Анализ механизмов генерации и распространения вариабельного потенциала у проростков тыквы и пшеницы
На правах рукописи
АКИНЧИЦ ЕЛЕНА КОНСТАНТИНОВНА Анализ механизмов генерации и распространения вариабельного потенциала у проростков тыквы и пшеницы 03.01.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета феде рального государственного бюджетного образовательного учреждения выс шего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.
Научный консультант:
доктор биологических наук Воденеев Владимир Анатольевич
Официальные оппоненты:
Булычев Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва Иванов Борис Николаевич, доктор биологических наук, профессор, заведую щий лабораторией фотосинтетического электронного транспорта ИФПБ РАН, г. Пущино
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учрежде ние науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва.
Защита диссертации состоится «13» июня 2013 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 на базе Московского государственно го университета имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленин ские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, аудитория 389.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан « » мая 2013 года
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук М.Г. Страховская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Функционирование растения в меняющихся условиях окружающей среды требует непрерывной адаптации к действию неблагоприятных факторов. Развитие системного ответа при локальном воздействии возможно лишь при условии рас пространения стрессовых сигналов. У растений выделяют несколько типов стрес совых сигналов – химические, гидравлические и электрические. К электрическим сигналам относят потенциал действия (ПД) и вариабельный потенциал (ВП) (Stahlberg et al., 2006;
Davies et al., 2006). Генерация ПД происходит при действии неповреждающего раздражения, а ВП, характерная только для высших растений электрическая реакция, возникает при повреждении. Основной отличительной чер той этой реакции является её нерегулярность (вариабельность). ВП отличается от ПД изменчивой формой и амплитудой, способностью возникать в период абсолют ной рефрактерности после ПД, и меньшей скоростью распространения. Кроме того, ВП характеризуется значительно большей длительностью, особенно в фазе реполя ризации (Опритов и др., 1991;
Stankovic et al., 1998;
Stahlberg et al., 2006).
Электрические сигналы у высших растений вызывают изменения их функци онального состояния, такие как: увеличение интенсивности дыхания (Sinyukhin, Britikov 1967;
Filek, Koscielniak 1997), временное снижение активности фотосинте за (Bulychev et al. 2004;
Koziolek et al. 2004;
Lautner et al. 2005), индукция экспрес сии генов pin2 (Stankovic, Davies, 1996;
Fisahn et al. 2004), временное увеличение содержания АТФ (Сухов и др., 2005), индукция биосинтеза жасмоновой и абсцизо вой кислоты (Hlavkov, 2007) и др. Вызванные электрическими сигналами изме нения функциональной активности, вероятно, направлены на повышение устойчи вости растений к действию неблагоприятных факторов (Пятыгин и др., 2008). Пути преобразования электрических сигналов в функциональный ответ на сегодняшний день не известны. Для их понимания необходимо изучение процессов генерации и распространения электрических сигналов.
В настоящее время достаточно хорошо изучены генерация и распространение ПД. Генерация ПД начинается с активации потенциал-зависимых кальциевых ка налов и поступления в клетку Ca2+, который активирует хлорные каналы (Lunevsky et al., 1983;
Lewis et al., 1997). Входящий поток Ca2+ и выходящий поток Cl- форми руют фазу деполяризации ПД. Фаза реполяризации ПД формируется выходящим потоком K+ (Fromm, Spanswick, 1993). В генерации ПД участвует также Н+АТФаза плазмалеммы, вклад которой наиболее значителен в фазе реполяризации (Воденеев и др., 2006).
Сведения об ионном механизме генерации ВП противоречивы. В настоящее время сложилось мнение, что генерация ВП целиком обусловлена переходным из менением активности Н+-АТФазы, без возникновения пассивных потоков ионов (Julien et al., 1991;
Stahlberg et al., 2006;
Zimmermann et al., 2009). Однако сведений для формирования целостной картины генерации ВП недостаточно. Механизм рас пространения ВП также остаётся не установленным. В отличие от ПД, электриче ски распространяющегося по флоэме, распространение ВП связывают с ксилемой.
Существуют две гипотезы распространения ВП: химическая (Malone M., 1996;
Davies E., 2006) и гидравлическая (Malone M., 1996;
Mancuso S., 1999;
Stahlberg et al., 2006). Таким образом, несмотря на значительный период исследований, сведе ния о ВП у высших растений фрагментарны и остаются противоречивыми. Также отсутствует теоретическое (математическое) описание генерации и распростране ния ВП.
Цель и основные задачи исследования Целью работы явилось изучение механизмов генерации и распространения индуцированного локальным повреждением ВП у высших растений.
В связи с поставленной целью выполнялись следующие задачи:
1. Определение основных параметров электрических реакций, индуцированных ожогом;
2. Ингибиторный анализ механизма генерации ВП;
3. Анализ концентрационных сдвигов ионов хлора и протонов потенциометрическим методом при генерации ВП;
4. Анализ механизма распространения ВП на основании сопоставления скоростей распространения гидравлического сигнала и радиоактивной метки со скоростью ВП;
5. Составление общей схемы распространения и генерации ВП и разработка ма тематической модели ВП.
