Сенсорные электроды на основе наночастиц диоксида марганца
На правах рукописи
Донцова Екатерина Александровна
Сенсорные электроды на основе
наночастиц диоксида марганца
специальность:
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва 2011
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Курочкин Илья Николаевич
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Гольдберг Владимир Михайлович Институт биохимической физики имени Н.М. Эммануэля РАН доктор химических наук, профессор Евдокимов Юрий Михайлович Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН
Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН
Защита состоится « » декабря 2011 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова
Автореферат разослан «…» ноября 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Диоксид марганца используется в качестве окислителя, катализатора, адсорбента и как электродный материал источников энергии. В технологиях био- и химических сенсоров применяют модификацию поверхности электродов MnO2 для формирования медиаторного слоя, который способен к многократному циклическому окислению-востановлению на электроде, и осуществляет транспорт электрона от аналита к поверхности электрода, тем самым существенно повышая чувствительность определения аналита.
Традиционно используемой процедурой формирования медиаторного слоя на поверхности электрода является электрохимическое осаждение. В нашей лаборатории была разработана методика изготовления пероксид чувствительных и холиноксидазных электрохимических сенсоров на основе электрохимически осажденного MnO2, которые позволяли определять пероксид водорода с чувствительностью 1,2 А/(М · см2) и пределом обнаружения 30 нМ и холин с пределом обнаружения 800 нМ и чувствительностью 50 мА/(М · см2).
Вместе с тем, при переходе к массовому производству сенсоров, необходима разработка более удобных в технологическом отношении подходов. Таковыми являются методы струйно-капельного нанесения. Современные технологии позволяют дозировать с высокой точностью микро- и нанолитровые объемы растворов, содержащих необходимые компоненты. При этом существуют автоматизированные системы дозирования, позволяющие сделать процесс изготовления аналитических элементов высокопроизводительным и воспроизводимым. Для такого нанесения необходимо заранее подготовить препарат, содержащий медиатор: раствор или стабильный золь наночастиц.
Описано использование MnO2 в качестве медиатора для анализа пероксида водорода, а также аскорбиновой и мочевой кислот, на его основе были разработаны высокочувствительные системы определения глюкозы и холина, в которых осуществлено сопряжение медиатора с ферментом класса оксидаз. Данное соединение привлекательно с технологической точки зрения т.к. его легко получить в виде различных кристаллических модификаций.
Однако, существует проблема его стабилизации в виде золя для нанесения на поверхность сенсоров струйно-капельными методами.
Также следует заметить, что в литературе не описано возможности использования диоксида марганца в качестве медиатора для анализа тиолов, в то время как имеются данные о способности MnO2 окислять тиолы.
Таким образом, исследование различных способов получения и стабилизации золей наночастиц диоксида марганца, возможности нанесения их на поверхность электрохимических сенсоров капельным методом и создания на основе полученного медиаторного слоя систем определения H2O2 и тиолов, а также создания на их основе более сложных ферментативных биосенсоров, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование возможности применения наночастиц диоксида марганца для изготовления электрохимических систем анализа тиолов, пероксида водорода и холина, позволяющих определять активности холинэстераз и проводить анализ их ингибиторов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
- Получение и исследование стабильности различных препаратов наночастиц диоксида марганца, в том числе различных кристаллических модификаций.
- Исследование возможности применения наночастиц MnO2 для электрохимического анализа пероксида водорода и тиолов, в частности тиохолина.
- Разработка системы сопряжения наночастиц MnO2 с ферментами класса оксидаз, в частности холиноксидазы, для электрохимического анализа холина.
- Исследование возможности определения активности ферментов холинэстераз и анализа их ингибиторов с использованием разработанных на основе наночастиц MnO2 систем анализа холина и тиохолина.
Научная новизна. Разработана методика получения наночастиц MnO2 в обращенных мицеллах. Показана возможность использования таких наночастиц для создания пероксид-чувствительного слоя.
Исследованы медиаторные свойства наночастиц MnO2 различных кристаллических модификаций в реакции электрохимического окисления тиохолина и пероксида водорода, показано, что -модификация MnO2 обладает более высокой медиаторной активностью по сравнению с аморфным и -MnO2.
Впервые показана возможность электрохимического определения тиолов, в частности тиохолина, с использованием диоксида марганца в качестве медиатора.
Разработана и оптимизирована методика получения стабильного гидрозоля наночастиц -MnO2, исследовано влияние различных катионов и анионов на стабильность гидрозоля. Наночастицы MnO2 в гидрозоле охарактеризованы при помощи электронной микроскопии, светорассеяния и т.д.
Разработана методика формирования медиаторных слоев на основе полученных наночастиц -MnO2 и последующей иммобилизации ферментов для создания сенсоров, определяющих H2O2 и холин. Разработан холиноксидазный биосенсор на основе стабильного гидрозоля наночастиц MnO2.
Разработанные сенсоры использованы для анализа активности БХЭ и ингибиторов холинэстеразной активности.
Практическая значимость работы.
Разработаны пероксид-чувствительные электроды на основе наночастиц MnO2, полученных в обращенных мицеллах. Аналитические характеристики электродов: линейный диапазон определения H2O2 1 · 10-7 – 1 · 10-4, предел обнаружения H2O2 8 · 10-8, чувствительность 922 мА/(М · см2).
Разработаны электрохимические сенсоры для высокочувствительного анализа пероксида водорода и тиолов, а также ферментативные биосенсоры для анализа холина на основе стабильного гидрозоля наночастиц -MnO2.
-MnO2, Методики получения стабильного гидрозоля наночастиц формирования медиаторного слоя на поверхности электрода, а также иммобилизации фермента холиноксидазы для создания холин-чувствительных биосенсоров, были защищены патентом РФ. Все описанные сенсорные элементы могут быть использованы как непосредственно для анализа соответствующих аналитов, так и в качестве базовых элементов при создании более сложных биосенсорных систем.
Основные аналитические характеристики сенсоров: линейный диапазон определяемых концентраций H2O2 составил 2·10-8 М – 1·10-4 М, предел обнаружения и чувствительность - 2·10-8 М и 515 мА/(М·см2), соответственно.
Линейный диапазон определяемых концентраций тиохолина, цистеина и глутатиона составил 5·10-7 М – 1·10-4 М, 5·10-7 М – 1·10-3 М и 5·10-7 М – 1·10-5 М соответственно. Предел обнаружения и чувствительность для тиохолина, цистеина и глутатиона составили - 6·10-8 М и 345 мА/(М·см2), 9·10-8 М и мА/(М·см2) и 2·10-7 М и 178 мА/(М·см2)соответственно. Предел обнаружения тиохолина снижен в 8 раз по сравнению с электрохимическими сенсорами для анализа тиохолина на основе других медиаторов и в 200 раз по сравнению со спектрофотометрическим методом Эллмана.
