Способность листьев и корней теплолюбивых растений табака к формированию устойчивости к гипотермии
На правах рукописи
АНТИПИНА Ольга Валерьевна СПОСОБНОСТЬ ЛИСТЬЕВ И КОРНЕЙ ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА К ФОРМИРОВАНИЮ УСТОЙЧИВОСТИ К ГИПОТЕРМИИ 03.01.05 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в лаборатории зимостойкости Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
кандидат биологических наук Попов Валерий Николаевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор Бабаков Алексей Владимирович доктор биологических наук, профессор Загоскина Наталья Викторовна ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева
Защита состоится «15» марта 2011 г. в 11 часов на заседании совета по защите док торских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской ака демии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу:
127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.
Факс: (499) 977 8018, электронная почта: [email protected];
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.
Автореферат разослан « 11 » февраля 2011 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук М.И. Азаркович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Практически все растения на Земле подвергаются действию разных неблагоприятных факторов, в том числе действию холода (низких положительных температур) и мороза (температуры ниже 0С). В субтропиках темпе ратура периодически опускается ниже 0С, в умеренных зонах – до минус 20-40С.
Севернее этих районов лежит зона вечной мерзлоты, где температура бывает еще ни же (Larcher, 2003). В связи с этим проблема адаптации растений к пониженным тем пературам является весьма актуальной, причем эта актуальность имеет не только фундаментальный, но и практический характер в связи с большими потерями, кото рые несет сельское хозяйство в результате периодических снижений температуры, заморозков и критических морозов (Сандухидзе и др., 2003). Несмотря на крупные достижения в области исследований физиолого-биохимических основ устойчивости растений к гипотермии (Туманов, 1979;
Levitt, 1980;
Титов, 2006), до сих пор не соз дана единая теория адаптации к низким температурам, а меры предотвращения ги бельного действия не только отрицательных, но и низких положительных температур остаются крайне неэффективными.
Жизнеспособность растений в условиях низких температур обеспечивается ком плексом физиологических процессов, имеющих своей целью адаптацию растительно го организма к изменяющимся условиям окружающей среды. Известно, что в форми ровании устойчивости к низким температурам важную роль играют углеводы расте ний (Туманов, 1979;
Трунова, 1984, 2007;
Perera et al., 1995;
Ma et al., 2009). Сущест венное значение в закаливании растений к гипотермии имеют изменения липидного состава и степени ненасыщенности жирных кислот, которые позволяют поддерживать текучесть мембран и предотвращать фазовый переход липидов (Lуons, 1973;
Лось, 2005). Не вызывает сомнений существенная роль фотосинтеза для адаптации расте ний к низким температурам (Levitt, 1980;
Климов и др., 2003;
Суворова, 2009).
Процессы формирования низкотемпературной устойчивости наиболее полно изучены на растениях, относящихся к группе морозостойких. Теплолюбивые расте ния, в частности табак, в этом отношении менее изучены (Балагурова и др., 2001;
Ти тов и др., 2006). Кроме того, большинство исследователей основное внимание уделя ли изучению низкотемпературного стресса, развивающегося в листьях. Поскольку ус тойчивость целого растения к действию низких температур зависит от устойчивости его отдельных органов и в целом определяется наиболее чувствительными из них (Туманов, 1979;
Lee, 2005;
Сусов, 2009), то возникает необходимость в более деталь ном исследовании особенностей формирования холодоустойчивости не только листь ев растений, но и корней, так как причины высокой чувствительности корневой сис темы к действию низких температур, особенно у теплолюбивых растений, всё ещё недостаточно изучены.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании способности листьев и корней теплолюбивых растений табака (Nicotiana tabacum L.) к формированию устойчивости к гипотермии. В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Определить эффективность низкотемпературного закаливания теплолюбивых рас тений табака и выявить особенности холодоустойчивости их органов.
2. Изучить изменения содержания и состава жирных кислот (ЖК) липидов в листьях и корнях растений табака при низких положительных температурах.
3. Исследовать особенности развития окислительного стресса в листьях и корнях растений табака при низких положительных температурах.
4. Оценить эффективность работы антиокcидантных ферментов в листьях и корнях исследуемых растений при низких положительных температурах.
