Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков np, vp40 вируса эбола и vp40, vp35 вируса марбург
На правах рукописи
Иванова Алла Владимировна
ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ
ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ
БЕЛКОВ NP, VP40 ВИРУСА ЭБОЛА И VP40, VP35 ВИРУСА МАРБУРГ
03.01.03. – МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Кольцово – 2010
Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Научный руководитель:
к.б.н. Качко Алла Васильевна
Официальные оппоненты:
д.б.н. Карпенко Лариса Ивановна к.б.н. Белавин Павел Александрович
Ведущая организация:
Новосибирский государственный университет.
Защита диссертационной работы состоится « 3 » декабря 2010 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан « » 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н. Г. П. Трошкова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Вирусы Марбург (ВМ) и Эбола (ВЭ), вызывающие геморрагические лихорадки (ГЛ), были открыты более 30 лет назад, однако до настоящего времени эффективных средств специфической профилактики этих заболеваний для людей не разработано. Филовирусы способны вызывать геморрагические лихорадки у человека с крайне тяжелым течением заболевания и высоким уровнем летальности (до 90%) (Baron R.C., 1977).
Симптомы, характеризующие ГЛ ВЭ и ВМ в первые несколько дней инфекции, являются неспецифическими и во многом схожими с клинической картиной характерной для ряда заболеваний, вызванных другими вирусами, бактериями или простейшими (желтая лихорадка, лихорадка Ласса, дизентерия, тиф, чума, малярия и т.д. (Gear J.H., 1979), что усложняет раннюю симптоматическую диагностику. Высокая патогенность данных вирусов весьма затрудняет экспериментальные работы по созданию методов лечения, профилактики и диагностики, потому что исследования ВЭ и ВМ, относящихся к I группе патогенности, требуют специально сконструированных лабораторий с максимальным уровнем биологической защиты BSL-4, биоохраны и специальной подготовки персонала. Тем не менее, для проведения многих видов исследований нет необходимости проводить работы с живым вирусным агентом, а достаточно использовать лишь его генетический материал. Длительное и безопасное хранение генетического материала РНК-содержащих вирусов, а также его наработка в стандартных лабораторных условиях, возможны при создании геномных библиотек, представляющих собой коллекцию гибридных плазмид, содержащих фрагменты вирусного генома.
Филовирусные геморрагические лихорадки являются эндемичными заболеваниями (в основном это страны центральной Африки), но их завоз на территорию РФ возможен в связи с поставками экзотических животных для нужд учреждений и частных лиц, а также с увеличивающимся людским потоком между государствами, обусловленным расширяющимися туристическими и экономическими связями со странами африканского континента. В случае возникновения вспышки филовирусных лихорадок в пределах РФ необходимо иметь эффективные средства диагностики данного вида заболеваний.
Наряду с методом ПЦР-диагностики основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, а именно иммунодиагностике, базирующейся на выявлении специфических антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. В качестве антигенов для определения титров специфических антител могут быть использованы рекомбинантные вирусные белки, несущие в своём составе антигенные структуры, узнаваемые специфическими антивирусными антителами (Saijo M., 2001). С использованием рекомбинантных белков открываются новые возможности для создания тест-систем, неотъемлемой частью которых является наличие библиотек генов рекомбинантных плазмид, кодирующих полноразмерные копии генов этих высокопатогенных вирусов.
Создание библиотек полноразмерных генов позволит надёжно законсервировать в биологически безопасной форме генетический материал для будущих исследований. Поддержание и пополнение клонотек полноразмерных генов ВЭ и ВМ, а также продуцентов рекомбинантных вирусных белков, создаёт предпосылки для их использования в обратной генетике и изучения репликации вирусов. Фундаментальные исследования вирусов, включая особо опасные, входят в число основных направлений деятельности ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», в связи с чем целью настоящего исследования являлось получение рекомбинантных белков NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ и исследование их иммунохимических свойств, с помощью поликлональных (ПАТ) и моноклональных антител (МКА), специфичных к филовирусам и пополнение коллекции гибридных плазмид, содержащих полноразмерные копии генов филовирусов.
Основные задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- сконструировать экспрессирующие гибридные плазмиды, содержащие полноразмерные копии генов NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург;
- оптимизировать условия экспрессии генов, кодирующих белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург;
- получить аффинно-очищенные препараты полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург;
- исследовать антигенную специфичность и иммуногенность продуктов экспрессии генов NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург.
Научная новизна работы и практическая значимость работы.
В результате проведенной работы сконструированы гибридные плазмиды, кодирующие полноразмерные копии генов VP40, NP вируса Эбола и VP40, VP вируса Марбург, пополняющие коллекцию библиотеки полноразмерных генов филовирусов.
Были оптимизированы условия экспрессии генов в составе плазмид pQE30 P40, pQE30-NP ВЭ и pQE31- P40, pQE31-VP35 ВМ в штамме E. coli JM103. Были наработаны и выделены с помощью аффинной хроматографии полноразмерные рекомбинантные белки филовирусов.
Показано, что аффинно-очищенные препараты рекомбинантных белков сохранили антигенную структуру, сходную со структурой нативных природных белков, что позволило использовать данные препараты в качестве антигенов для выявления специфических противовирусных антител, а также в качестве положительного контроля при конструировании лабораторных тест-систем.
Новизна и приоритет данной разработки подтверждены патентами РФ (патенты № 2395575, № 2395576, № 2395577).
Библиотеки клонов гибридные плазмиды и рекомбинантные белки высокопатогенных вирусов могут быть использованы для обеспечения работ по изучению генетической организации вирусов, а также при разработке современных методов экспресс-диагностики геморрагических лихорадок.
Положения, выносимые на защиту.
1. Гибридные плазмиды, кодирующие полные гены NP, VP40 ВЭ и VP40, 35 ВМ белков вирусов Эбола и Марбург обеспечивают эффективную продукцию данных белков в прокариотической системе экспрессии.
