Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона для местного применения.
На правах рукописи
Выжлова Евгения Николаевна
Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона
для местного применения.
03.00.06 - Вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2008 г.
2
Работа выполнена в Государственном учреждении Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН и в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.
Ивановского РАМН.
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Валентина Васильевна Малиновская доктор биологических наук, профессор Георгий Артемьевич Галегов
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Николай Николаевич Носик доктор биологических наук Сергей Викторович Ожерелков
Ведущая организация: ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Защита диссертации состоится «18» апреля 2008 г. в 10-00 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.026.01 при Государственном учреждении Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН по адресу 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН.
Автореферат разослан «18» марта 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук О.А. Медведкина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Проблема терапии наиболее распространенных и социально значимых вирусных инфекций (ОРВИ, инфекции вируса семейства герпеса) крайне актуальна в настоящий момент, поскольку именно эти инфекции относятся к самым распространенным вирусным инфекциям среди населения. Местные проявления герпетической, аденовирусной или гриппозной инфекции встречаются практически у каждого человека ежегодно.
В работах (Ванько Л.В., Кудашов Н.И., и др., Железникова Г. Ф., Иванова В. В. и др., Коломиец А.Г., Малевич Ю.К., Коломиец Н.Д.) установлено, что инфицирование вирусами семейства герпеса или вирусами семейства гриппа может существенно изменять иммунный ответ организма на различные патогены. Выявлено (Мальханов В.Б. и др., Железникова Г. Ф.
и др.), что при персистенции ВПГ – инфекции, аденовируса или вируса гриппа в тканях происходит нарушение функционирования иммунитета на местном уровне, что может приводить к вторичным бактериальным инфекциям, а также к рецидиву заболевания.
Местные офтальмологические проявления ВПГ и аденовирусной инфекции имеют общую симптоматику, зачастую невозможно четко дифференцировать эти заболевания без серодиагностики возбудителя. Для вирусов гриппа так же актуальна проблема серодиагностики, поскольку многие вирусы и другие микроорганизмы, поражающие респираторный тракт, имеют общую симптоматику, а диагностика возбудителей инфекции проводится не повсеместно.
Обилие специфических противовирусных препаратов не решает проблему полностью, поскольку довольно часто имеет место инфицирование вирусами с устойчивостью к специфическим лекарственным препаратам. Специфические противогерпетические препараты, обладая высокой активностью при купировании проявлений инфекции, не достаточно эффективны в предупреждении возникновения рецидивов. Следует отметить, что специфические химиотерапевтические препараты для терапии аденовирусных заболеваний отсутствуют.
Сложности при идентификации возбудителя, изменчивость возбудителей и устойчивость к химиопрепаратам требуют применения для терапии заболеваний универсальных противовирусных средств, обладающих активностью по отношению к широкому спектру вирусов.
Показано участие системы антиокислительной защиты организма в патогенезе вирусных и бактериальных инфекций, и в развитии многих других заболеваний (Владимиров Ю.А., Волгарев А.П., Горбунов Н.В., Быкова Н.О.). Доказано участие антиоксидантов в регуляции клеточного иммунитета (Новоселова Е. Г., Макаp В. P., Семилетова Н. В., и др., Stagnaro R., Pierri I., Piovano P., at all). Внутриклеточный окислительно-восстановительный баланс является регуляторным фактором в процессах Т- клеточной активации, секреции лимфокинов макрофагами, а также клеточной гибели при апоптозе. Выявлено стимулирующее воздействие антиоксидантов на фагоцитирующую активность макрофагов, антиоксиданты защищают Т-клетки от гибели по апоптотическому типу под воздействием ФНО (Чекнев С. Б.). Показано, что антиоксиданты обладают противовирусной активностью in vitro: при использовании антиоксидантов наблюдается торможение развития вирус – индуцированного цитопатического действия вируса на культуру клеток (Ананьев В.А., и др.).
Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2 является аналогом нативного интерферона альфа человека, относящегося к интерферонам первого типа, обладает противовирусными, иммуномодулирующими и антипролиферативными свойствами, и антимикробной активностью за счет способности стимулировать систему фагоцитов. ИФН является универсальным противовирусным средством и высоко эффективен в отношении широкого спектра вирусов (Ершов Ф.И., 90, 145).
В исследованиях (Малиновская В.В.) показано, что антиоксиданты способны влиять на функционирование и активность системы ИФН в организме.
Согласно данным литературы (Dal Negra et all., Steward, A., Bayley, D.L., Howes, C., Tupasi T.E. et all) местное применение препаратов интерферона для терапии вирусных инфекций является перспективным направлением, поскольку обеспечивает высокую концентрацию интерферона в очаге воспаления, и даёт возможность проводить кроме противовирусной терапии местную иммунокоррекцию. Доказано, что альтернативные пути введения лекарственных веществ через различные слизистые оболочки или кожу в некоторых случаях более приемлемы, поскольку не требуют специальных навыков и не оказывают негативного воздействия на внутренние органы человека (Aungst, B.J., Rogers, N.J., Shefter, E., Elkayam, R. Et all, Senel S., Kremer M., Nagy K., Squier C.).
Таким образом, разработка новой комбинированной пролонгированной лекарственной формы для местного применения в виде раствора, включающей интерферон альфа- человеческий рекомбинантный, комплекс антиоксидантов и другие вспомогательные вещества, а также изучение её противовирусной активности, в том числе совместно с другими противовирусными средствами является перспективной задачей.
Цели и задачи исследования Цель исследования:
разработать новую пролонгированную лекарственную форму для местного применения, обладающую широким спектром противовирусной активности на основе интерферона в комбинации с антиоксидантами и другими вспомогательными веществами.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
Обосновать состав и изучить взаимодействие основных и вспомогательных компонентов и их концентрационных соотношений с целью обеспечения необходимых физико химических, биологических и фармацевтических свойств новой лекарственной формы.
