Получение и оценка рекомбинантных видоспецифичных белков mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза
На правах рукописи
БОЛДЫРЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ
Получение и оценка рекомбинантных видоспецифичных белков
Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза
03.00.03 – молекулярная биология
03.00.23 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Кольцово – 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития Российской Федерации.
Научные руководители:
кандидат химических наук Туманов Юрий Васильевич доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Малыгин Эрнст Георгиевич кандидат медицинских наук Букин Евгений Константинович
Ведущая организация:
Федеральное государственное учреждение Новосибирский научно исследовательский институт туберкулеза Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи (г. Новосибирск)
Защита состоится «_20_» _ноября_ 2009 г. в _ч. на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел.
(383)-336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Автореферат разослан «_» _октября_ 2009 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Карпенко Л.И.
Актуальность проблемы. Туберкулёз – социально опасная инфекционная болезнь человека. Около трети населения в мире инфицировано преимущественно микобактериями вида M. tuberculosis, в России инфицированность превышает 80%.
По заболеваемости и числу больных туберкулёзом Россия по-прежнему входит в число стран с самой неблагоприятной ситуацией по туберкулёзу. По данным ВОЗ за 2007 г., число впервые выявленных заболевших туберкулёзом в нашей стране составило 157 тыс. (110 на 100000 населения). Из них 68 тыс. выявлены как положительные по результатам микроскопии мазка. Общее число больных туберкулёзом на конец 2007 г. составило 164000. Распространение ВИЧ-инфекции становится отягощающим фактором для активизации туберкулёзной инфекции: заболевших от общего числа больных туберкулёзом являлись ВИЧ-позитивными.
Таким образом, доля ВИЧ-инфицированных больных туберкулёзом в нашей стране достигла 16 % (WHO Report 2009). Число смертей составило 20000 (среди не инфицированных ВИЧ) и 5100 – из числа ВИЧ-инфицированных. Смертность ВИЧ позитивных пациентов в ~70 % случаев связана именно с туберкулёзом.
Возбудителем туберкулёза являются бактерии рода Mycobacterium, среди которых этиологическое значение имеют M. tuberculosis и реже M. africanum и M. bovis (Djelouadji Z. et. al., 2008). Для предотвращения распространения туберкулёза в настоящее время актуальное значение приобретает своевременная и достоверная лабораторная диагностика этого заболевания.
Традиционные методы диагностики, такие как флюорография и бактериоскопия мокроты, не всегда эффективны. Бактериологический метод занимает много времени – даже основывающийся на обнаружении роста микобактерий в присутствии флуоресцентного красителя Ежегодная (Ardito F. et al., 2001).
туберкулинодиагностика – основной и до сих пор единственный метод в нашей стране, с помощью которого определяется напряжённость иммунной системы у детей и подростков, – также не всегда отвечает предъявляемым требованиям. Молекулярно биологические методы позволяют достаточно быстро с высокой специфичностью и чувствительностью проводить выявление и типирование микобактерий в различных клинических образцах. Но даже полимеразная цепная реакция (ПЦР), один из самых чувствительных современных методов молекулярной диагностики, не позволяет выявить всех больных, так как для её проведения требуются микобактерии или ДНК/РНК, выделенная из них. Существенным недостатком ПЦР также является невозможность оценить активность туберкулёзного процесса. Наряду с этими методами основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. Её основной проблемой остаётся низкая специфичность и чувствительность применяемых антигенов.
Причиной кросс-реактивности белковых антигенов M. tuberculosis является присутствие гомологичных белков других микроорганизмов, дающих перекрёстные реакции с иммуноглобулинами сыворотки здоровых пациентов. Поэтому результаты рутинного иммунологического обследования группы вакцинированных больных обычно оказываются малоинформативными.
Для постановки окончательного диагноза туберкулёз требуется сравнение результатов, полученных разными методами. Развитие новых методов Т-клеточной иммунологии напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т клеточных компонентов крови, имеющих прямое отношение к иммунной системе.
Разрабатываемые в мире в течение последних десяти лет эти методы диагностики туберкулёза, например гамма-интерфероновый анализ (-ИФН-анализ), на сегодняшний день оказывается и своевременным, и в значительной степени достоверным: время выполнения анализа занимает не более 2-х суток (чувствительность в пределах 90 %, а специфичность приближается к 100 %). -ИФН анализ в настоящее время является одним из самых эффективных методов для детекции -ИФН, секретирующегося при стимуляции Т-клеток in vitro белковыми антигенами M. tuberculosis. Высокая разрешающая способность этого метода позволяет оценивать антигенстимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа. Так, если за рубежом в наиболее развитых странах проблема диагностики туберкулёза с помощью этих методов практически решена (имеются тест-системы), в России её решение находится на начальном этапе. Новый тест, основанный на исследовании антигенспецифических Т-лимфоцитов, позволяет раньше диагностировать туберкулёз, чем кожные туберкулиновые пробы. Разработка иммунологических Т-клеточных тест-систем является крайне важной для нашей страны и в настоящее время входит в разряд наиболее актуальных проблем современной медицины.
Цель работы. Целью настоящего исследования являлись получение и оценка пригодности рекомбинантных видоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для диагностики туберкулёза с помощью иммуноферментного и -интерферонового анализа.
Основные задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
– провести, руководствуясь литературными данными, теоретический анализ по выбору видоспецифичных высокоиммуногенных антигенов M. tuberculosis;
– сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки M. tuberculosis;
– оптимизировать условия для биосинтеза рекомбинантных белков;
– подобрать условия для выделения и очистки рекомбинантных белков;
– оценить полученные рекомбинантные видоспецифичные белки M. tuberculosis на пригодность для использования их в диагностике туберкулёза;
– провести сравнительный анализ результатов, полученных с использованием рекомбинантных видоспецифичных белков M. tuberculosis, с результатами, полученными с помощью ПЦР-анализа.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые на основе плазмиды pGEX-2T были сконструированы рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки M. tuberculosis, такие как ESAT-6, CFP10 и MPT64.
Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм E. coli BL21 позволило получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих в своей N-концевой части аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве белка носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитных белков в растворимой форме.
Впервые для проведения иммуноферментного (ИФА) и -интерферонового анализа для выявления больных туберкулёзом и подтверждения (опровержения) диагноза туберкулёз в диагностических целях использованы рекомбинантные белки, содержащие на N-конце аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве вспомогательного белка.
Применение рекомбинантных белков без проведения протеолитического расщепления его на два фрагмента – белок-носитель и целевой белок – сокращает существенно время до получения целевого белка, необходимого для выполнения ИФА и -ИФН-анализа.
Таким образом, продвижение в клиническую практику диагностических методов, использующих Т-клеточные технологии, вооружит медицину новым мощным диагностическим средством.
Результаты диссертационной работы могут служить основанием для того, чтобы, используя полученные рекомбинантные белки (rESAT-6 и rCFP10), приступить к разработке тест-системы для диагностики туберкулёза, основывающейся на -ИФН анализе, и внедрению её в клинико-диагностические лаборатории специализированных лечебных учреждений и общей лечебной сети, в частности (постановка метода занимает от 1,5 до 2-х суток, чувствительность рекомбинантных белков находится в пределах 80–100 %, а специфичность – в пределах 82–100 %).
Положения, выносимые на защиту.