2. Полученные нами рекомбинантные белки обладают иммуногенностью и индуцируют в сыворотке крови иммунизированных мышей синтез специфических антител с высоким титром (1 : 2 000 000).
3. Рекомбинантные белки VP40, NP ВЭ и VP40, VP35 ВМ антигенно подобны вирусным белкам ВЭ и ВМ и могут быть использованы при конструировании иммунодиагностических тест-систем для обнаружения вирусных антигенов и противовирусных антител.
Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы представлены автором в форме доклада на VI Международной конференции РФФИ «Результаты фундаментальных исследований для инвестиций», г. Пущино 2001 г.;
II Научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», г. Новосибирск, 29-31 мая 2002 г.;
Международной научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека», г. Минск, Беларусь, 22-23 октября 2009 г. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для кандидатских диссертаций. Получено 5 патентов РФ на изобретение.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов:
«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 8 таблиц.
Библиография включает 167 наименований, из которых 38 отечественных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Часть первая «Конструирование плазмид, несущих полноразмерные копии генов VP40, NP ВЭ и VP40, VP35 ВМ» посвящена разработке и получению конструкций гибридных плазмид, обеспечивающих высокий уровень продукции штаммов-продуцентов в клетках Escherichia coli.
С целью получения полноразмерных копий генов VP40 и NP ВЭ была построена кДНК методом обратной транскрипции геномной РНК ВЭ (суммарная РНК ВЭ была любезно предоставлена Субботиной Е. Л.). Амплификацию фрагментов вирусной кДНК проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров, рассчитанных по последовательности генома ВЭ с помощью компьютерной программы OLIGO:
для VP40:
5’ – AAAAGGATCCATGAGGCGGGTTATATTGCCTAC – 3’ 5’ – AAAAAAGCTTTTACTTCTCAATCACAGCTGGAA – 3’ для NP:
5’ – AAAAGGATCCATGGATTCTCGTCCTCAGAAAATCTGG – 3’ 5’ – AAAAAAGCTTTCACTGATGATGTTGCAGGATTG-3’ Для различных комбинаций праймеров использовались программы, имеющие отличие на стадии отжига праймеров. Полученные ПЦР-продукты были очищены и обработаны эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII.
А. Б.
T5 промотор T5 промотор Bam (146) HI Ava (5015) II Bam (146) HI AmpR Ava (566) II VP40E Ava (3776) II Ava (4793) II AmpR Ava (723) II Ava (957) II Ava (3554) II Ava (952) II NPE pQE30-VP40Enew pQE30-NPEnew Ava (1036) II Ava (1442) II 4407 bp 5646 bp Bsp1720I (1145 Ava (1600) II ColE1 Ori Ava (2035) II ColE1 Ori HindIII (2372) Рис. 1. Схематическое изображение рекомбинантных плазмид pQE30-VP40 (А) и pQE30-NP ВЭ (Б). Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции BamHI, AvaII, HindIII, Bsp1720I, промотор фага Т5, ген устойчивости к ампициллину (AmpR), оri репликации ColE1 и клонированные полноразмерные гены NP и VP40 ВЭ.
В линеаризованную и обработанную щелочной фосфатазой плазмиду pQE 30, гидролизованную рестриктазами BamHI и HindIII были встроены фрагменты, содержащие полноразмерные копии генов NP и VP40 ВЭ. С помощью рестрикционного анализа, с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI, AvaII, из множества клонов произвольно были отобраны по 10 клонов обеих гибридных плазмид, содержащие необходимые вставки (Рис. 2). Таким образом, были получены плазмиды pQE30-VP40 (Рис. 1 А) и pQE30-NP (Рис. 1 Б), которые должны были обеспечивать экспрессию полноразмерных генов в E.coli JM 103.
А. Б.
Рис. 2. Электрофореграмма ДНК рекомбинантных плазмид, обработанных эндонуклеазами рестрикции BamHI и AvaII в ПААГ. Размеры фрагментов в п.н.
приведены справа, размеры фрагментов маркёра - слева.
А) pQE30-VP40 ВЭ. M – маркёр молекулярного веса, 1-7 - гибридная плазмида (f 2518, 777, 577, 229, 222,84).
Б) pQE30-NP ВЭ. М – маркёр молекулярного веса, 1-5 – гибридная плазмида (f 2518, 811;
600, 485, 222), 6 – контрольная плазмида pQE30 (f 2463, 777, 222).
В результате встройки плазмиды содержали открытые рамки трансляции (ОРТ), кодирующие белок длиной 338 аминокислотных остатков (а.о.) для VP ВЭ и 751 а.о. для NP ВЭ.
Следующим этапом работы было получение плазмиды pQE-31-VP40 и pQE 31-VP35 ВМ. Аминокислотная последовательность гена VP40 ВМ (штамм Popp) составляет 911 пар оснований (п.о.). ОРТ содержит 303 а.о. и кодирует полипептид с расчетной массой 33734 Да.
На первых этапах сборки полноразмерных копий генов VP40 и VP35 ВМ была использована библиотека клонов, клонированная по сайту PstI плазмидной ДНК рВR322 и несущих специфические фрагменты генома ВМ (Bukreyev A.A., 1995).
Для конструирования полноразмерной копии гена VP40 ВМ, фрагмент плазмиды pMBG 4-48 из геномной библиотеки, несущий кДНК-фрагмент XbaI/BglII (c 4550 по 5659 нуклеотид (н.) по геномной РНК ВМ) генома ВМ штамм Popp с 3863 по 5864 н. (GenBank Accession No. Z29337), был встроен в полилинкер промежуточной плазмиды pMTL22 по соответствующим сайтам рестрикции в обратной ориентации.
В результате была получена плазмидная конструкция pMTL22(rev)-VP BM, со встроенным фрагментом, включающим полноразмерную кДНК гена VP ВМ. Правильность сборки данной конструкции была проверена гидролизом эндонуклеаз рестрикции.
А. Б.
