Мария михайловна роль нарушений энергетического метаболизма в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов

На правах рукописи

УДК 577.3

Михайлова Мария Михайловна

Роль нарушений энергетического метаболизма в механизмах

дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при

гиперстимуляции глутаматных рецепторов

03.00.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики Московского Физико-Технического Института (ГУ) и в Научно-исследовательском Институте Патологии и Патофизиологии РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Борис Израилевич Ходоров

Официальные оппоненты: кандидат физико-математических наук, Перевозчиков Николай Филиппович доктор биологических наук, Хаспеков Леонид Георгиевич

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. Ломоносова

Защита диссертации состоится «22» _марта 2007 г. в _10_ часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу:

141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «_» 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156. кандидат физико-математических наук Брагин В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время считается установленным, что возбуждающие аминокислоты глутамат и аспартат играют важную роль в гибели нейронов при острых поражениях головного мозга, таких как инсульт, ишемия/гипоксия, а также различных нейродегенеративных процессах (Rothman and Olney, 1986;

Lipton, 1999). Избыточное выделение и накопление глутамата во внеклеточном пространстве приводит к гиперстимуляции глутаматных рецепторов, открыванию N-метил-D-аспартат-управляемых каналов и мощному потоку ионов Са2+ внутрь клетки. Основной моделью для изучения глутаматной нейротоксичности являются первичные культуры нервных клеток из различных областей мозга крыс или мышей. Показано, что глутаматная нейротоксичность опосредуется кальциевой перегрузкой нейронов (Hartley et al., 1993). Более детальное изучение изменений концентрации внутриклеточного Са2+ ([Ca2+]i) при глутаматном воздействии привело к открытию явления, названного отсроченной кальциевой дизрегуляцией (ОКД). Оказалось, что первичный сравнительно небольшой подъем [Ca2+]i, вызванный глутаматом в нейронах, через некоторое время сменяется сильным необратимым увеличением [Ca2+]i – ОКД (Tymianski et al., 1993;

Vergun et al., 1999;

Nicholls and Budd, 2000). Дальнейшие исследования показали, что культивируемые нейроны различного возраста по-разному отвечают на одно и тоже глутаматное воздействие. Так, молодые нейроны (6-10 дней в культуре) в ответ на 10-15 мин глутаматный удар отвечают небольшим обратимым подъемом [Ca2+]i, который сопровождается слабой митохондриальной деполяризацией (МД).

В зрелых нейронах, содержащихся в культуре более 11 дней, в ответ на такое же воздействие глутамата развивается ОКД (Adamec et al., 1998) и сильная МД (Vergun et al, 1999). Причины возрастного различия в поведении нейронов при глутаматном воздействии и механизмы ОКД до сих пор остаются невыясненными.

Данная работа направлена на изучение зависимости устойчивости нейронов к гиперстимуляции глутаматных рецепторов от состояния их энергетического метаболизма.

Исследование показало, что гликолиз играет ведущую роль в противодействии нейронов мозга нарушению кальциевого гомеостаза и дисфункции митохондрий, вызываемых глутаматом.

Цели работы.

1. Исследовать роль энергетического метаболизма в регуляции внутриклеточной концентрации Са2+ и митохондриального потенциала нейронов в состоянии физиологического покоя.

2. Исследовать роль энергетического метаболизма в механизмах защиты нейронов от нарушений кальциевого гомеостаза и коллапса митохондриального потенциала, вызываемых глутаматом.

Задачи исследования.

В опытах на молодых нейронах мозжечка исследовать роль наружного Са2+, 1.

блокаторов глутаматных каналов и ингибитора АТФ-синтазы олигомицина в развитии митохондриальной деполяризации, возникающей в нейронах при замене глюкозы на 2-деокси-D-глюкозу.

2. Исследовать роль митохондриальной поры в развитии отсроченной кальциевой дизрегуляции и митохондриальной деполяризации, вызванных токсическим глутаматным воздействием на нейроны, лишенные глюкозы.

3. Исследовать вклад реактивных форм кислорода в нарушение кальциевого гомеостаза и коллапс митохондриального потенциала, вызванных токсическим глутаматным воздействием на молодые нейроны, лишенные глюкозы.

4. Изучить влияние пирувата на развитие митохондриальной деполяризации, возникающей в нейронах в отсутствии глюкозы.

5. Изучить влияние пирувата на развитие отсроченной кальциевой дизрегуляции и митохондриальной деполяризации, вызванных токсическим воздействием глутамата на лишенные глюкозы нейроны.

Изучить вклад Nа+/Са2+-обменника и Na+/K+-АТФазы в нарушение кальциевого 6.

гомеостаза и митохондриальную дисфункцию, вызванные глутаматным воздействием в молодых нейронах в отсутствии глюкозы.

7. Исследовать изменения содержания АТФ при воздействиях глутамата, 2-деокси D-глюкозы и пирувата в гранулярных нейронах мозжечка, а также изменения уровня цитоплазматического и митохондриального АТФ в трансфецированных кортикальных нейронах, подвергнутых глутаматному воздействию.

Научная новизна.

В опытах на молодых культивируемых нейронах мозжечка впервые изучен механизм возникновения медленной деполяризации митохондрий, вызываемой длительной глюкозной депривацией (замены глюкозы на ее неметаболизируемый аналог 2-деокси-D-глюкозу).

Показано, что эта митохондриальная деполяризация (МД) устойчива к удалению наружного Са2+ или антагонистов глутаматных рецепторов, но быстро подавляется блокатором АТФ синтазы олигомицином и предотвращается пируватом.

Впервые показано, что глюкозная депривация значительно ускоряет развитие ОКД и сопровождающей ее сильной МД в молодых нейронах, подвергнутых глутаматному воздействию.

Впервые установлено, что ускорение развития ОКД в условиях глюкозной депривации нельзя объяснить ускорением открывания митохондриальной поры, поскольку блокада митохондриальной поры путем замены Са2+ на Sr2+ не изменяет латентного периода между первой и второй фазами подъема внутриклеточной концентрации Sr2+ (по сравнению с Са2+-содержащей средой).

Впервые показано, что обработка культуры антиоксидантом MnTBAP или блокатором NO-синтазы L-NAME не оказывают заметного влияния на развитие ОКД и сильной митохондриальной деполяризации во время глутаматного воздействия в молодых нейронах, лишенных глюкозы. Сделано заключение, что ускорение развития ОКД и сильной митохондриальной деполяризации нельзя объяснить усилением синтеза реактивных форм кислорода и моноокиси азота при глюкозной депривации во время глутаматного воздействия в отсутствии глюкозы.

Впервые установлено, что добавление пирувата в безглюкозную среду предотвращает развитие ОКД и сильной митохондриальной деполяризации, вызванных глутаматом. Исходя из полученных данных сделано заключение, что основной причиной ускорения развития ОКД при глюкозной депривации является прекращение гликолитической продукции пирувата, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и торможению синтеза АТФ.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание клеточных процессов, позволяющих молодым нейронам длительное время противостоять токсическому воздействию нейромедиатора глутамата. Эти результаты могут помочь в разрешении медико-биологической проблемы возрастных различий в чувствительности нейронов к токсическому воздействию глутамата.

Показано, что захват Са2+ митохондриями играет ключевую роль в противостоянии нейронов токсическому глутаматному воздействию в условиях блокады гликолиза.

Полученные результаты говорят о том, что разработка препаратов, направленных на повышение выживаемости нейронов головного мозга после ишемического инсульта, должна быть нацелена на восстановление и стабилизацию их гликолиза путем усиленной доставки нейронам мозга глюкозы и пирувата.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на конференциях: Съезд физиологического общества Великобритании (Лондон, 2002), III Съезд Биохимического Общества (Санкт Петербург, 2002), III Российский Конгресс по Патофизиологии, 48-ой Съезд Биофизического Общества (Балтимор, США, 2004), 34-ый Съезд Общества Нейронаук (Сан-Диего, США, 2004), конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 9 тезисных сообщений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились на культивируемых зернистых нейронах мозжечка и кортикальных нейронах крыс (6-10 дней в культуре, ДВК).

Для измерения [Ca2+]i нейроны нагружались Са2+-чуствительными зондами Fura 2(AM) или Fura-2FF(АМ). Для измерения митохондриального потенциала (м) нейроны нагружались потенциал-чувствительным зондом родамин-123 (3.5 мкг/мл, 15 мин, Rh-123).

Измерения [Ca2+]i и м проводились на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axiovert-200 (“Zeiss”, Германия), оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx (“Roper Scientific”, США). Флуоресценция зондов возбуждалась светом от ксеноновой лампы, пропускаемым последовательно через светофильтры: 340 и 380 нм для Fura-2 (Fura 2FF) и 490 нм для Rh-123.

Данные, полученные с помощью Са2+-чувствительных зондов представлены как отношение флуоресценции, возбуждаемой светом с длинами волн 340 и 380 нм (F340/F380).

Сигналы Rh-123 нормировались на базальный уровень флуоресценции.

Измерения уровня АТФ в культивируемых нейронах мозжечка проводились в лизатах клеток с помощью люциферин-люциферазной системы.