Научная новизна Впервые показано, что в генерацию вариабельного потенциала, наряду с из менением активности электрогенного насоса, вносят вклад пассивные потоки ионов Ca2+ и Cl-.
Распространение ВП может быть обусловлено турбулентной диффузией неко его химического соединения («фактора Рикка») из зоны локального повреждения.
Экспериментально показано, что скорость распространения радиоактивной метки из зоны повреждения сопоставима со скоростью распространения ВП.
Предложена схема распространения и генерации ВП у высших растений, со гласно которой формирование ВП связано с активацией лиганд-зависимых Ca2+ каналов раневым фактором Рикка. Вход в клетку ионов Ca2+, вероятно, вызывает активацию анионных каналов и инактивацию H+-АТФазы.
На основании предложенной схемы разработана математическая модель гене рации ВП у высших растений, которая включает в себя описание систем пассивно го и активного (первичного и вторичного) транспорта ионов, а также изменения ионных концентраций в клетке, внеклеточной среде, буферные свойства цитоплаз мы и апопласта. Верификация модели показала качественное сходство эксперимен тально зарегистрированных и симулированных изменений потенциала.
Научно-практическое значение Результаты работы важны для создания целостной картины формирования электрофизиологического ответа у высших растений на действие повреждающих раздражителей. Предложенная в работе схема генерации ВП способствует понима нию механизмов преобразования электрического сигнала в функциональный ответ у высших растений.
Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при разработке соответствующих спецкурсов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. По мере удаления от зоны локального повреждения уменьшается амплитуда и скорость распространения электрической реакции, изменяется количество импульсов в составе ВП. Это свидетельствует об ослаблении индуцирующе го электрический ответ сигнала, передаваемого по растению.
2. Ингибиторный анализ механизма генерации ВП и зарегистрированные потен циометрическим методом концентрационные сдвиги, сопровождающие реак цию, свидетельствуют об участии потоков Са2+, Н+ и Сl- в формировании ВП.
3. Инициация ВП обусловлена распространением химического вещества из зоны локального повреждения, о чём свидетельствует соответствие скоростей рас пространения по растению радиоактивной метки и ВП, а также отсутствие ВП при механическом блокировании распространения химического сигнала.
4. Изменения потенциала, описываемые математической моделью ВП, качествен но соответствуют экспериментальным данным, что подтверждает основные по ложения предложенной модели.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 12-ой международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2008), 13-ой Нижегородской сессии молодых ученых «Татинец» (Н. Новгород, 2008), 13-th Aunnual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders» (Казань, 2009), 14 Меж дународной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), III Всероссийском с международным участием конгрес се студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Н. Новгород. 2010), International Autumn School (Vulcan-Brasov, Romania, 2010), Всероссийском симпо зиуме «Растения и стресс» (Москва, 2010), VII Съезде Общества физиологов расте ний России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и иннова ционных биотехнологий» (Н. Новгород, 2011), IV Съезде биофизиков России (Н.
Новгород, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ из них 4 статьи в рецензируемых изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав (включая обзор литературы), заключения, выводов и списка литературы. Изложена на 109 стра ницах, содержит 28 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 164 работы, из них 136 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объект и методы исследования В качестве объекта исследований использовали 2-3-недельные проростки тыквы Cucurbita pepo L. сорта Мозолеевская и пшеницы Triticum aestivum L. сорта Москов ская-35. Растения выращивали гидропонным способом (керамзит, 50 % среда Хоглэн да-Арнона) в климатической камере (KBW-240, «Binder») при освещении люминес центными лампами (16-ти часовой световой период) и температуре 24 оС.
Растения располагали на специально изготовленных подставках, корни поме щали в чашку Петри, содержащую стандартный раствор (1 мМ KCl, 0.1 мМ NaCl, 0.5 мМ CaCl2, 2 мМ Tris-Mes (pH 6.0)).Внеклеточная регистрация электрической ак тивности осуществлялась с помощью Ag/AgCl макроэлектродов ЭВЛ-1М3, усили телем служил иономер ИПЛ-113 с входным сопротивлением 1012Ом, соединенный с компьютером. Контакт электрода со стеблем тыквы или листом пшеницы осу ществлялся через электропроводящий гель. Электрод сравнения помещали в рас твор, омывающий корни проростков. Измерительные электроды располагали в трех точках на различных расстояниях от места раздражения в диапазоне от 1 до 15 см.
В качестве повреждающего раздражителя использовали локальный ожог откры тым пламенем края листа в течение 2 секунд. Раздражение наносили на край семя дольного листа проростка тыквы или на кончик листа пшеницы. Площадь поврежде ния семядольного листа проростка тыквы составляла около 0.3 см2, у проростка пше ницы был поврежден кончик листа длиной около 2 мм.
Для ингибиторного анализа использовали 1 мМ раствор ЭГТА (хелатор ионов Са2+), 0.5 мМ NaN3 (ингибитор метаболизма) и 2 мМ этакриновую кислоту (ЭК, блокатор анионных каналов). Химический агент действовал локально на находя щийся в кювете диаметром 1 см участок стебля. Агенты вносили за час до индук ции ВП.