T5 промотор T5 промотр Bam (145) HI Bam (145) HI BamHI (203) Pst (172) I Ava (3940) II Ava (482) II Ava (3949) II AmpR VP35M AmpR VP40M Ava (3718) II HindIII (811) Ava (3727) II Ava (863) II Ava (826) II pQE31-VP40Mnew pQE31-VP35Mnew 4571 bp 4580 bp HindIII (1297) Pst (1302) I Bsp1720I ( ColE1 Ori ColE1 Ori Рис. 3. Схематическое изображение рекомбинантной плазмиды pQE31-VP40 (А) и pQE31-VP35 (Б) ВМ. Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции BamHI, AvaII, PstI, Bsp1720I, HindIII, промотор фага Т5, ген устойчивости к ампициллину (AmpR), оri репликации ColE1 и клонированные полноразмерные гены белков VP40 и VP35 ВМ.
Для получения экспрессирующей конструкции полноразмерного гена VP ВМ фрагмент плазмиды pMTL22(rev)-VP40BM, длиной 1105 п.о. по сайтам BamHI/Bsp1720I, был встроен в линеаризированную и обработанную щелочной фосфатазой плазмиду pQE31 по соответствующим сайтам (Рис. 3 А).
Наличие вставки целевого гена в структуре плазмиды pQ31-VP40 было определено с помощью рестрикционного анализа, с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI-AvaII-PstI и из множества клонов произвольно были отобрано 6 клонов (Рис. 4 А).
На следующем этапе работы была получена плазмида pQE31-VP35 ВМ.
Аминокислотная последовательность гена V35 ВМ (штамм Popp) составляет п.н. ОРТ содержит 329 а.о. и кодирует полипептид с расчетной массой 36149 Да.
Фрагмент музейной плазмиды pMBG 8-25 BglII-PstI c 3272 по 3965 н. по геномной РНК ВМ (GenBank Accession No. Z29337) был встроен в плазмиду pMBG2-26 по сайтам BglII-Zsp21I(NsiI).
В результате была получена промежуточная плазмидная конструкция pMBG226/825, несущая фрагмент кДНК геномной РНК ВМ с2374 по 3965 н.
Далее фрагмент кДНК SspI-HpaI (1066 п.о.) плазмиды pMBG226/825 встраивали в линеаризованную по сайту SmaI и обработанную щелочной фосфатазой плазмиду pQE31 (Рис. 3 Б).
С помощью рестрикционного анализа, с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI-AvaII-HindIII, из множества клонов произвольно были отобраны 6 клонов, содержащие необходимые вставки (Рис. 4 Б).
Таким образом, были получены плазмиды pQE31-VP40 и pQE31-VP35, которые должны были обеспечивать экспрессию полноразмерных генов в E.coli JM 103.
В результате встройки плазмиды содержали ОРТ, кодирующие белок длиной 331 а.о. для VP40 ВМ и 370 а.о. для VP35 ВМ.
А. Б.
Рис. 4. Электрофореграмма ДНК рекомбинантных плазмид в ПААГ, Размеры фрагментов в п.н. приведены слева, размеры фрагментов маркёра - справа.
А) pQE31-VP40 ВМ, обработанная эндонуклеазами рестрикции BamHI-AvaII-PstI.
М – маркер молекулярного веса, 1-6 – гибридная плазмида (f 2864, 779, 691, 439, 222, 27), 7 – контрольная плазмида pQE31 (f 779, 222, 38).
Б) pQE31-VP35 ВМ, обработанная эндонуклеазами рестрикции BamHI-HindIII AvaII.
М – маркер молекулярного веса, 1-6 – гибридная плазмида (f 2421, 779, 485, 329,279, 222, 15), 7 – контрольная плазмида pQE31 (f 779, 222, 42).
Нуклеотидные последовательности рамок считывания целевых генов в плазмидах pQE30-NP, pQE30-VP40, pQE31-VP40 и pQE31-VP35 были определены секвенированием на автоматическом анализаторе ДНК Beckman CEQ2000XL, используя набор реактивов CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit с использованием специфических праймеров для pQE, согласно инструкциям фирм-производителей.
Часть вторая «Оптимизация условий экспрессии и очистка Ni-хелатной хроматографией рекомбинантных белков» описывает получение расчётных характеристик рекомбинантных полипептидов для оптимизации условий экспрессии генов, кодирующих белки филовирусов, подбор условий экспрессии штаммов-продуцентов и получение аффинно-очищенных препаратов полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ.
Расчёт характеристик рекомбинантных белков и профилей гидрофильности гидрофобности проводили с помощью программы «Vector NTI 8»
Таблица 1.
Расчетные характеристики рекомбинантных полипептидов, полученных в E.coli.
Расчетная Расчетная Рекомбинантный Изоэлектрическая длина белка № молекулярная белок точка белка (pI) масса белка (Да) ( а.о.) 1 VP40 ВЭ 338 36579.31 8, 2 NP ВЭ 751 84679.78 5, 3 VP40 ВM 331 36941.29 9, 4 VP35 ВM 370 40931.02 9, У белков, как у амфотерных соединений величина и знак заряда определяется соотношением аминокислотного состава и рН раствора. Величина изоэлектрической точки (pI) белка - это значение рН, при котором суммарный заряд белка равен 0. Белки в изоэлектрическом состоянии характеризуются:
минимальной устойчивостью и вязкостью в растворе, отсутствием подвижности в электрическом поле, максимальной способностью к осаждению.
У большинства белков pI лежит в слабокислой среде, однако имеются белки и с резким преобладанием щелочных свойств. Для большинства природных белков изоэлектрическая точка находится в слабокислой среде (рН 4,8 – 5,4), что свидетельствует о преобладании в их составе дикарбоновых аминокислот. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами – в слабощелочной.