Медиаторный слой на основе наночастиц MnO2 может быть использован для анализа концентрации пероксида водорода, которая является важным параметром при изучении различных биохимических процессов, в частности связанным с работой ферментов класса оксидоредуктаз: оксидаз, супероксиддисмутаз и пероксидаз. Данный медиаторный слой может служить базовой конструкцией для создания биосенсоров на основе этих ферментов или измерения их активности.
Разработан и оптимизирован холиноксидазный биосенсор на основе гидрозолей наночастиц -MnO2. Линейный диапазон определяемых концентраций холина составил 1,3·10-7 М – 1·10-4 М Предел обнаружения холина и чувствительность – 1,3·10-7 нМ и 103 мА/(М·см2), соответственно.
Такое значение передела обнаружения по холину является минимальным значением для электрохимических холиноксидазных биосенсоров, описанных на сегодняшний день в литературе.
Возможность анализа тиолов при помощи сенсора на основе наночастиц MnO2 также может быть использована для анализа биологически активных молекул, таких как глутатион и цистеин.
Показано, что разработанные тиохолин-чувствительные сенсоры и холиноксидазные биосенсоры могут быть использованы для анализа активности эстераз в биологических жидкостях, а также определения содержания ингибиторов холинэстеразной активности в экологических образцах.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 2-я Международная школа ‘Наноматериалы и нанотехнолигии в живых системах. Безопасность и наномедицина’, 19- сентября 2011, Московская область;
IV-й Московский Международный Конгресс ‘Биотехнология – состояние и перспективы развития’, 21-25 марта 2011, Москва;
ICYS-ICMR Summer School on Nanomaterials, July 22-28 2006, Tsukuba, Japan.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в международных и отечественных журналах, 1 глава в книге, тезисы на 3-х научных конференциях и 1 патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения в 4-х главах, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 186 ссылок. Работа содержит рисунка, 22 таблицы.
Список сокращений.
ХЭ – холинэстераза(ы), АХЭ – ацетилхолинэстераза, БХЭ – бутирилхолинэстераза, АОТ – (ди(этил-2-гексил)сульфосукцинат натрия, ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия, СЭМ – сканирующая электронная микроскопия, NTA - Nanoparticles Tracking Analysis ПАСН – полианетолсульфонат натрия, ПДДА – полидиметилдиаллиаммонийхлорид, ХО – холиноксидаза, ПНП – послойное нанесение полиэлектролитов, БХ - бутирилхолин ПТХ - пропионилтиохолин СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы В литературном обзоре рассматривается структура, функции и роль в организме млекопитающих ферментов группы холинэстераз (АХЭ и БХЭ), приводятся сведения об их ингибиторах и систематизируются методы анализа ингибиторов холинэстеразной активности. Подробно рассматриваются два подхода к анализу ингибиторов – определение скорости гидролиза природных субстратов ХЭ с образованием холина и их синтетических тиоаналогов с образованием тиохолина. Систематизируются сведения о методах определения холина и тиохолина, подробно освещаются конструкции предназначенных для этого электрохимических сенсорных систем. Классифицируются методы получения и стабилизации наночастиц медиаторов, используемых в качестве обязательного компонента в таких системах. Анализируются данные о структуре, способах получения и стабилизации наночастиц диоксида марганца, а также описываются существующие электрохимические сенсорные системы на его основе.
Экспериментальная часть Получение наночастиц MnO2. Наночастицы диоксида марганца получали с использованием реакции сопропорционирования ионов Mn2+ и MnO4-. Для получения MnO2 в обращенных мицеллах 0.221 г АОТ растворяли в 5 мл гексана, раствор разделяли на две части, к одной части добавляли водный раствор ацетета марганца (II), ко второй - водный раствор KMnO4 в равных объемах (4,5-31,5 мкл). Смеси интенсивно встряхивали для получения однородных прозрачных растворов, полученные растворы немедленно смешивали и встряхивали на шейкере. Препарат аморфного MnO2 готовили из водных растворов KMnO4 и MnSO4 в тефлоновом вкладыше автоклава. Для -модификации получения препаратов проводили последующую гидротермальную обработку полученной суспензии в стальном автоклаве при температуре 160oC. Водные золи аморфного и -MnO2 получали суспензированием в ацетатном буфере (0,125 мМ АсК/0,25 мМ AcH) при помощи ультразвука. Золи наночастиц -MnO2 получали смешением разбавленных водных растворов KMnO4 и ацетата марганца (II). Растворы реагентов смешивали и встряхивали.
Физико-химическая характеристика наночастиц MnO2..
Кристаллическую структуру полученных препаратов MnO2 определяли методом рентгеновской дифракции с использованием автоматического порошкового дифрактометра STOE STADI-P. Электронные микрофотографии наночастиц MnO2 били получены при помощи ПЭИ LEO912 AB OMEGA и СЭМ Carl Zeiss Supra 40 (Германия). Измерение концентрации и распределения наночастиц в по размерам проводили с использованием прибора Nanosight LM10-HS (Великобритания), основанного на методе Анализа траекторий Броуновского движения наночастиц (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA).
Спектры водных золей диоксида марганца были получены на спектрофотометре Cary 100 (Varian, США). Изучение квазиупругого динамического светорассеяния золей - MnO2 проводили в цилиндрических кюветах, на приборе ALV DLS/SLS-SP 5022F. Определение дзетта-потенциала наночастиц MnO2 в гидрозоле проводили на зета-сайзере Nano-ZS фирмы ‘Malvern instruments’ (Великобритания).