1. Плазмиды pTSE6, pTB232 и pTB323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки M. tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки E. coli (BL21) обеспечивается продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулёза.
2. Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 применимы в качестве компонента в иммуноферментном и -интерфероновом анализе при диагностике туберкулёза (без проведения протеолитического отщепления аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка).
3. Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, обязательными компонентами которых являются полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающие гены, кодирующие секретируемые белки M. tuberculosis, и экспрессирующий штамм BL21, может быть использована как составная часть технологической схемы для разработки лабораторного регламента по производству этих белков.
Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы представлены автором в форме доклада на III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (27–29 сентября 2006 г., Новосибирск) и конференциях, указанных в списке «Докладов и тезисов» в конце автореферата.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из «Введения», трёх глав:
«Обзора литературы», «Материалов и методов» и «Результатов и их обсуждения», «Заключения», «Выводов» и «Списка литературы». Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 13 таблиц. Библиография включает 249 наименований, из которых 10 отечественных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Конструирование рекомбинантных молекул, несущих гены, кодирующие высокоиммуногенные видоспецифичные белки M. tuberculosis На первом этапе создавали генетические конструкции, которые обеспечивали после введения в клетки бактерий E. сoli продукцию видоспецифичного рекомбинантного белка, содержащего в своей C-концевой части аминокислотную последовательность (АП) целевого белка M. tuberculosis – ESAT-6 (pTSE6), CFP10 (pTB232) или MPT (полный и не содержащий лидерного пептида белок) (pTB323 и pTSM соответственно) (рис. 1). В качестве экспрессирующего вектора использовали коммерческую плазмиду pGEX-2T (ApR) (Pharmacia Biotech, Швеция), содержащую высокоэффективный tac-промотор под контролем Lac-репрессора, ген глутатион-S трансферазы (GST) с нуклеотидной последовательностью (НП), кодирующей сайт протеолиза для протеазы тромбин, и терминатор транскрипции.
Рис. 1. Кольцевые рестрикционные карты полученных рекомбинантных плазмид.
pTSE6 обеспечивает синтез rESAT-6, pTB232 – rCFP10 и pTB323 – синтез rMPT64 (rMPT64 без лидерного пептида длиною 23 N-концевых а.о.). Толстой стрелкой на карте отмечено положение гена, кодирующего рекомбинантный белок. Карта плазмиды pTSM64 не приводится, так как рекомбинантный белок не был обнаружен в растворимой форме (для построения использована программа, размещённая на сайте http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) Дизайн НП олигодезоксирибонуклеотидов для синтеза ампликонов, содержащих гены, кодирующие интересуемые белки, проводили по программе на сайте используя НП генов, http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html, найденные на сайте http://genolist.pasteur.fr/TubercuList. Белку ESAT-6 соответствует ген esxA, CFP10 – esxB и MPT64 – mpt64. Синтез олигонуклеотидов, содержащих, кроме видоспецифичной НП, дополнительную – для сайтов эндонуклеаз рестрикции (ЭР) BamHI (в прямом праймере) и EcoRI (в обратном праймере), был выполнен научным сотрудником Центра Ю.А. Горбуновым В качестве матрицы для синтеза ампликонов с помощью ПЦР использовали геномную ДНК штамма M. tuberculosis H37Rv и Taq-полимеразу производства «Сибэнзим» (г. Новосибирск).
Для амплификации интересуемых генов были использованы праймеры:
для ESAT-6:
Fesat – 5-GAGGATCCATGACAGAGCAGCAGTGG-3, Resat – 5-GCGAATTCTAAACACGAGAAAGGGCG-3;
для CFP10:
Fcfp – 5-GAGGATCCATGGCAGAGATGAAGACC-3, Rcfp – 5-GCGAATTCTATTAGCGGGTCAGAAGC-3;
для MPT64 и MPT64:
Fmpt64 – 5-СGGGATCCGCGCCCAAGACCTACTG-3, Fmpt64 – 5-СGGGATCCGTGCGCATCAAGATCTT-3, Rmpt64 – 5-СGGAATTCGTCCTCGCGAGTCTAGG-3 – общий для двух ампликонов.
Ампликоны (рис. 2) обрабатывали одновременно ЭР BamHI и EcoRI («Сибэнзим», г. Новосибирск) и клонировали в вектор по BamHI- и EcoRI-сайтам.
Рис. 2. Электрофореграммы в 1,2 % агарозном геле амплификатов генов 1А – esxB, 3А – esxA и 1Б – mpt64, полученных с помощью ПЦР. 2А и 2Б – МФ (маркёры длины фрагментов ДНК в п.н.), Пр – не использованные в реакции праймеры Эффективность протекания лигазной реакции контролировали с помощью ПЦР.
Обнаружение ампликона в геле агарозы размером, большим на 160 п.н., чем длина искомого клонируемого гена, являлось основанием для использования лигазной смеси для трансформации компетентных клеток E. coli. Особенность этой реакции в том, что праймеры гибридизуются с НП векторной молекулы по разные стороны от НП полилинкера (рис. 3). Поэтому образование ожидаемого ампликона в ПЦР возможно только после объединения НП вектора и клонируемого ДНК-фрагмента.
Поиск интересуемых клонов проводили непосредственно из колоний внесением небольшого количества клеток в реакционную смесь (colony PCR), содержащую те же праймеры, что и для контроля лигазной реакции, – FpGEX и RpGEX. Такой подход облегчает скрининг большого числа клонов, минуя операцию выделения рекомбинантной ДНК, необходимую для обнаружения вставки с помощью ПЦР или рестрикционного анализа.
841 ccagcaagta tatagcatgg cctttgcagg gctggcaagc cacgtttggt ggtggcgacc FpGEX SmaI 901 atcctccaaa atcggatctg gttccgcgtG GATCCCCGGG AATTCatcgt gactgactga BamHI EcoRI 961 cgatctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg RcpGEX 1021 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt Рис. 3. Участок НП векторной плазмиды pGEX-2T, прилегающий к полилинкеру (выделен прописными буквами). Курсивом с подчёркиванием выделены НП праймера FpGEX и последовательности, комплементарной последовательности обратного праймера, RcpGEX.
Нумерация нуклеотидов соответствует нумерации в плазмиде pGEX-2T (U13850) 2. Обнаружение клонов, продуцирующих рекомбинантные белки Из множества полученных клонов, содержащих одну и ту же плазмидную ДНК с интересуемым геном, засевали по отдельности от 4 до 10 колоний. Экспрессию гена осуществляли в штамме E. coli BL21. В качестве контроля для определения выхода белка засевали параллельно два образца культуры BL21/pGEX-2T, обеспечивающую продукцию GST: клетки одного образца индуцировали, другого – нет (контроль проведения индукции). В качестве дополнительного контроля засевали исходную культуру BL21 (не содержащую плазмиды) для демонстрации на электрофореграмме картины хозяйских белков (в ходе культивирования индуктор в неё не вносили).
После анализа лизатов, полученных из этих культур, с помощью ЭФ по Лэммли выбирали единственный клон, обеспечивающий максимальный выход белка.