Отношение кислотных и основных а.о. в белках VP40 филовирусов и VP ВМ, имеющих изоэлектрическую точку с резким преобладанием щелочных свойств (8,97(для VP40 ВЭ), 9,01 (для VP40 ВМ) и 9,49 (для VP35 ВМ) говорят о преобладании остатков основных аминокислот. Данные белки являются сильно основными и связываются с нуклеиновыми кислотами за счёт электростатического взаимодействия с фосфатными остатками нуклеиновых кислот. Первичная структура этих белков в большей степени является гидрофильной (Рис. 5 А, В, Г), что говорит о хорошей растворимости белков.
А. Б.
В. Г.
Рис. 5. Профиль гидрофобности – гидрофильности. А) рек. белок VP40 ВЭ;
Б) рек.
белок NP ВЭ;
В) рек. белок VP40 ВМ;
Г) рек. белок VP35 ВМ. Гидрофобные районы находятся выше разделительной линии (0), гидрофильные – ниже.
Профили построены c интервалом 9 а.о. Н. ед. – номинальные единицы.
Белок NP ВЭ имеет изоэлектрическую точку в слабокислой среде 5,14, что говорит о преобладании в его составе дикарбоновых аминокислот.
Аминокислотная последовательность NP ВЭ имеет гидрофобную N-концевую область и гидрофильный C-концевой район (Рис. 5 Б).
Согласно литературным данным длина полипептида VP40 ВЭ составляет 326 а.о. Как упоминалось ранее, в результате генно-инженерных манипуляций, полученная гибридная плазмида pQE-VP40 ВЭ содержит ОРТ, кодирующую белок длиной 338 а.о. (с шестью остатками гистидина, обеспечивающими последующее выделение белка на Ni-хелатном носителе и остатками полилинкера векторной плазмиды pQE) под контролем промотора фага Т5.
Клетки E.coli JM 103 трансформировали плазмидами pQE30-VP40, pQE31 VP40 и pQE31-VP35, индуцировали индуктором Lac-оперона IPTG, обеспечивающим высокоэффективную транскрипцию с промотора фага Т5, в среднеарифметической стадии роста (ОП=0,8) с последующим культивированием в течение 4 часов при 30 °С. Отбор клонов-продуцентов проводили по наличию экспрессируемого белка в 15% SDS-ПААГ. В качестве контроля использовали полученный аналогичным способом лизат клеток штамма E.coli JM103, содержащий векторную плазмиду pQE30 (для pQE30-VP40) и pQE31 (для pQE31 VP40 и pQE31-VP35).
А. Б. В.
Рис. 6. Электрофореграмма лизатов E.coli JM103, содержащих плазмиды: pQE30 VP40 (А), pQE31-VP40 (Б) и pQE31-VP35 (В) в 15% SDS-ПААГ.
A) 1-9 – лизаты клеток, несущих плазмиду pQE30-VP40;
10 – лизат клеток E.coli JM103, несущий плазмиду pQE30 (контроль бактериальных клеток), M – маркер молекулярной массы (Sigma);
Б) 1 – лизат клеток E.coli JM103, несущий плазмиду pQE31 (контроль бактериальных клеток), 2-5 - лизаты клеток, несущих плазмиду pQE31-VP В) M – маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, M3913),1 - лизат клеток E.coli JM103, несущий плазмиду pQE31-VP35 ВМ до индукции IPTG, 2-4 - лизаты клеток E. coli JM103, несущие плазмиду pQE31 -VP35 ВМ, 5 - лизат клеток E.coli JM103, несущие плазмиду pQE31 (контроль бактериальных клеток).
Электрофоретическая подвижность синтезируемых рекомбинантных белков совпадала с нашими теоретическими расчётами (Рис. 6 А, Б, В).
Для получения рекомбинантного белка NP использовали иную стратегию культивирования и индукции синтеза белка. Как отмечалось ранее, гидролиз эндонуклеазами рестрикции BamHI-HindIII-AvaII с последующим электрофоретическим разделением в ПААГ произвольно выбранных клонов рекомбинантной плазмиды pQE30-NP ВЭ, а также определение нуклеотидных последовательностей, показывали наличие в их составе вставок целевых генов.
Однако, при стандартной схеме культивирования штаммов-продуцентов, электрофорез лизатов в 10% SDS-ПААГ визуально не выявлял продуктов экспрессии гена NP ВЭ (Рис. 7).
Мы предприняли попытки получить экспрессию гена и провели эксперимент по наработке отдельно взятых клонов с поверхности агаризованной среды LB для ночного культивирования и последующей дневной индукцией синтеза в течение 5-6 часов при пониженной (25 С) температуре. Экспрессия рекомбинантного белка различными клонами E.coli была проанализирована электрофорезом в 10% SDS-ПААГ. По результатам электрофореза были выбраны клоны с 8 по 13 (Рис. 7).
Рис. 7. Электрофореграмма лизатов E.coli JM103, содержащих плазмиду: pQE30 NP в 10% SDS-ПААГ.
1-6 – лизаты клеток E.coli JM103, несущих плазмиду pQE30-NP после дневного культивирования и индукции IPTG, 7 – лизаты клеток E.coli JM103, несущих плазмиду pQE30 после дневного культивирования с дневной индукцией IPTG, 8 15 – лизаты клеток E.coli, несущих плазмиду pQE30-NP ВЭ после ночного культивирования и дневной индукции IPTG.
Полученные клоны штаммов–продуцентов были наработаны и клеточные лизаты E.coli JM103, несущие плазмиды pQE30-NP, pQE30-VP40, pQE31-VP40 и pQE31-VP35 были проанализированы методом ИФА со специфическими иммунными сыворотками.
Как упоминалось ранее, все полученные конструкции содержали кластер из 6 остатков His в N-концевой части белка, включающая полигистидиновый тракт (6хHis-tag), что позволило нам очищать рекомбинантные белки филовирусов c помощью Ni-хелатной хроматографии. Цифровая обработка электрофореграмм показала, что чистота белков после Ni-хелатной хроматографии достигает от 67 до 88 %.
Очищенный рекомбинантный белок VP40 ВЭ представлен единичной полосой и имел молекулярную массу 37 кДа, что соответствовало нашим расчётам (Рис. 8 А).