Изготовление электродов на основе наночастиц MnO2. Для изготовления сенсорных элементов на основе наночастиц MnO использовались: шлифованные графитовые стержни и планарные электроды, напечатанные на подложке из поливинилхлорида с использованием аппарата для полуавтоматической печати Winon модели WSC160B, трафаретной сетки (Mesh count = 200 нитей/см), и проводящих графитовых чернил (Coates Screen, Германия). Модификацию графитовых стержней наночастицами MnO2, синтезированными в обращенных мицеллах осуществляли следующим образом: за один цикл нанесения на рабочую поверхностью электрода, наносили одну каплю мицеллярного раствора диоксида марганца в гексане с АОТ объемом 3.4 мкл. Электрод высушивали в течение 1 минуты на воздухе при комнатной температуре, за это время гексан полностью испарялся. Цикл нанесения повторяли необходимое количество раз, затем промывали электрод смесью метанола с ацетоном для удаления АОТ и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для модификации планарных графитовых электродов водными золями наночастиц MnO2 на поверхность электрода наносили каплю гидрозоля объемом 10 мкл, электрод высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем промывали бидистиллированной водой, излишки воды удаляли и прогревали электроды 1 час при 60oC в термостате. Для изготовления холиноксидазных электродов конструкции ПДДА/ХО на рабочую поверхность электрода наносили каплю водного раствора ПДДА объемом 5 мкл, выдерживали 10 минут, не допуская высыхания капли, затем электрод промывали бидистиллированной водой для удаления неспецифически адсорбировавшихся молекул, стряхивали излишки воды и высушивали электрод на воздухе при комнатной температуре. После этого наносили каплю раствора ХО объемом 5 мкл, снова выдерживали 10 минут, затем промывали водой и высушивали. Аналогичную процедуру использовали для изготовления электродов других конструкции (ПДДА/ПАСН)2/(ПДДА/ХО)n на планарных графитовых электродах.
Электрохимические измерения активности электродов проводились в амперометрическом режиме в 50 мМ буфере Hepes, 30 мМ KCl, pH 7.5 при помощи потенциостата IPC-2000 (Кронас, Россия).
Результаты и обсуждение Исследование электрохимических свойств наночастиц диоксида марганца, синтезированных в обращенных мицеллах. Синтез в обращенных мицеллах является одним из методов, широко использующимся для получения различных типов наночастиц. Нами было проведено исследование возможности синтеза наночастиц MnO2 в системе гексан-АОТ-вода и изготовления на их основе пероксид-чувствительного покрытия.
В целях оптимизации условий синтеза наночастиц для последующего изготовления пероксид-чувствительных электродов была проведена серия экспериментов, в которых варьировался параметр степень гидратации (w0=[H2O]/[АОТ]) и концентрации Ac2Mn и KMnO4 и перманганата калия в исходных водных растворах. Было показано, что электрохимический сигнал возрастает при увеличении параметра w0, однако, при w0 выше 5 наблюдается разрушение мицелл выпадение MnO2 в осадок, что сопровождается резким снижением электрохимического отклика изготовляемых электродов. Для различных степеней гидратации при определенных концентрациях диоксида марганца в мицеллярном растворе величина аналитического сигнала выходит приблизительно на один и тот же уровень. Дальнейшая работа велась с наночастицами, полученными в мицеллярных растворах, w0 в которых составляла 5 и исходные концентрации водных растворов ацетата марганца (II) и перманганата калия - 0.025 М и 0.037 М соответственно.
Исследования полученных наночастиц методом ПЭМ показали, что препараты состоят из нитевидных объектов толщиной около 1 нм и длиной 20 30 нм, объединенных в аморфные скопления (рис. 1).
Рис. 1. ПЭМ-изображения наночастиц MnO2, полученных в обращенных мицеллах.
Кроме того, иногда на образцах встречаются шарообразные кристаллические образования диаметром около 30 нм. Спектры потерь энергии электронов для обоих типов структур имеют максимумы, соответствующие марганцу в районе 645 и 655 еВ.
В целях оптимизации процедуры изготовления медиаторного слоя было изучены влияние числа циклов нанесения наночастиц и операционная стабильность электрода. Было показано, что отклик на стандатрную концентрацию H2O2 увеличивается с одного до 4-х циклов нанесения, после чего практически не меняется (рис. 2). В дальнейшей работе электроды готовили, повторяя цикл нанесения 8 раз Операционная стабильность таких электродов характеризовалась постепенным падением (данные приведены на рисунке 3, а). Декремент падения составляет от 0.5 до 2% за одно измерение Увеличение операционной стабильности сенсоров было достигнуто за счет формирования на их поверхности тонкого слоя из ацетата целлюлозы (рис. 3, б). Операционная стабильность такого сенсора характеризуется вариационным коэффициентом 4.9±0.1%, декремент падения составляет не более ±0.2% за измерение.
400 б) I, нА I, нА а) 0 2 4 6 8 0 5 10 15 Число циклов нанесения Номер измерения Рис. 2. Зависимость аналитического Рис. 3. Операционная стабильность сигнала от числа циклов нанесения электродов. а) не покрытых, б) мицеллярного раствора диоксида покрытых ацетатцеллюлозной марганца. мембраной.
Долговременная стабильность определялась для электродов, стабилизированных и нестабилизированных ацетатцеллюлозной мембраной. В обоих случаях электроды демонстрировали стабильный аналитический сигнал при хранении в течение месяца.
В целях оптимизации условий анализа H2O2 было изучено влияние рабочего потенциала, ионной силы и pH измерительного буфера на величину аналитического отклика электрода. При потенциале от 350 до 500 мВ наблюдаются максимальные отклики на H2O2. (рис. 4) При дальнейшем повышении потенциала величина откликов падает, а шум базовой линии увеличивается, что затрудняет проведение точных измерений для низких концентраций.
0, 0, 0, 0, I, мкА I,мкA 0, 0, 0, 0, 200 300 400 500 600 700 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8, E, мВ pH Рис. 4. Зависимость величины Рис. 5 Зависимость величины аналитического откликов на 10 мкМ аналитического отклика на 10 мкМ H2O2 от потенциала измерения против H2O2 от pH Ag/AgCl-электрода Измерения, проведенные при различной ионной силе буфера, показали рост аналитического отклика от 0 до 30 мМ KCl, при дальнейшем увеличении ионной силы изменения величины аналитического сигнала не происходит. В интервале pH буферного раствора от 6.5 до 8.5 наблюдается наибольшая величина отклика (рис. 5). Для более низких значений pH величина наблюдаемого аналитического сигнала меньше. Как показало исследование операционной стабильности электродов при различных pH, в кислой среде величина наблюдаемого аналитического сигнала уменьшается от измерения к измерению. Такая картина свидетельствует о том, что в кислой среде происходит разрушение пероксид-чувствительного слоя за счет растворения MnO2.
Таким образом, в качестве оптимальных условий измерения H2O2 были выбраны: рабочий потенциал 480 мВ, состав буферного раствора: 50 мМ Hepes, 30 мМ KCl, pH 7.5. В этих условиях были получены градуировочные зависимости и определены аналитические характеристики электродов: время развития 90% тока от максимального составляет 5 сек, предел обнаружения H2O2, рассчитанный по уравнению y=0.001+0.06455·x при уровне шума 2нА составил 7.8·10-8 M (3), линейный диапазон 7.8·10-8-1.0·10-4 M, чувствительность электродов составила 922±2мА/(М·см2).