Для измерений уровня АТФ в митохондриях и цитозоле культивируемые нейроны коры головного мозга крыс трансфецировали с помощью реагента Lipofectamine плазмидами, кодирующими изоформы люциферазы, селективно экспрессирующейся в митохондриях (mtLuc) и цитозоле (cytLuc), соответственно. Культуры перфузировались раствором, содержащим люциферин (20 мкМ). Измерения проводились с помощью счетчика квантов.

В экспериментах со Sr2+, ионы Са2+ полностью заменялись на ионы Sr2+ во внеклеточной среде. В экспериментах с циклоспорином А (ЦсА), ингибитор в концентрации 1мкМ или 0. мкМ добавлялся к клеткам вместе с флуоресцентными красителями и далее присутствовал во всех растворах, в которых содержалась 2-деокси-D-глюкоза. В экспериментах с антиоксидантом MnTBAP до начала эксперимента нейроны 30 мин инкубировали в буфере, содержащем глюкозу и антиоксидант MnTBAP (200 мкМ). MnTBAP присутствовал далее во всех растворах за исключением калибровочных: FCCP и Iono.

Плазмиды белков любезно предоставлены проф. Р. Рицутто (R. Rizutto, Университет Феррары, Италия).

Все полученные результаты являются статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние глюкозной депривации и блокады F1/Fо-АТФсинтазы на кальциевый гомеостаз и митохондриальный потенциал нейронов в состоянии покоя.

Прежде всего, мы изучили, как влияет на митохондриальный потенциал (m) и внутриклеточную концентрацию Са2+ ([Ca2+]i) блокада митохондриального синтеза АТФ олигомицином. Олигомицин не повлиял на [Ca2+]i, но вызвал гиперполяризацию митохондрий, которая являлась следствием прекращения потока протонов через Fo-канал митохондриальной АТФ-синтазы (не показано, см. также Duchen and Biscoe, 1992).

Далее мы исследовали, как влияет на m и [Ca2+]i замена глюкозы на 2-деокси-D глюкозу (глюкозная депривация). 2-деокси-D-глюкоза (ДГ) приводит к торможению гликолиза в клетках, поскольку она конкурирует с глюкозой за захват нейронами, а также за фосфорилирование ферментом гексокиназой. Образующийся в результате фосфорилирования 2-ДГ-6-фосфат далее не метаболизируется, подавляя гликолитический синтез как АТФ, так и пирувата, необходимого для поддержания m (Chi et al., 1987). В нашей работе инкубация молодых (6-10 дней в культуре, ДВК) гранулярных нейронов мозжечка в течение 20-60 мин в безглюкозном растворе, содержащем ДГ (10мМ), приводила к постепенной деполяризации митохондрий (24 эксперимента, Рис 1А, В).

Ранее в экспериментах, проведенных на смешаных нейронально-глиальных культурах, было показано, что замена глюкозы на ДГ приводит к увеличению [Ca2+]i (Silver et al., 1997). В опытах на гиппокампальных срезах также было обнаружено, что лишение А Б Глу FCCP m (Rh-123, F490/F0) 3. m (Rh-123, F490/F0) 4 ДГ 2. 2. 1.5 2+ 0Ca +EGTA ДГ пируват 1. 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 Время (мин) Время (мин) Рис 1. Изменения m нейронов, В вызываемые заменой глюкозы на ДГ FCCP ДГ и добавлением пирувата в 2. m, (Rh-123, F490/F0) пируват безглюкозную среду. Замена 2. глюкозы на ДГ (10мМ) приводит к 2. развитию МД (А). Присутствие в 1. безглюкозной среде пирувата (5мМ) 1. предотвращает МД, вызываемую 1. заменой глюкозы на ДГ (Б), а 1.2 добавление пирувата в безглюкозную 1.0 среду способствует восстановлению m 0.8 (В). Кривые являются 0 10 20 30 40 результатом усреднения по 8 (А), Время, мин (Б) и 6 (В) клеткам.

клеток глюкозы и кислорода (Zhang and Lipton, 1999) или замена глюкозы на ДГ (Tekkok et al., 1999) увеличивает [Ca2+]i в нервных клетках. Это увеличение [Ca2+]i предотвращалось блокаторами N-метил-D-аспартат-управляемых каналов, поэтому было сделано предположение о действии эндогенного глутамата (Глу) в данных экспериментальных условиях. Основываясь на этих результатах, можно было бы предположить, что в наших экспериментах митохондриальная деполяризация (МД), развивающаяся в результате замены глюкозы на ДГ, является следствием действия эндогенного глутамата. Однако мы не наблюдали увеличения [Ca2+]i во время инкубации клеток с ДГ, независимо от того, проводились ли измерения [Ca2+]i с помощью высокоаффинного красителя Fura-2 или низкоаффинного Fura-2FF. Кроме того, добавление в наружный раствор, содержащий ДГ, блокатора N-метил-D-аспартат-управляемых каналов мемантина (50мкМ;

5 экспериментов) или же уборка Са2+ из инкубационного раствора (4 эксперимента) не только не предотвратили, но даже не ослабили развития МД (не показано). Полученные данные говорят о том, что МД, развивающаяся в нейронах в отсутствии глюкозы, не может быть объяснена действием эндогенного Глу.

Известно, что ингибирование гликолиза, наряду с истощением внутриклеточного АТФ, приводит к прекращению синтеза одного из основных митохондриальных субстратов– пирувата (Ленинджер, 1976). Следовательно, одной из причин развития МД в отсутствии глюкозы может являться нарушение работы дыхательной цепи митохондрий в результате прекращения синтеза пирувата. Наши дальнейшие эксперименты (3 эксперимента) показали, что добавление к клеткам пирувата (5мМ) за 5 мин до замены глюкозы на ДГ предотвращает развитие МД (Рис. 1Б). Добавление пирувата в наружный раствор через 30 мин после замены глюкозы на ДГ приводило к восстановлению m (2 эксперимента, Рис. 1В).

Известно, что прекращение гликолитического синтеза АТФ приводит к накоплению АДФ в клетке, что, в свою очередь, может способствовать усилению митохондриального синтеза АТФ. Митохондриальный синтез АТФ сопряжен с потоком протонов через Fo-канал АТФсинтазы внутрь митохондрий, следовательно, еще одной причиной МД, развивающейся в результате замены глюкозы на ДГ, может быть деполяризующий поток протонов через Рис.2. Влияние олигомицина 4.0 FCCP на МД, вызываемую заменой m (Rh123, F 490 /F 0 ) олигомицин 3.5 глюкозы на ДГ. Олигомицин (2,5 мкг/мл) способствует 3.0 восстановлению m после 60 мин инкубации нейронов 2.5 с ДГ (10мМ). Кривая является усреднением по 2. клеткам.

1. 1.0 ДГ 0 15 30 45 60 Время (мин) митохондриальную мембрану в результате усиления митохондриального синтеза АТФ.

Действительно, мы обнаружили, что добавление в наружный раствор блокатора Fo субъединцы митохондриальной АТФ-синтазы олигомицина (2,5 мкг/мл) через 20 мин после удаления глюкозы из раствора приводит к восстановлению митохондриального потенциала во всех нейронах (8 экспериментов, не показано). Особенно впечатляющим оказался тот факт, что добавление олигомицина даже через 60 мин после замены глюкозы на ДГ также приводило к восстановлению потенциала митохондрий (3 эксперимента, Рис. 2). В покоящихся клетках, в которых идет митохондриальный синтез АТФ, олигомицин вызывает гиперполяризацию (см. выше). Восстановление м при действии олигомицина в наших экспериментах указывает на то, что, несмотря на блокаду гликолиза и, следовательно, прекращение синтеза пирувата, нейроны сохраняют способность продолжать митохондриальный синтез АТФ.

Таким образом, мы пришли к заключению, что МД, развивающаяся во время глюкозной депривации, может являться следствием ослабления дыхания из-за торможения синтеза пирувата, а также увеличения деполяризующего потока протонов через митохондриальную АТФ-синтазу в результате АДФ-зависимого усиления митохондриального синтеза АТФ.

2. Роль энергетического метаболизма в противодействии молодых нейронов глутаматному воздействию.

В соответствии с ранее полученными данными (см обзор Khodorov, 2004) мы обнаружили, что 15-мин воздействие Глу (100мкМ, 10 мкМ глицина в отсутствии ионов Mg2+) в большинстве молодых гранулярных нейронов мозжечка вызывает небольшой подъем [Ca2+]i, который сопровождается слабой МД (6 экспериментов, Рис. 3А). Отмывка Глу бескальциевым раствором (в присутствии 100мкМ EGTA) в этих клетках приводила к восстановлению как [Ca2+]i, так и m. Однако в некоторых клетках (Рис. 11Б) такое же Глу воздействие приводило к развитию вторичного подъема [Ca2+]i (отсроченная кальциевая дизрегуляция, ОКД), который сопровождался сильной МД (Рис. 3А). В этих нейронах после удаления Глу [Ca2+]i и МД по-прежнему держались на высоком уровне, наблюдалось постглутаматное кальциевое плато. В целом ряде работ показано, что в молодых нейронах мозжечка развитие второй фазы подъема [Ca2+]i в большинстве клеток происходит только после 20-60 мин Глу воздействия (Nicholls and Budd, 1996;

Вабниц и др., 2006).