А. Б. В.
М 1 2 1 М М 1 NP ВЭ VP40 ВЭ VP35 ВМ VP40 ВМ Рис. 8. Электрофореграмма очищенных рекомбинантных белков.
А) Рекомбинантный белок VP40 ВЭ в 15% SDS-ПААГ, M – маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, M3913), 1 – очищенный рекомбинантный белок VP40 ВЭ, – лизат клеток E. coli, несущих плазмиду pQE30-VP40 ВЭ;
Б) белок ВЭ в 10% SDS-ПААГ. M – маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, M3913), 1 – лизат клеток E. coli, несущих плазмиду pQE30-NP ВЭ;
2 – очищенный рекомбинантный белок NP ВЭ;
В) Рекомбинантный белок VP40 и VP35 ВМ в 15% SDS-ПААГ. M – маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, M3913), 1 – очищенный рекомбинантный белок VP35 ВМ, 2 – очищенный рекомбинантный белок VP ВМ.
Электрофоретический анализ рекомбинантного белка NP ВЭ показал, что его электрофоретическая подвижность (приблизительно 115 кДа) не соответствовала расчетной молекулярной массе (Рис. 8 Б). При картировании NP ВЭ в 2006 г.Watanabe S. с соавторами показали, что две области этого белка, ограниченные а.о. 439-492 и 589-739, изменяют подвижность NP ВЭ в SDS-ПААГ на 5 и 15 кДа, соответственно.
Полученные рекомбинантные белки VP40 и VP35 ВМ имели большую электрофоретическую подвижность, чем нативные белки (Рис. 8 В), что соответствует нашим расчётам (табл. 1) и объясняется наличием дополнительных н.о., оставшихся после генно-инженерных манипуляций.
Концентрацию белков в полученных стоках измеряли при помощи набора «Bio-Rad Protein Assay Kit» в соответствии с рекомендациями производителя на спектрофотометре UVmini 1240 при длине волны 495 нм и оценивали путем калибровки по овальбумину в 4 М растворе мочевины (Lowry O. H., 1951).
Уровень синтеза рекомбинантных полипептидов оценивался до 70 мг на литр культуральной среды с выходом целевого белка от 25 до 40% от суммарного клеточного белка.
Электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков NP и VP40 ВЭ соответствовала расчётным данным и была сравнима с подвижностью нативных вирусных белков. Рекомбинантные VP40 и VP35 ВМ имеют большую электрофоретическую подвижность, чем нативные белки, как упоминалось ранее, за счет дополнительных нуклеотидов, оставшихся после генно-инженерных манипуляций (Рис. 9).
Все полученные нами, аффинно-очищенные рекомбинантные белки были использованы для получения моносывороток.
1 2 3 4 5 6 М NP ВЭ VP40 ВЭ VP35 ВМ VP40 ВМ Рис. 9. Электрофореграмма очищенных рекомбинантных и вирусных белков ВЭ и ВМ.
1. - рекомбинантный белок VP35 ВМ, 2. - рекомбинантный белок VP40 ВМ, 3. препарат инактивированного ВМ, 4. - препарат инактивированного ВЭ, 5. рекомбинантный белок VP40 ВЭ, 6. - рекомбинантный нуклеопротеин ВЭ, M маркер молекулярного веса (Bio-Rad).
Часть третья «Сравнительное изучение антигенных и иммуногенных свойств белков филовирусов» содержит характеризацию полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ с помощью поликлональных и МКА, специфичных к филовирусам. На данном этапе работы очищенные рекомбинантные белки NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ были использованы для иммунизации, а также для исследования антигенных свойств методами ИФА и иммуноблота (ИБ). С этой целью нами была использована коллекция МКА, полученных при иммунизации инактивированными препаратами ВМ и ВЭ и поликлональные иммунные сыворотки.
Рис.10. Иммуноблот МКА с нативными и рекомбинантными белками ВЭ.
А) 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 4А2, 2 - препарат ВЭ, обработан МКА 1С, - рекомбинантный белок VP40, обработан МКА 4А2, 4 - рекомбинантный белок VP40, обработан МКА 1С1, 5 - препарат ВМ, обработан МКА 4А (отрицательный контроль), 6 - препарат ВМ, обработан МКА 1С (отрицательный контроль), 7 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 4А (отрицательный контроль), 8 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 1С (отрицательный контроль). Разведение 1 : 10 000.
Б) 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 1В2, 2 - препарат ВЭ, обработан МКА 7В11, 3 - рекомбинантный NP, обработан МКА 1В2, 4 - рекомбинантный NP, обработан МКА 7В11, 5 - препарат ВМ, обработан МКА 1В2 (отрицательный контроль), 6 - препарат ВМ, обработан МКА 7В11 (отрицательный контроль), 7 лизат клеток E.coli, обработан МКА 1В2 (отрицательный контроль), 8 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 7В11 (отрицательный контроль). Разведение 1 :
500.
Полученные в денатурирующих условиях рекомбинантные белки распознавались специфическими МКА, полученными к нативным белкам ВЭ и ВМ. Что позволило предположить о сохранении линейных детерминант в рекомбинантных белках. Так специфичность рекомбинантных белков NP и VP ВЭ была показана при связывании с МКА 4А2 и 1С1 для белка VP40 ВЭ (Рис. 10 А), а 1В1 и 7B11 для белка NP (Рис. 10 Б). Аналогично предыдущим белкам, рекомбинантный белок VP40 ВМ распознавался двумя МКА 7 Н10 и 7В (Рис. 11 А), полученными ранее к нативному препарату ВМ. Рекомбинантный VP35 ВМ, так же как и вирусный антиген, распознавался МКА 3F9 (Рис. 11 Б).
Это свидетельствует о подобии линейных эпитопов на рекомбинантных и природных белках NP,VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ.
Данные ИБ позволяют заключить, что полученные продуценты гибридных белков сохраняют иммунохимические свойства природных антигенов ВЭ и ВМ.
