Молекулярно-генетическая и иммунофенотипическая характеристика мезенхимных стромальных клеток из миелоидных органов крыс в онтогенезе
На правах рукописи
КОЖЕВНИКОВА Мария Николаевна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
И ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ МИЕЛОИДНЫХ
ОРГАНОВ КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ
03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена в лабораториях Гистогенеза и Молекулярно-генетических механизмов онтогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Научные руководители: доктор биологических наук, Старостин Валерий Иванович кандидат биологических наук, Микаелян Арсен Суренович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Бродский Всеволод Яковлевич кандидат биологических наук, Копанцев Евгений Павлович
Ведущая организация: Московский государственный университет им. М. В.
Ломоносова.
Защита состоится «_» 2009 года в «» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:
119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26;
http://idbras.comcor.ru;
e-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Автореферат разослан «_» 2008 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова e-mail: [email protected]
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. В настоящее время мезенхимные стромальные клетки (МСК) рассматриваются как мультипотентные тканеспецифические стволовые и родоначальные клетки взрослого организма, способные осуществ лять направленную дифференцировку в определенные типы клеток соедини тельной ткани, такие как остеобласты, хондробласты, адипоциты и стромаль ные клетки, организующие кроветворное микроокружение (Dominici et al., 2006). По общему признанию, основы экспериментального изучения и клини ческого применения МСК были заложены отечественным исследователем А. Я.
Фриденштейном в 60-х гг. XX века (Friedenstein et al., 1966). МСК обнаружены в различных органах и тканях половозрелого организма, тем не менее, основ ным источником этих клеток на протяжении всего постнатального онтогенеза считается костный мозг. МСК также найдены в составе кроветворной стромы эмбриональных органов гемопоэза, в частности, в печени. Присутствие МСК в составе стромы кроветворных органов в разные периоды онтогенеза тесным образом связано с исключительной ролью этих клеток и их производных в формировании и поддержании кроветворного микроокружения, так называемой “ниши” кроветворной стволовой клетки (КСК). Сравнительный анализ МСК различной органной принадлежности важен для получения глубокого и всесто роннего представления о биологии этих клеток в целом. Мы полагаем, наиболее подходящим критерием для проведения подобного сравнительного исследова ния является функциональная близость МСК. Это определило выбор органов источников данных клеток: печень зародышей и зрелый костный мозг. Первый является транзиторным, а второй дефинитивным органами миелоидного крове творения. При этом популяция МСК из костного мозга рассматривается нами в качестве контроля, т.к. общеизвестно, что клетки этой популяции отвечают всем критериям МСК, а сам костный мозг, как уже было сказано, является ос новным источником этих клеток в постнатальном периоде онтогенеза. Мы по лагаем также, что изучение МСК из разных кроветворных источников в срав нительном аспекте позволит не только охарактеризовать исследуемые клеточ ные популяции с необходимой полнотой и определенностью, но и предоставит возможность судить об их идентичности.
Интерес к подобному сравнительному анализу возник недавно, поэтому публикации, посвященные этой проблеме, малочисленны. Показано, что МСК из печени зародышей обладают большим пролиферативным потенциалом по сравнению с костномозговыми МСК (Gotherstrom et al., 2003, 2005;
Guillot et al., 2007), а также, по некоторым данным, несут на своей поверхности маркеры эм бриональных стволовых клеток, такие как Oct4 и Nanog (Guillot et al., 2007).
Вместе с тем, сведения о дифференцировочных потенциях МСК в составе пе чени зародышей остаются неполными и противоречивыми. Так, рядом авторов подтверждена способность этих клеток дифференцироваться в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях (Campagnoli et al., 2001;
Gotherstrom et al., 2003, 2005;
Guillot et al., 2007), тогда как другими исследователями нали чие таких множественных потенций ставится под сомнение (in’t Anker et al., 2003;
Fromigue et al., 2008).
Цель и задачи исследования. Все вышесказанное позволило наметить основную цель диссертационной работы – сравнительный молекулярно генетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остео генных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга крыс.
Для достижения поставленной цели исследования были сформулированы следующие основные задачи:
1. Охарактеризовать изучаемые клеточные популяции с позиции общепринятых критериев МСК по экспрессии специфических поверхностных антигенов CD73, CD90, CD105.
2. Изучить динамику экспрессии указанных маркеров на разных сроках культивирования.
3. Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследо вание остеогенных потенций МСК из двух источников.
4. Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры ос теогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК.
5. Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследо вание адипогенных потенций МСК из двух источников.
6. Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры адипогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые проведена комплексная оценка антигенного профиля МСК из печени зародышей крыс в период ее высокой кроветворной активности в срав нении с МСК из зрелого костного мозга. Показано, что обе клеточные популя ции обладают сходным иммунофенотипом, а именно экспрессируют специфи ческие поверхностные антигены CD90, CD73, CD105. Выявлено, что по мере увеличения сроков культивирования МСК из обоих источников наблюдается снижение экспрессии таких маркеров как CD73 и CD105.