Изменения ионных концентраций в растворе, омывающем участок стебля, реги стрировали потенциометрическим методом. Перед измерением у проростка тыквы с участка стебля, находящегося в кювете с раствором, удаляли эпидермис. К экспери менту приступали не ранее чем через 2 часа после удаления эпидермиса. Регистрацию изменений рН и рСl раствора осуществляли с помощью электродов ЭСК-10614 и ЭЛИС-131Cl соответственно.
Для определения механизма распространения ВП применяли оптическую коге рентную микроскопию (ОКМ) и метод меченых атомов. С помощью когерентного микроскопа OCM1300SS Swept Source OCT Microscope System (Thorlabs) визуали зировали изменения структуры листа (разрешение метода составляет 10 мкм). Рас тения располагали на столике микроскопа, одновременно регистрировали электри ческую активность от трёх точек на различном расстоянии до зоны повреждения.
Регистрацию ОКМ-изображения проводили в районе расположения второго элек трода (Э2). Двумерные ОКМ-изображения внутренней структуры листа получали каждые 3 с. Исходный размер получаемого изображения составлял 3х3 мм. Прово дили серию измерений на различном расстоянии (от 5 до 15 см) между зонами раз дражения и регистрации. Оценку изменения размеров листовой пластины произво дили на основании отдельных ОКМ-изображений с помощью графической про граммы CorelDRAW Graphics Suite X4.
Скорость распространения химического соединения из зоны локального по вреждения определяли с помощью метода меченых атомов. В качестве метки ис пользовали 14С в составе сахарозы. У проростков пшеницы не менее чем за 2 часа до опыта был подрезан кончик листа. На подрезанный кончик листа наносили ожог.
Сразу после ожога кончик листа опускали в бюкс с меченой сахарозой. У кон трольных растений кончик листа погружали в содержащий метку раствор без нане сения ожога. Инкубация кончика листа в растворе составляла 100 или 200 с. После этого лист разрезали на фрагменты по 20 мм. Фрагменты высушивали и из них го товили фиксированные препараты. Активность препаратов регистрировали с по мощью торцового счётчика МСТ-17, находящегося в свинцовом домике.
Математическая модель ВП была разработана на основании модификации ма тематической модели ПД (Sukhov, Vodeneev, 2009). Полученная система уравнений решалась численно методом Эйлера. Начальные значения переменных модели и её параметры частично были взяты из предыдущей работы (Sukhov, Vodeneev, 2009), частично определялись на основе экспериментальных данных.
Эксперименты проводили в 5–10-кратной биологической повторности. Стати стическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики (Тейлор, 1985;
Гланц, 1998) с использованием программ Microsoft Excel.
Результаты и их обсуждение Общая характеристика реакции, индуцированной локальным повреждением.
ВП представляет собой переходную деполяризацию нерегулярной формы и амплитуды (рис. 1). Амплитуда и длительность реакции могут значительно варьи ровать у отдельных растений. Несмотря на значительную вариабельность, можно выделить основные закономерности трансформации ВП по мере удаления от зоны повреждения. С увеличением расстояния глубокая деполяризация сменяется плав ной волной деполяризации меньшей амплитуды, на фоне которой возникают им пульсы (рис. 1). Амплитуда медленной волны и скорость распространения ВП па дают с расстоянием (рис. 2А, Б). Изменения количества импульсов в ответе имеют более сложный характер (рис. 2В): тенденция к возрастанию их числа при увеличе нии расстояния от 4 до 10 см сменяется последующим снижением.
Основные закономерности трансформации реакции, обнаруженные в про ростках тыквы – снижение амплитуды и скорости распространения ВП по мере удаления от зоны повреждения (рис. 3, рис. 4) – характерны и для ВП в листе пше ницы. Импульсов в составе реакции у проростков пшеницы не было обнаружено.
ожог ожог Рис. 1. Электрические ответы, индуцированные ожогом, в стебле проростка тыквы на расстоянии 7 см (Э1), 10,5 см (Э2) и 18,5 см (Э3) от места раздражения.
А Б В Рис. 2. Зависимость амплитуды (А), скорости распространения (Б) и количества им пульсов (В) от расстояния до зоны раздражения для вариабельного потенциала, ин дуцированного ожогом семядольного листа тыквы.
Е1 Е2 Е ожог Рис. 3. Электрические ответы, индуцированные ожогом, в листе проростка пшеницы на расстоянии 2 см (Э1), 4 см (Э2) и 8 см (Э3) от места раздражения.
V, см/с А A, мВ Б Расстояние, см Расстояние, см Рис. 4. Зависимость амплитуды (А) и скорости распространения (Б) ВП от расстоя ния до зоны раздражения для вариабельного потенциала, индуцированного ожогом кончика листа пшеницы.
Параметры ВП, зарегистрированные нами в стебле проростков тыквы и листе пшеницы качественно сходны с характеристиками ВП, зарегистрированными на других растительных объектах (Malone, 1992;
Stahlberg, 1996;
Stankovik, 1997).