5. Выявить изменения интенсивности фотосинтеза и дыхания у растений табака при низких положительных температурах.
6. Изучить изменения содержания сахаров в листьях и корнях табака при низких по ложительных температурах.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование причин разной устойчивости листьев и корней теплолюбивых растений табака к низким температу рам.
Установлено, что листья теплолюбивых растений табака реагировали на пони женную температуру (8оС, 6 сут.) увеличением содержания липидов и доли полине насыщенных ЖК (ПНЖК) в их составе, в то время как в корнях происходило сниже ние содержания липидов и ненасыщенных ЖК. Увеличение доли ПНЖК в листьях за время закаливания обеспечивало сохранение функциональной стабильности мембран, что способствовало предотвращению избыточной генерации активных форм кисло рода (АФК) и приводило к повышению устойчивости листовой ткани к действию низких температур. Уменьшение содержания ПНЖК в корневой системе табака в ус ловиях низких положительных температур могло приводить к увеличению скорости генерации АФК и повышению интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ). Это являлось одной из причин более слабой по сравнению с листьями устой чивости корневой системы растений табака к окислительному стрессу, вызванному пониженной температурой.
Впервые установлена возможность значительного повышения холодоустойчиво сти надземной части растений табака, вплоть до устойчивости к действию отрица тельных температур (-3оС), и неспособность корневой системы табака к низкотемпе ратурному закаливанию, что является лимитирующим фактором, определяющим в целом низкий потенциал устойчивости теплолюбивых растений к гипотермии.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе экспери ментальные данные о роли листьев и корней в формировании устойчивости к гипо термии растений табака существенно расширяют представления о физиологических механизмах низкотемпературного закаливания теплолюбивых растений. Результаты работы имеют как фундаментальный характер, так и предоставляют возможность практического применения и могут быть рекомендованы к использованию в селекци онной практике (получение новых сортов сельскохозяйственных растений, устойчи вых к низким температурам) и сельскохозяйственном производстве (рациональное распределение температур при выращивании растений в тепличных комбинатах, под бор подвоя и привоя теплолюбивых культур).
Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов ВУЗов биологических и сельскохозяйственных специальностей.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были пред ставлены на международной конференции "Физико-химические основы структурно функциональной организации растений" (Екатеринбург, 2008), на VIII международ ном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использова ния" (Москва, 2009), международной научно-практической конференции "Интенси фикация и оптимизация продукционного процесса сельскохозяйственных растений" (Орел, 2009), научных конференциях молодых ученых ИФР РАН (Москва, 2008, 2009), всероссийском симпозиуме "Растение и стресс" (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из которых статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора ли тературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 124 страницах маши нописного текста, включает 24 рисунка и 4 таблиц;
список литературы состоит из наименований, из них - 153 на иностранном языке.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили теплолюбивые растения табака (Nicotiana tabacum L., сортотип Samsun). Растения размножали черенкованием и культивирова ли на минеральном субстрате (перлит) в камере фитотрона ИФР РАН при температу ре 22-24С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 5 клк. Для опытов использовали растения в возрасте шести недель.
Закаливание растений проводили в климатической камере Binder KBW- (Германия), в условиях 16-часового фотопериода и освещенности 5 клк в течение шести суток при температуре 8С. Данная температура относится к диапазону закали вающих температур для теплолюбивых растений (Дроздов, 1990) и была подобрана в ходе предварительных опытов.
Холодостойкость контрольных (незакаленных) и закаленных растений табака оценивали по их выживаемости после промораживания при температуре –3С с со хранением режима освещенности в течение суток в климатической камере Sanyo MIR-153 (Япония), а также путем измерения выхода электролитов в водную фазу из тканей листьев и корней (Hepburn et al., 1986).
Определение содержания липидов и их жирнокислотного состава осуществляли методом газожидкостной хроматографии (Цыдендамбаев, Верещагин, 1980;
Пчелкин и др., 2001).
Скорость генерации супероксидного радикала (О2) определяли методом, в ос нове которого лежит способность этого радикала восстанавливать адреналин в адре нохром (Часов и др., 2002) и выражали в ед. оптической плотности *10-3/мин.