Прежде всего, мы исследовали влияние ингибитора митохондриальной F1/Fo АТФсинтазы олигомицина на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу в молодых нейронах в присутствии глюкозы (3 эксперимента, рис. 3Б). В покоящихся клетках олигомицин вызывал слабую гиперполяризацию митохондрий. На фоне олигомицина Глу воздействие А FCCP [Ca2+]i (Fura-2FF, F340/F380) Глу 1.0 Глу FCCP 0. m (Rh-123, F490/F0) 3. 0. 3. 0. 2. 0. 0. 0 Ca2++EGTA 2. 0. 1. 0. 0.2 1. 0Ca2++EGTA 0. 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 Время (мин) Время (мин) Б Глу FCCP Глу FCCP 2. [Ca2+]i (Fura-2FF, F340/F380) 1. m (Rh-123, F490/F0) олигомицин олигомицин 2. 1. 0Ca2++EGTA 1. 1. 1. 1. 0. 0. 0Ca2++EGTA 0. 0 10 20 30 40 0 10 20 30 Время (мин) Время (мин) В FCCP Глу [Ca2+]i, (Fura-2FF, F340/F380) Глу 1. m (Rh-123, F490/F0) FCCP 1. 1. 1.4 1. 1.1 1. 1. 0. 0. 0. 0Ca2++EGTA 0Ca2++EGTA ДГ 0. ДГ 0. 0. 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 Время (мин) Время (мин) Рис.3 Изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу в молодых нейронах в присутствии метаболических ингибиторов. (А) В отсутствии ингибиторов Глу воздействие (0,1 мМ) в большинстве клеток приводит к небольшим обратимым подъемам [Ca2+]i и слабой МД.

(Б) Добавление олигомицина (2,5мкг/мл) в среду, содержащую глюкозу не влияет на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу. (В) В отсутствии глюкозы (60 мин предварительная инкубация с ДГ (10 мМ)) в ответ на Глу в клетках развивается ОКД, сопровождаемая сильной МД, и формируется кальциевое плато. Пунктиром выделены кривые, соответствующие изменениям [Ca2+]i и m в одной клетке.

приводило к небольшому подъему [Ca2+]i, который сопровождался очень слабой МД, причем после удаления Глу нейроны восстанавливали как [Ca2+]i, так и m. Таким образом, блокада Б А FCCP Глу Глу [Ca 2+ ]i (Fura-2FF, F 340 /F 380 ) FCCP 3. [Ca 2+ ] i (Fura-2FF, F 0 /F 380 ) 2. m (Rh-123, F 490 /F 0 ) m (Rh-123, F 490 /F 0 ) 1. 2.6 1. 2.2 1.4 m 2.2 1.9 1. 1. [Ca2+]i m 0. 1.8 2+ 1. [Ca ]i -Ca2++EGTA 1. 0. 1. -Ca2++EGTA 1. 0.2 ДГ 1. ДГ 1.0 0. 0 5 10 15 20 0 10 20 30 Время (мин) Время (мин) Рис.4 Изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу (0,1мМ) в молодых нейронах в безглюкозной среде. Предварительная инкубация с ДГ (10мМ) в течение 20 мин (А) и 90мин (Б). Во время фазы кратковременной реполяризации и восстановления [Ca2+]i m восстанавливается до уровня ниже, чем m до Глу воздействия (А, Б).

митохондриального синтеза АТФ не повлияла на изменения [Ca2+]i, и m, вызываемые Глу в молодых нейронах в присутствии глюкозы (сравнить Рис. 3А и Б). Эти данные согласуются с данными Budd and Nicholls (1996). Авторы показали, что олигомицин не влияет на время наступления ОКД в молодых гранулярных нейронах мозжечка крыс, подвергнутых длительному воздействию 100 мкМ Глу (Budd and Nicholls, 1996). Наши данные свидетельствует в пользу того, что в гранулярных нейронах мозжечка сильно развит гликолиз, который в отсутствии митохондриального синтеза АТФ может обеспечивать клетку АТФ, необходимым для поддержания кальциевого гомеостаза.

Инкубация молодых гранулярных нейронов в безглюкозной среде, содержащей ДГ (10мМ, 20-60 мин), привела к тому, что 15-мин воздействие Глу (100мкМ) вызывало в большинстве клеток двухфазный подъем [Ca2+]i, который сопровождался сильной двухфазной МД (37 экспериментов, рис. 3В, рис. 11Б). Наряду с нейронами, в которых наблюдались двухфазные изменения [Ca2+]i и m, были также клетки с монофазными ответами, в которых МД и [Ca2+]i сразу же поднимались до высокого уровня.

FCCP Глу Глу [Ca2+]i (Fura-2FF, F340/F380) 2. FCCP 0Ca2++EGTA 0Ca2++EGTA m (Rh-123, F490/F0) 0Ca2++EGTA 2. 1. 2. 1. 1. 1. 1. 1. 0Ca2++EGTA 0. 1. ДГ ДГ 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 Время (мин) Время (мин) Рис.5 Зависимость [Ca2+]i и m от уборки ионов Са2+ из внешнего раствора во время Глу воздействия. Уборка ионов Са2+ во время Глу воздействия (0,1мМ) приводит к восстановлению [Ca2+]i и m. После возвращения Са2+ в среду наблюдаются подъемы [Ca2+]i и m. Пунктиром выделены кривые, соответствующие изменениям [Ca2+]i и m в одной клетке.

В 50% нейронов с сильной МД между первичными и вторичными подъемами [Ca2+]i и МД наблюдалось временное восстановление как [Ca2+]i, так и m (Рис. 3В). Следует отметить, что в 20-29% нейронов (в зависимости от времени инкубации клеток в безглюкозной среде до Глу воздействия) восстановление m происходило до уровня, который был ниже, чем уровень m, наблюдаемый непосредственно перед Глу воздействием (Рис. 3В, рис. 4). Этот олигомицин-подобный эффект Глу (сравнить рис. 2 и рис. 4) можно было бы назвать гиперполяризацией, однако, учитывая тот факт, что сама инкубация нейронов в безглюкозной среде приводит к снижению m, можно говорить лишь о частичном восстановлении m. Действительно, проследив, как меняется во времени m после удаления глюкозы, и как впоследствии на него влияет Глу, мы обнаружили, что так называемая гиперполяризация является ни чем иным, как частичным восстановлением m (Рис. 4А). В большинстве клеток с двухфазными изменениями [Ca2+]i и m восстановление m между первой и второй фазой МД не было таким сильным, и m не достигал даже уровня, на котором он был до Глу воздействия (не показано).

Удаление из внешнего раствора ионов Са2+ (при продолжающемся действии Глу) через 3-5 мин после развития ОКД приводило к восстановлению как [Ca2+]i, так и m (Рис.

5). После возвращения ионов Са2+ во внешнюю среду наблюдалось сильное повышение [Ca2+]i и развитие МД (3 эксперимента). Подобная зависимость [Ca2+]i и m от уборки ионов Са2+ (или блокады NMDA-каналов) в начале второй фазы подъема [Ca2+]i характерна для зрелых (11 ДВК) нейронов гиппокампа (Vergun et al., 2001), а также для молодых нейронов мозжечка при 40-60 мин воздействии Глу (Вабниц и др., 2006). Необходимо отметить, что чувствительность вторичных подъемов [Ca2+]i и МД к удалению наружного Са2+ (или блокаде NMDA-каналов) не зависела от величины латентных периодов между первичными и вторичными подъемами [Ca2+]i и МД. Решающим фактором здесь являлась продолжительность высокого кальциевого плато, т.е. длительность кальциевой перегрузки нейрона перед удалением наружного Са2+. Так, в работе Вабниц и др. (2006) ОКД и сильная МД, развивающиеся через 20 мин Глу воздействия, были чувствительны к уборке наружного Са2+ из Глу-содержащего раствора также, как и вторичные подъемы [Ca2+]i и МД, развивающиеся в наших экспериментах в безглюкозной среде через 5 мин после добавления к клеткам Глу.

Однако через 15 мин после добавления к клеткам Глу вторичный подъем [Ca2+]i и сильная МД были уже нечувствительны к уборке Глу и ионов Са2+ из безглюкозного раствора. После удаления Глу большинство нейронов (Рис. 11Б) не могли восстановить ни m, ни [Ca2+]i – формировалось стойкое постглутаматное кальциевое плато. Устойчивость постглутаматного [Ca2+]i плато к удалению ионов Са2+ указывает на то, что кальциевая перегрузка происходит, в основном, из-за ингибирования механизмов, выводящих Са2+ из клетки (Khodorov et al., 1993).

Таким образом, в условиях глюкозной депривации в молодых клетках значительно ускоряется развитие ОКД и сильной МД в ответ на длительное Глу воздействие.