Снижение амплитуды и скорости распространения реакции с расстоянием может быть связано с ослаблением индуцирующего электрический ответ сигнала, переда ваемого по растению.
Анализ ионного механизма генерации вариабельного потенциала.
В развитие переходной деполяризации растительных клеток наиболее вероя тен вклад ионов Са2+, Н+, Сl-, поскольку для них на мембранах в состоянии покоя существуют наибольшие градиенты (Пятыгин и др., 2006;
Stahlberg et al., 2006) и, как известно, эти же ионы принимают участие в генерации другого типа электри ческого сигнала – ПД (Опритов и др., 1991;
Воденеев и др., 2006;
Trebacz et al., 2006). В связи с этим основное внимание в работе было уделено возможной роли Са2+, Н+ и Сl- в генерации ВП.
Ингибиторный анализ генерации электрических реакций в случае с ВП встре чает ряд трудностей, обусловленных его вариабельностью. В связи с этим было ис пользовано локальное действие специфических ингибиторов. Электрическую ак тивность регистрировали в зоне действия агента (Э2), а также выше (Э1) и ниже (Э3) нее (рис. 5). В контроле было показано последовательное снижение амплитуды ВП с увеличением расстояния (рис. 2А), следовательно, отклонение от такой зависимо сти указывает на влияние агента на генерацию ВП.
На первом этапе определяли влияние блокирования входящего потока Ca2+ на генерацию ВП, для чего проводили эксперименты в бескальциевой среде (рис.
5А). Внесение 1 мМ ЭГТА существенно подавляло амплитуду и скорость развития деполяризации (рис. 5А), что указывает на необходимость входящего потока Ca2+ для формирования ВП у проростков тыквы. Опираясь на сведения о генерации ПД у высших растений (Опритов и др., 1991;
Воденеев и др., 2006;
Trebacz et al., 2006), можно предположить, что в случае ВП ионы Ca2+ также являются скорее сигналь ным фактором, нежели непосредственным носителем заряда. Сходное предполо жение высказано в работах (Julien et al., 1991;
Rousset et al., 2002).
Известно, что увеличение концентрации Ca2+ в клетке инактивирует H+ АТФазу плазмалеммы (Kinoshita et al., 1995;
Lino et al., 1998;
De Nisi et al., 1999) и активирует анионные каналы (Lunevsky et al., 1983;
Lewis et al., 1997). В дальней шем определяли возможную роль указанных систем в генерации ВП.
Роль H+-АТФазы в генерации ВП определяли с использованием снижающего ее активность ингибитора метаболизма NaN3 (Reid et al., 1985). Внесение NaN3 зна чительно подавляет амплитуду ВП (рис. 5Б), что указывает на участие Н+-АТФазы в формировании ВП. Однако, такой результат нельзя считать однозначным, по скольку угнетение Н+-насоса приводит также к деполяризации мембраны и к дис сипации градиентов других ионов.
Более прямые сведения об участии Н+-АТФазы в генерации ВП могут быть получены на основании исследований изменений рН. На рис. 6А представлена за пись одновременной регистрации индуцированных ожогом изменений электриче ского потенциала и рН внеклеточной среды. При генерации ВП наблюдается обра тимое повышение рН раствора. Такое изменение концентрации Н+ во внеклеточной среде может быть вызвано временным угнетением активности протонной АТФазы.
А Б В Рис. 5. Влияние хелатора двухвалентных катионов (1 мМ ЭГТА) (А), ингибитора ме таболизма (0.5 мМ NaN3) (Б) и блокатора анионных каналов (2 мМ этакриновой кислоты) (В) на генерацию вариабельного потенциала.
Слева приведены типичные записи электрических ответов, справа – средние значения их амплитуд, внизу – схема проведения измерений. Время инкубации в присутствии агента со ставляло не менее 30 мин. Расстояние между электродами Э1-Э2 составляло 5 см, Э2-Э3 – 3. см. Расстояние от зоны раздражения до Э1 – от 6 до 8 см.
Для оценки роли выхода анионов в генерации ВП применяли блокатор анион ных каналов этакриновую кислоту (ЭК). ЭК вызывает снижение амплитуды ВП и существенное замедление скорости деполяризации (рис. 5В), что указывает на ак тивацию анионных каналов при развитии ВП. Роль ионов Cl- в развитии деполяри зации оценивали по изменению его содержания во внеклеточной среде (рис. 6Б).
Генерация переднего фронта ВП, а также электрических импульсов, входящих в состав ВП, сопровождается временным увеличением концентрации Cl-. Можно по лагать, что это связано с переходной активацией анионных каналов.
А Б рСl -U Рис. 6. Изменение концентрации ионов Н+ (А) и Cl- (Б) внеклеточной среде при гене рации вариабельного потенциала.
Концентрацию ионов H+ и Cl- регистрировали в растворе, омывающем участок стебля, в той же зоне регистрировали электрическую активность.