Изучить активность новой лекарственной формы на модели культуры клеток с использованием эталонных штаммов вирусов простого герпеса первого и второго типа, аденовируса и вирусов гриппа.
Изучить активность новой лекарственной формы на модели культуры клеток с использованием вирусов простого герпеса и вирусов гриппа с лекарственной устойчивостью к противовирусным препаратам.
Изучить эффективность новой лекарственной формы в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса и эпидемических штаммов вирусов гриппа сезона 2006 – 2007 года.
Исследовать возможность сочетанного применения новой лекарственной формы и других противовирусных препаратов, активных в отношении вирусов герпеса и гриппа (нуклеозидов и нуклеотидов, ациклических аминов, производных фосфоновой кислоты). Оценить эффективность комбинации новой лекарственной формы и противовирусных препаратов в отношении вирусов герпеса и гриппа.
Научная новизна:
В опытах in vitro показано, что комбинация интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного, выбранного комплекса антиоксидантов унитиол - лимонная кислота, стабилизатора активности интерферона альбумина сывороточного человеческого, полимера – пролонгатора натрий - карбоксиметилцеллюлозы и других вспомогательных веществ (борной кислоты, натрия тетрабората, натрия хлорида) позволяет усилить специфическую противовирусную активность интерферона в несколько раз. Так в отношении ВПГ-1 штамм Л2 комплексный состав препарата обеспечивает усиление специфической противовирусной активности в 3,85 раза.
Выявлена значительная противовирусная активность новой лекарственной формы в отношении вирусов простого герпеса, в том числе по отношению к ВПГ-1 с лекарственной устойчивостью к ацикловиру, и по отношению к клиническим изолятам вируса простого герпеса. Новая лекарственная форма обладает выраженной противовирусной активностью по отношению к аденовирусу человека Ad5 и вирусам гриппа A H1N1/USSR/77, АH3N2/Aichi/68, варианту вируса гриппа АH3N2/Aichi/68, изолированному из легочной ткани инфицированных животных, и в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа А сезона 2006-2007 г., чувствительных и резистентных к римантадину, а такжев отношении эпидемического штамма вируса гриппа В сезона 2006-2007 г.
Установлено, что противовирусная активность разработанной лекарственной формы зависит от концентрации препарата, схемы внесения препарата и множественности инфицирования. Препарат обладает достаточной эффективностью при внесении одновременно или непосредственно после инфицирования, наиболее эффективно противовирусное действие препарата проявляется при предварительном внесении до инфицирования, что свидетельствует о потенциале лекарственной формы в качестве как лечебного, так и профилактического средства.
Выявлено, что разработанная лекарственная форма составляет эффективные комбинации со многими противовирусными препаратами, причем с некоторыми из них комбинирование носит синергидный характер: при совместном присутствии препаратов их концентрации, обладающие противовирусной активностью, значительно ниже, чем концентрации для взятых в отдельности соединений, что обосновывает принципиально новые схемы терапии вирусных инфекций.
Практическая значимость Разработан состав новой пролонгированной лекарственной формы широкого спектра действия на основе интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного в комплексе с антиоксидантами и другими вспомогательными веществами, стабильный в процессе хранения. Разработанная лекарственная форма удобна для применения при многих формах вирусных инфекций и может быть использована в тех областях клинической медицины, где ранее местная терапия препаратами интерферона не проводилась: в гинекологии при лечении герпес - ассоциированных эндометритов у женщин, а так же в урологии при лечении герпетических уретритов у мужчин и женщин. Доказана значительная противовирусная активность разработанного препарата в отношении вирусов гриппа, простого герпеса, аденовируса, в том числе в отношении вариантов вирусов с лекарственной устойчивостью к специфическим химиопрепаратам и в отношении клинических изолятов вирусов, выделенных от больных. Полученные данные о значительной противовирусной активности новой лекарственной формы в отношении различных видов вирусов позволят разработать эффективную тактику терапии в случае неэффективности традиционных химиопрепаратов.
Возможность комбинирования новой лекарственной формы с другими специфическими противовирусными препаратами даёт основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии вирусных инфекций, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений, и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой эффективности.
Внедрение результатов работы Состав разработанной лекарственной формы защищен патентом (Патент РФ RU «Пролонгированный раствор интерферона»/Малиновская В.В., Малиновский Е.Ю., Выжлова Е.Н.;
заявители и патентообладатели: Малиновская В.В., Малиновский Е.Ю., Выжлова Е.Н.- № 2004132134/15;
заявл. 11.04.2004;
опубл. 27.02.2006.-Бюл. №6.-7 с.). января 2007 года в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения и социального развития в ФГУ НЦЭСМП поданы документы на регистрацию разработанной лекарственной формы (торговое название Виферон, раствор для местного применения), в настоящий время проходит экспертиза с целью регистрации новой лекарственной формы:
RegWork 47886, RegNx 105216. В соответствии с требованиями Федерального закона №86 ФЗ от 22.06.1998 г. «О лекарственных средствах» и распорядительными документами Федеральной службы Росздравнадзора в рамках регистрации новой лекарственной формы были проведены исследования общетоксического и аллергенного действия. В результате экспериментального исследования, проведенного в Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов, г. Серпухов, на половозрелых и неполовозрелых животных, установлено, что препарат не обладает выраженными токсическими свойствами, не проявляет аллергизирующего и иммунотоксического воздействия, что даёт основание для проведения дальнейших клинических исследований эффективности и переносимости нового препарата.
Апробация работы Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва в году;
на международном симпозиуме Общества исследователей интерферонов и цитокинов в Оксфорде, Англия в 2007 г. По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы в отечественной и зарубежной печати, а также получен патент РФ RU 2270692 (Малиновская В.В., Малиновский Е.Ю., Выжлова Е.Н «Пролонгированный раствор интерферона»).