Впервые проведен сравнительный молекулярно-генетический, иммуно фенотипический и гистохимический анализ остеогенных и адипогенных потен ций МСК из печени зародышей в сравнении с МСК из костного мозга половоз релых крыс. В сходных экспериментальных условиях in vitro МСК печеночного происхождения обладают менее выраженными потенциями к адипогенезу. Они также не способны к завершению остеогенной дифференцировки, а именно к формированию зрелых остеобластов и минерализованного межклеточного мат рикса. Кроме того, МСК из печени зародышей обладают более низким уровнем экспрессии генов, вовлеченных в реализацию как остеогенной, так и адипоген ной программ дифференцировок, по сравнению с костномозговыми МСК.
Сравнительный анализ изученных популяций представляет общебиоло гический интерес, поскольку позволяет получить более целостное представле ние о системе МСК. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курса лекций по биологии развития и биологии стволовых клеток, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были пред ставлены на симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекуляр ные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007 г.);
II Съезде Обще ства клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007 г.);
конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н. К. Кольцова (Москва, 2006, гг.);
IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием (Новосибирск, 2008 г.);
на XV Школе “Актуальные проблемы биологии развития” (Звенигород, 2008 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных ра бот. Из них статей в рецензируемых журналах – 4, тезисов докладов и материа лов конференций – 6.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах, содержит 52 рисунка, состоит из следующих разделов: введения, обзора лите ратуры, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения резуль татов, выводов и списка литературы, включающего 230 цитируемых источни ков.
Материалы и методы исследования В работе использованы неинбредные крысы Wistar в возрасте 3–4 мес., весом 150–200 г и зародыши крыс на 16-е сут эмбрионального развития. Для каждого эксперимента получали клетки от 3–4 половозрелых животных и 12– зародышей.
Выделение и культивирование МСК. Для получения культуры МСК из костного мозга половозрелых крыс содержимое диафизов бедренных и больше берцовых костей вымывали культуральной средой -MEM (Sigma, США). По лученные образцы костного мозга суспендировали и пропускали через фильтр, d=40 мкм (BD Biosciences, США). Подсчет клеток в суспензии осуществляли с использованием камеры Горяева. После подсчета числа клеток суспензию (5 х 106 кл/мл) помещали в культуральные флаконы (Greiner, Германия) и культиви ровали в стандартной ростовой среде -MEM с добавлением 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 10% сыворотки плодов коровы (Биолот, Россия), 100 ед/мл пе нициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (HyClone, США). Спустя 24 ч после посева первичной культуры неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепив шиеся дважды промывали 0.01 М раствором PBS (Sigma, США) и проводили смену среды. В дальнейшем среду меняли через 3–4 сут в течение 14–15 сут.
При достижении 90–95% конфлуентного монослоя, клетки пересевали по куль туральным флаконам с использованием 0.25% раствора трипсина (Биолот, Рос сия) в 1 мМ ЭДТА (Биолот, Россия).
Для получения культуры МСК из печени зародышей у беременных крыс иссекали рога матки и помещали их в охлажденную культуральную среду (Sigma, США) с добавлением 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептоми цина. Под бинокулярной лупой извлекали зародыши, выделяли печень, приго товляли клеточную суспензию механическим дезагрегированием с помощью шприца с иглами уменьшающегося диаметра и фильтровали. Клеточную сус пензию трижды отмывали ростовой средой -MEM центрифугированием при 80g. После последнего центрифугирования клетки ресуспендировали. После подсчета в камере Горяева клеточную суспензию помещали в культуральные флаконы и культивировали по описанной выше методике для МСК из зрелого костного мозга.
Индукция остеогенной дифференцировки МСК in vitro. Для индукции остеогенеза МСК 2–3-го пассажей культивировали в ростовой среде -MEM с добавлением 10-8 M дексаметазона (Sigma, США), 50 мкг/мл фосфата аскорби новой кислоты (Fluka, Германия) и 10 мМ -глицерофосфата (Sigma, США) (остеогенная среда) со сменой среды через 3–4 сут в течение 16–21 сут. Уро вень экспрессии мРНК генов маркеров остеогенной дифференцировки оцени вали каждые 2, 5, 7, 12, 16, 21 сут культивирования в контрольной (ростовая среда без добавления индукторов – контрольная культура/контроль) и остео генной (остеогенная культура/опытная культура/опыт) средах.
Индукция адипогенной дифференцировки МСК in vitro.Для индукции адипогенеза МСК 2–3 пассажей культивировали в ростовой среде с добавлени ем 10-6 М дексаметазона, 0.5 mM индометацина (Sigma, США) и 100 нг/мл ин сулина (Sigma, США) (адипогенная среда) со сменой среды через 3–4 сут в те чение 10–16 сут. Уровень экспрессии мРНК генов маркеров адипогенной диф ференцировки оценивали каждые 3, 5, 7, 10 сут (МСК из костного мозга) и 2, 7, 12, 16 сут (МСК из печени зародышей) культивирования в контрольной (росто вая среда без добавления индукторов – контрольная культура/контроль) и адипогенной (адипогенная культура/опытная культура/опыт) средах.
Гистохимические исследования. Для визуализации минеральных отло жений во внеклеточном матриксе клетки окрашивали ализариновым красным S (Sigma, США) (Пирс, 1962). Активность щелочной фосфатазы оценивали с ис пользованием набора “Alkaline Phosphatase Kit” (Sigma, США) по протоколу фирмы-производителя. Для визуализации жировых включений клетки окраши вали жировым красным О (Sigma, США) или смесью судана III и IV (Пирс, 1962). Ядра клеток докрашивали гематоксилином. Гистохимические реакции анализировали с помощью микроскопа Olympus AH-3 (Япония).