В целом, предположена следующая последовательность событий при генера ции ВП: начало деполяризации связано с поступлением в клетку ионов Ca2+, кото рые вызывают активацию Cl–-каналов и инактивацию Н+-АТФазы. С инактивацией Н+-АТФазы связано развитие медленной волны деполяризации, а анионные каналы принимают участие, главным образом, в развитии переднего фронта ВП и импуль сов в составе реакции. Фаза реполяризации формируется активным потоком Н+, связанным с реактивацией H+-АТФазы.
Анализ механизма распространения вариабельного потенциала.
В настоящее время существуют две основные гипотезы механизма распростра нения ВП: гидравлическая (Stahlberg, Cosgrove, 1997;
Stankoviс, Davies, 1997) и хи мическая (Houwink, 1935;
Sibaoka, 1969;
Malone et al., 1994;
Malone, 1996). Также обсуждался электрический механизм распространения ВП, подобно ПД (Цаплев, За цепина, 1980). Однако впоследствии эта гипотеза не была подтверждена. В нашей ра боте также было показано (рис. 5), что локальное подавление генерации ВП не влияет на дальнейшее его распространение, что также противоречит электрической гипотезе.
Изучение механизма распространения ВП было основано, в первую очередь, на сопоставлении скоростей гидравлического сигнала и распространения радиоактив ной метки из зоны повреждения со скоростью ВП.
Распространение гидравлического сигнала определяли по структурным изме нениям листа пшеницы на расстоянии от зоны локального повреждения с помощью оптической когерентной микроскопии (ОКМ). На рис.7Б приведено типичное ОКМ-изображение листа пшеницы в сравнении с гистологическим срезом (рис.
7А).
В Б А Рис. 7. Гистологический срез листа пшеницы (А), ОКМ-изображение (Б) и схема де формации листа, индуцированной повреждением (В) Методом ОКМ была зарегистрирована вызванная ожогом быстрая деформа ция листа на расстоянии от зоны повреждения (рис. 7 В). Динамику деформации оценивали по изменению расстояния между двумя противоположными симметрич но расположенными точками листа (параметр А на рис. 7Б, В). Такая деформация листа отражает распространение гидравлического сигнала – волны повышенного давления – по растительным тканям при повреждении как описано в работах (Malone, 1992;
Stankovic et al., 1998;
Mancuso, 1999). Следовательно, по началу де формации можно судить о моменте прохождения гидравлического сигнала.
Проводили одновременную регистрацию электрической активности и ОКМ изображений из одной зоны (рис. 8). Как видно из графика, начало деформации опережает электрический ответ. Это согласуется с предположениями о том, что гидравлический сигнал индуцирует генерацию ВП, высказанными в работах (Stahl berg, Cosgrove, 1997;
Stankovic et al., 1998;
Malone, 1992;
Mancuso, 1999).
Тем не менее, было обнаружено значительное несоответствие в скоростях распространения электрического и гидравлического сигналов. На рис.9 показано нелинейное возрастание временного интервала (t) между раздражением и началом деформации листа при увеличении расстояния, что соответствует снижению скоро сти распространения ВП, отмеченное как в нашей работе (рис. 2, 4), так и в работах других авторов (Stankovic et al., 1998). Разница в величинах t значительно растет с увеличением расстояния (r).
Ожог U А Рис. 8. Одновременная регистрация изменений электрической активности и пара метра А, отражающего деформацию листа при нанесении локального повреждения.
Полученные в наших экспериментах данные, расходятся с результатами рабо ты (Malone, 1992), демонстрирующей соответствие между скоростями электриче ского и гидравлического сигналов. В то же время, по данным (Stahlberg, Cosgrove, 1997) скорость гидравлического сигнала превышает скорость ВП. Возрастание лаг периода между гидравлическим сигналом и ВП объясняется авторами диссипацией давления с увеличением расстояния от зоны повреждения (Stahlberg, Cosgrove, 1997). С другой стороны, несоответствие в скоростях распространения может быть объяснено с привлечением химической гипотезы распространения ВП.
t, c r, см Рис. 9. Зависимость временного интервала (t) между раздражением и началом дви жения листовой пластины (кривая 1) или началом развития электрической реакции (кривая 2) от расстояния между зонами раздражения и регистрации. Кривая 3 отра жает теоретическую зависимость для одномерной диффузии.
Коэффициент диффузии, использованный при построении теоретической зависимости ин тервала времени от расстояния до места нанесения раздражения: D = 4,510-2 см2/с В соответствии с химической гипотезой распространение ВП происходит за счёт перемещения некого химического вещества («фактора Рикка»), которое вызы вает активацию ионтранспортирующих систем. Предполагали, что распространение «фактора Рикка» происходит путем его диффузии по проводящим пучкам. Для описания распространения индуцирующего электрический ответ химического агента было использовано диффузионное уравнение:
где c(x,t) – функция зависимости концентрации (c) диффундирующего вещества от времени (t) и координаты (x), D – коэффициент диффузии.
Так как продольные размеры проводящего пучка много больше, чем поперечные, диффузию в сосуде можно рассматривать как одномерную. Было принято, что при действии повреждающего фактора происходит мгновенное возрастание концентрации раневого вещества в точке повреждения (t=0, x=0). В этом случае решение диффузионного уравнения будет иметь вид (Джаксон, 2009):
r cr,t = C exp 2 Dt 4 Dt где С0 – общее количество раневого вещества, выделившегося в точке r = 0, в момент времени t = 0, r – расстояние до зоны повреждения.