Аналогичным способом отбирали клоны для продукции остальных интересуемых белков. В качестве маркёров молекулярных масс белков (МБ) на начальном этапе для определения местоположения искомого белка использовали смесь двух стандартных белков – овальбумина (44 кДа) и химотрипсиногена А (24 кДа) (рис. 4). Далее в большинстве случаев ориентировались по расположению в геле клеточных белков конкретного штамма E. coli.
Рис. 4. Электрофореграмма лизата культуры клеток BL21/pTSE6, содержащая рекомбинантный белок rESAT-6, в 12 % ПАА-геле (денатурирующие условия). На дорожках слева направо МБ – маркёры молекулярных масс белков: Химотрип – химотрипсиноген А, Овальбум – овальбумин, белки лизатов культур клеток:
BL21 – бесплазмидный штамм и штамм-продуцент BL21/pTSE6 – рекомбинантного белка rESAT- НП клонированного гена после окончательного отбора клона, продуцирующего интересуемый белок, подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Все рекомбинантные плазмиды, выделенные из отобранных штаммов-продуцентов, содержали НП клонированных генов, идентичную НП этих генов из штамма M.
tuberculosis H37Rv.
Далее были подобраны условия культивирования клеток для наработки рекомбинантных белков:
rESAT-6: до индукции – 1,5–2 ч, 37 С, 180 об/мин;
индукция – 0,1 мМ ИПТГ и продолжение культивирования 3 ч при тех же условиях;
rCFP10 и rMPT64 (rMPT64): до индукции – 2,5–3 ч, 37 С, 180 об/мин;
индукция – 0,5 мМ ИПТГ и продолжение культивирования 5–6 ч, 37 С. Три рекомбинантных белка, за исключением rMPT64, были обнаружены в растворимой форме в цитоплазме и далее нарабатывались в препаративных количествах. Поскольку мы ставили своей задачей исследовать рекомбинантные белки в растворимой форме, третичная структура которых, на наш взгляд, наиболее идентична третичной структуре природного белка, то белок rMPT64 впоследствии не исследовали.
Чтобы убедиться, что рекомбинантные белки, наблюдаемые на электрофореграммах, это те, которые нас интересуют, из гелей их переносили на нитроцеллюлозные фильтры, которые обрабатывали моноклональными антителами (МКА) 2H3-19 к GST (рис. 5Б и 6Б).
А – электрофорез в 12 % ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 – BL21, 2 – BL21/pGEX-2T (GST), 3 – BL21/pTB (rCFP10), 4 – BL21/pTSE (rESAT-6).
Б – иммуноблотинг лизатов соответствующих штаммов с МКА к GST: – BL21, 2 – BL21/pGEX Рис. 5. Детекция рекомбинантных продуктов экспрессии 2T (GST), 3 – клонированных генов esxA (rESAT-6) и esxB (rCFP10) BL21/pTB232 (rCFP10), M. tuberculosis в штамме E. coli BL21. – BL21/pTSE6 (rESAT-6) А – электрофорез в 12 % ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 – BL21, 2 – BL21/pGEX-2T (GST), 3 – BL21/pTB (rCFP10), 4 – BL21/pTB323 (rMPT64).
Б иммуноблотинг – лизатов соответствующих штаммов с МКА к GST: – BL21, 2 – BL21/pGEX 2T (GST), 3 – BL21/pTB232 (rCFP10), – BL21/pTB Рис. 6. Детекция рекомбинантных продуктов экспрессии (rMPT64) клонированных генов esxB (rCFP10) и укороченного mpt (rMPT64) M. tuberculosis в штамме E. coli BL21.
Как видно из рис. 5А и 6А, видимая деградация рекомбинантных белков не была замечена. Белки нарабатывались с высоким выходом: положение их на электрофореграммах соответствовало расчётным значениям молекулярной массы (м.м.) Однако взаимодействие белков на блотах с МКА к GST выявило дополнительно несколько минорных полос. Они (рис. 5Б и 6Б) соответствовали белкам с м.м. большей, чем м.м. GST, но меньшей, чем м.м. рекомбинантного белка.
По-видимому, ограниченной протеолитической деградации, хотя и в незначительной степени, подвергается только C-концевая часть рекомбинантных белков rCFP10 и rMPT64, и только rESAT-6 деградирует значительно сильнее (рис. 5Б). Таким образом, местоположение в геле искомых белков было подтверждено. По результатам электрофоретического анализа м.м. рекомбинантных белков (rESAT-6, rCFP10, rMPT64) соответствовала расчётным значениям – 32, 40 и 48,8 кДа. Уровень их синтеза, за исключением rESAT-6, составил около 20 % суммарного клеточного белка, что позволило получать до 2,5 мг рекомбинантного антигена с 1 л культуральной среды. Уровень продукции rESAT-6 составил 2–4 % суммарного клеточного белка.
3. Выделение и очистка рекомбинантных белков Cлитные рекомбинантные белки выделяли с помощью аффинной хроматографии на глутатионсефарозе 4B. После элюции обычно получали препарат очищенного белка с концентрацией 1 мг/мл. Чистоту белка оценивали электрофоретически. Рис. 7 и иллюстрируют очистку белков rESAT-6 и rCFP10. Из рис. видно, что после каждой элюции в геле наряду с основным рекомбинантным белком имеются минорные белки, представляющие собой ряд дискретных полос. Этими белками, как было определено, являлись клеточные белки, от которых удалось освободиться введением 2–3-х промывок ФБС с 1 % тритона Х-100.
Рис. 7. Дробная элюция рекомбинантного белка rESAT-6 с глутатионсефарозы.
Электрофореграмма ДСН-ПААГ, показывающая этапы выделения белка: 1 – осветлённый соникат BL21/pTSE6 до нанесения на глутатионсефарозу в качестве сорбента, рекомбинантный белок после n-ой элюции с одной колонки: 2 – 1 ой, 3 – 2-ой, 4 – 3-й, 4 – 4-й Рис. 8. Дробная элюция 2-х партий (1-я – дорожки 1–4, и 2-я – дорожки 5–8) рекомбинантного белка с rCFP глутатионсефарозы. Электрофореграмма ДСН-ПААГ, показывающая этапы выделения белка: рекомбинантный белок после n-ой элюции с одной колонки:
дорожки 1, 5 – после 1-ой, 2, 6 – 2-й, 3, 7 – 3-й, 4, 8 – 4-й Оптимизация условий промывки и элюции рекомбинантных белков с аффинной колонки позволила получать уже после 1-ой элюции препарат, гомогенный на 98% (рис. 9, дорожка 2).
Рис. 9. Электрофореграмма аффинно очищенного рекомбинантного белка rMPT64. 1 – лизат BL21/pTB (rMPT64);
аффинно очищенный белок rMPT64: 2 – 1-я элюция;
3 – 2-я элюция;
4 – 3-я элюция Цифровая обработка электрофореграммы показала, что чистота белка после аффинной хроматографии достигает 95–98 %. Выход белка после первой элюции составляет не менее 66 % адсорбированного белка, после второй – 27%, третьей – 7%.
Используя результаты этого исследования, была предложена технологическая схема для наработки рекомбинантных микобактериальных белков в E. coli, включающая создание генетических конструкций, несущих слитный ген GST c секретируемым антигеном M. tuberculosis, введение их в штамм E. coli BL21 или его производные, которые в определённых условиях обеспечивают продукцию рекомбинантного белка в растворимой форме. На рис. 10 представлена схема получения, выделения и очистки такого типа белка.