Исследование медиаторных свойств гидрозолей диоксида марганца для анализа пероксида водорода и тиохолина. При апробации технологии формирования медиаторного слоя наночастиц MnO2, полученных в обратных мицеллах, были использованы графитовые стержни. В настоящее время для изготовления электрохимических сенсорных элементов используют планарные электроды, изготовленные при помощи трафаретной печати. Причиной этого является простота, низкая стоимость и одновременно универсальность данной технологии, позволяющей изготавливать планарные электроды различной конфигурации, в том числе миниатюризированные варианты сенсоров, что особенно важно при разработке портативных аналитических систем для АМЛ, ‘анализа по месту лечения’ (‘point-of-care’). Проведенные исследования показали, что использование технологии создания медиаторного слоя на основе наночастиц MnО2, полученных в обращенных мицеллах, не приводит к формированию активных и стабильно работающих конструкций при нанесении ферментов. Поэтому следующим шагом было получение гидрозолей нано частиц MnO2 и исследование их медиаторных свойств по отноше нию к процессам окисления перо ксида водорода и тиолов на поверхности планарных графи товых электродов. Диоксид мар ганца нерастворим в воде, однако наночастицы этого материала могут быть получены или ресуспендированы в воде с образованием гидрозолей При взаимодействии KMnO4 с MnCl2 в водном растворе образу ющийся диоксид марганца бы стро выпадает в осадок. Известно, что некоторые ионы, способные достраивать кристаллическую ре шетку или адсорбироваться на поверхности кристаллической фазы, препятствуют агрегации частиц, что позволяет получить Рис. 6. Фотографии и ПЭМ-изображения стабильный золь. Поэтому для золей диоксида марганца, через 2 часа после получения стабильного золя проведения реакции 2.5·10-4 M MnO2 было исследовано влияние перманганата калия а) с хлоридом марганца различных ионов. Для этого (II) (3.75·10-4 M) б) с ацетатом марганца реакция сопропорционирования - проводилась в присутствие на (II) (3.75·10 M). Спектр потерь энергии триевых солей анионов, взятых в электронов (в).
полуторократном избытке по отношению к хлорид-иону. Было показано, что ряд анионов, а именно: ацетат, гидрокарбонат, гидрофосфат и дигидрофосфат, способствуют образованию стабильного гидрозоля MnO2, в то время как в случае сульфата, фторида, карбоната и додецилсульфата происходит агрегация частиц и выпадение осадка (рис. 6, а).
По данным ПЭМ (рис. 6, б) частицы стабильного гидрозоля, полученного с использованием Ac2Mn, имеют форму складчатых плоскостей толщиной 0,3 0,6 нм и размерами 50-100 нм. Спектр потерь энергии электронов, полученный методом ПЭМ приведен на рисунке 6 (в). Интенсивные максимумы в районах 645 и 655 эВ подтверждают, что основным элементом частиц является марганец. Оптический спектр поглощения золя имеет максимум в районе нм, что, в соответствие с литературными данными, подтверждает наличие MnO2.
Дополнительное изучение стабильности гидрозоля проводили методом NTA (Nanoparticles Tracking Analysis). На рисунке 7 приведены данные по изменению концентрации частиц в гидрозоле (а) и их размеров (б), полученные методом NTA в течение 8-ми часов. Было показано, что изменения концентрации и размеров частиц за это время не происходит. Средний размер частиц согласно данным NTA составляет около 107 нм, значения диаметров, ниже которых лежат размеры 90 и 10 % частиц составляет соответственно и 50 нм.
1, 1, Концентрация, частиц1011/мл 1, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0,0 2,0 4,0 6,0 8, Время, ч а б Рис. 7. Зависимость а) концентрации частиц в гидрозоле б) размера частиц от времени.
По данным квазиупругого динамического светорассеянья гидродинамический радиус частиц составил 64 нм. Определение -потенциала методом измерения электрофоретической подвижности частиц в капилляре показало, что частицы золя заряжены отрицательно (величина -потенциала - мВ). Данный факт был также косвенно подтвержден тем, что золь коагулирует под действием катионов. Определены пороговые концентрации различных катионов, данные находятся в соответствие с поведением классических коллоидных систем.
Кристаллическая структура диоксида марганца была определена методом рентгеновской дифракции. Показано, что частицы имеют поликристаллическую природу, размер кристаллитов составляет около 2 нм. Характер дифрактограммы свидетельствует о наличии орторомбической симметрии и соответствует -MnO2 (ICDD –JCPDS Card No. 72-1983).
Известно, что тип кристаллической структуры MnO2 влияет на его электрохимические свойства. В связи с этим возникает необходимость проведения сравнительного анализа наночастиц MnO2 различных кристаллических модификаций в отношении их медиаторной способности обеспечивать окисление H2O2 и тиолов. Препараты аморфного и -MnO2, синтезированные в гидротермальных условиях, были любезно предоставлены сотрудниками лаб. катализа и газовой электрохимии хим. факультета МГУ.
Наночастицы MnO2 различных кристаллических модификаций были охарактеризованы методами рентгеновской дифракции, СЭМ (рис. 8) и NTA.
Для получения гидрозолей препараты диспергировали при помощи ультразвука в ацетатном буфере.
а б в г Рис. 8. СЭМ-изображения препаратов MnO2, (а) – аморфная модификация, (б, в) -модификация (г) – -модификация.
Исследования электрохимических свойств проводили, нанося полученные гидрозоли наночастиц MnO2 на поверхность планарных графитовых электродов и измеряя величину аналитического сигнала электродов на стандартные концентрации H2O2 и тиохолина.
Табл. 1. Сравнение медиаторной активности MnO2 Наибольший отклик в обоих случаях различных кристаллических модификаций Отклик электрода Отклик электрода наблюдается для Тип MnO2 на 8 мкМ на 10 мкМ H2O2, MnO2 (табл. 1). Таким -MnO тиохолина, нА нА образом, аморфный 28 + 13 100±23 является наиболее -MnO2 эффективным 15 + 6 175± -MnO2 медиатором окисления 11 + 3 115± -MnO2 тиолов и H2O2.
129 + 28 233± В целях оптимизации условий формирования медиаторного слоя -MnO была изучена зависимость величины аналитического отклика на 1 мкМ H2O2 от концентрации MnO2 в гидрозоле. Данные приведены на рис. 9, в качестве характеристики концентрации используется оптическая плотность гидрозоля при 370 нм.