Иммуноцитохимические исследования. Иммунофенотипическую ха рактеристику МСК проводили с применением антител к CD90 (Abcam, Велико британия), CD73 (BD Pharmingen. США), CD45 (BioLegend, США), CD34 (Santa Cruz, США) и CD144 (Abcam, Великобритания). В качестве положительных контролей для фенотипических маркеров кроветворных клеток CD45 и CD использовали отпечатки селезенки половозрелых крыс, для маркера эндотели альных клеток CD144 – криостатные срезы селезенки этих же животных. Ос теогенные потенции МСК изучали с помощью антител к белкам внеклеточного матрикса коллагену I типа (Sigma, США), остеокальцину (QED Bioscience, США), костному сиалопротеину (Chemicon, США) и фактору транскрипции Os terix (Abcam, Великобритания). Адипогенные потенции МСК изучали с помо щью антител к ядерному рецептору PPAR (Cayman Chemical, США) и маркеру зрелых адипоцитов ALBP (Abcam, Великобритания). Иммуноцитохимическую реакцию анализировали под микроскопом Leica DM RXA2 (Германия). Анализ изображения проводился с помощью компьютерной программы Image J.
Молекулярно-генетические исследования. Выделение тотальной РНК из МСК осуществляли с помощью реактива TRI® Reagent (Sigma, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез кДНК проводили на то тальной РНК (5 мкг) с использованием обратной транскриптазы М-МLV и олиго(дТ)15 (Силекс, Россия). Предварительно тотальную РНК обрабатывали ДНКазой “Turbo” (Ambion, США) для исключения контаминации геномной ДНК. При конструировании праймеров использовалась программа DNAStar (США) и данные о структуре исследуемых генов, полученные из междуна родной базы данных NCBI (США). Для исключения получения ПЦР-продукта на матрице хромосомной ДНК праймеры конструировали на основе нуклео тидной последовательности из разных экзонов. Для количественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК была предварительно нормиро вана по GAPDH. ПЦР проводили на матрице кДНК с использованием Col oredTaq полимеразы (Силекс, Россия) и специфических праймеров (Литех, Россия) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler (Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофоретически в 1 %-ном агарозном геле (Amresco, США) с добавлением бромистого этидия (Sigma, США). Оценку интенсивности свече ния ПЦР продуктов проводили на УФ-трансиллюминаторе (BIO-RAD, США) с помощью программы для анализа электрофоретического изображения QuantityOne (BIO-RAD, США).
Статистическая обработка результатов исследования. Подсчет сред неквадратической (стандартной) ошибки среднего числа “костных узелков” на мм2 площади культурального флакона основан на экспресс-методе статистиче ской обработки с использованием таблиц Стрелкова (Стрелков, 1999).
Результаты исследования и их обсуждение Сравнительная оценка антигенного профиля МСК из печени заро дышей и зрелого костного мозга. Для подтверждения принадлежности изучаемых клеточных популяций к системе МСК нами проведен сравнительный анализ экспрессии позитивных и негативных маркеров МСК на разных сроках их культивирования в соответствии с рекомендациями Международного общества клеточной терапии (Dominici et al., 2006).
В качестве негативных маркеров (а) 1п 3п 2п были выбраны следующие: общий лей 403 н.п.
CD коцитарный антиген CD45, маркер ран CD11b 473 н.п.
них кроветворных предшественников CD19 415 н.п.
CD34, антиген В-лимфоцитов CD19, 348 н.п.
CD маркер моноцитов/макрофагов и грану 378 н.п.
GAPDH лоцитов CD11b и маркер эндотелиаль (б) 1п 2п 3п ных клеток CD144. Иммунофлюорес CD45 403 н.п.
центный анализ первичных культур из CD11b 473 н.п.
костного мозга (КМ) и печени зароды 415 н.п.
CD шей (ПЗ) выявил примесь CD45- и CD CD34-иммунопозитивных клеток. С по 348 н.п.
мощью ПЦР-анализа во всех исследо 378 н.п.
GAPDH ванных культурах МСК на 1–2 пассаже Рис. 1. Данные ПЦР-анализа по экс детектирована мРНК генов CD45, CD11b прессии генов негативных маркеров и CD144, что указывает на присутствие в МСК CD45, CD11b, CD19 и CD144 в клеточных популяциях из КМ (а) и ПЗ составе изучаемых популяций макрофа (б) на 1-ом (1п), 2-ом (2п) и 3-ем (3п) гов, лимфоцитов и эндотелиальных кле пассажах. Справа обозначен молеку ток на ранних этапах их культивирова лярный вес фрагментов ПЦР-реакции в ния. В обеих культурах на 1-ом и после нуклеотидных парах (н.п.).
дующих пассажах не обнаружена мРНК гена CD19. Начиная с 3-го пассажа, обе популяции МСК лишены примесей кро ветворных и эндотелиальных клеток, что подтверждается не только данными иммуноцитохимии, но и ПЦР-анализа (рис. 1). Вероятно, в процессе пассирова ния происходит их элиминация, а созданные условия культивирования способ ствуют предпочтительному росту МСК.