Рис. 10. Принципиальная схема получения рекомбинантного белка GST-P 4. Испытание рекомбинантных видоспецифичных белков M. tuberculosis в ИФА, -ИФН-анализе на клинических изолятах крови Второй этап исследования включал использование рекомбинантных белков в иммунодиагностике туберкулёза на образцах клинических изолятов, полученных от больных туберкулёзом. Далее приводятся выборки, использованные в работе:
1. Диагностическое значение рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10 в ИФА проверяли на панели из 34 сывороток, собранных от пациентов, больных туберкулёзом. Контрольная группа включала сыворотки 470 пациентов, не болеющих туберкулёзом.
2. Рекомбинантный белок rMPT64 проверяли на выборке из 147 сывороток.
Изоляты этих выборок получены из Клинического центра «Фтизиатрия» (г.
Новосибирск).
3. Проверку чувствительности и специфичности рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10 с помощью -ИФН-анализа проводили на образцах крови, поступавшими периодически небольшими партиями. Забор крови производился у больных туберкулёзом пациентов и здоровых доноров. В общем было получено 114 и образцов соответственно (табл. 1 и 2).
4. Для определения чувствительности и специфичности рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10 с помощью -ИФН-анализа при выявлении различных форм туберкулёза лёгких были получены образцы крови от пациентов с установленной формой заболевания общим количеством 67 (табл. 3).
5. Для испытания рекомбинантных белков в -ИФН-анализе от пациентов с подозрением на туберкулёз были получены:
а) 20 образцов цельной крови (табл. 4) и б) 18 образцов цельной крови (для выделения мононуклеарных клеток) (табл. 5) и 18 проб цельной крови от здоровых доноров (табл. 5).
6. 38 изолятов мокрот, соответствующих образцам крови от пациентов с подозрением на туберкулёз лёгких, были получены для подтверждения туберкулёза с помощью ПЦР.
Все клинические изоляты выборок 3–6 получены из областной клинической туберкулёзной больницы г. Томска 7. 1350 клинических изолятов культур клеток микобактерий M. tuberculosis получены из НИИ туберкулёза (г. Новосибирск) и Клинического центра «Фтизиатрия» (г. Новосибирск).
Очищенные антигены проверяли с помощью ИФА и -ИФН-анализа.
Иммуноферментным анализом в крови больных туберкулёзом выявляли видоспецифические иммуноглобулины, а с помощью -ИФН-анализа определяли концентрацию -ИФН, который секретируется Т-лимфоцитами в результате стимуляции их рекомбинантными белками.
4.1. Рекомбинантные белки в иммуноферментном анализе N-концевая АП полученных нами слитных белков включает АП GST, С-концевая – АП целевого антигена. GST способствует повышению растворимости слитного белка и используется для его выделения с помощью аффинной хроматографии (Cabrita L.D.
et al., 2006). Расщепление рекомбинантного белка может быть проведено с помощью тромбина, результатом которого будут белки GST и целевой антиген. Первичная структура последнего близка к АП природного белка, отличаясь наличием на N-конце дипептида – GlySer. Поскольку отщепление GST от целевого антигена усложняет процедуру выделения этого антигена в чистом виде, мы решили убедиться в необходимости проведения такой дополнительной операции. Такое решение было принято благодаря обнадёживающим результатам, предварительно полученным с помощью двух программ, первая из которых предсказывает эпитопы, представляемые антиген-презентирующей клеткой с помощью MHC II (http://www.imtech.res.in /raghava/propred/index.html), вторая – вторичную структуру белка, определяемую по первичной (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html).
Картины, совмещающие результаты, полученные по обеим программам, представлены на рис. 11. Это вторичные структуры рекомбинантного и природного белка с выделением на первичной структуре предсказанных эпитопов интересуемого белка. В конечном счёте, сравнивались вторичные структуры эпитопов природного белка (11А – ESAT-6, 11Б – CFP10 и 11В – MPT64) с таковыми же в составе рекомбинантного белка (rESAT-6, rCFP10 и rMPT64).
rESAT-6 (рекомбинантный) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMA ccceeeehhhhtccchhhhhhhhhtcchhhhheccccchhhhhhcccccccccccceeettcceehhhhh IIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHK hhhhhhhhttcccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhheecccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttc TYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATF ceeetccccehhhhhhhhhhhhhhcctthhccchhhhhhhhhhhhccthhhhhhcttccccccccceeee GGGDHPPKSDLVPRGSMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGV tccccccccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhtthhhhhhhhhttchhhhhhhhhttcccchhhhhh QQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA Длина АП белка (а.о.): hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttcceeeee ESAT-6 (нативный) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQ hhhhhcchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttcchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh NLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh Длина АП белка (а.о.): Рис. 11А. Сравнение вторичных структур эпитопов в рекомбинантном и нативном (целевом) белках для ESAT-6. В АП белка предсказанные эпитопы длиною 9 а.о. выделены жирным шрифтом;
начало эпитопа обозначено красной буквой. Под приведённой последовательностью эпитопа в составе рекомбинантного белка закрашена область совпадения его вторичной структуры с вторичной структурой нативного белка. Буква зелёного цвета в первичной структуре рекомбинантного белка – N-концевой а.о. нативного белка. Обозначения элементов вторичной структуры: h – -спираль, e – вытянутая цепь, t – изгиб, c – случайное кольцо rCFP10 (рекомбинантный) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMA ccceechhhhhtccchhhhhhhhttcchhhhhcccccchhhhhhcccccccccccceeettcceeehhhh IIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHK hhhhhhhcttccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhheecccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttc TYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATF ceeetcccchhhhhhhhhhhhhhhhctthhccchhhhhhhhhhhhccthhhhhhcttccccccccceeee GGGDHPPKSDLVPRGSMAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAA tccccccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhtchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhtcchhhhhhhh VVRFQEAANKQKQKLDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttceecccchhhhhhhhhhhhh Длина АП белка (а.о.): CFP10 (нативный) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELD hhhhhhhhhhhhhhhtchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh EISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF hhhhhhhhttccccccchhhhhhhhhhhhh Длина АП белка (а.о.): Продолжение рис. 11Б. Сравнение вторичных структур эпитопов в рекомбинантном и нативном белках для те же) (целевом) CFP10 (обозначения rMPT64 (рекомбинантный) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMA ccccccccchttcccchhhhhhhhhhhhhheeecccccchhhhhhhhheccccccceehhtcccchhhhh IIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHK hhhecccccccccccccchhheehhhhhhhccchhhhheecccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhccc TYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATF cccccccccchhhhhhccccceeccccccccccccceeeccccccccccchhcccttcccccccceeeee GGGDHPPKSDLVPRGSAPKTYCEELKGTDTGQACQIQMSDPAYNINISLPSYYPDQKSLENYIAQTRDKF ttccccccccccccccccchhhhhccccccccceeeeeccttcceeeecccccccchhhhhhhhhhhhhh LSAATSSTPREAPYELNITSATYQSAIPPRGTQAVVLKVYQNAGGTHPTTTYKAFDWDQAYRKPITYDTL hhhhccccccccceeeecccccccccccttccceeeeeehhtttcccccceeeecchhhtccccccehhh WQADTDPLPVVFPIVQGELSKQTGQQVSIAPNAGLDPVNYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEAAGPTQVL hhccccccceeeeechhhhcccccceeeecttttccccceeeeeecttceeeeecttcccccccccceee VPRSAIDSMLA ecccccchhhh Длина АП белка(а.о.): MPT64 (зрелый, нативный) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | APKTYCEELKGTDTGQACQIQMSDPAYNINISLPSYYPDQKSLENYIAQTRDKFLSAATSSTPREAPYEL cccchhheetcccccceeeeecccttceeeeeccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhccccccccccee NITSATYQSAIPPRGTQAVVLKVYQNAGGTHPTTTYKAFDWDQAYRKPITYDTLWQADTDPLPVVFPIVQ eecccccccccccccchheeeehhhtttcccccceeeeeccccccccceeeeeeccccccchhhhhhhhh GELSKQTGQQVSIAPNAGLDPVNYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEAAGPTQVLVPRSAIDSMLA hhhhhtcccceeecccccccccccceeeecttceeeeecttcccccccccceeeeccchhhhhhh Длина АП белка (а.о.): Продолжение рис. 11В. Сравнение вторичных структур эпитопов в рекомбинантном и нативном (целевом) белках для MPT64 (обозначения те же) Как видно из рис 11, наблюдалось либо полное совпадение вторичных структур, например, FAGIEAAAS, VTSIHSLLD, LQNLARTIS, YQGVQQKWD у ESAT-6 (рис.