Антитела моносывороток, специфичные к рекомбинантным белкам, выявляют соответствующие им белки – аналоги в инактивированных вирусных препаратах, что свидетельствует о подобии антигенных детерминант, представленных на поверхности рекомбинантных и природных белков NP, VP40 ВЭ и VP40,VP ВМ.
Рис.11. Иммуноблот МКА с нативными и рекомбинантными белками ВМ в разведении 1:500.
А) 1 - препарат ВМ, обработан МКА 7Н10, 2 - препарат ВМ, обработан МКА 7D8, 3 - рекомбинантный белок VP40, обработан МКА 7Н10, 4 рекомбинантный белок VP40, обработан МКА 7D8, 5 - препарат ВЭ, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль), 6 - препарат ВЭ, обработан МКА 7D (отрицательный контроль), 7 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 7Н (отрицательный контроль), 8 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 7D (отрицательный контроль).
Б) 1 – препарат ВМ, 2 - препарат ВЭ (отрицательный контроль на антиген), 3 – лизат клеток E.coli. (отрицательный котроль для рекомбинантного белка), 4 – очищенный рекомбинантный белок VP35. Все полоски мебраны обработаны препаратом очищенных МКА 3F9.
Для сравнения иммуногенности природных и рекомбинантных белков VP и NP ВЭ были использованы мышиные антисыворотки, исследованные на специфичность, динамику наработки антител в организме и перекрестную реактивность с исследуемыми белками в ТИФА и ИБ.
По результатам ТИФА (таблица 2) видно, что в результате иммунизации мышей антигенами, содержащими рекомбинантные белки или белки в составе цельновирионного инактивированного препарата ВЭ, у всех животных на данные белки формировался специфический иммунный ответ.
Таблица 2.
Иммунохимические свойства различных антигенов ВЭ и ВМ в ТИФА Конечные разведения антител (обратные величины) Конц Вирусный ентра Антигены для ТИФА Иммуног белок Антитела ция Рек. Рек.
ен мишень в Вирус Рек. NP Рек. VP40 Вирус (мг/ VP40 VP иммуноблоте Эбола ВЭ ВЭ Марбург мл) ВМ ВМ IgG Инфекц. NP, VP40, 90 656100 656100 656100 24300 100 лошади ВЭ VP NP, VP40, АС ВЭ 90 VP35, VP30, 218700 656100 218700 2700 100 кролика VP АС крысы ВЭ 50 NP 218700 218700 218700 100 100 NP, VP40, АС мыши ВЭ 90 VP35, VP30, 218700 218700 218700 2700 100 VP рек.
АС мыши 90 VP40 656100 100 100 100 VP40-ВЭ рек. NP АС мыши 90 NP 656100 1968300 100 100 100 ВЭ МКА 1Е5 ВЭ 6,3 NP 218700 243000 100 100 100 МКА 1В5 ВЭ 5,7 VP40 72900 100 656100 100 100 GP, NP, VP35, АС инфекц.
50 VP40, VP30, 900 100 100 24300 8100 человека ВМ VP IgG инфекц. GP, NP, VP35, 90 2700 100 100 218700 72900 лошади ВМ VP40, VP АС ВМ 18,5 н.о. 100 100 100 24300 24300 кролика GP, NP, VP35, АС мыши ВМ 50 VP40, VP30, 300 100 100 24300 24300 VP рек.
АС мыши VP40 14 VP40 100 100 100 72900 1968300 ВМ рек.
АС мыши VP35 11,8 VP35 100 100 100 24300 100 ВМ МКА ВМ 8 VP40 100 100 100 729000 729000 7Н Отрицательный контроль 100 100 100 100 100 Примечание:
ЧС – сыворотка человека, переболевшего лихорадкой Марбург, IgG лошадей, иммунизированных инфекционными препаратами ВМ и ВЭ (г. Сергиев Посад), МАС – мышиные антисыворотки, КАС – антисыворотка кролика, иммунизированного инактивированным антигеном ВМ или ВЭ, Кр-АС-ВЭ – антисыворотка крысы, иммунизированной инактивированным антигеном ВЭ, концентрация антигенов 100 нг/лунка.
Полученный рекомбинантный белок VP40 ВЭ при иммунизации мышей ICR индуцировал синтез специфических антител с высоким титром (1 : 1 968 300).
Антитела мышиных моносывороток, полученных к рекомбинантному белку VP ВЭ также эффективно распознавали аналогичный белок в инактивированном препарате ВЭ в ИФА и титр антисывороток против VP40 достигал 1 : 656 100.
Согласно полученным данным ИБ и ИФА, очищенный рекомбинантный белок VP40 эффективно распознавался специфическими МКА, полученными против нативного ВЭ, а также другими иммунными сыворотками и гипериммунными сыворотками (лабораторные животные, иммунизированные инактивированным ВЭ). Это говорит о том, что рекомбинантный и вирусный белок VP40 антигенно подобны.
В соответствии с полученными данными (табл. 2) рекомбинантный белок NP ВЭ, также использованный при иммунизации мышей ICR, высокоэффективно индуцировал синтез специфических антител к рекомбинантному белку NP. Титр антител достигал 1 : 1 968 300, что также позволяет говорить о высокой иммуногенности данного белка. Полученная поликлональная сыворотка эффективно взаимодействовала с антигеном ВЭ в разведении 1 : 656 100.
Интересно отметить, что и другие специфические МКА из нашей коллекции, связывающиеся с природным NP ВЭ, также распознают рекомбинантный аналог.
Это позволило сделать заключение, что рекомбинантный белок NP сохранил основные антигенные эпитопы, тождественные вирусному белку NP.