3. Влияние антиоксиданта MnTBAP на вызванные Глу нарушения кальциевого гомеостаза и митохондриальную дисфункцию нейронов, лишенных глюкозы.

В настоящее время широко распространено мнение, что реактивные формы кислорода (РФК) играют центральную роль в механизмах Глу нейротоксичности (см обзор Khodorov, 2004). Однако в различных моделях нейротоксичности на разных типах нейронов результаты действия одного и того же антиоксиданта MnTBAP были различны. Так, в работе Vergun et al. (2001) было показано, что MnTBAP не оказывает существенного влияния на развитие в зрелых гиппокампальных нейронах постглутаматного кальциевого плато и сильной МД в ответ на гиперстимуляцию Глу рецепторов. В то же время, Castilho et al.

(1999) в экспериментах на молодых гранулярных нейронах мозжечка обнаружили, что MnTBAP задерживает наступление ОКД, вызванной длительным Глу воздействием.

Учитывая эти противоречия, нами были проведены эксперименты с применением антиоксиданта MnTBAP (200мкМ). В наших опытах добавление в безглюкозную среду антиоксиданта не повлияло на развитие МД, вызываемой заменой глюкозы на ДГ ( Глу [Ca 2+ ]i (Fura-2FF, F340/F380) Глу FCCP 4. FCCP 1. 4.0 0Сa2++EGTA m (Rh-123, F490/F0) 3.5 1. 3. * 1. 2. 1. 2. 1.5 1. 0Сa2++EGTA ДГ 1. ДГ 0. MnTBAP 0. MnTBAP 0.0 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 Время (мин) Время (мин) Рис.6 Влияние антиоксиданта MnTBAP (200мкМ) на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые воздействием Глу (0,1мМ) на молодые нейроны в безглюкозной среде. (А) Присутствие MnTBAP в безглюкозной среде не предотвратило развития сильной МД, индуцированной Глу и формирования постглутаматного кальциевого плато. * постепенное снижение флуоресценции Rh-123 во время и после Глу воздействия отражает вытекание зонда из клеток (Ward et al., 2000), а не реполяризацию митохондрий.

эксперимента). MnTBAP также не оказал влияния на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу воздействием – наблюдались двухфазные подъемы [Ca2+]i и МД, причем после удаления Глу [Ca2+]i и МД оставались на высоком уровне (Рис. 6). Таким образом, можно предположить, что ускорение развития Глу-индуцированной ОКД во время глюкозной депривации не связано с гиперпродукцией РФК.

4. Влияние ингибитора NO-синтазы L-NAME на изменения [Ca2+]i и m, вызванные гиперстимуляцией глутаматных рецепторов в нейронах, лишенных глюкозы.

Наряду с генерацией РФК, гиперстимуляция Глу рецепторов приводит также к генерации NO··, который в результате взаимодействия с супероксид анионом превращается в пероксинитрит ONOO (Sattler et al., 1999;

обзор Khodorov, 2004). В работе Keelan et al. (1999) было показано, что ингибирование NO-синтазы с помощью L-NAME значительно уменьшает долю зрелых гиппокампальных нейронов, в которых в ответ на Глу развивается сильная МД FCCP FCCP Глу 1.8 Глу 3. [Ca 2+ ]i (Fura-2, F0/F380) m (Rh-123, F490/F0) 1. 3. 1. 2. 1. 2. 1.5 1. 0Са2++EGTA 1.0 0. 0Са2++EGTA L-NAME+ДГ L-NAME+ДГ 0.5 0. 0 10 20 30 40 0 10 20 30 Время (мин) Время (мин) Рис.7 Влияние игибитора NO-синтазы L-NAME (1мМ) на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые воздействием Глу (0,1мМ) на молодые нейроны в безглюкозной среде.

Присутствие L-NAME в безглюкозной среде не предотвратило развития сильной МД, индуцированной Глу и формирования постглутаматного кальциевого плато.

(Keelan et al., 1999). Учитывая эти данные, мы провели серию экспериментов, в которых все растворы наряду с ДГ содержали L-NAME (1мМ). Однако в отличие от Keelan (1999), мы не увидели влияния L-NAME на нарушение [Ca2+]i гомеостаза и митохондриальную дисфункцию нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов в условиях блокады гликолиза (6 экспериментов). Ингибитор NO-синтазы не предотвратил МД, вызываемой глюкозной депривацией, и не оказал заметного влияния на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые гиперстимуляцией Глу рецепторов (Рис. 7). По-прежнему во всех клетках в ответ на Глу развивались двухфазные подъемы [Ca2+]i и МД, а после удаления Глу наблюдалось постглутаматное [Ca2+]i - плато.

5. Влияние ингибиторов митохондриальной поры, циклоспорина А (ЦсА) и ионов Sr2+, на нарушение [Ca2+]i гомеостаза и митохондриальную дисфункцию нейронов, подвергнутых воздействию Глу в отсутствии глюкозы.

Одной из наиболее вероятных причин возникновения постглутаматного кальциевого плато и сильной МД в нейронах при гиперстимуляции Глу рецепторов считается открывание митохондриальной поры (МТП) (Vergun et al., 1999;

см. обзор Khodorov, 2004). Связывание АТФ с транслокатором адениновых нуклеотидов со стороны цитозоля способствует стабилизации поры в закрытом состоянии (Kristian et al., 2000), поэтому сильное падение АТФ в цитозоле при действии Глу в безглюкозной среде (см. рис. 12) будет облегчать открывание поры. Мы предположили, что глюкозная депривация ускоряет открывание МТП, и таким образом, ускоряет развитие ОКД в молодых нейронах. Доказательства участия поры в нарушениях кальциевого гомеостаза в основном базируются на эффекте неспецифических блокаторов порообразования - ЦсА и его аналога метил-валин-ЦсА. Однако данные, полученные с помощью этих веществ, противоречивы. Так, Vergun et al. (1999) показали, что применение блокаторов МТП ЦсА и метил-валин-ЦсА значительно замедляет или предотвращает развитие ОКД и сильной МД в зрелых гиппокампальных нейронах, подвергнутых длительному Глу воздействию. На основании этих данных авторами было высказано предположение, что открывание митохондриальной поры является, по крайней мере, одной из причин нарушения нейронального кальциевого гомеостаза при гиперстимуляции Глу рецепторов (см. также Alano et al., 2002). Однако в ряде работ защитный эффект ЦсА отсутствовал (Castilho et al., 1998;

Pivovarova et al., 2004;

Chinopoulos et al., 2004). Поэтому чтобы прояснить роль митохондриальной поры в нарушении кальциевого гомеостаза, вызванного Глу в молодых нейронах, лишенных глюкозы, наряду с ЦсА в наших экспериментах был использован также другой ингибитор поры – ионы Sr2+ (Hunter et al., 1976;

Bernardi et al., 1992). Ионы Sr2+ транспортируются в клетку теми же системами, что и Са2+, в частности, NMDA-каналами, Са2+/Н+-АТФазой и Na+/Са2+ обменником (Tsuzuki et al., 1994;

Bernardi, 1999;

Blaustein and Lederer, 1999). Накопление ионов Sr2+ в матриксе митохондрий не приводит к открыванию митохондриальной поры, более того, ионы Sr2+ в концентрациях, в 20 раз превышающих концентрацию Са2+, ингибируют открывание поры, вызванное ионами Са2+ (Hunter et al., 1976;

Bernardi et al., 1992).

Сначала мы исследовали, как в условиях глюкозной депривации влияет на развитие вызванных Глу ОКД и сильной МД ЦсА. Присутствие в безглюкозном растворе ЦсА (1мкМ или 0,5мкМ) не предотвратило развития МД после замены глюкозы на ДГ (Рис. 8А). ЦсА также не оказал никакого влияния на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые в клетках длительным Глу воздействием. Эффект ЦсА не наблюдался ни в экспериментах с 20 мин инкубацией нейронов с ДГ до Глу воздействия (Рис. 8А), ни в экспериментах с 60 мин инкубацией нейронов с ДГ (Рис. 8Б). Как и в контрольных экспериментах в большинстве нейронов (80%, 82 клетки) наблюдалось посглутаматное кальциевое плато, устойчивое к уборке ионов Са2+ и Глу, которое сопровождалось сильной МД (4 эксперимента, рис. 8). Как известно, защитный эффект ЦсА связан с увеличением пороговой концентрации Са2+, необходимой для открывания митохондриальной поры (Chalmers and Nicholls, 2003).