11А);
MKTDAATLA, FERISGDLK, ISGDLKTQI, VVRFQEAAN, VRFQEAANK, FQEAANKQK у CFP10 (рис. 11Б);
INISLPSYY, YIAQTRDKF, FLSAATSST, YQNAGGTHP, VTNDGVIFFFNPGELLPE (антигенная детерминанта состоит из эпитопов) у MPT64 (рис. 11В), либо – частичное. Такой анализ позволил предположить, что рекомбинантные белки ещё до проведения протеолиза должны взаимодействовать с сывороточными видоспецифическими к антигенам M.
tuberculosis иммуноглобулинами, а также обладать стимулирующей способностью для запуска процесса пролиферации лимфоцитов, праймированных Т-клеточными рецепторами к различным эпитопам, принадлежающим АП белков M. tuberculosis.
Возраст обследуемых первой выборки составлял 24–45 лет. Контрольная группа включала сыворотки 470 пациентов, не болеющих туберкулёзом. Эти же сыворотки предварительно были проанализированы с помощью референс-тест-систем «Анти Туб-IgG» (СПб) и «АТ-Туб-БЕСТ-стрип» (г. Новосибирск).
Исследование наличия антител (Ат) к GST в поликлональной сыворотке здоровых доноров и больных туберкулёзом проводили двумя методами. В первом варианте GST сорбировали непосредственно на поверхности лунок. Во втором – на поверхность лунки сначала наносили МКА к GST (рис. 12).
Рис. 12. Схема ИФА для выявления видоспецифических антител к рекомбинантному антигену (или GST). Вторичные антитела – поликлональные IgG-Ат человека, меченные пероксидазой хрена В результате было установлено, что 1,3 % исследованных сывороток (и в группе ТБ больных и в группе здоровых доноров) содержали антитела к N-концевой компоненте рекомбинантного белка. Из этого был сделан вывод о незначительном влиянии АП белка-носителя на диагностику туберкулёза этим методом (см. рис. 13). И далее как следствие – отщепление N-концевой АП от целевого белка, например, ESAT-6, CFP10, MPT64 и других, не является обязательной процедурой при испытании рекомбинантных белков с помощью современных иммунологических методов.
Рис. 13. Использование GST и рекомбинантного белка rESAT- в ИФА. Частота выявления (%) IgG-антител к GST и к рекомбинантному белку rESAT- M. tuberculosis в различных исследуемых группах: 1 – ТБ больные, 2 – здоровые доноры Из рис. 13 видно, что при использовании белка rESAT-6, его фоновое значение при обследовании здоровых лиц, даже выше, чем при использовании белка GST, и составляет 4,6 % (для rCFP10 оно соответствовало 5,3 %). Сыворотки, полученные от таких пациентов, в дополнение подтверждались с помощью референс-тест-систем, так как выявленный низкий уровень IgG-Ат, но превышающий уровень, определённый для здоровых лиц, мог также свидетельствовать о начале патологического процесса.
Проведение ИФА с использованием белков rESAT-6 и rCFP10 в случае замены поликлональных IgG-Ат в роли вторичных Ат, меченных пероксидазой хрена, на Ат других классов, показало, что они способны выявлять положительные сыворотки и по антителам IgA и IgM среди разных групп обследуемых. Выявляемость иммуноглобулинов различных классов представлена в ряду: анти-IgG – 70,0, анти-IgA – 31,4 и анти-IgM – 11,8 %. Поэтому в дальнейшем способность других рекомбинантных белков выявлять положительные сыворотки, в частности, белка rMPT64, оценивали только по IgG-Ат (сочетанное использование антител к Ig класса G, A и M достигало 82,0 %).
Для подтверждения результатов, полученных на сыворотках здоровых доноров, на предмет выявления уровня видоспецифических IgG-антител к антигенам M.
tuberculosis нами были проанализированы сыворотки от больных с другими инфекционными заболеваниями, такими как гепатиты A, B и C, пневмонии и бронхиты различной (нетуберкулёзной) этиологии, хламидиоз. В результате было установлено, что при использовании рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP сыворотки таких доноров по уровню антител статистически не отличались от сывороток, полученных от здоровых доноров. Эти пациенты были отнесены к здоровым, или ТБ–-пациентам (пациентам, не болеющим туберкулёзом). Поэтому можно сделать вывод: возбудители этих инфекционных заболеваний не проявляют перекрёстных реакций с антигенами ESAT-6 и CFP10. В итоге, используя ИФА, было показано, что rESAT-6 и rCFP10 обладают высокой чувствительностью (65–79 %) и специфичностью (92–98, 95–98 % соответственно).
Аналогичная работа была проведена при испытании рекомбинантного белка rMPT64 (общая выборка из 147 образцов сывороток: при использовании референс тест-систем выявлено 47 положительных и 100 отрицательных сывороток, из которых по результатам проведённого анамнестического анализа 62 сыворотки были получены от здоровых лиц без клинических жалоб, а 38 – от пациентов с другими патологиями (вирусные гепатиты – в общем, отдельно – гепатиты, вызванные вирусами гепатита B и C;
ВИЧ-инфекция, хламидиоз, пневмонии и бронхиты нетуберкулёзной этиологии, урогенитальные инфекции). В этом эксперименте наблюдали другую картину: во всех случаях – у ТБ-больных, больных другими инфекционными заболеваниями и здоровых доноров – наблюдали различающиеся уровни IgG-Ат или их полное отсутствие. Так, панель, собранная из отрицательных сывороток, только в 76 % образцов показала отсутствие видоспецифических к туберкулёзу IgG-Ат. Разрыв в уровне IgG-Ат между ТБ больными и ТБ–-пациентами различался. Это понятно, поскольку белок MPT64, являющийся секретируемым белком M. tuberculosis, присутствует (Behr M.A. et al., 1999) в вакцинном штамме M. bovis BCG, применяемым в России. Этим также объясняется появление антител к белку MPT64 в сыворотке крови здоровых доноров, которые в обязательном порядке вакцинированы против туберкулёза. Тем не менее, с помощью rMPT64 оказалось возможным различать больных и здоровых пациентов. На выборке и 21 ТБ+- и 21 ТБ–-сывороток была определена чувствительность rMPT64 по отношению к референс-тест-системе «Анти-Туб-IgG»
как 81 %, а специфичность – 76 %. Отсутствие видоспецифических IgG-Ат к MPT в сыворотке крови у большинства лиц, а именно здоровых доноров и больных заболеваниями нетуберкулёзной этиологии можно расценивать как утерю приобретённого в детском возрасте иммунитета против туберкулёза к определённому возрасту, а значит, и как возможность использования его наряду с rESAT-6 и rCFP в диагностике туберкулёза.