I, nА 0 0,5 1 1,5 2 2,5 OD Рис. 10. СЭМ-изображение Рис. 9. Зависимость аналитического поверхности планарных графитовых сигнала пероксид-чувствительного электродов, модифицированных сенсора от A370 гидрозоля -MnO2 наночастицами -MnO2.
На начальном участке зависимости с ростом концентрации MnO2, растет аналитический отклик, при определенных концентрациях достигается область насыщения, в которой дальнейшее увеличение концентрации MnO2 не приводит к существенному изменению величины аналитического сигнала. Для дальнейшей работы были выбраны исходные концентрации ацетата марганца 3.75·10-4M и перманганата калия 2.5·10-4M. Расчетная концентрация образующегося в этих условиях диоксида марганца составляет 30 мкг/мл, A370 = 1,6, что соответствует области плато на графике 9. Методом СЭМ было показано, что при такой модификации часть поверхности электрода покрыта наночастицами MnO2, представляющими собой объекты в характерной форме ‘сморщенных листов’ (рис. 10).
Из данных вольтаммограмм, полученных в отсутствие и присутствие H2O2 и и тиохолина (рис. 11, 12) была определена область рабочих потенциалов против Ag/AgCl электрода, при которых можно проводить анализ H2O2 и тиолов. Вольтаммограмма, полученная в присутствие 10-4М пероксида водорода на модифицированном электроде, характеризуется увеличением токов по сравнению в вольтамперограммой, полученной в отсутствие H2O2.
Максимальная разница токов между двумя кривыми достигается при 600 мВ.
Однако, при потенциалах выше 500 мВ в режиме стационарного потенциала наблюдается резкое увеличение базового тока и шумов. Поэтому, для оптимального проведения измерений H2O2 была выбрана область потенциалов от 250 до 500 мВ. В присутствие тиохолина, начиная с потенциала +300 мВ относительно электрода сравнения (Ag/AgCl) наблюдается увеличение анодного тока, разница между анодными токами в присутствии и отсутствие тиохолина достигает максимума при потенциале +410 мВ и существенно не меняется при дальнейшем увеличении потенциала. Для дальнейших измерений тиохолина был выбран потенциал +450 мВ.
II 6 I I II 4 I, мкA I, мкA 2 - - 200 400 600 200 300 400 500 600 700 E, мВ E, мВ Рис. 11. Линейные вольтамперограммы Рис. 12. Циклические электродов, модифицированных -MnO2, в вольтаммограмы электродов, модифицированных -MnO2, в отсутствие (I) и присутствии 0,1 мМ H2O (II). отсутствие (I) и присутствии (II) 0,4 мМ тиохолина При помощи оптимизированной конструкции были получены градуировочные зависимости для H2O2 и ряда органических тиолов (тиохолина, цистеина и глутатиона), из которых рассчитаны аналитические характеристики электродов. Данные приведены в таблице 2.
Табл. 2. Аналитические характеристики электродов, модифицированных -MnO2.
Время выхода Предел Е, Линейный Чувствительность, Аналит аналитического обнаруже мА/(М см2) мВ диапазон, М сигнала, с ния, М 4.510-8 4.510-8-1.010- H2O2 250 6 2.210-8 2.210-8-1.010- H2O2 480 6 6·10-8 5·10-7-1·10- тиохолин 450 15 9·10-8 5·10-7-1·10- цистеин 450 8 2·10-7 5·10-7-1·10- глутатион 450 10 Таким образом, электроды на основе -MnO2 позволяют измерять в 5 раз меньшую концентрацию H2O2, чем было описано в ранее опубликованных работах по пероксид-чувствительным сенсорам на основе диоксида марганца, и в 8 и более раз меньшую концентрацию тиохолина, чем описанные электроды на основе других электрохимических медиаторов.
Операционная стабильность электродов при анализе H2O характеризуется разбросом значений в 5.5±1.7% при 250 мВ и 5.0±3.0% при 480 мВ по результатам 20-ти последовательных измерений Операционная стабильность при анализе тиохолина характеризуется разбросом значений в 4,0±0.2% по результатам 10 последовательных измерений. Данное исследование подтверждает важную особенность нового медиатора – способность к многократному использованию электродов на его основе для анализа тиолов без отравления катализатора.
Для изучения долговременной стабильности электроды хранили на воздухе при комнатной температуре и проводили измерения аналитического отклика на 10-5 М H2O2 каждую неделю в течение двух месяцев с момента изготовления. По результатам исследований изменения активности электродов в течение двух месяцев хранения не наблюдалось.
Холиноксидазные электроды на основе гидрозоля наночастиц -MnO2. Для изготовления ХО биосенсора использовали технологию послойного нанесения полиэлектролитов (ПНП), позволяющую формировать на поверхности послойные конструкции заряженных объектов, в том числе белковой природы.
Изоэлектрическая точка для холиноксидазы составляет 4.1, это означает, что в оптимальном диапазоне значений pH (7.0 8.5), молекулы фермента заряжены отрицательно. Для иммобилизации фермента была применена предварительная модификация поверхности пероксид чувствительного слоя поликатионом (ПДДА) путем адсорбции из водного раствора (рис.
13). Далее на подготовленную таким образом поверхность адсорбировали фермент. В целях оптимизации процедуры изготовления холиноксидазного электрода и измерений холина были изучены активность электрода (аналитический отклик на стандартную концентрацию холина) и операционная стабильность (изменение активности Рис. 13. Схема изготовления электрода в ряду последовательных холиноксидазного электрода на измерений) в зависимости от разных основе -MnO2 конструкции параметров. Варьируемые параметры:
ПДДА/ХО по технологии ПНП концентрация фермента в растворе, влияние подслоев поликатион/полианион, влияние числа слоев поликатион/ХО, потенциал измерений и pH рабочего буферного раствора.
Зависимость величины аналитического от Табл. 3. Влияние концентрации ХО клика на 10-4М холина от концентрации в растворе для адсорбции на холиноксидазы в растворе, из которого величину аналитического отклика происходила адсорбция фермента была и воспроизводимость методики исследована в диапазоне 0.05-4.00 мг/мл.