Поэтому можно предположить, что в наших экспериментах концентрация Са2+, накопленного в митохондриях во время Глу воздействия, превышала пороговое значение, необходимое для открывания поры, даже в присутствии ЦсА. Этому могло способствовать и то А Б [Ca 2+ ]i (Fura-2FF, F 340 /F 380 ) Глу FCCP FCCP Глу [Ca2+]i (Fura-2FF, F0/F380) 2.0 4. 3. 1. 3. 2. 1. 2. 0Ca2++EGTA 1. 0. 0Ca2++EGTA ДГ 1. циклоспорин А+ДГ циклоспорин А 0. 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 Время (мин) Время (мин) FCCP Глу FCCP Глу m (Rh-123, F490/F0) m (Rh-123, F490/F0) 3.5 1. циклоспорин А+ДГ 3. 1. 2. 2.0 1. 0Ca2++EGTA 1. 0. ДГ 1. 0Ca2++EGTA циклоспорин А 0.5 0. 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 30 Время (мин) Время (мин) Рис.8 Влияние ингибитора митохондриальной поры ЦсА на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу в молодых нейронах в безглюкозной среде. Присутствие в безглюкозной среде ЦсА (1мкМ) не влияет на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу в молодых нейронах. До добавления Глу нейроны инкубировали в безглюкозной среде, содержащей ДГ(10мМ) и ЦсА, в течение 20 мин (А) или 60 мин (Б).

обстоятельство, что в отсутствии гликолиза снижается количество АТФ, необходимое для работы плазматической Са2+/Н+-АТФазы, а следовательно, насос выкачивает меньше Са2+ из цитозоля, и большее количество Са2+ захватывается митохондриями во время Глу воздействия. Другим возможным объяснением отсутствия эффекта ЦсА может являться открывание ионами Са2+ пор, нечувствительных к ЦсА. В этом случае, если большая часть пор, открываемых Са2+, является не чувствительной к ЦсА, то мы не будем наблюдать эффект ингибитора (см. обзор Khodorov, 2004).

Далее мы исследовали влияние замены Са2+/Sr2+ на развитие ОКД и МД при Глу воздействии в условиях глюкозной депривации. Замена ионов Са2+ на ионы Sr2+ не повлияла на МД, которая развивалась после замены глюкозы на ДГ (Рис. 9). В присутствии ионов Sr2+ в безглюкозной среде, как и в Са2+-содержащей среде (Рис. 3В), 15 мин Глу воздействие вызывало в большинстве клеток (80%, 109 клеток) двухфазный подъем [Sr2+]i и сильную МД (3 эксперимента, рис. 9). Таким образом, присутствие в безглюкозной среде Sr2+, который не открывает пору, не предотвращало ускорения развития ОКД в молодых нейронах. Недавно было показано, что изменения [Sr2+]i и m, вызываемые Глу в молодых гранулярных нейронах мозжечка в присутствии глюкозы не отличаются от изменений в Са2+-содержащей среде (Wabnitz et al, 2005). Поскольку Sr2+ не открывает поры (Bernardi et al., 1992), авторы заключили, что в молодых гранулярных нейронах в присутствии глюкозы в Са2+-содержащей среде открывание МТП не является обязательным условием развития ОКД и сильной МД, вызываемой Глу.

Мы показали, что замена глюкозы на ДГ даже в присутствии ионов Sr2+ ускоряет развитие вторичных подъемов [Sr2+]i и сильной МД, вызываемых Глу воздействием (Рис. 9).

FCCP Глу Глу [Sr2+]i (Fura-2FF, F340/F380) 4. FCCP 1. m (Rh-123, F490/F0) 4. 0. 3. 0. 0.7 3. 0.6 2. 0.5 2. 0Sr2++EGTA 0.4 2+ 0Sr +EGTA 1. ДГ 0. ДГ 1. 2+ 0. Sr 2+ Sr 0. 0. 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 Время (мин) Время (мин) Рис.9 Изменения [Sr2+]i и m, вызываемые Глу (0,1мМ) в молодых нейронах в безглюкозной среде при замене ионов Са2+ на ионы Sr2+. Замена Са2+/Sr2+ не предотвратила ускорения в развитии вторичного подъема [Sr2+]i и сильной МД в нейронах, подвергнутых Глу воздействию.

Поскольку Sr2+ не открывает пору, то эффект ДГ в присутствии Sr2+ (т.е. уменьшение латентных периодов между первой и второй фазами клеточного ответа при Глу воздействии в безглюкозной среде по сравнению со средой, содержащей глюкозу) нельзя объяснить ускорением открывания поры из-за падения АТФ.

6. Влияние Na+/Li+ замены на глутаматные ответы нейронов, находящихся в безглюкозной среде.

Глу воздействие на нейроны приводит не только к увеличению [Ca2+]i, но и к увеличению внутриклеточной концентрации Na+ (Pinelis et al., 1994;

Kiedrowski, 1994).

Основным механизмом, восстанавливающим концентрацию Na+ в клетке в нормальных условиях является Na+/К+-АТФаза. Однако в условиях глюкозной депривации происходит сильное падение АТФ в клетке, и это может привести к нарушению работы насоса. В этом случае можно ожидать, что удаление ионов Na+ из клетки будет осуществляться Na+/Ca2+ обменником плазматической мембраны, что может привести к дополнительному входу Са2+ в нейроны, и таким образом, ускорить развитие ОКД при Глу воздействии. Чтобы выяснить, какую роль играет Na+/Ca2+ обменник в развитии ОКД и сильной МД, вызываемых воздействием Глу на молодые нейроны в безглюкозной среде, мы заблокировали обменник, заменив во всех растворах ионы Na+ на ионы Li+. Необходимо отметить, что Na+/Li+ замена производилась еще до Глу воздействия, ионы Li+ присутствовали в безглюкозном растворе, в котором клетки инкубировались до добавления Глу. При такой постановке экспериментов по Глу каналам в клетку поступал Li+, а не Na+, поэтому Na+/Li+ замена ингибировала оба режима работы Na+/Ca2+-обменника.

На рис. 10А представлены изменения [Ca2+]i и m в ответ на применение Глу в безглюкозной среде, содержащей ионы Li+ вместо ионов Na+. В присутствии Li+ значительно уменьшилось количество вторичных подъемов [Ca2+]i в ответ на 15-мин аппликацию Глу.

Так, в контроле в присутствии Na+ вторые фазы развивались в 88% клеток (n= эксперимента, 87 клеток), в то время как в безглюкозной среде, содержащей Li+, количество вторичных подъемов [Ca2+]i в ответ на Глу уменьшилось до 14% (n=3 эксперимента, клетки) (Рис. 10Б). Исходя из полученных данных, можно предположить, что во время Глу воздействия в безглюкозной среде Na+/Ca2+ обменник работает в реверсивном режиме и вносит вклад в развитие ОКД и сильной МД.

Защитный эффект Li+ можно объяснить тем, что он уменьшает накопление Са2+, вызванное воздействием на нейроны N-метил-D-аспартатом (Kiedrowski, 1999;

Czyz and Kiedrowski, 2002). Так, Li+ может уменьшать количество Са2+, входящего в клетку, путем непосредственного влияния на ионные токи через N-метил-D-аспартат-управляемые каналы (Tsuzuki et al., 1994;

Karkanias and Parke, 1999). Однако в работе Khodorov et al. (1999) 1 мин воздействие 100 мкМ Глу на гранулярные нейроны мозжечка в Li+-содержащей среде приводило к такому же подъему [Ca2+]i как и в Na+-содержащей среде, что свидетельствует против предположения о том, что в гранулярных нейронах мозжечка Na+/Li+ замена существенно уменьшает ток Са2+через N-метил-D-аспартат-управляемые каналы. В наших экспериментах мы также не наблюдали уменьшения первичного подъема [Ca2+]i в ответ на Глу в Li+-содержащей безглюкозной среде по сравнению с Na+-содержащей безглюкозной средой (сравнить рис. 3В и рис. 10А).

Второй механизм, посредством которого ионы Li+ могут уменьшать количество Са2+, входящего в клетку при Глу воздействии, это влияние ионов Li+ на работу Nа+/Ca2+ обменника плазматической мембраны. Как уже говорилось выше, в Nа+-содержащем растворе воздействие Глу повышает концентрацию Nа+ в цитозоле (Pinelis et al., 1994;

Kiedrowski, 1994). В отсутствии глюкозы накоплению Nа+ может способствовать также снижение активности Nа+/К+-АТФазы из-за остановки гликолитического синтеза АТФ.

Накопление Nа+ в цитозоле и деполяризация мембраны способствуют реверсии Nа+/Ca2+ обменника: удалению ионов Nа+ и транспорту ионов Ca2+ в клетку (Blaustein and Lederer, 1999). Следовательно, во время глутаматного воздействия помимо NMDA-каналов появляется еще один источник Са2+, что должно способствовать возникновению вторичных кальциевых подъемов в нейронах (Tymianski et al., 1993). Ионы Li+ не транспортируются Nа+/Ca2+ обменником, поэтому замена ионов Nа+ на Li+ может уменьшать количество Са2+, поступающего в клетку, и следовательно уменьшать вероятность развития ОКД, что мы и наблюдали в наших экспериментах. В пользу нашего предположения об уменьшении ионами Li+ входящего потока Са2+ через Nа+/Ca2+ обменник, а не на N-метил-D-аспартат управляемые каналы, говорят также данные полученные в группе Kiedrowski. Авторы показали, что к уменьшению накопления 45Са2+ во время действия N-метил-D-аспартата приводит замена ионов Nа+ на ионы Cs+, которые, в отличие, от Li+ не влияют на ионные А Б FCCP [Ca2+]i (Fura-2FF, F340/F380) 1.0 Глу 0. % клеток 0. 0. 0. 0Са 2++EGTA ДГ-Na ++Li+ Na+-содержащая Li+-содержащая 0 10 20 30 40 среда среда Время (мин) Рис. 10 Влияние замены Na+/Li+ на FCCP Глу изменения [Ca2+]i и m, вызываемые 15 2. m (Rh-123, F490/F0) мин воздействием Глу (0,1мМ) в 2. молодых нейронах в безглюкозной среде.