В настоящее время не существует единого мнения о целесообразности применения ИФА для диагностики туберкулёза в том виде, в котором он используется. Причины тому – это, во-первых, низкая чувствительность из-за слабой выявляемости антимикобактериальных антител на фоне индуцируемого возбудителем угнетения процессов антителопродукции и снижения содержания в крови свободных антител, и, во-вторых, низкая специфичность ИФА-тестов, основанных на использовании суммарных антигенов M. tuberculosis, поскольку в сыворотке крови могут присутствовать антитела к белкам M. bovis BCG, а также антитела к белкам сапрофитных микобактерий, которые дают перекрёстные реакции с антигенами M.
tuberculosis.
Анализ антител к исследуемым рекомбинантным белкам, проведённый в нашем исследовании, подтвердил общую тенденцию – выявляемость туберкулёза по уровню IgG-Ат выше, чем по уровню IgA- и IgM-Ат. Показано повышение чувствительности определения положительных сывороток с помощью рекомбинантных антигенов M.
tuberculosis (Conde M.B. et al., 2004) по суммарному выявлению иммуноглобулинов класса A, G и M. Таким образом, полученные нами данные об иммунореактивности рекомбинантных белков в серологических исследованиях позволяют сделать вывод о том, что эти белки пригодны для выявления активного туберкулёза или подтверждения его.
4.2. Рекомбинантные белки в -ИФН-анализе Использование рекомбинантных белков, полученных нами, в -ИФН-анализе рассматривалась как конечная цель этого исследования. Преимущество -ИФН анализа, как одного из Т-клеточных иммунологических методов, заключается в том, что при стимуляции видоспецифичным антигеном (природным, рекомбинантным, синтетическим) мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) основной вклад в секрецию -ИФН вносят активированные T-лимфоциты, которые являются главным объектом исследования. Стимуляция их проводится в селективной для размножения лимфоцитов полной ростовой среде – RPMI-1640. В результате стимуляции праймированных к данному заболеванию лимфоцитов они секретируют -ИФН, концентрацию которого можно измерить.
В большинстве случаев в настоящее время туберкулёзный контроль проводится для выявления лиц с активной формой туберкулёза и лиц, имеющих контакт с больным туберкулёзом, с использованием туберкулиновой пробы. Быстрый путь раннего выявления туберкулёзной инфекции по крови с использованием рекомбинантных белков является альтернативным кожному тесту (Mustafa A.S. et al., 2000, Lalvani A., Pathan A.A. et al., 2001;
Mori T. et al., 2004, Brock I. et al., 2004). При этом уровень ИФН коррелирует со стадией развития туберкулёзной инфекции, уровнем иммунного ответа и вероятностью прогрессирования активной формы. Поэтому, измерив концентрацию -ИФН, можно судить о наличии или отсутствии заболевания туберкулёзом.
Изучение чувствительности и специфичности rESAT-6 и rCFP10 были проведены с использованием образцов гепаринизированной крови, полученных от больных туберкулёзом и поставленных из клиники в разное время небольшими партиями (6– образцов) (табл. 1, 2 и 3). Диагноз туберкулёз был предварительно подтверждён с помощью классических методов выявления возбудителя (микроскопическим и культуральным).
Табл. 1 показывает результаты, полученные при стимуляции цельной клеточной культуры крови белком rESAT-6 и туберкулином (PPD): специфичность rESAT-6 в ИФН-анализе при выявлении туберкулёза оказывается выше, чем при использовании PPD, поскольку среди здоровых доноров выявлены ТБ-больные. Этот факт, несмотря на свою очевидность, показывает, что развитие туберкулёзного процесса с помощью -ИФН-анализа может быть зафиксировано у вполне здоровых лиц, поэтому желательно проводить наблюдение в динамике с целью своевременного выявления как впервые заболевших туберкулёзом, так и наблюдения за пациентами, проходящими курс противотуберкулёзной терапии. В табл. 2 сведены аналогичные результаты по белку rCFP10.
Таблица Сравнение чувствительности и специфичности -ИФН-анализа при использовании rESAT- и PPD Количество выявленных Количест- больных ТБ/ к общему числу Чувствитель- Специфич Антиген обследованных во -ИФН, ность, % * ность, % ** пг/мл ТБ-пациенты здоровые доноры*** 300 PPD 5/6 7/7 83,3 rESAT-6 4/6 4/14 66,7 71, 1000 PPD 7/9 13/14 77,7 7, rESAT-6 9/10 3/21 90,0 85, 3000 rESAT-6 17/21 2/19 80,9 89, * – Позитивный ответ среди ТБ-инфицированных ** – Позитивный ответ среди неинфицированных пациентов *** – BCG-вакцинированные и невакцинированные пациенты Таблица Сравнение чувствительности и специфичности -ИФН-анализа при использовании rCFP и PPD Количество выявленных больных ТБ/ к общему числу Количест Чувствитель- Специфич во -ИФН, Антиген обследованных ность, % * ность, % ** пг/мл ТБ-пациенты здоровые доноры*** 300 PPD 10/11 14/14 90,9 rCFP10 12/13 4/21 92,3 81, 1000 PPD 14/17 13/14 82,3 7, rCFP10 18/21 4/25 85,7 84, * – Позитивный ответ среди ТБ-инфицированных ** – Позитивный ответ среди неинфицированных пациентов *** – BCG-вакцинированные и невакцинированные пациенты В табл. 3 показаны обобщённые характеристики рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10, полученные при выявлении больных с различными формами туберкулёза лёгких (образцы крови были взяты после подтверждения диагноза).
Таблица Показатели рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10 при выявлении больных с различными формами туберкулёза лёгких в -ИФН-анализе Форма туберкулёза rESAT-6 rCFP лёгких Чувстви- Специфич- Чувстви- Специфич тельность, % ность, % тельность, % ность, % Инфильтративный (19) 86–95 87–97 83–94 86– Очаговый (12) 87–94 93–94 82–93 90– Диссеминированный 84–97 86–94 80–92 82– (22) Фиброзно-кавернозный 96–100 97–100 87–95 93– (14) Экспериментальное применение рекомбинантных белков для определения их пригодности в диагностике туберкулёза было проведено с помощью -ИФН-анализа на двух выборках: первая включала 20 образцов цельной гепаринизированной крови (пациенты под №№ 1–20) (табл. 4), вторая – 18 образцов крови, из которых выделяли МКПК (пациенты под №№ 21–38) (табл. 5). Первичный материал по обеим выборкам получен от больных с подозрением на туберкулёз, т.е. до установления диагноза с помощью культурального метода. В качестве контрольных образцов белков использовали PPD и митогены конканавалин А (КонА) и фитогемагглютинин (ФГА).
