироваться антитела против антигенов самого зародыша. Они являются для матери аллогенными, поэтому не всегда совместимыми. (П.С. Гуревич с соавт., 2005).
Таким образом, можно говорить о том, что патологическая система, возникающая под воздействием внутриутробного стресса включает в себя две детерминанты: первичную – стрессорные повреждения под влиянием поступающих продуктов метаболизма;
и вторичную – аутоиммунные процессы под воздействием антигенной атаки со стороны материнского организм.
Многочисленные клинические исследования указывают на наличие особой связи между состоянием здоровья матери и плодом, играющей важную роль при беременности. При этом, отклонения, происходящие в любом элементе системы мать-плацента-плод, неизбежно приводят к развитию ответной реакции во всех взаимодействующих компонентах системы как функционального, так и структурного характера. (Н.И. Цирельников, 2005).
Процессы, происходящие в результате патологии гепатобилиарной системы матери, приводят к изменению иммунологической реактивности и резистентности потомства и нарушению морфо-функционального становления тимико-лимфатической системы. Это проявляется в изменении весовых и морфологических параметров тимуса, нарушении специфического внутритимусного микроокружения, усилении пролиферативной и апоптотической активности тимоцитов, а также в интенсификации реакции гиперчувствительности замедленного типа. Обобщая все вышеизложенное, можно заключить, что у самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы рождается потомство с нарушенным «стартом здоровья» в том числе «иммунного».
ВЫВОДЫ 1. На экспериментальных моделях, воспроизводящих различные формы поражения печени матери, установлено нарушение процессов созревания лимфоцитов тимуса у потомства в постнатальном периоде.
К общим проявлениям депрессии тимуса потомства в условиях экспериментального поражения печени матери относятся: снижение весового индекса, инверсия площадей коркового и мозгового вещества, делимфатизация со снижением числа ядросодержащих клеток во всех функциональных зонах тимусной дольки.
2. У потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени изменение Т- лимфоцитопоэза сопровождается нарушением содержания и функциональной активности клеточных элементов внутритимусного микроокружения: макрофагов (достоверное снижение содержания CD положительных клеток) и мастоцитов (достоверное увеличение числа тучных клеток, усиление степени их гранулярного насыщения и дегрануляционной активности).
3. Структурно-функциональные изменения тимуса потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза сопровождается угнетением Т-лимфоцитопоэза, о чем свидетельствует достоверное снижение числа зрелых лимфоцитов во всех функциональных зонах тимуса. Угнетение лимфоцитопоэза на уровне тимуса протекает на фоне усиления пролиферативной активности лимфоцитов, что находит свое проявление в достоверном увеличении числа малодифференцированных клеток и гиперэкспресии на них Ki-67.
4. Нарушение у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени различного генеза Т-лимфоцитопоэза на центральном уровне сопровождается достоверным увеличением в тимусе популяции тимоцитов, экспрессирующих рецепторы к р53, индуцирующему апоптоз, и достоверном снижение числа клеток, экспрессирующих на своей поверхности антиапоптотический протеин Bcl-2.
5. У потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза имеет место усиление Т-зависимой иммунологической реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на стандартный антиген в различные сроки постнатального периода.
6. Сравнительный анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о том, что наиболее выраженные изменения клеточного звена иммунитета выявлены у потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы, обусловленным введением E Coli.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Бирюкова, Т.И. Морфофункциональные особенности становления клеточного иммунитета потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В. Брюхин // Вестник ЧГПУ – Челябинск: Изд-во Челяб. гос. пед. ун-та – 2009. – №.8. – С. 299-306 (издание, рекомендованное ВАК РФ) 2. Бирюкова, Т.И. Особенности морфологии тимуса потомства самок крыс с поражением печени различного генеза генеза [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В.
Брюхин // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды: материалы II международной научно-практической конференции / науч. ред. Д.З. Шибкова – Челябинск: Изд-во Челяб. гос. пед. ун та – 2008. – Т.2. – С. 114-118.
3. Бирюкова, Т.И. Морфофункциональная характеристика тучных клеток вилочковой железы потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В. Брюхин // Вестник Челябинского государственного университета: Биология.– 2008. - №4 (105). – С.64-68.
4. Бирюкова, Т.И. Морфофункциональная характеристика тучных клеток тимуса потомства самок крыс с экспериментальным D-галактозаминовым поражением печени [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В. Брюхин, А.А. Федосов // Морфология. – 2008. – Т.133, N2. - С.19.
5. Бирюкова, Т.И. Морфологическая характеристика тимуса потомства крыс с хроническим D-галактозаминовым поражением печени [Текст] / Т.И.
Бирюкова, Г.В. Брюхин, А.А. Федосов // Морфология. – 2008. – Т.133, N3. - С.
24.
6. Бирюкова, Т.И. Особенности морфологии тимуса у потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В. Брюхин // Морфология. – 2008. – Т.134,№5. – С. 57.
7. Бирюкова, Т.И. Особенности экспрессии антиапоптозного белка Bcl- тимоцитами потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В. Брюхин // Аллергология и иммунология. – 2008. – Т.9, №.3. – С. 366.
8. Бирюкова, Т.И. Морфофункциональная характеристика мастоцитов тимуса и селезенки потомства матерей на различных сроках исследования при экспериментальном поражении печени различного генеза [Текст] / Т.И.
Бирюкова, Г.В. Брюхин, О.М. Малышева // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. – 2008. – Т.18,№5. – С. 80.
9. Бирюкова Т.И. Влияние различных форм экспериментального поражения печени самок крыс на интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа у их потомства [Текст] / А.А. Федосов, Т.И. Бирюкова // Роль патологии печени матери в нарушении развития реактивности и резистентности потомства в условиях эксперимента: сборник / под ред. проф.
Г.В. Брюхина. – Челябинск: Челябинская государственная медицинская академия. – 2009. – вып.2. – С. 105 – 110.
10. Бирюкова Т.И. Характеристика пролиферативной и апоптотической активности тимоцитов потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза [Текст] / А.А. Федосов, Т.И. Бирюкова // Роль патологии печени матери в нарушении развития реактивности и резистентности потомства в условиях эксперимента: сборник / под ред. проф.
Г.В. Брюхина. – Челябинск: Челябинская государственная медицинская академия. – 2009. – вып.2. – С. 111 – 119.
11. Бирюкова Т.И. Морфофункциональные особенности становления иммунной системы у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением гепатобилиарной системы. [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В. Брюхин // Роль патологии печени матери в нарушении развития реактивности и резистентности потомства в условиях эксперимента: сборник / под ред. проф.
Г.В. Брюхина. – Челябинск: Челябинская государственная медицинская академия. – 2009. – вып.2. – С. 120-127.
12. Бирюкова, Т.И. Характеристика пролиферативной и апоптотической активности тимоцитов потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы [Текст] / Т.И. Бирюкова, Г.В. Брюхин // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. – 2009. – Т.9,№1. – С. 28.