Аффинно-очищенные рекомбинантные белки VP40 и VP35 ВМ также оказались хорошими иммуногенами и сохранили свою антигенную структуру, что было показано методами ТИФА и ИБ с использованием набора сывороток крови животных, иммунизированных очищенным препаратом ВМ или рекомбинантным белком. Результаты тестирования (таблица 2) демонстрируют, что рекомбинантные аналоги вирусных белков VP40 и VP35 ВМ тоже обладают иммуногенностью, вызывая синтез антител в организме иммунизированных мышей и выявляют специфические антитела к ВМ в сыворотках иммунизированных животных и переболевшего человека, то есть обладают антигенными свойствами.
Необходимо отметить, что оба рекомбинантных белка распознавались серопозитивной сывороткой рековалесцента, которая содержит противовирусные антитела, индуцированных иммунной системой человека в течение естественной инфекции. Таким образом, рекомбинантные белки VP40, VP35 ВМ содержат антигенные детерминанты распознаваемые противовирусными антителами человека. Аналогично вышеописанным рекомбинантным аналогам ВЭ, белки VP40 и VP35 ВМ распознаются коллекцией моноклональных антител и поликлональных сывороток. Таким образом, данные белки при иммунизации аутбредных мышей линии ICR, индуцируя синтез специфических антител к рекомбинантным белкам VP40 и VP35 ВМ в высоком титре (1 : 2 000 000 - для VP40 и 1 : 656 000 для VP35) способны с высокой чувствительностью выявлять маркёры ВЭ и ВМ.
Следовательно, иммунохимические исследования рекомбинантных белков показали, что рекомбинантные белки VP40, NP ВЭ и VP40, VP35 ВМ антигенно подобны вирусным белкам ВЭ и ВМ и могут использоваться в качестве антигенов для выявления специфических противовирусных антител. Серопозитивная сыворотка рековалесцента, оказалась очень ценным препаратом для исследования рекомбинантного белка, так как содержит противовирусные антитела, которые наглядно отражают распознавание антигенных детерминант ВМ иммунной системой человека в течение естественной инфекции.
Следующим этапом, была характеризация полученных рекомбинантных белков по их способности распознаваться в ИФА формата «сэндвич».
В нашем исследовании чувствительность выявления рекомбинантных антигенов разными парами МКА колебалась до 150 нг/мл. Для примера были выбраны две пары МКА, наиболее эффективно выявляющие как очищенный вирусный антиген, так и рекомбинантный аналог с чувствительностью 1 нг/мл.
Это пара МКА 1В2 и 7В11, специфичные к NP ВЭ и пара МКА 4А2 и 1С1, специфичные к белку VP40 ВЭ. Выбранные нами пары МКА строго специфичны к структурным вирусным белкам VP40 и NP ВЭ, и не имеют перекрестной реактивности с гетерологичными антигенами (Рис. 10).
Для выявления антигена ВМ мы выбрали МКА, узнающие антигенные сайты рекомбинантных белков, совпадающих по аминокислотному составу с антигенными сайтами аналогичных вирусных белков. Для примера были выбраны две пары МКА, которые наиболее эффективно выявляли как очищенный вирусный антиген, так и рекомбинантный аналог с чувствительностью в нашей системе менее 1 нг/мл. Это пара МКА, очищенных 7D8 и меченных биотином 7H10, специфичных к белку VP40 ВМ (Рис. 11 А).
МКА 3F9, специфичные белку к VP35, можно одновременно эффективно использовать как в качестве «захватывающих» антиген, так и в качестве меченных биотином МКА для выявления антигенов VP35 ВМ (Рис. 11 Б). В двух известных коллекциях мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ВМ, штамм Musoke (Hevey M., 1997) и штамм Рорр (Ручко С.В., 2001), отсутствуют гибридомы, продуцирующие МКА к белку VP35. Это делает МКА 3F9 к VP35 ВМ особенно перспективными для дальнейшего практического использования.
Данные Вестерн-блот анализа позволяют заключить, что полученные продуценты гибридных белков сохраняют иммунохимические свойства природных антигенов ВЭ и ВМ. Антитела моносывороток, специфичные к рекомбинантным белкам, выявляют соответствующие им белки – аналоги в инактивированных вирусных препаратах, что свидетельствует о подобии антигенных детерминант, представленных на поверхности рекомбинантных и природных белков NP, VP40 ВЭ и VP40,VP35 ВМ.
А. Б.
В. Г.
Рис. 12. Кривая титрования вирусных антигенов и рекомбинантных белков ВЭ и ВМ с МКА в системе ИФА формата «сэндвич».
А) Антиген ВЭ и рекомбинантный белок VP40 ВЭ. МКА – 4А2 и 1С1*.
Отрицательный контроль – МКА 7D8 и 7Н10*, специфичные к белку VP40 ВМ Б) Антиген ВЭ и рекомбинантный белок NP ВЭ. МКА – 1B2 и 7B11*.
Отрицательный контроль – МКА 9С7 и 5F11*, специфичные к белку NP ВМ, В) Антиген ВМ и рекомбинантный белок VP40 ВМ. МКА – 7D8 и 7H10*).
Отрицательный контроль – МКА 4A2 и 1C1*, специфичные к белку VP40 ВЭ, Г) Антиген ВМ и рекомбинантный белок VP35 ВМ. МКА – 3F9 и 3F9*).
Отрицательный контроль – МКА 1С7, специфичные к белку VP35 ВЭ.
Исходная концентрация препаратов антигенов 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1:400 соответствует концентрации 2500 нг/мл, * - индикаторные МКА, меченые биотином. концентрация МКА для «захвата» антигенов – 10 мкг/мл, концентрация индикаторных МКА, меченых биотином – 1 мкг/мл.
ВЫВОДЫ 1. Сконструированы экспрессирующие гибридные плазмиды, содержащие гены полноразмерных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург и подобраны условия, обеспечивающие эффективную наработку данных белков в прокариотической системе экспрессии с выходом целевого белка от 25 до 40% от суммарного клеточного белка.
2. Были получены полноразмерные рекомбинантные белки NP, VP вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург с чистотой 67-88%. При иммунизации аутбредных мышей ICR данные рекомбинантные белки вызывали индукцию антител, которые специфически связывались с природными антигенами вирусов Эбола и Марбург.