В качестве позитивных маркеров МСК были выбраны следующие по верхностные антигены: мембранный гликопротеин CD90, экто-5’-нуклеотидаза CD73 и рецептор трансформирующего фактора роста CD105. В начальные сроки культивирования (1–3 пассажи) практически все клетки популяции МСК из КМ положительно окрашивались на маркеры CD90 и CD73 (рис. 2, а, в).
Маркер CD90 также выявлен почти во всех клетках популяции из ПЗ (рис. 2, б).
Вместе с тем, поверхностный антиген CD73 был обнаружен лишь приблизи тельно в 60% клеток печеночного происхождения (рис, 2, г). Возможно, это связано с неодинаковым органным происхождением клеток, что, в свою оче редь, может вносить свой вклад в фенотипическую характеристику МСК.
Анализ динамики экспрессии фенотипических маркеров МСК на протя жении длительного срока культивирования выявил, что на 8–11-ом пассажах практически все клетки культуры МСК из КМ и ПЗ экспрессировали маркер CD90, что хорошо согласуется с данными ПЦР-анализа (рис. 3, а, б). Нами впервые показано, что экспрессия поверхностного антигена CD73 в культурах печеночных МСК 8–11-го пассажей сохранялась лишь в отдельных клетках, со ставляющих минорную субпопуляцию среди CD74-иммунонегативных клеток (рис. 3, в).
Рис. 2. Экспрессия поверхностных антигенов CD90 (а, б) и CD73 (в, г) в культурах МСК из зрелого КМ (а, в) и ПЗ (б, г) 3-го пассажа. а, б, в, г - совмещение изображений ре зультата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI.
Рис. 3. Экспрессия поверхностных антигенов CD90 и CD73 в культурах МСК из КМ (а) и ПЗ (б, в) 11-го (а, б) и 9-го (в) пассажей. а, б, в - совмещение изображений результата имму номечения и ядер клеток, окрашенных DAPI.
Полученный результат находится в полном соответствии с данными ПЦР анализа (рис. 4). Снижение содержания мРНК гена CD73 также наблюдалось при долгосрочном культивировании МСК из зрелого КМ. С использованием специфических праймеров нами выявлено снижение уровня экспрессии еще одного гена – CD105, в обеих клеточных популяциях МСК (рис. 4).
Итак, можно с определенностью утверждать, что анализируемые клеточ ные популяции характеризуются сходным фенотипом, а именно экспрессируют поверхностные антигены CD90, CD73 и CD105, что определенно доказывает их принадлежность к системе МСК и, начиная с 3-го пассажа, практически лишены примесей других типов клеток.
1п 2п 3п 8п 11п (а) Рис. 4. Данные ПЦР-анализа по CD90 496 н.п.
экспрессии генов позитивных CD73 401 н.п.
маркеров МСК CD90, CD73 и 553 н.п.
CD CD105 в клеточных популяциях из КМ (а) и ПЗ (б) на 1-ом (1п), 2 378 н.п.
GAPDH ом (2п), 3-ем (3п), 8-ом (8п), 9-ом (б) 1п 2п 3п 9п 11п (9п) и 11-ом (11п) пассажах.
CD90 496 н.п.
Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в CD73 401 н.п.
нуклеотидных парах (н.п.).
553 н.п.
CD 378 н.п.
GAPDH Молекулярно-генетический и морфологический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте.
Оценка активности щелочной фосфатазы в колониях-клонах (КОЕ-ф) в первичных культурах МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга. В рамках выполненного исследования нами была проанализирована активность щелочной фосфатазы в колониях-клонах (КОЕ-ф) первичных культур МСК из двух источников. Этот фермент широко применяется в качестве маркера самых ранних предшественников остеогенных клеток. В большинстве колоний КОЕ-ф из КМ выявлялась высокая активность щелочной фосфатазы, тогда как в коло ниях печеночного происхождения количество клеток с положительной реакци ей на фермент было существенно ниже. Полученный результат отражает крайне низкую степень коммитирования печеночных МСК в остеогенном направлении на стадии КОЕ-ф. Напротив, уже в составе первичной культуры костномозго вых МСК присутствует достаточное число клеток, потенциально способных, по нашему мнению, к остеогенезу.
Остеогенез в пассируемой культуре МСК из костного мозга. В культуре МСК из КМ 2–3-го пассажа остеогенез имел очаговый характер. Первые пре зумптивные очаги остеогенеза – участки скопления клеток с отложениями вне клеточного матрикса, появлялись уже на 10–12 сут эксперимента, что подтвер ждалось иммуноцитохимически с использованием антител к коллагену I типа и костному сиалопротеину (рис. 5).
Слабое окрашивание ализариновым красным S культуры костномозговых МСК на 10-е сут инкубации в остеогенной среде свидетельствовало о начале минерализации внеклеточного матрикса в предполагаемых очагах остеогенеза (рис. 6, б). Максимальная активность щелочной фосфатазы также наблюдалась в пределах презумптивных очагов остеогенеза (рис. 6, г).
Рис. 5. Экспрессия коллагена I типа (Col Рис. 6. Скопления соединений кальция и I) (а) и костного сиалопротеина (BSP) (б) положительно окрашенных на щелочную в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на фосфатазу (ЩФ) клеток (указаны стрелка 11- (а) и 12-е (б) сут инкубации клеток в ми) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на остеогенной среде. а, б - совмещение 10-е сут инкубации в контрольной (а, в) и изображений результата иммуномечения остеогенной (б, г) средах. а, б – окраска и ядер клеток, окрашенных DAPI. ализариновым красным S (Alizarin Red S).