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании научной конференции отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 6 марта 2008 года.
Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводы и практические рекомендации и указателя литературы: изложена на 155 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 15 рисунками. Список литературы состоит из 218 работ отечественных (123) и зарубежных (95) авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований Вирусы. В работе использованы 23 штамма различных вирусов: вирус энцефаломиокардита мыши (ЕМС), штамм Кислинга 40614;
15 штаммов вируса простого герпеса: из них два эталонных штамма: ВПГ-1 штамм Л2 и ВПГ-2. 13 клинических изолятов, выделенных с использованием культуры клеток из материала, полученного от больных (слюна, моча, сперма), в период 2005-2006 года, а так же лабораторный штамм ВПГ-1 Л2 резистентный к ацикловиру;
эталонный вариант аденовируса человека Ad5;
штаммов вируса гриппа: из них 2 эталонных варианта - вирус гриппа A H1N1/USSR/77 и вирус гриппа АH3N2/Aichi/68, вариант вируса гриппа АH3N2/Aichi/68, изолированный из легочной ткани инфицированных животных, эпидемические штаммы вируса гриппа А сезона 2006-2007 г., чувствительные и резистентные к ремантадину, эпидемический штамм вируса гриппа В сезона 2006-2007 г. Штамм вируса энцефаломиокардита мыши был получен в отделе интерферона ГУ НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, другие эталонные штаммы были получены в лаборатории коллекционных штаммов вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Эпидемические штаммы вируса гриппа сезона 2006-2007 любезно предоставлены ведущим научным сотрудником ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Е.И. Бурцевой.
Культуры клеток. В работе использовали 5 линий культур клеток: культуру клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ);
культуру клеток почки африканской зеленой мартышки, клон Е (Vero Е6);
культуру клеток легкого эмбриона человека (MRC-5);
культуру клеток почки эмбриона человека, трансформированной ДНК аденовируса типа 5 (293);
культуру клеток почки собаки (MDCK). Использованные культуры относятся к перевиваемым монослойным культурам, культивирование и пересев культур осуществляли по общепринятым методикам с использованием питательных сред и эмбриональной телячьей сыворотки.
Определение цитотоксического действия веществ. О цитотоксическом действии различных веществ, включая человеческий рекомбинантный интерферон альфа-2, судили по влиянию присутствия этих веществ на жизнеспособность клеток и их морфологию. За 50% тканевую цитотоксическую концентрацию вещества (ТЦД50) принимали такую концентрацию, которая вызывала цитотоксические изменения в 50% клеток на 4 сутки наблюдения (через 96 часов), для идентификации живых и мертвых клеток использовали краситель трипановый синий. Также в работе определяли максимально переносимую концентрацию вещества (МПК) - концентрацию вещества, воздействие которой не вызывало видимых цитодеструктивных изменений клеточного монослоя.
Определение цитопатической дозы вируса. Определение 50% тканевой цитопатической дозы вируса (ТЦИД50) проводили микрометодом с использованием культуры клеток. За ТЦИД50 вируса принимали минимальное разведение вируса, вызывающее 50% поражение клеточного монослоя при отсутствии дегенерации клеточного монослоя в контроле. В работе также определяли тканевую цитопатическую дозу вируса методом бляшкообразования.
Определенную таким образом цитопатическую дозу вируса выражали как число бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл). Зная число клеток в 1 мл (посевная доза, умноженная на индекс пролиферации культуры), рассчитывали дозу вируса как число бляшкообразующих единиц на клетку (БОЕ/клетку).
Определение специфической противовирусной активности интерферона. Для определения специфической противовирусной активности препарата использовали индикаторный штамм вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) и 2-3 суточный монослой культуры клеток СПЭВ или Vero. Определение проводили в сравнении с Отраслевым стандартным образцом активности человеческого рекомбинантного интерферона альфа – (ОСО 42-28-369-03), активность которого составляет 106 МЕ/мл.
Определение противогерпетической, противоаденовирусной и противогриппозной активности веществ и препаратов in vitro. Проводили путем оценки способности препарата предотвращать развитие вирусиндуцированного цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, и путем оценки снижения инфекционного титра вируса под воздействием различных концентраций препарата. Концентрацию вещества, обеспечивающую 50% ингибирование вирусного ЦПД, обозначали как ИД50, концентрацию вещества, обеспечивающую полную 100% защиту клеточного монослоя от вирусиндуцированного ЦПД, обозначали как ЭД100. В качестве оценки цитотоксичности и активности соединений использовали понятие химиотерапевтического индекса (ХТИ), вычисляемого как отношение МПК к ИД50. Согласно данным литературы для химиотерапевтического препарата значение ХТИ должно быть более или равно 3.
Определение противовирусной активности комбинации соединений in vitro.
Проводили по методу Anhal at all, 1980 и Neyts J., De Clercg E, 1997. Концентрации одного вещества и другого в комбинации, которые приводили к 50% ингибированию вирусного ЦПД, обозначали как ИД50 и сравнивали по отношению к концентрации этого вещества, вызывающего 50% ингибирование вирусного ЦПД, если его исследовали не в комбинации.
Для оценки эффективности комбинации использовали понятие фракционного ингибирующего индекса (ФИК), значение которого вычисляли по формуле:
сумма ИД 50 (соединений в комбинации ) ФИК = сумма ИД 50 (соединений) При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении ФИК равном 1,0 -1,5 имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений.