3. Рекомбинантные белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург эффективно распознаются как моноклональными антителами так и поликлональными сыворотками, специфичными к вирусам Эбола и Марбург в иммуноблоте и иммуноферментном анализе. Таким образом, данные белки подобны по своим антигенным свойствам вирусным белкам.
4. Методом иммуноферментного анализа в формате «сэндвич» показано эффективное выявление рекомбинантных белков моноклональными антителами, не имеющими перекрёстной реактивности с гетерологичными антигенами вирусов Эбола и Марбург, с чувствительностью 1 нг/мл, что позволяет использовать полноразмерные рекомбинантные белки NP, VP вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург в качестве положительного контроля при конструировании иммунодиагностических тест-систем.
Список работ, опубликованных по теме диссертационной работы:
1. Сорокин А.В., Казачинская Е.И., Качко А.В., Иванова А.В., Букреев А.А., Разумов И.А.. Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург. // Вопросы вирусологии. - 1999. - № 5. - С. 206-213.
2. Качко А.В., Чеусова Т.Б., Сорокин А.В., Казачинская Е.И., Чешенко И.О., Беланов Е.Ф., Букреев А.А., Иванова А.В., Разумов И.А, Рябчикова Е.И., Нетесов С.В. Сравнительное изучение морфологии и антигенных свойств рекомбинантных аналогов нуклеопротеина вируса Марбург. // Молекулярная биология. - 2001. - № 3. - С. 1-8.
3. Sorokin A.V., Kazachinskaya E.I., Ivanova A.V., Kachko A.V., Netesov S.V., Bukreev A.A., Loktev V.B., and Razumov I.A. Mapping of two dominant sites of VP Marburg virus. // Viral Immunology. – 2002. - Vol.15. - № 3. – Р. 481-92.
4. Казачинская Е.И., Иванова А.В., Сорокин А.В., Качко А.В., Субботина Е.Л., Разумов И.А., Локтев В.Б. Моноклональные антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Медицинская иммунология. - 2010.- № 3. - Том 12. - С. 177-190.
Доклады и тезисы конференций:
1. А.В. Качко, А.В. Сорокин, Е.И. Казачинская, А.В. Иванова, Е.Ф. Беланов, И.А. Разумов, А.А. Букреев, P. Collins, Нетесов С.В. // г. Пущино 2001. - Тезисы докладов. - С. 140.
2. I.A. Razumov, A.V. Sorokin, E.I. Kazachinskaia, A.V. Ivanova, A.V. Kachko, S.V.
Netesov, A.A. Bukreyev, V.B. Loktev, Mapping of Two Dominant Sites of VP35 of Marburg Virus. // In “The world of microbes. XIIth International Congress of Virology”, 27 July – 01 August, Paris. – 2002. -
Abstract
Book. - P. 460.
3. Казачинская Е.И., Иванова А.В., Сорокин А.В., Качко А.В., Субботина Е.Л., Разумов И.А., Локтев В.Б. Моноклональные антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Международная научно-практическая конференция «Современные проблемы инфекционной патологии человека».
г. Минск, 2009. - Cборник научных трудов. – С. 277-280.
Список патентов, оформленных по теме диссертации:
1. Сорокин А.В., Разумов И.А., Казачинская Е.И., Качко А.В., Иванова А.В., Мишин В.П., Букреев А.А., Локтев В.Б., Нетесов С.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQf35M, кодирующая гибридный полипептид f35M, обладающий антигенными и иммуногенными свойсвами белка VP35 вируса Марбург, способ ее получения, и штамм бактерий Esherichia coli сверхпродуцент рекомбинантного полипептида f35М. // Патент РФ № 21445665, приоритет изобретения от 12.11.1998. Опубликован 20.01.2000 в БИ № 2.
2. Казачинская Е.И., Сорокин А.В., Иванова А.В., Качко А.В., Беланов Е.Ф., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L.
3F9 – продуцент моноклональных антител, пригодных для использования в иммуноферментной системе формата «сэндвич» для выявления белка VP вируса Марбург и моноклональные антитела 3F9, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток. // Патент РФ № 2393220, приоритет изобретения от 15.12.08. Опубликован 27.06.2010 в БИ № 18.
3. Казачинская Е.И., Сорокин А.В., Иванова А.В., Качко А.В., Беланов Е.Ф., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител для выявления белка VP40 вируса Марбург (штамм Рорр) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата «сэндвич» для выявления матриксного белка VP40 вируса Марбург (штамм Рорр). // Патент РФ № 2395575, приоритет изобретения от 15.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.
4. Казачинская Е.И., Перебоев А.В., Иванова А.В., Качко А.В., Субботина Е.Л., Чепурнов А.А., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 1В2 - продуцент моноклональных антител для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата «сэндвич» для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2395576, приоритет изобретения от от 16.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.
5. Казачинская Е.И., Иванова А.В., Качко А.В., Субботина Е.Л., Чепурнов А.А., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител для выявления белка VP вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты) и набор для иммуноферментной системы формата «сэндвич» для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2395577, приоритет изобретения от 18.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.
Благодарности • Автор выражает благодарность всем коллегам за поддержку данной работы и за сотрудничество: научному руководителю к.б.н. Качко А.В., н.с. Сорокину А.В., к.б.н. Казачинской Е.И., к.б.н. Субботиной Е.Л., д.б.н. Локтеву В.Б., д.б.н., профессору Нетесову С.В., к.ф.-м.н. Швалову А.Н., за техническую помощь лаборанту-исследователю Кавериной Г.Б., лаборанту-исследователю Плетнёвой Е.В. За предоставленные для исследования препараты: д.б.н. Чепурнову А.А. за инактивированный вирус Эбола и сыворотку крови иммунизированного кролика, к.б.н. Беланову Е.Ф. за инактивированный вирус Марбург. За ценную консультативную помощь при написании диссертации Дадаевой А.А.