Ядра докрашены гематоксилином.
На 16–21 сут культивирования в остеогенной среде уже полностью сфор мированы так называемые “костные узелки” – массивные скопления внекле точного минерализованного матрикса и полигональных клеток, похожих на ос теобласты. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к коллагену I ти па и костному сиалопротеину выявило присутствие этих белков преимущест венно в пределах “костных узелков”, где их количество было значительно вы ше, по сравнению с начальными сроками культивирования клеток в остеоген ной среде (рис. 7).
Рис. 7. Экспрессия колла гена I типа (Col I) и кост ного сиалопротеина (BSP) в “костных узелках” в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 16-е сут инкуба ции клеток в остеогенной среде.
а", б", в" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а', б').
Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркера зрелых остеобластов остеокальцина выявил присутствие этого белка также преимущественно в пре делах “костных узелков” (рис. 8). C помощью фазово-контрастной микроско пии показано, что клетки, экспрессирующие остеокальцин, обладали кубиче ской или полигональной формой, а их ядра были смещены к периферии, т.е. по морфологии напоминали функционально зрелые остеобласты (рис. 8, а). Ни в одной из контрольных культур экспрессия остеокальцина, костного сиалопро теина и коллагена I типа не обнаружена.
Рис. 8. Экспрессия остеокальцина (ОС) в пределах “костных узелков” в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 16-е сут инкубации клеток в остеогенной среде. а – фазово-контрастная микроскопия;
а" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окра шенных DAPI.
Минерализованный костный матрикс, хорошо заметный при фазово контрастной микроскопии (рис. 9, б), положительно окрашивался ализарино вым красным S (рис. 9, г, е). Среднее число таких “костных узелков” составило 0.72 ± 0.17 на мм2 площади культурального флакона.
Рис. 9. Участки минерализованной костной ткани (отмечены стрелками) в культуре МСК из КМ 2-го пассажа. 16 сут инкубации клеток в контрольной (а, в, д) и остеогенной (б, г, е) сре дах. а, б - фазово-контрастная микроскопия;
в, г, д, е- окраска ализариновым красным S (Alizarin Red S);
д, е – ядра докрашены гематоксилином.
Кроме того, нами впервые выявлен ряд особенностей временного и топо графического паттерна распределения фактора транскрипции Osterix в культуре МСК из КМ на разных сроках культивирования в остеогенной среде. Показано, что экспрессия этого фактора значительно усиливалась в местах предполагае мых очагов остеогенеза, когда сами очаги еще не были обособлены морфологи чески, и достигала максимального значения в окончательно сформированных “костных узелках” (рис. 10).
Рис. 10. Экспрессия фактора транскрипции Osterix (Оsx) в культуре МСК из КМ 3-го пасса жа на 2-е (а), 10-е (б) и 16-е (в) сут культивирования в остеогенной среде. а", б", в" - совме щение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а', б', в').
Остеогенез в пассируемой культуре МСК из печени зародышей. В срав нимых экспериментальных условиях в культуре МСК из ПЗ наблюдались неко торые морфогенетические преобразования, отчасти напоминающие таковые в остеогенной культуре МСК из КМ. Уже к 10-ым сут инкубации в остеогенной среде клетки формировали скопления, сходные с “костными узелками” (рис.
11).
Рис. 11. Фазово-контрастная микроскопия Рис. 12. Экспрессия коллагена I типа (Col I) МСК из ПЗ на 10-е (а, б) и 16-е (в, г) сут (а) и костного сиалопротеина (BSP) (б) в культивирования в контрольной (а, в) и ос- МСК из ПЗ 3-го пассажа. 14-е сут инкуба теогенной (б, г) средах. Стрелками указаны ции клеток в остеогенной среде. а, б - со участки скопления клеток, напоминающие вмещение изображений результата имму номечения и ядер клеток, окрашенных “костные узелки”.
DAPI.
В пределах таких клеточных скоплений наблюдались массивные отложе ния межклеточного вещества, при этом сами клетки сохраняли фибробластопо добную морфологию. Иммунофлуоресцентный анализ выявил в клеточных скоплениях отложения коллагеновых волокон I типа и костный сиалопротеин (рис. 12). Под действием остеогенных индукторов в культуре МСК из ПЗ также происходило незначительное усиление экспрессии щелочной фосфатазы. Тем не менее, число клеток, положительно окрашенных на щелочную фосфатазу, а также интенсивность самой реакции, были заметно ниже, чем в МСК из КМ.
Как известно, основным морфологическим признаком позд них этапов остеогенной дифферен цировки in vitro является минерали зация внеклеточного матрикса. Од нако во всех исследованных куль турах печеночных МСК гистохи мически отложения кальция выяв лены не были, за исключением крайне малочисленных положи тельно окрашенных ализариновым красным S участков (рис. 13).
Среднее число таких участков было ничтожно мало и составило всего Рис. 13. Клеточные скопления в культуре 2х10-4 ± 0.28 на мм2 площади куль- МСК из ПЗ, напоминающие “костные узел ки”. 16-е (а, б) и 21-е сут (в, г) культивирова турального флакона.