Так же по результатам определения ИД50 двух веществ в комбинации строили изоболограммы по общепринятому методу: по оси абсцисс откладывали концентрации ИД одного вещества в комбинации, по оси ординат откладывали концентрации ИД50 другого вещества в комбинации. В этих координатах строили кривую, точки которой соответствовали 50% ингибированию вирусиндуцированного ЦПД комбинации веществ в соответствующих концентрациях. Синергидный противовирусный эффект комбинации веществ выражался в наличии экспоненциальной зависимости, радиус кривизны которой был направленной к центру оси координат, при наличии линейной зависимости эффект комбинации соединений приближался к аддитивному. При наличии экспотенциальной зависимости, радиус кривизны которой был направлен вверх - в противоположную от центра оси координат сторону, проявлялся антагонистический эффект комбинации веществ.
Препараты. Для разработки новой лекарственной формы использовали следующие вещества: интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2, субстанция ФСП 42-11082-06, производства ДГУПП Вектор-фарм, Новосибирская обл., пос. Кольцово, активность 4* МЕ/мл;
натрий карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ), марки Blanose 12М31Р, 7HOF, 7MF, производства фирмы Hercules, Франция;
гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ), марки Natrosol, НХ, 250 ННХ, производства фирмы Hercules, Франция;
альбумин сывороточный человеческий, 10% раствор для инфузий, ФСП 42-0381-3757-02, производства ОАО «Биомед» им. Мечникова, Россия;
димеркаптопропансульфонат натрия, под торговой маркой Унитиол, ФСП 42-0348-4718-03, производства ФГУП «Технолог СКТБ», Россия;
лимонная кислота, ГОСТ 908-79, производства ЗАО Белгородский завод лимонной кислоты «Цитробел», Россия;
борная кислота, ГФХ, производства ФГУП Мосхомфарм препараты им.
Семашко, Россия;
натрия тетраборат, ГФ Х, производства ЗАО Ярославская фармфабрика;
натрия хлорид, НД 42-10525-99, производства Акзо-Нобель Салт А.С., Дания;
цистеин НД 42-11785-01, производства Аджиномото Ко.Инк, Япония;
метионин НД 42-11249-06, производства Аджиномото Ко.Инк, Япония;
кофеин бензоат натрия, НД 42-12622-02, производства Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко.Лтд, Китай;
тиомочевина (тиокарбамид), (NH2)2CS, ГОСТ 6344-73, производства ООО «МСД», Россия;
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), каталог Fluka, кат.№.46081;
диметил сульфоксид, (CH3)2SO, каталог Sigma, кат.№.D2650;
рибофлавин, производства ДСМ Нутришнл Продактс Франс С.а.С, Франция;
натрия сульфит Na2SO3, каталог Sigma-Aldrich, кат.№.S0505;
натрия тиосульфат Na2S2O3, каталог Fluka, кат.№.72049;
натрия метабисульфит Na2S2O5, каталог Sigma-Aldrich, кат.№.161519;
аскорбиновая кислота, субстанция, НД 42 13554-05, производства ДСМ Нутришнл Продактс (ЮК) Лимитед, Великобритания;
калий йодистый KJ, субстанция, ФСП 42-0210-0884-01, производства ОАО Троицкий йодный завод, Россия;
дигидрокверцитин, субстанция, ФСП 42-0083-0185-06, производства ООО «Флавир», Россия;
L-Цистин, [-SCH2CH(NH2)CO2H]2, каталог Aldrich, кат.№.С122009;
N Ацетилцистеин, субстанция, ФС 42-1142-88, производства ГУП «Иммунопрепарат», Россия.
Для изучения возможности комбинирования новой лекарственной формы и других противовирусных средств использовали следующие препараты: ацикловир, субстанция, НД 42-14057-06, производства Хубей Йтай Фармасеутикал Ко.Лтд, Китай;
ганцикловир, торговое название «Цимивен», производства Ф.Хоффманн-Ля Рош Лтд, Швейцария;
9--D арабинофуранозиладенин (АраА), торговое название «Вира МП», производства Пьер фабр, Франция;
ИДУ, 5-йод-2’-дезоксиуридин, торговое название Офтан-Иду, производства Сантэн АО, Финляндия;
(Е)-5-(бромовинил)-2’-дезоксиуридин (БВДУ), торговое название «Гелпин», производства Берлин-Хеми, Германия;
рибавирин, субстанция, НД 42-14800-07, производства Цзянлин Бэньда Фармасеутикал Ко.Лтд, Китай;
тринатриевая соль фосфорномуравьиной кислоты (ФМК), торговое название «Фоскарнет натрия», производства ООО «НПП Поликом», Россия;
фосфит ацикловира, получен в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта;
римантадина гидрохлорид, субстанция, НД 42-12125-02, производства Чжецзян Кангю Фармацеутикал Ко.Лтд, Китай.
Животные. Для получения изолята вируса гриппа штамм АH3N2/Aichi/68 использовали линейных белых мышей BALB/c весом 7-8 г. Животных получали в питомнике РАМН.
Стандарты. В качестве стандарта активности человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 в работе использовали Отраслевой стандартный образец активности интерферона ОСО 42-28-369-03, с активностью 106 МЕ/мл, полученный в ФГУН ГИСК им.
Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора.
Статистическая обработка результатов. Для получения достоверных результатов каждый эксперимент повторяли не менее трёх раз. Для обработки результатов эксперимента использовали описательную статистику: вычисляли среднее значение, рассчитывали стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Разработка новой лекарственной формы интерферона для местного применения.
В результате изучения свойств различных марок полимеров была определена наиболее приемлемая концентрация полимера в готовой лекарственной форме – 1%, предложена технология изготовления препарата для обеспечения надлежащей микробиологической чистоты, заключающаяся в комбинации метода мембранной фильтрации термически нестабильных компонентов и метода термической стерилизации концентрата полимерной основы. При исследовании способности полимера влиять на специфическую противовирусную активность ИФН было установлено, что марка полимера не влияет на активность ИФН при изготовлении, однако в процессе хранения наибольший стабилизирующий эффект был получен при использовании натрий карбоксиметилцеллюлозы марки 7НОF. Так же было установлено, что без включения в состав препарата альбумина сывороточного человеческого невозможно обеспечить стабильность ИФН в процессе хранения, определенная минимальная эффективная концентрация альбумина в НЛФ, обеспечивающая активность препарата в течение всего предполагаемого срока хранения, соответствует 0,5%.