Если предположить, что для генерации ВП необходимо превышение концентрацией раневого вещества некоторого порогового уровня (сth), то на основании приведённого выше уравнения для случая одномерной диффузии можно найти зависимость расстояния, на которое распространяется ВП, от времени, в течение которого происходит распространение:
2c Dt r = 4 Dtln th C0 На основании этого уравнения было подобрано значение D при котором наблюдается достаточно хорошее соответствие между экспериментальной и теоретической кривой зависимости интервала времени (t), необходимого для распространения ВП, от расстояния (r) до зоны повреждения (рис. 9). Значение, найденного коэффициента диффузии составило 4,5*10-2 см2/с. Такое значение бо лее чем на 3 порядка превышает значения коэффициентов молекулярной диффузии для небольших молекул в жидкостях (~10-5 см2/с) (Левич, 1959).
Противоречие может быть связано с протекающей в проводящих путях не только молекулярной, но и турбулентной диффузией. Поток жидкости может при обретать турбулентный характер даже при невысокой скорости ее течения в том случае, если сосуд, по которому происходит движение, имеет сложную геометрию, в частности - переменный диаметр сечения. Сосуды ксилемы удовлетворяют этому условию и, как теоретически показано в работе (Roth, 1996), движение водных по токов в них имеет сложный характер, отличный от ламинарного течения. При наличии потоков итоговый коэффициент диффузии представляет собой сумму мо лекулярного и турбулентного коэффициентов диффузии. Причём значение коэф фициента турбулентной диффузии на несколько порядков больше молекулярной (составляет порядка 10-2 – 10-1 см2/с) (Левич, 1959).
Турбулентность потоков усиливается при наличии градиентов давления (Ле вич, 1959). Гидравлический сигнал, возникающий при повреждении, представляет собой распространение области повышенного давления в сосудах ксилемы. Следо вательно, генерацию ВП может вызывать распространение «фактора Рикка» из зо ны повреждения, скорость перемещения которого значительно возрастает вслед ствие турбулентных потоков, индуцированных гидравлической волной.
Для экспериментальной проверки возможности распространения какого-либо соединения со столь высокой скоростью исследовали распространение радиоак тивной метки по растению из зоны локального повреждения. На рис. представлена зависимость скорости счёта фиксированных препаратов от расстояния до места нанесения раздражения. Время, в течение которого происхо дило распространение радиоактивной метки из зоны повреждения, составляло (рис. 10А) и 200 (рис. 10Б) секунд. По истечении указанного времени растения бы ли разделены на фрагменты длиной 2 см, активность которых представлена на гра фике. Полученные данные были использованы для определения коэффициента диффузии меченого соединения на основании уравнения одномерной диффузии.
Значение коэффициента диффузии для меченой сахарозы листа пшеницы составило 6*10-2 см2/с в опыте (при повреждении) и 1,8*10-2 см2/с в контроле (в от сутствие повреждения). Таким образом, нанесение повреждения ведет к заметному увеличению скорости распространения радиоактивной метки.
Б А Рис. 10. Зависимость скорости счета препаратов от расстояния до места нанесения раздражения. Время инкубации – 100 с (А), Время инкубации – 200 с (В) Dэксп ~ 6*10-2 см2/с, Dконтр ~1,810-2 см2/с Необходимо отметить, что высокая скорость распространения соединения из зоны локального ожога обнаружена не только в нашей работе, но и была показана также ранее в работе (Rhodes et al., 1999) с использованием флуоресцентного зонда.
Далее исследовали возможность распространения ВП при блокировании пе редачи химического сигнала. Для этого лист пшеницы был перерезан через опре делённое время после нанесения ожога. Так как гидравлическая волна распростра няется очень быстро, то перерезание листа сразу после ожога не должно сказаться на распространении ВП при условии, что распространение связано с прохождением гидравлической волны. Было показано, что сам факт перерезания листа пшеницы без нанесения ожога не вызывает электрической реакции (рис. 11А). После перере зания листа через 1 с после ожога не происходило распространения ВП (рис. 11Б).
В А Е Е Е Б Г Рис. 11. Изменения электрической активности, вызванные перерезанием листа без нанесения ожога (А), и после нанесения ожога через различные интервалы времени (Б – 1 с, В – 3 с, Г – 6 с). Расстояния от зоны ожога до места перерзания составляло см, до электродов Е1, Е2 и Е3 – 3, 5 и 7 см соответственно.
Перерезание листа через 3 с приводило к тому, что ВП распространялся до первого электрода, через 6 с – до первого и до второго электродов (рис. 11В, Г). Это также свидетельствует в пользу химической гипотезы.
Таким образом, полученные результаты указывают на возможность распро странения ВП в соответствии с химической гипотезой, то есть инициация ВП про исходит в результате действия некого химического соединения, ускорению распро странения которого способствует прохождение гидравлической волны.