(А) Замена Na+/Li+ в большинстве клеток 1. предотвратила вызванное Глу развитие сильной МД и формирование 1. кальциевого плато в молодых нейронах, 0Са 2++EGTA лишенных глюкозы. (Б) Процент клеток, ДГ-Na ++Li+ 0. в которых в ответ на Глу в безглюкозной 0 10 20 30 40 Li+-содержащей среде развивались ОКД Время (мин) и сильная МД.

токи через N-метил-D-аспартат-управляемые каналы, но, как и Li+, не транспортируются Nа+/Ca2+ обменником (Czyz et al., 2002).

Защитный эффект Li+, обнаруженный в наших экспериментах, может быть также обусловлен тем, что литий сохраняет уровень АТФ при Глу воздействии в безглюкозной среде. Так, в Li+-содержащей среде уровень АТФ после 20-мин инкубации нейронов с ДГ и последующего 10-мин воздействия Глу был в 2 раза выше, чем в Nа+-содержащей среде (не показано).

Таким образом, мы предположили, что наблюдаемый нами защитный эффект Li+ обусловлен способностью Li+ сохранять уровень АТФ и уменьшать количество Са2+, входящего в клетку во время воздействия Глу. Последнее, однако, происходит не в результате уменьшения ионных токов через N-метил-D-аспартат-управляемые каналы каналы (хотя нельзя полностью исключить, что это тоже вносит свой вклад в эффект Li+), а вследствие влияния Na+/Li+ замены на работу Nа+/Ca2+ обменника. Необходимо отметить, что наши данные находятся в противоречии с данными, полученными Bano et al. (2005). Авторы обнаружили, что расщепление Na+/Ca2+ обменника протеазами является основной причиной нарушения кальциевого гомеостаза нейронов мозжечка при гиперстимуляции Глу рецепторов. В отличие от этой работы, мы показали, что в условиях глюкозной депривации блокада Nа+/Ca2+ обменника предотвращает развитие ОКД и сильной МД, вызванных Глу.

А Б FCCP [Ca2+]i (Fura-2FF,F340/F380) 4.0 Глу 0Ca 2+ +EGTA 3. % клеток 2.6 1.9 1. ДГ+пируват 0. ДГ контроль ДГ 0 5 10 15 20 пируват Время (мин) Глу FCCP 3. m (Rh-123, F490/F0) 2. 2. 1. 1. 0Ca 2+ +EGTA ДГ+пируват 0 5 10 15 Время (мин) Рис. 11 Влияние пирувата на изменения [Ca2+]i и m, вызываемые Глу в молодых нейронах в безглюкозной среде. До добавления Глу (0,1мМ) нейроны инкубировали в течение 60 мин в безглюкозной среде, содержащей ДГ (10мМ) и пируват (5мМ). (А) Присутствие пирувата в безглюкозной среде предотвращает индуцированное Глу развитие сильной МД и формирование кальциевого плато в молодых нейронах. (Б) Процент клеток, в которых в ответ на Глу наблюдались кальциевое плато и сильная МД в контроле, в безглюкозной среде, содержащей ДГ (10мМ, инкубация 60 мин), и в присутствии пирувата в безглюкозной среде (инкубация с ДГ+пируват 60 мин).

7. Влияние пирувата на вызываемые Глу изменения [Ca2+]i и m в молодых нейронах, лишенных глюкозы.

Как уже говорилось выше, наряду с истощением АТФ, блокада гликолиза приводит к прекращению синтеза пирувата, который является одним из основных субстратов для митохондрий. В этой серии экспериментов была предпринята попытка поддержать нормальное функционирование клеток в отсутствии глюкозы путем добавления к ним пирувата. Наличие в безглюкозной среде пирувата значительно повлияло на вызываемые Глу изменения [Ca2+]i и m (Рис. 11), однако эффект пирувата сильно зависел от времени инкубации клеток с ДГ и пируватом.

Так, в серии экспериментов, где до Глу воздействия нейроны находились 20 мин в безглюкозной среде, содержащей пируват, лишь 52% нейронов (6 экспериментов) смогли восстановить [Ca2+]i после 15-мин Глу воздействия, т.е. вели себя как молодые клетки, находящиеся в среде с глюкозой. В остальных 48% нейронов в ответ на Глу развивались 1 1 [АТФ], % от контроля Контроль олигомицин ДГ(30мин) ДГ(60мин) Глу Глу олигомицин+ ДГ(30мин)+Глу ДГ(60мин)+Глу Рис. 12. Влияние ингибиторов энергетического метаболизма на уровень АТФ в покое и после воздействия Глу. Олигомицин-[АТФ], измеренное после 10 мин воздействия олигомицина (2,5 мкг/мл). ДГ(30мин)-[АТФ], измеренное после 30мин инкубации нейронов с ДГ(10мМ). ДГ(60мин)-[АТФ], измеренное после 60мин инкубации нейронов с ДГ(10мМ). Глу-[АТФ], измеренное после 10 мин воздействия Глу (0,1мМ).

Олигомицин+Глу-[АТФ], измеренное после 10 мин воздействия олигомицина и Глу(0,1мМ). ДГ(30мин)+Глу-[АТФ], измеренное после 20мин инкубации нейронов с ДГ(10мМ) и последующего добавления на 10 мин в безглюкозную среду Глу.

ДГ(60мин)+Глу-[АТФ], измеренное после 50мин инкубации нейронов с ДГ(10мМ) и последующего добавления на 10 мин в безглюкозную среду Глу.

двухфазные изменения [Ca2+]i и m и наблюдалось постглутаматное кальциевое плато, как в контрольных экспериментах в безглюкозной среде (не показано).

Однако, в экспериментах (4 эксперимента), в которых предварительная инкубация нейронов в безглюкозной среде, содержащей пируват (5мМ), длилась 60 мин, в ответ на последующее 15-мин Глу воздействие в большинстве клеток наблюдались лишь небольшие подъемы [Ca2+]i, которые сопровождались слабой МД. После удаления Глу [Ca2+]i и m возвращались к базальному уровню (Рис. 11А). Таким образом, в присутствии пирувата в безглюкозной среде длительное Глу воздействие приводило к изменениям [Ca2+]i и m, характерным для молодых клеток, находящихся в среде с глюкозой (сравнить рис. 11А и рис.

3А).

Защитный эффект пирувата может быть обусловлен (1) поддержанием m на высоком уровне, необходимом для осуществления электрофоретического захвата ионов Са2+ митохондриями, (2) поддержанием митохондриального синтеза АТФ и (3) способностью пирувата взаимодействовать с перекисью водорода.

Ранее было показано, что пируват защищает нейроны от гибели, вызванной перекисью водорода (Desagher et al., 1997;

Nakamichi et al., 2005). Известно, что Глу воздействие приводит к производству реактивных форм кислорода (Dugan et al., 1995;

Atlante et al., 2000). Однако в наших экспериментах защитный эффект пирувата, по-видимому, не был связан с его антиоксидантными свойствами, поскольку антиоксидант MnTBAP, который защищает клетки от перекиси, не оказал влияния на нарушение кальциевого гомеостаза при Глу воздействии в безглюкозной среде (Рис. 6).

В ряде работ защитный эффект пирувата был объяснен его способностью поддерживать уровень АТФ в нейронах (Maus et al., 1999;

Vergun et al., 2003). Поэтому в следующей серии экспериментов мы провели измерения внутриклеточного содержания АТФ в нейронах при воздействии Глу, ДГ, олигомицина и пирувата.

8. Изменения внутриклеточного содержания АТФ при воздействии на нейроны ДГ, олигомицина, Глу и пирувата.

Параллельно с исследованием изменений [Ca2+]i и m при Глу воздействии в условиях глюкозной депривации, были проведены измерения внутриклеточного содержания АТФ ([АТФ]) при воздействии Глу, олигомицина, ДГ, и пирувата. Измерения проводились с помощью двух методов: на гранулярных нейронах мозжечка было измерено [АТФ] в клеточных лизатах с помощью люциферин-люциферазной системы, а на кортикальных нейронах, трансфецированных люциферазой, была прослежена динамика изменения содержания АТФ отдельно в цитозоле (АТФц) и митохондриях (АТФм).

8.1 Изменения [АТФ] и АТФц при воздействии олигомицина и ДГ.