Содержание перекиси водорода (H2O2) измеряли по реакции с хлоридом титана (TiCl4) (Kumar, Knowles, 1993) и выражали в ммоль/г сыр. массы.
Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по накоплению продуктов окисления: диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальде гида (МДА). Содержание ДК определяли путём измерения оптической плотности ли пидных экстрактов в смеси метанол-гексан (5:1) при 232 нм (максимум поглощения ДК) и выражали в мкмоль/г сыр. массы (Кейтс, 1975). Содержание МДА определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой с последующим измерением оптической плотности раствора при 532 нм и рассчитывали в мкмоль/г сыр. массы (Жиров и др., 1982).
Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли при помощи метода, осно ванного на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием за суперок сидные радикалы и выражали в ед. активности/г сыр. массы (Kumar, Knowles, 1993).
Активность каталазы измеряли по скорости деградации H2O2 согласно Kumar и Knowles (1993) и выражали в мкмоль разложившейся перекиси/г сыр. массы в мин.
Активность аскорбат-пероксидазы определяли по модифицированному методу Nakano, Asada (1981), основанному на регистрации снижения оптической плотности раствора при окислении аскорбата, и выражали в мкмоль аскорбата/г сыр. массы в мин.
Активность пероксидазы гваякола определяли по методу Kumar и Knowles (1993), основанному на реакции окисления ароматического соединения (гваякола) до окрашенного соединения (тетрагваякола), и выражали в мкмоль гваякола/г сыр. мас сы в мин.
Изучение СО2-газообмена растений табака при 22С и 8С проводили на уста новке открытого типа с инфракрасным газоанализатором URAS 2T (Германия). Изме рения газообмена включали определение скоростей видимой ассимиляции СО2 и тем нового дыхания, которые выражали в мг СО2/г сух. массы в ч (Климов, 2003).
Для определения содержания сахаров в тканях листьев и корней их навески (~500 мг) фиксировали 96%-ным кипящим этанолом. Ткань растирали в фарфоровой ступке и сахара извлекали трехкратной экстракцией 80%-ным этанолом. В получен ных экстрактах определяли глюкозу глюкозооксидазным методом, сахарозу и фрук тозу – по методу Рое (Туркина, Соколова, 1971).
Для определения содержания сахаров в апопласте целые листья подвергали ва куум-инфильтрации 50 мМ раствором СаСl2 с последующим центрифугированием (Luwe et al., 1993). В полученных экстрактах определяли глюкозу глюкозооксидазным методом, сахарозу и фруктозу – по методу Рое (Туркина, Соколова,1971).
Во всех экспериментах биологическая повторность измерений – 6-8-кратная, аналитическая – 4-6-кратная. Результаты экспериментов обработаны статистически. В таблицах и на гистограммах представлены средние значения опыта и их стандартные ошибки (Доспехов, 1977).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изменение устойчивости растений табака при низких положительных температурах. В начале работы было необходимо определить эффективность низко температурного закаливания (8С, 6 сут.) теплолюбивых растений табака. Для этого был использован метод прямого промораживания растений при температуре –3С в течение 1 сут. с последующей оценкой их выживаемости. По истечении холодовой экспозиции все незакаленные растения погибали (Рис. 1А). Напротив, закаленные растения табака после оттаивания сохраняли тургор и видимых повреждений надзем ной части не имели (Рис. 1А). Тем не менее, эти закаленные растения погибали через 5 сут. после промораживания при их выращивании в оптимальных температурных условиях (22С) (Рис. 1Б), что могло быть связано с гибелью корневой системы. Для проверки этого предположения у части закаленных растений после промораживания при –3С были срезаны побеги и помещены в резервуары с водой. Спустя 5 суток эти побеги не только не засыхали, но и возобновляли ростовые процессы и формировали придаточные корни (Рис. 1В).
А Б В Рис. 1. Растения табака после промораживания (–3°С, 1 сут.).
А – контрольное (слева) и закаленное (справа) растения сразу после промораживания;
Б – закаленное растение через 5 сут. после промораживания;
В – побег закаленного растения через 5 сут. после промораживания.
Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой эффективности закаливания листьев теплолюбивых растений табака, способных, в отличие от корней, развивать устойчивость даже к отрицательным температурам. Корневая система была не способна формировать устойчивость к отрицательным температурам в процессе закаливания в условиях, благоприятных для побегов, что в результате приводило к гибели целого растения.
2. Изменение содержания и жирнокислотного состава липидов в листьях и кор нях растений табака при низких положительных температурах.
Способность клеток теплолюбивых растений увеличивать количество нена мкг связанных ЖК/ г сырой массы сыщенных жирных кислот в мембран Содержание липидов, ных липидах является одним из важных факторов низкотемпературной адапта ции, что было продемонстрировано на растениях огурца, томата (Новицкая и др., 1999, 2000), тыквы (Lee et al., 2005), 22oC 8oC, 6 сут.
табака (Попов и др., 2006) и других рас Рис. 2. Изменение содержания липидов в тениях. В связи с этим дальнейшие ис листьях () и корнях () растений табака при низких положительных температурах.
следования были направлены на опреде ление содержания липидов и их жирно кислотного состава в листьях и корнях исследуемых растений.
Уже до закаливания имелись существенные различия в абсолютном содержании липидов в листьях и корнях растений (Рис. 2): содержание липидов в листьях расте ний в 2,8 раза превышало их содержание в корневой системе.
Более того, липиды листьев и корней различались и по составу ЖК (Таблица 1).
Липиды листьев включали основные жирные кислоты с длинной цепи 13-20 атомов углерода, а корней - 14-24 атома углерода, т.е. отличались бльшим набором и разно образием жирных кислот по сравнению с липидами листьев (содержится больше длинноцепочечных ЖК). В корнях преобладала линолевая кислота (18:2) в отличие от листьев, где максимальное содержание приходилось на линоленовую кислоту (18:3).
Холодовое закаливание приводило к 20% повышению содержания липидов в ли стьях, в то время как в корневой системе происходило снижение их количества на 14% (Рис. 2). При этом, в листьях при закаливании снижалось содержание насыщен ных ЖК (16:0, 18:0) и мононенасыщенных ЖК (18:1) и одновременно повышалось содержание полиненасыщенных ЖК (18:2, 18:3). В корневой системе после холодо вой экспозиции (8С, 6 сут.) наблюдалась другая тенденция в изменении содержания главных ЖК: количество насыщенных ЖК (16:0 и 18:0) возрастало, а ненасыщенных (18:1,18:2,18:3) – снижалось.
Таблица 1. Состав жирных кислот липидов в листьях и корнях растений табака.
Содержание ЖК в листьях, % Содержание ЖК в корнях, % Жирная ки- от суммы от суммы слота 22оС 8оС, 6 суток 22оС 8оС, 6 суток 13:0 2,5 ± 0,1 0,21 ± 0,1 – – 14:0 2,6 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0, 14:1 1,3 ± 0,1 – – – 15:0 2,1 ± 0,2 – 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0, 15:1 0,5 ± 0,1 0,15 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0, 16:0 19,5 ± 0,5 14,8 ± 0,3 18,0 ± 0,5 19,4 ± 0, 16:1 3,80 ± 0,1 2,0 ± 0,1 0,9 ± 0,1 0,7 ± 0, 16:2 1,45 ± 0,2 0,8 ± 0,1 – 0,1 ± 0, 16:3 6,05 ± 0,8 6,17 ± 0,2 – – 18:0 2,65 ± 0,1 2,0 ± 0,1 2,1 ± 0,1 2,6± 0, 18:1 1,6 ± 0,1 0,8 ± 0,1 3,0 ± 0,1 2,2 ± 0, 18:2 12,5 ± 0,3 14,85 ± 0,2 37,0 ± 0,4 30,2 ± 0, 18:3 42,5 ± 0,7 56,56 ± 0,5 19,0 ± 0,3 18,8 ± 0, 19:0 0,3 ± 0,1 0,46 ± 0,1 – 20:0 0,65 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,6 ± 0,1 1,7 ± 0, 20:3 – – 2,2 ± 0,1 0,8 ± 0, 21:0 – – 0,6 ± 0,1 – 22:0 – – 4,5 ± 0,2 6,8 ± 0, 22:2 – – – 0,2 ± 0, 22:3 – – – 1,4 ± 0, 23:0 – – 1,0 ± 0,1 – 24:0 – – 4,4 ± 0,1 6,0 ± 0, 24:2 – – 5,3 ± 0,1 7,8 ± 0, На основании данных таблицы 1 было рассчитано соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (Рис. 3). Если до закаливания сумма насыщенных ки слот в листьях растений табака составляла 29,5% и соответственно ненасыщенных – 70,5%, то после закаливания доля насыщенных ЖК снизилась до 18,8%, а сумма не насыщенных возросла до 81,2%, то есть Листья 22oC 29,5 70, соотношение насыщенных и ненасы Листья 18,8 81, 8oC, 6 сут.