Математическая модель распространения и генерации вариабельного потен циала.
Полученные результаты указывают на комплексный характер процессов гене рации и распространения ВП у высших растений. Одной из проблем изучения по добных процессов является сложность интерпретации экспериментальных данных, что делает актуальной теоретическую проверку предложенных в работе механиз мов генерации и распространения ВП. Математическое моделирование ВП позво ляет провести такой анализ и дополнительно подтвердить или опровергнуть пред полагаемые механизмы его генерации и распространения.
В основу модели ВП была положена, ранее разработанная математическая модель генерации ПД (Sukhov, Vodeneev, 2009, Sukhov et al., 2011). Модель ВП учитывает работу систем пассивного и активного транспорта, буферную ёмкость клеток и апопласта, а также диффузию раневого вещества (рис. 12).
В качестве систем пассивного транспорта клетки рассматривались: Сl-каналы, Са-каналы двух типов (потенциал зависимые и лиганд-управляемые), К-каналы (входящего направления и выходящего направления). Для описания потока этих ионов использовали уравнение Голдмана-Ходжкина-Каца. Первичный активный транспорт (представленный кальциевой и протонной АТФазой) был описан моде лью, учитывающей 2 состояния переносчика: свободное и связанное с ионом, в за висимости от концентрации ионов и мембранного потенциала. Вторичный актив ный транспорт, представленный 2H+/Cl--симпортером и H+/K+-антипортером, был описан как разность потоков в клетку и из неё. В случае электрогенного транспорта учитывали влияние потенциала с помощью уравнения Голдмана-Ходжкина-Каца.
Полагали, что раневое вещество способно активировать Са2+-каналы. Дина мика концентрации раневого вещества на расстоянии от зоны локального повре ждения описана с помощью приведенного выше уравнения одномерной диффузии.
Турбулентная диффузия «фактора Рикка» Рис. 12. Схема электрофизиологической модели клетки высшего растения, исполь зованная при математическом моделировании ВП.
Была проведена верификация математической модели. На рис. 13 представле ны экспериментальные (рис. 13А) и симулированные моделью (рис. 13Б) примеры изменения электрического потенциала на различном расстоянии от зоны локально го повреждения. Как уже отмечалось выше и видно из рис. 13, ответная реакция может значительно варьировать у отдельных растений. В модельных эксперимен тах мы изменяли начальное количество «фактора Рикка» в зоне повреждения. В ре зультате при моделировании были получены различные типы электрических отве тов, которые соответствуют экспериментальным. Это указывает на то, что вариа бельность индуцированной повреждением реакции может быть во многом обу словлена различиями в начальном количестве «фактора Рикка».
Модель хорошо описывает такие свойства ВП как затухание амплитуды и скорости медленной волны при распространении, а также двухфазное изменение количества импульсов в составе реакции. Изменения параметров реакции могут быть обусловлены уменьшением концентрации «фактора Рикка» с расстоянием.
На основании модели оценивали роль потоков ионов Са2+, Н+ и Сl- в генера ции ВП. Симулированное и экспериментальное влияние исключения ионов Са2+ на изменения потенциала показано на рис. 14А. Как видно из рисунка, удаление Са2+ как в эксперименте, так и в модели, ведёт к подавлению ВП.
А [SW0]2 [SW0] [SW0] Б Рис. 13. Электрические ответы, индуцированные ожогом, на различном расстоянии от места раздражения А – экспериментально зарегистрированные, Б - cимулирован ные моделью электрические ответы. [SW0] – начальное количество раневого веще ства в зоне повреждения. [SW0]1[SW0]2[SW0]3.
Угнетение АТФазы симулированное моделью, так же как и в эксперименте, приводит к снижению амплитуды реакции (рис. 14Б). Симулированное моделью снижение активности Сl-каналов и экспериментальное – к замедлению фазы депо ляризации и снижению амплитуды (рис.14В). В целом, симулированные моделью изменения потенциала качественно соответствуют экспериментальным. Это указы вает на правомерность наших предположений, которые были положены в основу модели.
Б А В Рис. 14. Влияние угнетения потоков Н+ (А), Са2+ (Б) и Сl- (В) на генерацию ВП (слева экспериментальные, справа – симулированные моделью) ЗАКЛЮЧЕНИЕ В целом, на основании полученных результатов можно предложить следую щую схему событий при развитии ВП. Нанесение повреждающего воздействия вы зывает выделение и последующее распространение по сосудам «фактора Рикка», скорость перемещения которого возрастает вследствие прохождения гидравличе ской волны. По мере распространения «фактор Рикка» активирует лиганд управляемые кальциевые каналы. Увеличение концентрации ионов кальция в клет ке вызывает снижение активности Н+- АТФазы, а также активацию анионных ка налов, что ведет к возникновению выходящего потока хлора, вносящего суще ственный вклад в деполяризацию. Затем, по-видимому, происходит восстановление концентрации кальция в цитозоле. Можно полагать, что такое снижение концен трации кальция сначала ведет к инактивации хлорных каналов, при подавленной активности Н+-АТФазы, а дальнейшее снижение приводит к реактивации Н+ АТФазы, которая вносит основной вклад в формирование фазы реполяризации ВП.