При исследовании способности выбранной боратной буферной системы обеспечивать рН новой лекарственной формы в интервале 5-9, был определен состав буферных компонентов в готовой лекарственной форме: 5,7% борной кислоты и 8,4% натрия тетрабората. Выбранная буферная система обеспечивает не только рН лекарственной формы в приемлемом диапазоне, но и сохранность микробиологической чистоты препарата в процессе использования пациентом, поскольку борная кислота и натрия тетраборат обладают бактерицидной и фунгистатической активностью.
При изучении способности антиоксидантов влиять на специфическую противовирусную активность ИФН, в том числе в процессе хранения было установлено, что наибольший синергидный эффект наблюдается при использовании рибофлавина, унитиола, кофеина бензоата натрия, метионина, цистеина, аскорбиновой кислоты и тиомочевины. При изучении влияния антиоксидантов на активность интерферона в процессе хранения наилучший результат был получен для унитиола. Образцы, содержащие аскорбиновую кислоту, теряли свою активность в первые месяцы после изготовления, поскольку аскорбиновая кислота крайне неустойчива в водных растворах. В процессе окисления аскорбиновой кислоты и других нестабильных антиоксидантов, как и в случае использования сильных восстановителей метабисульфита натрия и тиосульфата натрия, образуются перекисные радикалы, способные окислять и молекулы интерферона. В образцах, содержащих легкоокисляющиеся соединения, в процессе хранения наблюдали изменение агрегатного состояния препарата: выпадение осадка и помутнение исходного раствора. Таким образом, мы остановили свой выбор на унитиоле, так как он является достаточно активным антиоксидантом, при комбинировании унитиола и ИФН наблюдается синергидный эффект, выражаемый в увеличении специфической противовирусной активности ИФН, кроме того, унитиол способен длительно сохранять свою активность в водных растворах.
При исследовании возможности включения в состав НЛФ сильных восстановителей и хелатообразователей для стабилизации активности антиоксидантов и ИФН были получены данные, свидетельствующие о том, что присутствие сильных восстановителей совместно с ИФН недопустимо, поскольку их окисление влияет на стабильность ИФН и агрегатное состояние НЛФ в процессе хранения. Установлено, что наилучшей стабилизирующей активностью по отношению к ИФН и выбранному антиоксиданту обладает лимонная кислота в концентрации 0,2%.
При расчете изотонических эквивалентов по NaCl было предложено включить в состав НЛФ натрия хлорид в количестве 0,3%, и, таким образом, определен окончательный состав новой лекарственной формы:
Интерферон человеческий рекомбинантный альфа 2, субстанция 40000 МЕ Унитиол 0,002 г.
Лимонная кислота 0,002г.
Альбумина раствор 10% 0,02 мл.
Борная кислота 0,01г.
Натрия тетраборат 0,007г.
Натрия хлорид 0,003г.
Натрий карбоксиметилцеллюлоза 0,005г.
Вода очищенная до 1 мл.
Разработанная нами новая лекарственная форма обладает противовирусной активностью за счет входящего в её состав интерферона человеческого рекомбинантного альфа-2, усиленной присутствующими в составе антиоксидантами (унитиол и лимонная кислота), стабильна в процессе хранения, имеет пролонгированное действие благодаря присутствию полимера, имеет физиологический рН за счет буферных компонентов и изотонична, что позволяет использовать её как на слизистых оболочках респираторного тракта и гениталий, так и для терапии офтальмологических вирусных заболеваний.
Изучение спектра противовирусной активности новой лекарственной формы.
Характеристика выделенных на культуре клеток штаммов ВПГ. При исследовании выделенных из клинического материала вариантов вируса герпеса по МФА и реакции нейтрализации со специфическими антисыворотками установлено, что все штаммы относятся к ВПГ тип 1. Два из выделенных изолятов относятся к ацикловирчувствительным разновидностям ВПГ-1, один из изолятов умеренно чувствителен к ацикловиру и один изолят относится к ацикловирезистентным штаммам ВПГ. Все 12 изолятов вируса простого герпеса высокочувствительны к тринатриевой соли фосфономуравьиной кислоты, включая варианты, имеющие низкую чувствительность к ацикловиру. Все выделенные изоляты пригодны для проведения опытов in vitro и использованы нами для оценки противогерпетической активности новой лекарственной формы, а так же для оценки эффективности комбинации новой лекарственной формы с другими химиотерапевтическими препаратами.
Цитотоксичноть НЛФ и других соединений на культуре клеток СПЭВ, Vero Е6, MRC-5, 293, MDCК. ТЦД50 НЛФ на культуре клеток (все используемые в работе линии) равна 10000 МЕ/мл, МПК 625 МЕ/мл. ТЦД50 субстанции интерферона альфа- человеческого рекомбинантного равна 1000 МЕ/мл, МПК 312,5 МЕ/мл.
Противогерпесвирусная активность новой лекарственной формы. Оценку проводили по отношению к эталонному штамму ВПГ-1 Л2, по отношению к свежевыделенным из клинического материала вариантам ВПГ, в том числе с лекарственной устойчивостью к ацикловиру. Установлено, что НЛФ обладает выраженной противовирусной активностью, как при высокой, так и при низкой множественности заражения: ИД50 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 250 МЕ/мл, ИД50 при ИМЗ 0,01 БОЕ/Кл составила 156,25 МЕ/мл. ЭД100 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 5000 МЕ/мл, ЭД100 при ИМЗ 0,01 БОЕ/Кл составила 1250 МЕ/мл. Параллельно для оценки состава разработанной НЛФ мы провели анализ противогерпесвирусной активности субстанции интерферона человеческого рекомбинантного альфа-2: ИД50 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 962,5 МЕ/мл, ЭД100 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 962,5 МЕ/мл. Сравнив ИД50 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл субстанции ИФН равную 962,5 МЕ/мл и НЛФ равную 250 МЕ/мл, можно сделать вывод о том, что вспомогательные вещества, входящие в состав НЛФ усиливают ингибирующую активность интерферона на вирусиндуцированное ЦПД примерно в 3,85 раза.