изготовления биосенсоров (табл. 3). С увеличением концентрации ХО Концентрация Iср, R.S.D., наблюдается рост величины аналитического холиноксидазы, нА % отклика на холин т.к. на поверхность мг/мл электрода адсорбируется большее 0.05 58 количество фермента. Однако, одновременн 0.10 98 о увеличива-ется R.S.D. В качестве 0.50 239 оптимальной была выбрана концентрация 1.00 276 0,5 мг/мл, для которой наблюдаются 2.00 318 достаточно высокие значения величины 4.00 331 активности, а значение величины стандартного отклонения (R.S.D.), вычисленное для 10 электродов, не превышает 15 %.
Для изучения операционной стабильности холиноксидазных биосенсоров были получены зависимости аналитического сигнала на 10-4М холина по результатам 10 последовательных измерений. Для каждой определены декремент падения (процент снижения аналитического сигнала в пересчете на одно измерение, вычислялся как тангенс угла наклона прямой) и вариационный коэффициент (R.S.D., среднеквадратичное отклонение).
Операционная стабильность сенсоров, конструкции MnO2/ПДДА/ХО, исследованная при рабочем потенциале 480 мВ и pH рабочего буферного раствора 7.5 показала декремент падения аналитического сигнала 2.1±0.1% за одно измерение и вариационный коэффициент за 10 измерений 7.0±0.3%.
Полученные величины свидетельствуют о недостаточной операционной стабильности. Причины этого могут заключаться либо в недостаточной стабильности пероксид-чувствительного слоя, разрушение которого ведет к потере стабильности всей конструкции в целом, либо в недостаточной стабильности слоя ПДДА/ХО. Ранее была продемонстрирована хорошая операционная стабильность медиаторного слоя в анализе пероксида водорода и тиохолина. Однако, остается возможность, что его разрушение все-таки происходит, но настолько медленно, что его нельзя отследить, измеряя ответы на стандартную концентрацию H2O2 или тиохолина. Т.к. выбранная концентрация MnO2 в гидрозоле лежит в области насыщения на зависимости отклика на H2O2 от концентрации (рис. 9), то даже существенное уменьшение количества медиатора на поверхности электрода практически не влияет на величину аналитического сигнала на пероксид водорода. В случае холиноксидазного электрода, нестабильность медиаторного слоя может приводить к тому, что фермент будет десорбироваться с поверхности электрода и аналитический сигнал на холин будет уменьшаться.
Для исследования этого вопроса концентрация диоксида марганца при изготовлении пероксид-чувствительного слоя холиноксидазных сенсоров уменьшалась в 10 раз, c 30 мкг/мл (A370 = 1,60) до 3 мкг/мл (А370=0,16), и измерения проводились в области, где изменение количества медиатора на электроде приводит к значительному изменению аналитического сигнала на пероксид водорода. Результаты исследований говорят о том, что пероксид чувствительный слой в этих условиях стабилен (декремент падения составил 0.2±0.4%, коэффициент вариации за 10 измерений 2.0±0.1%). Поэтому был сделан вывод о необходимости дополнительной стабилизации холиноксидазного слоя. Для этого провели предварительную модификацию поверхности пероксид-чувствительного слоя двумя дополнительными подслоями ПДДА/ПАСН с целью ее выравнивания. В результате такой модификации удалось снизить декремент падения аналитического сигнала на холин. Для электродов конструкции (ПДДА/ПАСН)2/ПДДА/ХО он составил 0.6±0.2% за измерение, вариационный коэффициент за 10 измерений 1.9±0.4%.
Было также исследовано влияние условий амперометрической детекции холина на операционную стабильность холиноксидазных электродов. При минимальном стационарном потенциале который позволяет регистрировать пероксид водорода - 250 мВ - декремент падения аналитического отклика на холин электродов конструкции (ПДДА/ПАСН)2/ПДДА/ХО составил 2.1±0.4, вариационный коэффициент за 10 измерений 9.6±3.0%. Изучение операционной стабильности пероксид-чувствительного слоя показало, что при низких измерительных потенциалах, происходит уменьшение количества MnO на поверхности электрода, за счет перехода в растворимую форму Mn II и III.
Это в свою очередь приводит к разрушению холиноксидазного слоя. При потенциале 480 мВ разрушения слоя MnO2 не происходит, что определяет операционную стабильность холиноксидазных электродов при этих условиях.
Таким образом, оптимальным потенциалом для измерения холина является 480 мВ.
Изучение зависимости величины аналитического сигнала на холин от pH рабочего буферного раствора показало, что с ростом pH увеличивается величина аналитического сигнала на холин. Эти результаты находятся в соответствии с известным из литературы pH-оптимумом работы фермента холиноксидазы, который лежит вблизи значения 8.0. Однако, операционная стабильность холиноксидазных биосенсоров при pH измерительного буфера 8. ниже, чем при 7.5, декремент падения составляет 3.2±0.0% за измерение, значение R.S.D. за 10 измерений 11.1±0.4%. Таким образом, оптимальным значением pH рабочего буферного раствора для холиноксидазных электродов является 7.5.
Следующим этапом работы было увеличение чувствительности холиноксидазных электродов. Чтобы повысить чувствительность электродов, необходимо увеличить количество фермента в поверхностном слое. Как было показано выше, увеличение количества фермента на поверхности электрода путем повышения его концентрации в растворе при адсорбции ограничено т.к.
при высоких концентрациях ухудшается воспроизводимость методики (табл. 3).
Однако, метод ПНП позволяет наносить несколько слоев фермента, путем чередования их со слоями поликатиона. В таблице 4 приведены результаты измерений аналитического отклика холиноксидазных электродов конструкции (ПДДА/ПАСН)2/(ПДДА/ХО)n от числа слоев ПДДА/ХО. Конструкции (ПДДА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)2 и (ПДДА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)3 имеют большую активность, чем конструкция (ПДДА/ПАСК)2/ПДДА/ХО, однако дальнейшее увеличение количества слоев ПДДА/ХО не влияет на активность сенсоров.
Было также замечено, что при увеличении число слоев ХО с 1-го до 3-х улучшается воспроизводимость от электрода к электроду. Вероятно, при увеличении числа слоев происходит более равномерное заполнение поверхности электрода молекулами фермента.
Табл. 4. Влияние числа слоев ПДДА/ХО на величину аналитического сигнала на 10-4М холина холиноксидазных электродов конструкции (ПДДА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)n Отношение величины аналитического отклика на 10-4 М холина для конструкции с n слоями ХО к n RSD, % аналитическому отклику для 1-го слоя ХО, In/I 1 1 2 1,29 3 1,52 4 1,53 5 1,25 6 1,40 8 1,48 10 1,37 Анализ градуировочных зависимостей аналитического сигнала от концентрации холина позволил вычислить следующие аналитические характеристики сенсоров:
Конструкция (ПДДА/ПАСК)2/ПДДА/ХО -предел обнаружения по холину, рассчитанный по уравнению y=2.9x+3.5 при уровне шума 0.3нА составил 3.010-7 M (3), -линейный диапазон 5.010-7-1.010-4 M, -чувствительность составила 59 ± 3мА/(Мсм2).