Прежде всего, мы исследовали, как изменяется [АТФ] при воздействии на нейроны ингибиторов синтеза АТФ: олигомицина и ДГ. Как видно из рисунка 12, 10-мин воздействие на нейроны олигомицина не изменило [АТФ] (3 эксперимента). Основываясь на этих данных, можно сделать предположение о том, что гликолиз в молодых нейронах мозжечка способен полностью компенсировать недостаток АТФ, вызванный ингибированием митохондриального синтеза АТФ. В отличие от блокады митохондриального синтеза АТФ инкубация клеток в безглюкозной среде, содержащей ДГ, в течение 30 мин и 60 мин уменьшила [АТФ] до 55±8% и 32±5% от [АТФ] в покоящихся клетках, соответственно ( эксперимента) (Рис. 12). Необходимо отметить, что инкубация нейронов с ДГ не сопровождалась увеличением [Ca2+]i (Рис. 4А), поэтому падение [АТФ], вызванное ДГ, нельзя объяснить увеличением [Ca2+]i. По всей видимости, это падение [АТФ] обусловлено потреблением АТФ различными внутриклеточными процессами в условиях блокады гликолитического синтеза АТФ.

Чтобы проследить, как изменяется уровень АТФ в цитозоле в первые минуты воздействия ДГ, мы использовали кортикальные нейроны, трансфецированные люциферазой. Как видно из рисунка 13, падение АТФ в цитозоле начинается сразу же после замены глюкозы на ДГ.

Первое резкое увеличение люминесценции на графике соответствует моменту добавления в систему люциферина (20 мкМ).

8.2 Изменения [АТФ], АТФц и АТФм при Глу воздействии.

Далее мы исследовали, как изменяется при воздействии Глу [АТФ] в гранулярных нейронах мозжечка, а также АТФц и АТФм в кортикальных нейронах. В соответствии с ранее полученными данными (см. обзор Khodorov, 2004), воздействие на гранулярные нейроны мозжечка Глу в течение 10 мин приводило к падению [АТФ] до 61±3% от контрольной величины. Мы также провели серию опытов на кортикальных нейронах, трансфецированных люциферазой, экспрессированной в цитозоле (cytoLuc) и в митохондриях (mitoLuc). Это позволило нам проследить динамику изменения АТФ при Глу воздействии отдельно в цитозоле (АТФц) и в митохондриях (АТФм). Кортикальные нейроны Люминесценция cytoLuc, имп/сек Глу ДГ 0 5 10 15 20 25 Время (мин) Рис. 13 Изменения АТФц при действии ДГ (10мМ) и Глу (0,1мМ). Замена глюкозы на ДГ приводит к снижению АТФц, которое усиливается при последующем добавлении Глу.

CytoLuc - люцифераза, экспрессируемая в цитозоле.

были выбраны из-за технических трудностей, связанных с трансфекцией гранулярных нейронов мозжечка.

На рисунке 14 представлены изменения АТФц и АТФм, вызванные добавлением к клеткам Глу. Первое резкое увеличение люминесценции на графиках соответствует моменту А Б Люминесценция cytoLuc, имп/сек Люминесценция mitoLuc, имп/сек Глу 2500 Глу 0Ca2++EGTA 0Ca2++EGTA 0 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Время (мин) Время (мин) В Люминесценция mitoLuc, имп/сек Рис. 14 Изменения внутриклеточного АТФ.

Глу воздействие (0,1мМ) приводит к олигомицин падению АТФ как в цитозоле (А), так и в Глу митохондриальном матриксе (Б). В присутствии олигомицина (2,5мкг/мл) Глу вызывает падение АТФ в митохондриях (В). cytoLuc - люцифераза, экспрессируемая в цитозоле. mitoLuc люцифераза, экспрессируемая в митохондриальном матриксе.

0 2 4 6 8 10 12 Время (мин) добавления в систему люциферина (20 мкМ). Добавление Глу к клеткам вызывало снижение АТФц до 67±5% от уровня АТФц в контроле (9 экспериментов) и падение АТФм до 50±8% (8 экспериментов) (рис. 14А, Б). Как видно из рисунка, падение АТФц и АТФм происходило уже в течение первых 2 мин с момента попадания Глу к клеткам. Отмывка Глу бескальциевым раствором, содержащим EGTA (0,25 мМ), привела к слабому восстановлению как АТФц, так и АТФм (Рис. 14А, Б).

Уменьшение АТФм в результате Глу воздействия может быть связано с активацией Са2+/Н+-АТФазы и Na+/К+-АТФазы плазматической мембраны и последующим перераспределением АТФ между цитозолем и митохондриями, или с блокадой ионами Са2+ митохондриального синтеза АТФ. Чтобы выяснить причину падения АТФм при Глу воздействии, нейроны до добавления Глу 20 мин инкубировались с олигомицином, блокирующим митохондриальную АТФсинтазу. Однако ингибирование этого фермента не предотвратило падения АТФм, возникающего после добавления к клеткам Глу (Рис. 14В).

Следовательно, падение АТФм при Глу воздействии нельзя объяснить блокадой митохондриального синтеза АТФ ионами Са2+. На основании полученных данных мы заключили, что падение АТФм во время Глу воздействия является отражением падения АТФц.

8.3 Изменения [АТФ] при воздействии Глу в присутствии олигомицина и ДГ.

Далее мы исследовали, как меняется [АТФ] в гранулярных нейронах мозжечка при одновременном воздействии на клетки олигомицина и Глу, а также ДГ (30- и 60-мин инкубация) и Глу. Мы обнаружили, что блокада митохондриального синтеза АТФ олигомицином не влияет на падение [АТФ], вызываемое Глу (2 эксперимента). Так, после 5 мин инкубации нейронов с олигомицином последующее добавление Глу снижало [АТФ] до 65±5% от [АТФ] в покоящихся клетках, что не составляет достоверного различия с [АТФ] после Глу воздействия в отсутствии олигомицина (Рис. 12). Таким образом, блокада митохондриального синтеза АТФ в молодых нейронах мозжечка не влияет на падение [АТФ], вызываемое Глу, а также на изменения [Ca2+]i и m, происходящие при гиперстимуляции Глу рецепторов. На основании этих данных можно заключить, что гликолиз в молодых клетках способен полностью компенсировать недостаток [АТФ], возникающий при блокаде митохондриального синтеза АТФ и последующем Глу воздействии.

В отличие от олигомицина, ДГ значительно усиливала падение [АТФ], вызываемое Глу. На рисунке 12 представлены данные по измерению [АТФ] после инкубации клеток с ДГ и последующего добавления Глу. Как видно из рисунка, падение [АТФ] после 20-мин инкубации нейронов с ДГ и последующего 10-мин Глу воздействия в безглюкозной среде составляло 34±10% от [АТФ] в покоящихся клетках. Эта величина достоверно отличается от [АТФ], измеренного после Глу воздействия в присутствии глюкозы. После 50-мин инкубации клеток с ДГ и последующего 10-мин Глу воздействия [АТФ] составляло 11±2% от [АТФ] в покое.

Необходимо отметить, что в цитозоле замена глюкозы на ДГ также усиливала падение АТФ, вызываемое Глу (Рис. 13).

8.4 Влияние пирувата на изменения [АТФ], вызываемые Глу в условиях глюкозной депривации.

Наконец, последняя серия экспериментов по измерению [АТФ] при Глу воздействии в безглюкозной среде была проведена в присутствии пирувата (4 эксперимента).

Как говорилось выше, после 60-мин инкубации нейронов в буфере, содержащем ДГ, [АТФ] составлял 32±5% от [АТФ] в покоящихся клетках. Такое низкое [АТФ] уменьшалось еще в большей мере при последующем 10-мин воздействии Глу (100 мкМ, 10 мин) и составляло всего 11±2% от контрольной величины (Рис.12, 15). Если во время 60-мин инкубации нейронов с ДГ в растворе присутствовал пируват, то [АТФ], измеренное после добавления к этим клеткам Глу, было выше, чем в отсутствии пирувата, и составляло 18±2% от [АТФ] в контроле (р0.05) (Рис. 15). Это повышение [АТФ] (ДГ+пируват+Глу) по сравнению с [АТФ] (ДГ+Глу) может быть связано с тем, что после 60 мин инкубации клеток в безглюкозной среде, содержащей пируват, [АТФ] было почти в 2 раза выше, чем после инкубации нейронов с ДГ в отсутствии пирувата (Рис. 15). Таким образом, [АТФ] к моменту добавления к клеткам Глу был выше в присутствии пирувата, и поэтому после Глу воздействия в присутствии пирувата [АТФ] был выше.