При анализе способности выбранного антиоксиданта унитиола влиять на репродукцию вируса простого герпеса в культуре клеток по сравнению с другими сильными антиоксидантами: токоферола ацетатом, аскорбиновой кислотой и антиоксидантом Фенамом, любезно предоставленным директором Института им. Эммануэля Бурлаковой Е.Б.
установили, что унитиол обладает выраженной противогерпесвирусной активностью при малой токсичности: ХТИ унитиола равен 4, ХТИ токоферола ацетата 0, фенама – 1, раствора аскорбиновой кислоты с рН 7,16 – 0, с рН 5,48 – более 8. Оценка эффективности комбинации ИФН и унитиола по методу Anhal at all, 1980 и Neyts J., De Clercg E, показала, что ФИК комбинации равен 0,32, что свидетельствует о значительном синергизме соединений. Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанный состав лекарственной формы обладает выраженной противогерпесвирусной активностью, и что присутствующие в НЛФ компоненты способствуют усилению специфической противовирусной активности интерферона.
При исследовании активности НЛФ в отношении выделенных изолятов ВПГ-1, в том числе по отношению к вариантам вируса с лекарственной устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам установлено, что НЛФ влияет на репродукцию вариантов ВПГ, чувствительных к ацикловиру в культуре: при концентрации 6250 МЕ/мл наблюдается снижение инфекционного титра вируса в среднем на 1,9 lg БОЕ/мл, при концентрации препарата 2500 МЕ/мл наблюдается снижение инфекционного титра вируса по сравнению с контролем в среднем на 1,5 lg БОЕ/мл. При изучении влияния препарата на репродукцию ацикловиррезистантных вариантов изолятов ВПГ получены следующие данные: под воздействием препарата в концентрации 625 МЕ/мл происходит снижение инфекционного титра вируса на 2,5 lg БОЕ/мл по сравнению с контролем.
Таким образом, полученные нами данные о противовирусной активности НЛФ в отношении вируса простого герпеса тапа 1 и 2, и в отношении клинических изолятов ВПГ, в том числе с лекарственной устойчивостью к ацикловиру, свидетельствуют о значительной противогерпесвирусной активности НЛФ. Активность НЛФ в отношении ацикловиррезистентных штаммов ВПГ позволит проводить терапию герпесвирусных инфекций при неэффективности традиционных химиотерапевтических препаратов.
Противоаденовирусная активность НЛФ. Изучение противоаденовирусной активности НЛФ показало, что препарат в концентрации 2000 МЕ/мл (ИД50) подавляет репродукцию аденовируса человека серотип 5 в культуре клеток 293 при низкой инфекционной множественности заражения (в пределах 0,1 БОЕ/Кл). Предварительная обработка клеток препаратом в концентрации 1000 МЕ/мл за 24 часа до инфицирования повышает проявляемую им на культуре клеток противоаденовирусную активность, что свидетельствует о большом потенциале препарата как профилактического средства.
Противогриппозная активность НЛФ. При изучении активности НЛФ по отношению к различным вариантам вируса гриппа (НЛФ вводили непосредственно после инфицирования), установлено, что препарат обладает выраженной противовирусной активностью: в присутствии препарата в концентрации 5000 МЕ/мл наблюдали снижение инфекционного титра вируса гриппа A H3N2/Aichi/68 на 1,01 lg ТЦИД50/мл, вируса гриппа A H3N2/Aichi/68, изолированного из легочной ткани белых мышей, на 1,0 lg ТЦИД50/мл, вируса гриппа А H1N1/USSR/77 на 2,32 lg ТЦИД50/мл. Показано, что в присутствии новой лекарственной формы выживаемость клеток значительно увеличивается по сравнению с инфицированными клетками в отсутствие препарата. Полученные данные свидетельствуют о противогриппозной активности НЛФ, причем активность НЛФ значительно выше в случае вируса гриппа А H1N1/USSR/77.
При анализе активности препарата в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа, выделенных от больных в сезоне 2006-2007 года, в том числе по отношению к эпидемическим штаммам вируса гриппа А с резистентностью к ремантадину установлено, что наибольший противовирусный эффект достигается при предварительной обработке культуры клеток препаратом за 24 часа до инфицирования, что свидетельствует о большом потенциале НЛФ при проведении профилактики гриппа в сезон подъёма заболеваемости.
Относительно эффективности препарата против вируса гриппа В, то она несколько ниже, чем против вируса гриппа А. При одновременном внесении НЛФ с инфицированием так же выявлена активность в отношении эталонного штамма вируса гриппа А H1N1/USSR/77, при внесении препарата через 24 часа после инфицирования противовирусная активность НЛФ снижается.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о значительном противовирусном эффекте новой лекарственной формы по отношению к вирусу простого герпеса, в том числе по отношению к вирусу герпеса с лекарственной устойчивостью к ацикловиру, и по отношению к вариантам вируса простого герпеса, выделенным из клинического материала. Также новая лекарственная форма обладает выраженной противовирусной активностью по отношению к аденовирусу человека Ad5 и вирусам гриппа А H1N1/USSR/77 и A H3N2/Aichi/68, в том числе к варианту вируса гриппа, изолированному из легкого белых мышей, и в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа А и В сезона 2006-2007 года. В ходе исследования выявлена зависимость противовирусной активности новой лекарственной формы от концентрации, множественности инфицирования и схемы внесения препарата. Отмечено, что предварительное внесение новой лекарственной формы (минимум за 90 минут, лучше за часа) до инфицирования культуры обеспечивает более полную защиту клеточного монослоя от цитопатического действия вируса при аналогичной концентрации по сравнению с внесением препарата сразу непосредственно после инфицирования.