Конструкция (ПДДА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО) -предел обнаружения по холину, рассчитанный по уравнению y=5,146·x при уровне шума 0.3нА составил 1.3.010-7 M (3), -линейный диапазон 5.010-7-1.010-4 M, -чувствительность составила 103 ± 3мА/(Мсм2).
Для получения статистических данных по воспроизводимости холиноксидазных электродов, содержащих 3 слоя холиноксидазы, было изготовлено 5 серий по 5 электродов и проведены измерения аналитического отклика этих электродов на стандартную концентрацию холина.
-среднее значение отклика для 25-ти электродов составило: 559±53 нА, -RSD для 5-ти электродов внутри одной серии составило: 9±2 % -RSD средних значений откликов между сериями составило: 9% Значения пределов обнаружения близки (по пероксиду водорода) или ниже (по холину) по сравнению с ранее разработанными в лаб Посгеномной химии сенсорами с использованием технологии электрохимического осаждения MnO2.
Для изучения операционной стабильности было изготовлено 5 электродов конструкции (ПДДА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)3, для каждого было сделано последовательных измерений на 10-4М холина в 50 мM буфере Hepes c 30 мМ КCl, pH 7.5 при рабочем потенциале 480 мВ. Среднее значение декримента падения (dI/dI0, % за одно измерение) составило -0,65±0,43 %, значение RSD составило 2,6±1,4% Долговременная стабильность изучалась для электродов, конструкции (ПДДА/ПАСН)2/ПДДА/ХО, которые хранили при +4оС, в герметичной упаковке с осушителем. Об активности электродов судили, измеряя раз в неделю значения аналитического отклика на тестовую концентрацию (10-4 М) холина на трех электродах при 480 мВ. Было показано, что остаточная активность электродов на 21-й день хранения составила 74.5% от начальной активности.
Анализ активности БХЭ и ингибиторов холинэстераз при помощи электродов, модифицированных наночастицами -MnO Основной областью применения разработанных электрохимических сенсоров является анализ активности холинэстераз и определение содержания их ингибиторов в образцах.
Возможность анализа активности холинэстераз при помощи разработанных электродов была исследована на примере БХЭ. В основу анализа легли два подхода:
1) Измерение холина, образующегося в реакции гидролиза природного субстрата БХЭ бутирилхолина (БХ), при помощи холиноксидазного электрода согласно схеме:
Холин + 2O2 + H2O Холиноксидаза Бетаин 2 H2O MnO 2e Mn (II, III) O2 + 2 H2O 2) Измерение тиохолина, образующегося в реакции гидролиза синтетического субстрата пропионилтиохолина (ПТХ), при помощи электрода, модифицированного медиаторным слоем MnO2 согласно схеме:
2 Тиохолин MnO 2e Дитиобисхолин + 2 H+ Mn (II, III) Определение ингибиторов холинэстеразной активности проводили, инкубируя БХЭ с ингибитором, и измеряя активность БХЭ до и после инкубации Измерение активности БХЭ проводили в двух режимах:
1) режим измерения накопленного продукта при перемешивании:
фермент инкубировали в течение фиксированного времени с ПТХ или БХ, после чего измеряли концентрацию наработанного (тио)холина в ячейке с перемешиванием. Аналитическим сигналом в этом случае являлся отклик электрода на (тио)холин (рис.14) 2) кинетический режим: хроноамперометрические кривые накопления (тио)холина получали, проводя гидролиз субстрата в электрохимической ячейке с перемешиванием при включенном потенциале. После добавления ПТХ (БХ) в электрохимическую ячейку, определяли тангенс угла наклона его спонтанного гидролиза, а затем, добавляя в ячейку БХЭ, наблюдали суммарный гидролиз субстрата. Скорость ферментативного гидролиза определяли по разнице скоростей суммарного и спонтанного гидролиза субстрата (рис. 15).
Рис. 14. Типичный вид аналитического Рис. 15. Типичный вид аналитического отклика холиноксидазного биосенсора отклика на последовательное на добавление в электрохимическую добавление в электрохимическую ячейку холина ячейку БХ и БХЭ В таблице 5 приведены аналитические характеристики разработанных методов определения активности БХЭ. Таким образом, было показано, что разработанные холиноксидазные и тиохолин-чувствительные электроды могут применяться для определения активностей ферментов холинэстераз с высокой чувствительностью. Для сравнения, спектрофотометрический метод Эллмана позволяет определять БХЭ в концентрации 1 · 10-10 М.
Табл. 5. Аналитические характеристики различных режимов определения активности БХЭ.
Предел Режим Субстрат/электрод обнаружения Чувствительность измерения БХЭ, М накопления 1 · 10- БХ/холиноксидазный 101 нА/нМ продукта 5 · 10- БХ/холиноксидазный кинетический 5,02 нА/(нМ · с) ПТХ/тиохолин- накопления 2 · 10-12 630 нА/нМ чувсвтвительный продукта ПТХ/тиохолин 1 · 10- кинетический 8,16 нА/(нМ · с) чувсвтвительный Анализ ингибиторов холинэстеразной активности при помощи холиноксидазных электродов проводили в кинетическом режиме. В таблице приведены диапазоны определяемых концентрация ряда ингибиторов.
Таким образом, показана Табл. 6. Диапазоны определяемых концентраций различных ингибиторов при возможность использования измерении относительной активности БХЭ разработанных холиноксидазных при помощи холиноксидазных электродов электродов для высокочувстви Диапазон тельного определения ингибито определяемых ров холинэстеразной Ингибитор концентраций, активности. Применение разра нМ ботанного метода ингибиторного Хлорпирифос 0,04 – 0,46 анализа было опробовано на Диазинон 0,9 – 10,9 примере определения нейро токсичности препаратов сине Диизипропилфторфосфат 12 – зеленых водорослей из Карбофуран 160 – оз. Сестрорецкий Разлив. Работа проводилась на базе с Санкт-Петербургского Научного Центра Экологической Безопасности РАН. Отбор проб и верификация данных была проведена сотрудниками центра Зигель В.В. и Пилип А. Г. С использванием холин-чувствительных электродов были зарегистрированы сезонные колебания нейротоксиов в препаратах сине зеленых водорослей, отобранных в летний период 2008-2010 гг. Данные были верифицированы методом масс-спектрометрии.