Как говорилось ранее, даже 20-30 мин инкубация гранулярных нейронов с ДГ приводила к ускорению нарушения кальциевого гомеостаза и сильной МД при Глу воздействии. Мы обнаружили, что [АТФ] после 20 мин инкубации нейронов с ДГ и последующего 10-мин воздействия Глу (ДГ(30 мин)+Глу) не отличается (р0,05) от [АТФ], которое мы наблюдали после 50мин инкубации клеток с ДГ и пируватом и последующего воздействия на клетки Глу (ДГ(60мин)+Глу+пируват) (Рис. 15). Таким образом, при достоверно не отличающемся уровне [АТФ] в нейронах, мы наблюдали различные изменения [Ca2+]i и m при Глу воздействии - постглутаматное [Ca2+]i-плато и сильную МД после воздействия ДГ (20 мин)+Глу, и небольшой обратимый подъем [Ca2+]i после воздействия ДГ(60мин)+пируват +Глу (сравните рис. 4А и рис. 11А). Это свидетельствует в пользу того, что защитный эффект пирувата не может быть объяснен только поддержанием митохондриального синтеза АТФ, а, по всей видимости, обусловлен поддержанием высокого [АТФ], % от контроля 70 р0, р0. р0. ДГ(60мин)+Глу ДГ(30мин)+Глу ДГ+пируват ДГ(60мин) +пируват ДГ(60мин)+Глу Контроль Глу Рис. 15. Изменения [АТФ], вызванные действием Глу (0,1мМ) в безглюкозной среде, содержащей ДГ (10мМ), а также одновременно ДГ и пируват (5мМ). Контроль - [АТФ], измеренное после 60 мин инкубации нейронов в буфере, содержащем глюкозу. Глу [АТФ], измеренное после 10 мин воздействия Глу в присутствии глюкозы. ДГ(60мин) [АТФ], измеренное после 60 мин инкубации нейронов с ДГ. ДГ(60мин)+Глу - [АТФ], измеренное после 50 мин инкубации нейронов с ДГ и последующего добавления в безглюкозную среду на 10 мин Глу. ДГ(60мин)+Глу+пируват - [АТФ], измеренное после 50 мин инкубации нейронов с ДГ и пируватом с последующим добавлением в безглюкозную среду, содержащую пируват, Глу на 10 мин. ДГ(30мин)+Глу - [АТФ], измеренное после 20 мин инкубации нейронов с ДГ и последующего добавления в безглюкозную среду на 10 мин Глу. ДГ+пируват - [АТФ], измеренное после 60 мин инкубации нейронов в безглюкозной среде, содержащей ДГ и пируват. На рисунке представлены усредненные данные по 4 экспериментам.

m и, соответственно, электрофоретического захвата Са2+ митохондриями.

На основании полученных нами данных были сформулированы следующие выводы.

ВЫВОДЫ 1. В молодых гранулярных нейронах мозжечка ингибирование гликолиза путем замены глюкозы на 2-деокси-D-глюкозу (глюкозная депривация), вызывает медленно развивающуюся митохондриальную деполяризацию (МД), которая устойчива к удалению наружного Са2+ и блокаде глутамат-активируемых каналов. На основании этих данных сделано заключение, что наблюдаемая МД не является следствием выделения эндогенного глутамата из нейронов или глиальных клеток.

2. МД, вызываемая глюкозной депривацией, подавляется олигомицином и предотвращается добавлением в безглюкозную среду пирувата. Следовательно, МД обусловлена АДФ-зависимым усилением потока протонов через митохондриальную АТФ-синтазу на фоне ослабления дыхания.

3. Блокада митохондриального синтеза АТФ олигомицином не ускоряет развития отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) и сильной МД, возникающих при глутаматном воздействии, а также не усиливает падения внутриклеточного АТФ, вызванного глутаматом. На основании этих данных сделано заключение, что в молодых нейронах нормального функционирования гликолиза достаточно для противодействия клетки нарушениям кальциевого гомеостаза при глутаматном воздействии.

4. В условиях глюкозной депривации в молодых нейронах значительно ускоряется развитие ОКД и сильной МД в ответ на глутаматное воздействие: МД и ОКД возникают в первые минуты Глу воздействия, как это происходит в зрелых клетках.

5. Антиоксидант MnTBAP и блокатор NO-синтазы L-NAME не оказывают заметного влияния на индуцированные глутаматом изменения [Ca2+]i и митохондриального потенциала в молодых нейронах, лишенных глюкозы. Следовательно, эффекты глюкозной депривации (ускорение развития ОКД и сильной МД во время Глу воздействия) не могут быть объяснены гиперпродукцией реактивных форм кислорода и NO· во время глутаматного воздействия.

Замена Са2+ на антагонист митохондриальной поры - ионы Sr2+ - не предотвращает 6.

быстрого развития вторичной МД, вызванной Глу воздействием в безглюкозной среде. На основании этих данных сделано заключение, что ускорение развития ОКД и сильной МД во время Глу воздействия не может быть объяснено ускорением открывания митохондриальной поры вследствие быстрого падения АТФ во время глюкозной депривации.

Ингибирование Na+/Ca2+-обменника с помощью замены ионов Na+ на ионы Li+ в 7.

безглюкозном растворе резко уменьшает число нейронов, в которых в ответ на 15-мин глутаматное воздействие возникает ОКД и сильная МД. Следовательно, в условиях глюкозной депривации реверсия Na+/Ca2+-обмена во время глутаматного воздействия вносит существенный вклад в нарушение кальциевого гомеостаза, вызываемое глутаматом.

8. Добавление пирувата в безглюкозную среду резко уменьшает или полностью устраняет ускорение развития ОКД и сильной МД во время глутаматного воздействия. Пируват не способен сильно увеличить уровень АТФ при действии глутамата в безглюкозной среде.

9. Сопоставление влияния пирувата на вызванные глутаматом изменения кальциевого гомеостаза и внутриклеточного АТФ в безглюкозной среде позволяет заключить, что защитный эффект пирувата обусловлен его способностью поддерживать генерацию митохондриального потенциала, необходимого как для электрофоретического захвата Са2+ митохондриями, так и для синтеза АТФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Михайлова М.М., Большаков А.П., Сурин А.М., Пинелис В.Г. Ходоров Б.И. (2003).

Снижение устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в отсутствии глюкозы. Биологические Мембраны, 20: 446-448.

2. Bolshakov A.P., Mikhailova M.M., Jurevicius A., Surin A.M., Pinelis V.G., Khodorov B.I.

(2003). Contribution of Ca2+ and Na+ to glutamate-induced mitochondrial depolarization in cerebellar granule cells. Биологические Мембраны, 20: 443-445.

3. Сурин А.М., Большаков А.П., Михайлова М.М., Сорокина Е.Г., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. (2006). Арахидоновая кислота усиливает рост концентрации Са2+ и митохондриальную деполяризацию, вызванные глутаматом в гранулярных нейронах мозжечка. Биохимия, 71(8): 1066-73.

4. Сурин А.М., Сторожевых Т.П., Сорокина Е.Г., Юрявичюс А.И., Большаков А.П., Михайлова М.М., Винская Н.П., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Исследование механизмов митохондриальной деполяризации нейрона при действии глутамата.

Тезисы научных докладов III Съезда Биохимического Общества. Санкт-Петербург, июня - 01 июля 2002, с.267-268.

5. Khodorov B., Surin A., Bolshakov A., Mikhailova M., Storozhevykh T., Jurevicius A., Sorokina E., Vinskaya N., Pinelis V. Prolonged glucose deprivation causes dramatic changes in [Са2+]i and mitochondrial responses to a toxic Glu challenge in young cerebellar granule cells (CGC). The Physiological Society Meeting, London-2002. J. Physiology 547P: PC23.

6. Ходоров Б.И., Вабниц А.В., Михайлова М.М., Большаков А.П., Сорокина Е.Г., Сурин А.М., Пинелис В.Г. О природе отсроченных нарушений кальциевого гомеостаза нейрона при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 146.

7. Pinelis V., Storozhevykh T., Sorokina E., Mikhailova M., Bolshakov A., Surin A., Khodorov B. Oligomycin as a tool for the study of Ca2+ homeostasis deterioration in glutamate-treated cultured neurons. 48th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, February 2004, 1401-pos/B386.

8. Пинелис В.Г., Сторожевых Т.П., Сурин А.М., Cенилова Я. Е., Михайлова М.М., Вабниц А.В., Ходоров Б.И. Механизмы стойкого повышения [Ca2+]i в нейронах, вызванного разобщителем митохондрий в постглутаматный период. Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 141.

9. Сурин А.М., Большаков А.П., Михайлова М.М., Cенилова Я. Е., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г. Влияние арахидоновой кислоты на индуцированные глутаматом изменения Ca2+ и митохондриального потенциала в культивируемых нейронах.

Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 144.

10. Khodorov B.I., Bolshakov A.P., Mikhailova M.M., Vabnitz A.V., Surin A.M., Storozhevykh T.P., Sorokina E.G., Senilova Y.E., Pinelis V.G. A difference in the mechanisms of mitochondrial depolarization induced by cyanides, glucose deprivation or glutamate exposure in cerebellar granule cells. 34th Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego 2004, Itinerary viewer 795.5.

11. Большаков А.П., Михайлова М.М., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Влияние глутаматного воздействия на митохондриальный рН в кортикальных нейронах. Конференция «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва 14-16 марта 2005.

Тезисы докладов, стр. 135.

12. Сурин А.М., Большаков А.П., Михайлова М.М., Сорокина Е.Г., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г. Роль арахидоновой кислоты в нарушениях Ca2+ гомеостаза, вызванных глутаматом в культивируемых нейронах. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 6-8 июня 2005.