Значение «cutoff» – пограничное значение -ИФН, разделяющее здоровых доноров и лиц, попадающих в группы риска и с диагнозом туберкулёз, – для -ИФН 300 пг/мл (или 1,2–1,7 МЕ/мл), согласно рекомендациям производителей, считали положительными. В табл. 4 представлены результаты, полученные на образцах цельной крови от обследуемых лиц, в табл. 5 – результаты, полученные на образцах мононуклеарных клеток, выделенных предварительно из образцов цельной крови с помощью системы Histopaque 1119.
Из табл. 4 видно, что у пациентов под № 9–11 при испытании всех трёх рекомбинантных белков диагноз туберкулёз не подтверждается. Пациенты под № 6 и 15 по уровню -ИФН находятся практически на пограничной линии – на верхней границе при использовании rESAT-6 и нижней – при использовании rCFP10.
Результат с такими значениями -ИФН требует повторения анализа и в случае совпадения с предыдущим результатом его следует оценивать как результат, который требует подтверждения с помощью других методов, например, с помощью ПЦР.
Пациента под № 8 так же следует присоединить к группе пациентов с сомнительным результатом (№ 6 и 15), хотя уровень -ИФН соответствует пограничному значению, полученному только при использовании rCFP10 (по результату, полученному с помощью белка rESAT-6, пациента под № 8 следовало бы отнести к лицам с неподтверждённым диагнозом туберкулёз). Таким образом, также требуется подтверждение другими методами. Для полного анализа табличных данных также интересен результат, полученный для пациента под № 14: по белку rESAT-6 – пациенту диагностируется туберкулёз (C-ИФН 1,2–1,7), тогда как по белку rCFP10 – результат сомнительный. В этом случае был проведён повторный анализ с использованием этих белков. Данный образец оказался отрицательный (значения для rESAT-6 составили 0,87 МЕ/мл, для rCFP10 – 0,91 МЕ/мл), что было подтверждено также культуральным методом. Остальные пациенты диагностированы однозначно и вошли в группу с подтверждённым позднее диагнозом туберкулёз с помощью культурального и молекулярно-биологических методов.
Анализируя данные табл. 5 аналогичным образом, можно сделать вывод, что у пациентов под № 23, 33 и 35 при испытании всех трёх рекомбинантных белков диагноз туберкулёз не подтверждается: концентрация -ИФН ниже предельного значения (C-ИФН 300 пг/мл). Об этом свидетельствовали и отрицательные результаты, полученные позднее с помощью классического культурального метода.
Однако если исходить из полученных PPD-значений -ИФН, то этих пациентов, за исключением № 35, следовало бы отнести к больным туберкулёзом. Повышенное содержание -ИФН в анализируемой пробе при использовании PPD можно объяснить тем, что секреция -ИФН стимулируется не только видоспецифичными белками M.
tuberculosis, присутствующими в составе PPD и среди которых имеются, кстати, нативные ESAT-6 и CFP10, но – и за счёт неспецифичных, дающих перекрёстные иммунологические реакции и имеющих отношение к белкам других видов микобактерий.
Таблица -ИФН-анализ на образцах гепаринизированной крови при стимуляции их рекомбинантными белками rESAT-6, rCFP10, rMPT -ИФН (МЕ/мл) Пациент Митоген ы PPD rESAT-6 rCFP10 rMPT КонА ФГА 1 54,30 2,34 3,21 4,23 56,7 63, 2 27,00 3,10 2,30 4,10 32,1 47, 3 59,20 5,70 4,30 3,10 148,4 123, 4 73,00 3,20 2,70 1,30 129,2 117, 5 24,80 2,70 2,20 1,90 49,7 43, 6 11,70 1,73 1,34 0,98 19,7 23, 7 4,70 0,87 2,10 1,12 139,7 126, 8 2,90 0,81 1,70 1,20 24,6 21, 9 5,30 0,73 0,56 0,57 44,7 53, 10 27,60 0,83 0,46 0,23 163,1 143, 11 57,20 0,23 0,10 0,12 68,7 65, 12 10,90 6,40 5,60 3,70 56,9 72, 13 62,30 7,20 6,25 6,10 67,2 57, 14 1,70 2,10 1,40 0,30 23,8 19, 15 33,40 1,70 1,20 0,78 36,0 34, 16 7,20 13,20 10,70 9,75 77,8 67, 17 98,70 12,40 11,70 8,90 72,2 78, 18 74,60 19,30 12,80 11,70 23,5 32, 19 43,10 132,20 132,80 111,20 184,2 179, 20 67,30 147,50 132,00 103,40 154,7 165, 39,22 25,65 25,28 24,37 – – M(s) (28,86) (48,75) (47,69) (41,15) n=19 n=14 n=13 n= – – 39,22± 25,65± 25,28± 24,37± M±m 6,62 13,03 13,23 12, n=19 n=14 n=13 n= – 0,86(0,47) 0,97(0,59) 0,73(0,45) – – M(s) к n=6 n=7 n= – – – 0,86±0,19 0,97±0,22 0,73±0, M±m к n=6 n=7 n= здоро- 1,2–1,7 1,2–1,7 1,2–1, – – – вые доноры Крайне низкий уровень -ИФН при использовании PPD у пациента под № 35, который сравним с концентрацией -ИФН, полученной в результате стимуляции смесью рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10, может свидетельствовать не только об отсутствии туберкулёзного процесса, более того, – об отсутствии инфицированности организма пациента микобактерией вида M. tuberculosis.
Таблица -ИФН-анализ на образцах МКПК при стимуляции их рекомбинантными белками rESAT-6, rCFP10, rMPT -ИФН (пг/мл) Пациенты Митоген rESAT-6/ PPD rESAT-6 rCFP10 rMPT КонА ФГА rCFP 21 4100 1750 845 736 6700 4782 22 3650 2360 1985 1740 7324 5421 23 2850 110 55 43 4530 3218 24 4870 4475 3200 2760 7300 6710 25 5110 1320 2755 2300 9650 8971 26 6200 27 2849 1430 7861 8764 27 17320 4210 5780 3210 12344 14230 28 3980 760 67 43 4851 4352 29 5830 3240 4210 2750 19870 21340 30 10350 3420 7400 6325 18300 17235 31 21200 2290 415 328 16540 14530 32 5730 1318 2065 2650 12347 13247 33 670 64 57 32 23450 32410 34 15340 5640 3875 5130 17650 18930 35 23 17 19 14 640 985 36 7458 64 2190 330 23410 28750 37 10480 3340 6240 4320 19340 18745 38 6130 1680 1745 1330 34500 29560 7722 2754 3254 2524 – – M(s) (5539) (1445) (2047) (1780) (1859) n=17 n=13 n=14 n=14 n= – – 7722± 2754± 3254± 2524±476 4014± M±m 1343 401 547 n=14 n= n=17 n=13 n= – 56(37) 50(21) 33(14) – – 110(89) M(s) к n= – – – 56±16 50±11 33±7 n=4 110±51 n= M±m к n=5 n= здоровые 300 300 300 доноры Исключая из обсуждения последний случай (№ 35), полученные PPD-данные свидетельствуют о низкой специфичности туберкулина при использовании его как суммарного антигена при диагностировании туберкулёза с помощью -ИФН-анализа.