Анализ ингибиторов на примере диазинона при помощи тиохолин чувствительных электродов проводили в трех режимах: кинетическом и режимах измерения накопленного продукта при перемешивании и без перемешивания (табл. 7). В последнем слечае использовались комбинированные плпнарные электроды, состоящие из рабочего графитового электрода, модифицированного наночастицами -MnO2 и Ag/AgCl электрода сравнения.
Табл. 7. Диапазоны определяемых концентраций диазинона при измерении относительной активности БХЭ при помощи тиохолин-чувствительного электрода.
Режим измерения Определяемый диапазон, нМ Кинетический 0,7-8, Измерения накопленного продукта при 0,9-10, перемешивании Измерение накопленного продукта без 1,3-14, перемешивания Таким образом, была продемонстрирована возможность использования разработанных тиохолин-чувствительных электродов для анализа ингибиторов холинэстеразной активности в различных режимах проведения измерений, в том числе в режиме, не требующем перемешивания и удобном для проведения анализов в ‘полевых условиях’, с высокой чувствительностью.
ВЫВОДЫ 1) С использованием обращенных мицелл синтезированы наночастицы MnO2, представляющие собой нитевидные образования диаметром 1 нм и длиной 20-30 нм. Исследованы медиаторные свойства этих наночастиц в реакции окисления пероксида водорода, получены аналитические - характеристики (предел обнаружения 7,8 · 10 М, чувствительность 922 мА/(М · см2).
2) Разработана методика получения стабильного гидрозоля наночастиц MnO2, имеющих гидродинамический радиус 60 нм по данным светорассеяния.
Показано, что частицы -MnO2 обладают более высокоактивными медиаторными свойствами по сравнению с аморфной и -модификациями. На основе полученного гидрозоля созданы высокочувствительные медиаторные слои, позволяющие определять пероксид водорода с чувствительностью мА/(М · см2) и пределом обнаружения 2,210-8 М.
3) Показано, что гидрозоль наночастиц -MnO2 позволяет формировать медиаторные слои более технологичным способом по сравнению с традиционно используемым электрохимическим осаждением, при этом не уступающие им по аналитическим характеристикам.
4) Разработан электрохимический формат определения тиолов с использованием наночастиц -MnO2 в качестве медиатора со следующими аналитическими характеристиками по тиохолину: чувствительностью мА/(М · см2) и пределом обнаружения 6 · 10-8М. Полученное значение в 200 раз ниже предела обнаружения спектрофотометрических методов и в 8 раз ниже описанных электрохимических сенсоров на основе других медиаторов.
5) Разработан электрохимический холин-чувствительный биосенсор на основе наночастиц -MnO2. Оптимизирована конструкция биосенсора.
Показано, что конструкция (ПДДА/ПАСН)2/(ПДДА/ХО)3 обладает улучшенной стабильностью, активностью и воспроизводимостью. Чувствительность определения холина при помощи разработанного биосенсора составляет мА/(М · см2), предел обнаружения 1,3 · 10-7 М, что является лучшим значением для электрохимических холиноксидазных биосенсоров, описанных на сегодняшний день в литературе.
6) Разработанные тиохолин- и холин-чувствительных сенсоры были использованы для высокочувствительного анализа БХЭ и ингибиторов холинэстеразной активности. Апробация сенсоров была проведена на базе Санкт-Петербургского Научного Центра Экологической Безопасности РАН в условиях мониторинга нейротоксичности водоемов в период вредоносного цветения водорослей.
Список работ по теме диссертации 1. Dontsova E.A., Zeifman Y.S., Budashov I.A., Eremenko A.V., Kalnov S.L., Kurochkin I. N. Screen-printed carbon electrode for choline based on MnO nanoparticles and choline oxidase/polyelectrolyte layers // Sensors and Actuators B: Chemical, V 159, No 1, 2011, pp. 261-270.
2. Донцова Е.А., Будашов И.А., Еременко А.В., Кальнов С.Л., Курочкин И.Н., Трудил Д. Гидрозоль для формирования покрытий электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров и биосенсоров, способ его получения, электрохимический сенсор и биосенсор, способы их получения и применение // Патент РФ № 2419785 (27 мая 2011) 3. Еременко А.В., Курочкин И.Н, Варфоломеев С.Д., Осипова М.С.,.
Сиголаева Л.В, Донцова Е.А., Донченко К.В., Жаковская З.А., Зигель В.В., Пилип А.Г. Биосенсорные системы как средства ранней диагностики экологической безопасности // Научно-информационный бюллетень 'Экологическая безопасность' № 1-2 (21-22). 2009. Санкт Петербург. стр 16-24.
4. Донцова Е.А., Будашов И.А., Еременко А.В., Курочкин И.Н. Пероксид чувствительный амперометрический сенсор на основе наночастиц диоксида марганца // Российские нанотехнологии Т 3 № 7-8, 2008, стр.
133-143.
5. Курочкин И.Н., Еременко А.В., Сиголаева Л.В., Громова М.С., Донцова Е.А., Торгонская А.А., Крайнова Н.А., Дубачева Г.В., Порус М.С., Махаева Г.Ф., Рудакова Е.Н., Пергушов Д.В., Будашов И.А., Евтушенко Е.Г., Зезин А.Б., Варфоломеев С.Д. Фермент-полимерные нанокомпозиты как основа диагностической платформы для медико-биологических исследований. С. 219-296. В книге Посгеномные исследования и технологии (под ред. Варфоломеева С.Д.), Москва. 2011.
6. Евтушенко Е.Г., Донцова Е.А., Курочкин И.Н. Практические примеры использования метода NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) для изучения нанобиообъектов, процессов агрегации белков, а также общей характеристики наночастиц // 2-ой Международной Школы ‘Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина’, 19-24 сентября 2011, Московская обл. С. 28.
7. Донцова E.A., Сиголаева Л.В., Пилип А.Г., Еременко А.В., Курочкин И.Н., Планарные амперометрические сенсоры на основе наночастиц диоксида марганца и холиноксидазы для анализа холинэстераз и их ингибиторов // VI -го Московского Международного Конгресса ‘Биотехнология: состояние и перспективы развития’, 21-25 марта 2011, Москва. С. 268.
8. Dontsova E.A. Investigation of including MnO2 nanoparticles and antibodies into polymer multilayered thin films // ICYS-ICMR Summer School on Nanomaterials, July 22-28 2006, Tsukuba, Japan. P. 41.