Разработка схем комбинированной терапии различных проявлений герпетической инфекции с использованием новой лекарственной формы и других химиотерапевтических препаратов.
В работе изучали возможность комбинирования НЛФ и других противогерпетических препаратов: ацикловира, фосфита ацикловира (ф-АЦВ);
ганцикловира;
9--D арабинофуранозиладенина (АраА);
5-йод-2’-дезоксиуридина (ИДУ);
(Е)-5-(бромовинил)-2’ дезоксиуридина (БВДУ);
рибавирина;
тринатриевой соли фосфономуравьиной кислоты (ФМК). Оценку эффективности комбинации различных препаратов и НЛФ проводили по методу Anhal at all, 1980 и Neyts J., De Clercg E, 1997, рассчитывая значения ФИК и путем построения изоболограмм.
Сравнивая ФИК комбинаций НЛФ и химиотерапевтических препаратов, мы получили результаты, свидетельствующие о том, что НЛФ составляет довольно эффективные комбинации со всеми представленными соединениями: рассчитанные значения ФИК для различных комбинаций лежат в интервале 0,2-0,66, что говорит о синергизме препаратов. Не выявлено несовместимости НЛФ ни с одним из представленных соединений. Наиболее эффективную комбинацию НЛФ составляет с АЦВ: значение ФИК 0,2, с ИДУ и ганцикловиром значение ФИК 0,28, с новым препаратом фосфитом ацикловира ФИК равен 0,29.
Таблица 1.
Индекс фракционных ингибирующих концентраций для комбинаций НЛФ с противогерпесвирусными препаратами.
Наименование комбинации, Значение Снижение ИД50 компонентов в концентрация компонентов индекса комбинации ФИК ИДУ 0,15 мкг/мл + НЛФ 50 МЕ/мл 0,28 ИДУ в 13 раз, НЛФ в 5 раз АЦВ 0,05 мкг/мл + НЛФ 25 МЕ/мл 0,2 АЦВ в 9,8 раз, НЛФ в10 раз АраА 3,8 мкг/ мл + НЛФ 50 МЕ/мл 0,68 АраА в 2 раза, НЛФ в 5 раз ФМК 8 мкг/мл + НЛФ 50 МЕ/мл 0,45 ФМК в 3,9 раза, НЛФ в 5 раз БВДУ 0,012 мкг/мл + НЛФ 31,25 МЕ/мл 0,325 БВДУ в 5 раз, НЛФ в 8 раз Рибавирин 62,5 мкг/мл + НЛФ 40 МЕ/мл 0,66 Рбв в 2 раза, НЛФ в 6,25 раза Ганцикловир 0,22 мкг/мл + НЛФ 12,5 0,28 Гнц в 4,4 раза, НЛФ в 20 раз МЕ/мл Ф-АЦВ 3 мкг/мл + НЛФ 25 МЕ/мл 0,29 Ф-АЦВ в 5,2 раза, НЛФ в раз По значению индекса ФИК наиболее эффективные комбинации новая лекарственная форма составляет с ИДУ (5-йод-2'-дезоксиуридином), ацикловиром, БВДУ (5-бром-2' дезоксиуридином), ганцикловиром и новым противогерпесвирусным препаратом фосфитом ацикловира. Умеренный синергизм соединений наблюдается для комбинации НЛФ с ФМК (натриевая соль фосфономуравьиной кислоты), синергизм близкий к аддитивному эффекту получен для комбинации новой лекарственной формы с рибавирином и АраА (9--D аденинарабинозидом). Представленные в таблице 1 данные однозначно указывают на то, что при комбинированном использовании препаратов достижение противовирусного эффекта происходит при снижении концентрации соединений, что имеет явное преимущество перед использованием противогерпесвирусных препаратов в отдельности.
Изучая возможность комбинирования различных противогерпетических препаратов между собой, выявили значительный синергизм между ФМК и ИДУ: ФИК комбинации равен 0,3;
для ФМК и рибавирина ФИК равен 1,25 что означает аддитивный эффект комбинации препаратов.
При изучении противовирусной активности комбинаций препаратов и НЛФ по отношению к клиническим изолятам ВПГ, а так же в отношении ВПГ-2 были получены аналогичные данные, что свидетельствует о широком диапазоне противогерпетической активности комбинаций специфических противогерпетических препаратов и разработанной НЛФ.
Разработка схем комбинированной терапии инфекции вируса гриппа с использованием новой лекарственной формы и других химиотерапевтических препаратов.
В процессе изучения влияния сочетаний НЛФ с римантадином и рибавирином на подавление вирусиндуцированного ЦПД в культуре клеток в отношении вирусов гриппа А H1N1/USSR/77 и A H3N2/Aichi/68 установлено, что эффективность соединений в комбинации значительно превосходит таковую при использовании препаратов в отдельности: при сочетании НЛФ и рибавирина наблюдается снижение ИД50 НЛФ в 4 раза, ИД50 рибавирина в 3 раза. ИД50 НЛФ при комбинировании с римантадином снижается так же в 4 раза, при этом ИД50 самого римантадина в комбинации с НЛФ снижается в 2 раза.
Относительно эффективности комбинации римантадина и рибавирина по отношению к тем же вариантам вирусам гриппа, установлено, что соединения проявляют умеренный синергизм. Значения ФИК для комбинаций препаратов приведены в таблице ниже.
Таблица 2.