Таким образом, генерация ВП связана как с пассивными потоками ионов Ca2+ и Cl-, так и с изменением активности H+-АТФазы. Необходимо подчеркнуть, что генера ция ПД происходит при участии тех же потоков ионов, что говорит об универсаль ности механизмов генерации электрических сигналов различного типа у высших растений.
ВЫВОДЫ С увеличением расстояния от зоны локального повреждения происходит 1.
снижение амплитуды и скорости распространения ВП, а также изменение количе ства импульсов в его составе. Такое затухание реакции может свидетельствовать об ослаблении индуцирующего электрический ответ сигнала, передаваемого по расте нию.
Подавление входящего потока Ca2+, ингибирование H+-АТФазы и блокирование 2.
анионных каналов ведет к угнетению генерации ВП. Генерация ВП сопровождается пе реходным защелачиванием апопласта и временным увеличением концентрации Cl-. Со вокупность полученных данных указывает на совместное участие Н+-АТФазы и пас сивных потоков ионов Ca2+ и Cl- в процессе генерации ВП.
Индукцию ВП вызывает распространение из зоны локального повреждения 3.
«фактора Рикка», на что указывают следующие факты: скорость распространения гид равлической волны значительно превышает скорость распространения ВП;
скорость распространения радиоактивной метки из зоны локального повреждения соответствует скорости распространения ВП;
блокирование передачи «фактора Рикка» из зоны ло кального повреждения подавляет распространение ВП.
Разработана математическая модель генерации и распространения ВП, учитыва 4.
ющая совместное участие активного и пассивного транспорта ионов в процессе генера ции, а также диффузию «фактора Рикка». Описываемые моделью изменения потенциа ла хорошо соответствуют экспериментальным, что служит подтверждением основных положений модели.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
.
Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:
Воденеев В.А., Сухов В.С., Опритов В.А., Царёва Ю.В., Яковлева Е.В., Неруш 1.
В.Н., Акинчиц Е.К. Динамика внеклеточной концентрации ионов хлора при гене рации холодоиндуцированного потенциала действия у высших растений//Вестник ННГУ. 2009. №2. С. 111-115.
Воденеев В.А., Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Сухов В.С. Анализ роли ионов Сa2+, H+, 2.
Cl- в генерации вариабельного потенциала у высшего растения Cucurbita pepo L.//Физиология растений. 2011. № 6 (58). С. 826-833.
3. Vodeneev V., Orlova A., Morozova E., Orlova L., Akinchits E., Orlova O., Sukhov V..
The mechanism of propagation of variation potentials in wheat leaves//J Plant Physiol.
2012. V. 169. P. 949-954.
4. Sukhov V., Akinchits E. Katicheva L., Vodeneev V. Simulation of Variation Potential in Higher Plant Cells//J Membrane Biol. 2013. V. 264. P. 287-296.
Тезисы:
Акинчиц Е.К., Орлова Л.А. Количественное определение внеклеточного рН у 5.
высших растений методом спектрофлуорометрии//12-я международная школа конференция «Биология наука ХХI века». Пущино, 2008. тез. док. с. 165-166;
6. L.A. Orlova, E.K. Akinchic. Changes of extracellular pH by generation potentials in plants//13-th unnual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders». Kazan. 2009. abstract. p. 91-91;
Акинчиц Е.К., Неруш В.Н., Орлова Л.А., Воденеев В.А. Изучение изменения 7.
концентраций ионов Н+ и Cl- при генерации потенциалов возбуждения у высших растений//«Биология – наука XXI века» «14 Международная Пущинская школа конференция молодых ученых». Пущино. 2010. с. 199-199;
Акинчиц Е.К., Мишина Е.Н., Неруш В.Н., Изучение механизма распространения 8.
индуцированного ожогом вариабельного потенциала у проростков пшеницы//III Всероссийская с международным участием конгресс студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия 2010» Н.Новгород. 2010. с. 161-161;
9. Orlova L.A., Akinchic E.K., Balalaeva I.V., Vodeneev V.A. Research of ionic concentra tion changes at generation of excitation potentials in higher plants by confocal microsco py//International Autumn School. Vulcan-Brasov. Romania. 2010. р. 11-11;
Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Неруш В.Н., Воденеев В.А. Участие ионов Ca2+, Cl- и 10.
H+ в генерации вариабельного потенциала у проростков тыквы (Cucurbita pepo)// «Растения и стресс». Москва. 2010. с. 29-30;
Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Неруш Н.В., Грибков А.Л., Воденеев В.А. Изучение 11.
ионного механизма генерации вариабельного потенциала у высших растений//VII Съезд Общества физиологов растений. Н. Новгород. 2011, с. 34-35;
Акинчиц Е.К., Катичева Л.А., Мысягин С.А., Неруш В.Н., Воденеев В.А. Изучение 12.
ионного механизма генерации вариабельного потенциала у высших растений//IV Съезд биофизиков России. Н. Новгород. 2012. с. 13.