ния клеток в контрольной (а, б) и остеоген В клеточных скоплениях, напоми- ной (в, г) средах. Окраска ализариновым нающих “костные узелки”, остео- красным S (Alizarin Red S). Ядра докрашены кальцин также не обнаружен. гематоксилином.
Иммуноцитохимическое окрашивание с использованием антител к Osterix выявило этот фактор лишь в единичных клетках опытной культуры МСК пече ночного происхождения. Отсутствие кальцификации внеклеточного матрикса и экспрессии фактора транскрипции Osterix, а также сохранение клетками фиб робластоподобной морфологии в пределах клеточных скоплений указывают на неспособность печеночных МСК в заданных условиях культивирования завер шить терминальную фазу остеогенной дифференцировки. Полученные данные иммуноцитохимии и гистохимии подтверждены с помощью ПЦР-анализа. Мак симальный уровень экспрессии генов остеокальцина OC и щелочной фосфатазы ALP в культуре МСК из КМ приходился на более поздние сроки культивирова ния клеток в остеогенной среде (9–16 сут эксперимента), что сопряжено с пе риодом накоплением соединений кальция во внеклеточном матриксе культуры.
Напротив, в культуре печеночных МСК содержание мРНК этих генов остава лось крайне низким на протяжении всего эксперимента по индукции остеоген ной дифференцировки, что еще раз указывает на неспособность этих клеток осуществлять минерализацию внеклеточного матрикса в созданных условиях in vitro (рис. 14).
(а) (б) 2сут 5сут 9сут 12сут 16сут 2сут 5сут 9сут 12сут 16сут ALP con 477 н.п.
ALP ex OC con 273 н.п.
OC ex GAPDH con 378 н.п.
GAPDH ex Рис. 14. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов ОС и ALP в культуре МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ex) средах.
Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нуклеотидных парах (н.п.).
Интересные результаты получены при изучении профиля экспрессии гена RUNX2 (рис. 15). В МСК из КМ на протяжении всего периода культивирования в остеогенной среде, за исключением начальных сроков (2–5 сут), отмечался высокий уровень экспрессии гена RUNX2. Вместе с тем, в популяции МСК пе ченочного происхождения содержание мРНК этого гена оказалось значительно ниже и не претерпевало существенных изменений на протяжении всего экспе римента. В обеих популяциях МСК также отмечен высокий уровень экспрессии генов коллагена I типа COL1A1 и остеопонтина OP (рис. 15).
(а) (б) 2сут 5сут 9сут 12сут 16сут 2сут 5сут 9сут 12сут 16сут OP con 362 н.п.
OP ex COL1A1 con 324 н.п.
COL1A1 ex RUNX2 con 289 н.п.
RUNX2 ex GAPDH con 378 н.п.
GAPDH ex Рис. 15. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов RUNX2, COL1A1, OP в культуре МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ex) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нуклеотидных парах (н.п.).
Cледует обратить внимание, что остеопонтин, в отличие от маркера функционально зрелых остеобластов остекальцина, в основном экспрессирует ся незрелыми остеогенными клетками. Поэтому повышенное содержание мРНК гена OP в опытной культуре печеночных МСК не является достаточным при знаком реализации программы остеогенной дифференцировки. Кроме того, ос теопонтин считается одним из ключевых ингибиторов процесса минерализации внеклеточного матрикса. Возможно, высокий уровень содержания мРНК этого гена на протяжении всего срока культивирования МСК печеночного происхож дения является одной из причин подавления процессов образования и роста кристаллов гидроксиапатита in vitro.
Молекулярно-генетический и морфологический анализ адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте.
Появление первых жировых клеток в культуре МСК из ПЗ приходилось на более поздние сроки инкубации клеток в индукционной среде, а сама диф ференцировка протекала менее интенсивно, чем в культуре МСК из КМ (рис.
16, 17).
Рис. 16. Адипоциты с множественными липидными включениями в культуре МСК из КМ 2 го пассажа. 10-е сут культивирования в контрольной (а, б, в) и адипогенной (г, д, е) средах.
а, б, г, д – окраска суданом III и IV, ядра докрашены гематоксилином;
в, е – фазово контрастная микроскопия.
Рис. 17. Адипоциты с множественными липидными включениями в культуре МСК из ПЗ 2 го (е) и 3-го (а–д) пассажей. 16-е сут культивирования в контрольной (а, г) и адипогенной (б, в, д, е) средах. а, б, в – окраска жировым красным О (Oil Red O);
г, д, е – окраска суданом III и IV;
ядра докрашены гематоксилином.
Интересно отметить, что в культуре печеночных МСК группы зрелых адипоцитов морфологически были обособлены от остальных клеток, сохра няющих фибробластоподобную морфологию и не содержащих липидные включения. Последние также обнаруживались и среди адипоцитов внутри группы (рис. 17, е).
В контрольных культурах МСК из обоих органов дифференцированные адипоциты не выявлены (рис. 16, а–в, рис. 17, а, г), хотя единичные клетки с морфологией фибробластов содержали в цитоплазме мелкие суданофильные включения.