Значение ФИК комбинаций препаратов Состав комбинации ФИК Римантадин + Рибавирин НЛФ +Римантадин 0, НЛФ +Рибавирин 0, Следует отметить, что выявленные закономерности эффективности комбинирования препаратов имели место в случае увеличения множественности инфицирования в 100 раз, штаммовой зависимости эффективности комбинирования препаратов не обнаружено.
При исследовании эффективности комбинаций препаратов при различных схемах внесения соединений было установлено, что внесение НЛФ за 24 часа до инфицирования позволяет получить более выраженное снижение инфекционного титра вируса по сравнению с вариантом, когда НЛФ вносится непосредственно в момент инфицирования: используя комбинации препаратов в заведомо неэффективных концентрациях, удалось полностью ингибировать ЦПД вируса. В случае увеличения множественности инфицирования противовирусный эффект комбинации несколько снижался.
При изучении эффективности комбинации НЛФ с римантадином и рибавирином (тройная комбинация) в отношении вируса гриппа А H1N1/USSR/77 при различных способах введения соединений (схема №1: за 24 часа до заражения;
схема №2: непосредственно сразу после инфицирования) были получены следующие данные: наименьшее значение ФИК тройной комбинации равняется 0,75, что свидетельствует о синергидном эффекте комбинации препаратов. Следует отметить, что при использовании препаратов в комбинации их ИД50 были ниже в 4 раза, чем ранее установленные концентрации для взятых в отдельности соединений.
ВЫВОДЫ 1. Разработана новая пролонгированная лекарственная форма интерферона альфа- человеческого рекомбинантного для местного применения, включающая корректоры ПОЛ - антиоксиданты (унитиол и лимонную кислоту), стабильная в процессе хранения в течение всего предполагаемого срока годности, имеющая пролонгированное действие благодаря присутствию полимера натрий карбоксиметилцеллюлозы, физиологический рН за счет буферных компонентов и изотоничность, что позволяет использовать её как на слизистых оболочках респираторного тракта и гениталий, так и для терапии офтальмологических проявлений вирусных инфекций.
2. Новая лекарственная форма обладает выраженной противогерпетической активностью как в отношении эталонного штамма ВПГ 1 Л2, так и в отношении лабораторного штамма ВПГ1 Л2 с резистентностью к ацикловиру, так и в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса, выделенных от больных. Активность лекарственной формы зависит от множественности заражения, концентрации препарата и способа внесения. При увеличении множественности заражения активность препарата несколько снижается. Установлена значительная противовирусная активность лекарственной формы при внесении одновременно или непосредственно после инфицирования, что может служить основанием для использования разработанного состава в качестве лечебного средства. Предварительная инкубация клеток с препаратом значительно усиливает его противовирусную активность, что свидетельствует о возможной перспективе применения препарата для профилактики рецидивирующей ВПГ- инфекции.
3. Новая лекарственная форма обладает активностью по отношению к аденовирусу человека серотип 5. Установлено, что при низкой множественности заражения при помощи препарата удаётся значительно уменьшить проявления вирусиндуцированного ЦПД на культуре клеток. Так же выявлена зависимость активности препарата от способа внесения: прединкубация за 24 часа до инфицирования значительно усиливает противовирусную активность.
4. Новая лекарственная форма обладает выраженной противовирусной активностью как в отношении вируса гриппа А, так и в отношении вируса гриппа В. Противовирусная активность препарата по отношению к вирусу гриппа В несколько ниже. Препарат активен в отношении эталонных вариантов вируса гриппа А, в отношении изолированного из легочной ткани мышей вируса гриппа, и в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа сезона 2006-2007 года.
5. Новая лекарственная форма составляет эффективные комбинации практически со всеми исследуемыми противовирусными препаратами. Ни для одного из исследуемых соединений не обнаружен антагонизм.
6. Установлено, что изученные лекарственные препараты в комбинации проявляют свою противовирусную активность в нецитотоксических концентрациях, что свидетельствует об избирательном эффекте терапии.
7. Комбинация новой лекарственной формы и других противовирусных препаратов позволяет уменьшить эффективные противовирусные концентрации используемых препаратов и тем самым уменьшить или избежать вовсе проявления побочных эффектов терапии. Использование препаратов с различными механизмами действия позволит избежать появления устойчивых к терапии мутантов вируса.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Патент РФ RU 2270692 «Пролонгированный раствор интерферона»//Малиновская В.В., Малиновский Е.Ю., Выжлова Е.Н.;
заявители и патентообладатели: Малиновская В.В., Малиновский Е.Ю., Выжлова Е.Н.- № 2004132134/15;
заявл. 11.04.2004;
опубл.
27.02.2006.-Бюл. №6.-7 с.
2. Выжлова Е.Н., Андронова В.Л., Галегов Г.А., Малиновская В.В. Комбинированное антигерпесвирусное действие комплексного препарата "Виферон - капли глазные" и модифицированных нуклеозидов//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2006.-том 141.-№6.-С.672-676.
3. Выжлова Е.Н., Андронова В.Л.. Галегов Г.А., Малиновская В.В.. Буданов С.В.
Комбинирвоанная химиотерапия герпесвирусной инфекции: сочетание препарата Виферон, глазные капли и специфических этиотропных лекарственных средств// Российский журнал кожных и венерических болезней, приложение «Герпес».-2007. №2.-С. 29-32.
4. Eugenia N. Vyzhlova., Valeria L. Аndronova., Georgiy A. Galegov., Valentina V.
Malinovskaya. Synergistic antiherpesviral combination of alpha interferon and nucleoside analog or pyrophosphate analog in relation to herpes simplex virus in cell culture in vitro//Journal of interferon and cytokine research.-2007.-Vol. 27.-№8.-Р.737-738.
Подписано в печать 13.03.2008 г. Тираж 75экз.