Низкая специфичность также подтверждается сравнением -ИФН-PPD-значений с уровнем -ИФН, полученного при стимуляции известными митогенами – КонА и ФГА, которые, как известно, вызывают неспецифическую активацию Т-лимфоцитов, не обусловленную связыванием с антигенраспознающими рецепторами, что приводит к высокой продукции -ИФН.
Пациенты под № 26, 28 и 36 (табл. 5) являются пациентами с диагнозом туберкулёз. Это видно из дополнительного результата, приведённого в крайнем правом столбце (смесь двух белков – rESAT-6/rCFP10). В случае же отсутствия последнего анализ с образцами МКПК следует повторить с тем белком, при использовании которого возникло расхождение в интерпретации полученных результатов. В случае получения такого же (или близкого) значения концентрации -ИФН результат можно интерпретировать особенностью иммунной системы конкретного пациента, а значит, и более низкой чувствительностью рекомбинантного белка применительно к конкретному случаю. Для окончательного диагноза необходимо подтверждение другими методами (например, ПЦР, культуральный метод, микроскопия мазка и др.).
ВЫВОДЫ 1. Сконструированы 4 рекомбинантные плазмиды на основе векторной плазмиды pGEX-2T, несущие полные гены esxA, esxB, а также полный и укороченный (без нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид) ген mpt64, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки Mycobacterium Идентичность каждого клонированного гена природному, tuberculosis.
соответствующего штамму H37Rv, подтверждена секвенированием.
2. Подобраны оптимальные условия для продукции в штамме Escherichia coli BL21 рекомбинантных белков – rESAT-6, rCFP10 и rMPT64, которые накапливаются в растворимой форме в цитоплазме бактериальной клетки, а также условия для их выделения и очистки.
3. Впервые показана принципиальная возможность использования рекомбинантных белков в иммуноферментном и -интерфероновом анализе без предварительного отщепления N-концевой аминокислотной компоненты, используемой в качестве белка-носителя, при установленном уровне выявления антител к N-концевой компоненте рекомбинантного белка – глутатионтрансферазе, не более 1,3 % среди исследованных сывороток.
4. На примере rESAT-6 и rCFP10 установлено, что эти рекомбинантные белки способны выявлять положительные сыворотки по антителам IgG, IgA и IgM среди разных групп обследуемых. Наиболее высокий показатель выявляемости иммуноглобулинов определён для IgG-антител и составил 70 % (для IgA – 31,4 %, IgM – 11,8 %).
5. При использовании панели сывороток, полученных от больных туберкулёзом и здоровых доноров, показано, что чувствительность ИФА при испытании rESAT-6 и rCFP10 составила 65–79 %, rMPT64 – 81 %, специфичность – соответственно 92–98, 95–98 и 76 %.
6. Показано, что чувствительность -ИФН-метода при стимуляции Т-лимфоцитов rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 составила соответственно 84–100, 80–95 и 60–78 %, а специфичность – соответственно 86–100, 82–100, 76–97 %. При сочетанном использовании трёх рекомбинантных белков – rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 – специфичность составила 96,2 %, а чувствительность – 89,1 %.
7. Предложена технологическая схема для наработки и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов.
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых изданиях, патента.
Список патентов, оформленных по теме диссертации:
1. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Татьков С.И. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTSE6, кодирующая гибридный полипептид GST-ESAT-6 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена ESAT-6, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli – продуцент гибридного полипептида GST-ESAT-6 и рекомбинантный полипептид GST-ESAT-6. Патент RU № 2282661 C2 от 16.08.2004.
2. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Татьков С.И. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTB232, кодирующая гибридный полипептид GST-CFP10 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена CFP10, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli – продуцент гибридного полипептида GST-CFP10 и рекомбинантный полипептид GST-CFP10. Решение о выдаче патента на изобретение от 17 июля 2009 г. Заявка № 2008107240/13(007837).
Список статей, опубликованных по теме диссертации:
1. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Вараксин Н.А., Татьков С.И.
Рекомбинантные белки M. tuberculosis в диагностике туберкулёза лёгких // Медицинская иммунология. 2006. № 2/3. С. 294–295.
2. Татьков С.И., Туманов Ю.В., Носарева О.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Порываева В.А., Ивлев-Дунтау А.П., Ткаченко С.Б., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков микобактерий туберкулёза для серологической диагностики инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2006. № 4(29). С.
42–47.
3. Татьков С.И., Носарева О.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Лебедев Л.Р., Порываева В.А., Ивлев-Дунтау А.П., Аутеншлюс А.И., Ткаченко С.Б., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M. tuberculosis для серологической диагностики туберкулёза // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. № 12. С.
23–24, 33–34.
4. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Боднев С.А., Медведева Е.В., Баранова О.И., Ивлев-Дунтау А.П., Блинова Л.Н., Пасечников А.Д., Татьков С.И.
Определение причин распространения MDR-штаммов на основе анализа популяции рифампицин- и/или изониазид-устойчивых изолятов M. tuberculosis // Молекуляр.
генетика микробиол. вирусол. 2006. № 2. С. 30–33.
5. Татьков С.И., Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Медведева Е.В., Ивлев-Дунтау А.П., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости M. tuberculosis в Новосибирской и Томской областях // Молекуляр.
генетика микробиол. вирусол. 2007. № 4. С. 9–15.
Доклады и тезисы конференций:
1. Болдырев А.Н., Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Использование полимеразной цепной реакции для одновременного определения инфицированности пациента туберкулёзом и устойчивости к рифампицину // Труды конференции «Межрегиональная научная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П.
Карпова». 2003. 7–10 октября. Томск.
2. Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Туманов Ю.В. и др. «Рекомбинантные белки M.tuberculosis в серологической диагностике туберкулеза», Тез.докл. Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П.Карпова 7-10 октября, 2003, с.171- 3. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Медведева Е.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И.
Применение олигонуклеотидных чипов для определения штаммов M. tuberculosis, устойчивых к рифампицину и/или изониазиду // Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней». 2005. 25–27 октября. Сосновка.
Новосибирская обл.
4. Болдырев А.Н., Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M. tuberculosis для серологической диагностики туберкулёза // III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». 2006.
27–29 сентября. Новосибирск. Россия. С. 134–135.
5. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Выявление маркёров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулёза // III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». 2006. 27–29 сентября. Новосибирск. Россия. С. 166– 167.
6. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Татьков С.И.
Использование рекомбинантных микобактериальных антигенов в диагностике туберкулёза лёгких // Сборник тезисов II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова.
2007. 9–12 сентября. Томск. Россия. С. 34–35.
7. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Видоспецифическая диагностика туберкулёза по маркёрам Т-клеточного иммунитета // Сборник тезисов II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова. 2007. 9–12 сентября. Томск. Россия. С. 36–37.
8. Туманов Ю. В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Татьков С.И. Иммунологический мониторинг туберкулёзной инфекции с использованием рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFP10 M.tuberculosis // Четвёртый Московский международный конгресс “Биотехнология:
состояние и перспективы развития”, секция 1 «Биотехнология и медицина». 2007. 12– марта. Москва. Россия. С. 147.