При культивировании костномозговых МСК в стандартной ростовой сре де 14–21 сут возможно появление спонтанной дифференцировки клеток в ади погенном направлении (рис. 18, а, б). Кроме того, формирование зрелых адипо цитов наблюдалось также в стандартной остеогенной среде (рис. 18, в, г). В по следнем случае, жировые клетки выявлялись в непосредственной близости от очагов остеогенеза (рис. 18, г).
Рис. 18. Мультилокулярные адипо циты при культивировании МСК из КМ 4-го (а, б) и 2-го (в, г) пассажей в стандартной ростовой среде (а, б) и в остеогенной среде (в, г) на 18-е (в) и 21-е (г) сут эксперимента. Стрел ками указан очаг остеогенеза (крас ная стрелка) и зрелые адипоциты (желтые стрелки). а, б – фазово контрастная микроскопия;
в – окра ска суданом III и IV с докрашивани ем ядер гематоксилином;
г – окраска гематоксилин-эозином.
Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к фактору транскрип ции PPAR и маркеру зрелых адипоцитов ALBP на поздних сроках культиви рования МСК из КМ (16-е сут эксперимента) выявило значительное усиление экспрессии перечисленных маркеров в опыте по сравнению с контролем (рис.
19). Следует отметить, что как в контроле, так и на ранних сроках культивиро вания костномозговых МСК в индукционной среде экспрессия ALBP преиму щественно регистрировалась в ядрах (рис. 18, в). В ходе дальнейшей инкубации клеток в адипогенной среде цитоплазматическая локализация этого белка ста новилась более заметной (рис. 19, г).
Ядерная локализация ALBP объясняется его ролью как транспортера жирных кислот в ядро клетки, где последние могут выступать в качестве спе цифических лигандов для ядерного рецептора PPAR. Полученные результаты находятся в хорошем соответствии с имеющимися данными литературы, где также продемонстрирована преимущественная ядерная локализация белка ALBP на ранних этапах дифференцировки преадипоцитов (Helledie et al., 2000, 2002).
Рис. 19. Экспрессия фактора транскрипции PPAR (а, б) и маркера зрелых адипоцитов ALBP (в, г) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 10-е сут культивирования клеток в контрольной (а, в) и опытной (б, г) средах. а, б, в, г – совмещение изображений результата иммуноме чения и ядер клеток, окрашенных DAPI.
По данным иммунофлуоресцентного анализа содержание фактора транс крипции PPAR лишь в отдельных МСК печеночного происхождения было со поставимым с таковым в костномозговых МСК (указаны стрелками на рис. 20, б).
Рис. 20. Экспрессия фактора транскрипции PPAR (а, б) и маркера зрелых адипоцитов ALBP (в, г) в культуре МСК из ПЗ 3-го пассажа на 16-е сут культивирования клеток в контрольной (а, в) и опытной (б, г) средах. а, б, в, г – совмещение изображений результата иммуноме чения и ядер клеток, окрашенных DAPI.
На 16-е сут инкубации МСК из ПЗ в адипогенной среде содержание ALBP в клетках было значительно ниже по сравнению с МСК из КМ, т.к. бе лок, в основном, располагался в ядрах, за исключением некоторых клеток, в ко торых ALBP обнаруживался также и в цитоплазме (указаны стрелками на рис.
20, г).
Следующий этап работы посвящен изучению адипогенных потенций МСК на молекулярно-генетическом уровне. В МСК костномозгового происхо ждения максимальный уровень экспрессии генов PPAR, PPAR и ALBP прихо дился на 7–10 сут инкубации клеток в адипогенной среде, что совпадает по времени с возрастанием численности терминально дифференцированных ади поцитов в культуре (рис. 21, а). Отмечено также, что на 10-е сут культивирова ния МСК из КМ в контрольной среде содержание мРНК гена PPAR было прак тически сопоставимым с таковым в опыте. Как известно, ядерный рецептор PPAR обладает антимитотической активностью, которая обуславливает выход адипогенных клеток из клеточного цикла, что является обязательным условием их дальнейшей дифференцировки (Gregoire et al., 1998). По-видимому, дости жение клетками контрольной культуры 100% конфлуентности к поздним сро кам культивирования, а также присутствие в добавляемой к среде сыворотке различных цитокинов, являются достаточным условием для выхода ранних предшественников адипоцитов из клеточного цикла и дальнейшей реализации программы адипогенеза этими клетками. Данный процесс, возможно, сопрово ждается повышением уровня экспрессии гена PPAR в клетках контрольной культуры. Косвенным доказательством присутствия в контроле преадипоцитов разной степени зрелости является спонтанная адипогенная дифференцировка, иногда наблюдаемая при культивировании костномозговых МСК в стандартной ростовой среде, т.е. без индукторов. На 7–10 сут культивирования костномозго вых МСК в адипогенной среде также детектирована мРНК гена LEP, кодирую щего гормон лептин (рис. 21, а).
(а) (б) 2 сут 5 сут 7 сут 10 сут 2 сут 7 сут 12 сут 16 сут PPAR con 455 н.п.
PPAR ex PPAR con 405 н.п.
PPAR ex ALBP con 337 н.п.
ALBP ex LEP con 271 н.п.
LEP ex GAPDH con 378 н.п.
GAPDH ex Рис. 21. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов PPAR PPAR, ALBP и LEP в культурах МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ex) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нук леотидных парах (н.п.).
Напротив, более низкий уровень экспрессии гена ALBP, незначительное содержание мРНК гена PPAR, а также практически полное отсутствие мРНК гена LEP в опытных культурах печеночных МСК полностью подтверждают ре зультаты гистохимии и иммуноцитохимии, согласно которым адипогенные по тенции этих клеток в заданных условиях культивирования выражены слабее (рис. 21, б). Вместе с тем отмечено, что на 16-е сут инкубации МСК из ПЗ в адипогенной среде уровень экспрессии гена PPAR увеличивался и становился сравнимым с таковым в МСК из КМ. Полученный результат свидетельствует о влиянии индукторов адипогенеза на дифференцировочный статус МСК пече ночного происхождения.
В совокупности, полученные экспериментальные данные позволяют за ключить: исследованные клеточные популяции из двух кроветворных органов, печени зародышей и зрелого костного мозга, отвечают критериям МСК, однако их остеогенные и адипогенные потенции в сравнимых экспериментальных ус ловиях культивирования неодинаковы, что, вероятно, объясняется разными программами развития этих клеток в онтогенезе.
Выводы 1. МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга обладают сходным иммунофенотипом, т.е. экспрессируют специфические поверхностные антигены CD90, CD73, CD105.
2. В обеих клеточных популяциях МСК, начиная с 8-го пассажа, на блюдается снижение экспрессии CD73 и CD105, что, возможно, является при знаком клеточного старения.
3. МСК из печени зародышей, в отличие от МСК из зрелого костного мозга, под влиянием индукторов остеогенеза не способны к реализации терми нальных этапов остеогенной дифференцировки, несмотря на некоторые морфо логические преобразования.
4. Временной и топографический характер распределения ключевого регулятора остеогенной дифференцировки Osterix в культуре МСК из зрелого костного мозга свидетельствует о строгой привязанности экспрессии этого фак тора транскрипции к презумптивным и сформированным очагам остеогенеза in vitro.
5. Под влиянием остеогенных индукторов в МСК из зрелого костного мозга заметно повышалось содержание мРНК генов ОС, ALP и RUNX2, тогда как в МСК из печени зародышей уровень экспрессии перечисленных генов ос тавался сравнительно низким.
6. Адипогенная дифференцировка МСК из печени зародышей выра жена слабее по сравнению с таковой МСК из костного мозга, что проявляется в невысокой численности зрелых адипоцитов, более позднем их формировании, а также в менее интенсивной экспрессии фактора транскрипции PPAR и марке ра зрелых адипоцитов ALBP.
7. Под влиянием адипогенных индукторов в МСК из печени зароды шей отмечали пониженное содержание мРНК гена ALBP, крайне низкий уро вень экспрессии гена PPAR, а также отсутствие мРНК гена LEP, в сравнении с выраженной экспрессией указанных генов в МСК из зрелого костного мозга.
СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Паюшина О. В., Старостин В. И. 2008.
Сравнительная характеристика мезенхимных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних этапах культивирования. Известия РАН. Се рия биол. №2: 156–162.
Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Молекулярно генетические основы регуляции остеогенной дифференцировки мезенхимных стромальных клеток. Известия РАН. Серия биол. №.3: 261–271.
Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Сравнительная им мунофенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных стро мальных клеток из дефинитивных и транзиторных кроветворных органов. Док лады Академии Наук. 422 (№2): 265–267.
Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Молекулярно генетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остео генных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и костного мозга половозрелых крыс. Цитология. 51 (в печати).
Тезисы конференций:
Кожевникова М.Н., Паюшина О.В., Микаелян А.С. Морфогенетические преоб разования мезенхимных стромальных клеток (МСК) крыс в ранние и поздние сроки культивирования // Симпозиум с международным участием “Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза”. Москва, 9–11 октября 2007. Сборник тезисов, стр. 83–84.
Кожевникова М.Н., Старостин В.И., Микаелян А.С. Анализ адипогенной и ос теогенной дифференцировок мезенхимных родоначальных клеток костного мозга и эмбриональной печени крысы in vitro // Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез, 2007, 38(4): 315.
Кожевникова М.Н., Паюшина О.В., Микаелян А.С. Сравнительная характери стика мезенхимных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних пассажах // Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН.
Цитология, 2007, 49(9): 756–757.
Кожевникова М.Н., Микаелян А.С., Старостин В.И. Сравнительная иммунофе нотипическая и функциональная характеристика мезенхимных стромальных клеток из дефинитивных и эмбриональных кроветворных органов // Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез, 2008, 39(4): 314– 315.
Кожевникова М.Н., Микаелян А.С. Молекулярно-генетический и иммунофено типический анализ антигенного профиля и остеогенных потенций мезенхимных стромальных клеток из печени зародышей и костного мозга половозрелых крыс // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Но восибирск, 11–15 мая 2008. Сборник тезисов, стр. 217.
Кожевникова М.Н., Микаелян А.С., Старостин В.И. Сравнительный молеку лярно-генетический и гистохимический анализ адипогенных потенций мезен химных стромальных клеток из зародышевой печени и зрелого костного мозга крыс // XV Школа “Актуальные проблемы биологии развития”. Звенигород, 19– 24 октября 2008. Сборник тезисов, стр. 41.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 06-04 48209), гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гран та Президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ – 1134.2008.4.