щенных ЖК в листьях ещё больше сме Корни 22oС 32,1 67, стилось в сторону преобладания нена Корни сыщенных, главным образом за счет 37,4 62, 8оС, сут.
увеличения количества линоленовой 0 20 40 60 80 Рис. 3. Изменение соотношения (%) насы кислоты с 42,51 до 56,56% (Таблица 1).
щенных () и ненасыщенных () ЖК липи дов в листьях и корнях растений табака при Обратная ситуация наблюдалась в кор низких положительных температурах.
нях растений табака: если в контроле сумма насыщенных ЖК составляла 32,1% и соответственно ненасыщенных – 67,9%, то после холодовой экспозиции (8С, 6 сут.) доля насыщенных ЖК увеличилась до 37,4%, а сумма ненасыщенных снизилась до 62,6%.
В результате таких изменений состава ЖК липидов в листьях во время закалива ния происходило увеличение индекса ненасыщенности, характеризующего жидкост ные свойства мембран, с 1,82 до 2,22. В корневой системе этот показатель, наоборот, снижался с 1,52 до 1,42.
Таким образом, повышение содержания в листьях мембранных липидов с более высокой степенью ненасыщенности их жирных кислот (с преобладанием триеновых ЖК), за время закаливания, в отличие от корней, где эти процессы имели противопо ложную направленность, могло быть одной из причин разной чувствительности ли стьев и корней табака к пониженной температуре. Снижение доли ненасыщенных жирных кислот в корневой системе при действии низких положительных температур могло являться результатом деградации полиненасыщенных ЖК, возможно, вызван ной развитием окислительного стресса и низкой активностью антиоксидантной сис темы.
3. Интенсивность окислительного стресса в листьях и корнях растений табака при низких положительных температурах.
Поскольку одной их основных причин повреждения теплолюбивых растений при действии холода является активация свободно-радикальных процессов (Мерзляк, 1989;
Лукаткин, 2002, 2005), было проведено исследование изменения уровня О2 и Н2О2, в листьях и корнях растений табака при закаливании.
ед. опт. плотности х 10-3/мин Н2О2, ммоль/г сырой массы Скорость генерации О2, 1,6 А Б 0, 0, 1, 0,8 0, 0, 0, 0 22oC 8oC, 6 сут. 22оС 8оС, 6 сут.
Рис. 4. Изменение скорости генерации супероксидного радикала (А) и содер жания перекиси водорода (Б) в листьях () и корнях () растений табака при низких положительных температурах.
Закаливание растений табака сопровождалось почти двукратным уменьшением скорости генерации супероксидного радикала в листьях и трехкратным увеличением скорости его генерации в корневой системе (Рис. 4А), что свидетельствует о значи тельной интенсификации окислительных процессов в корнях за время холодовой экс позиции.
Показателем интенсивности окислительного стресса во время охлаждения может служить также и содержание в клетках перекиси водорода. Опасность избытка Н2О для растительной клетки заключается в том, что она, являясь относительно стабиль ной молекулой, может диффундировать в клетке на значительные расстояния, а так же служит источником другой, более токсичной формы активного кислорода – гидро ксил-радикала (Мерзляк, 1989;
Полесская, 2007). Эксперименты показали (Рис. 4Б), что при закаливании в органах растений наблюдались прямо противоположные про цессы: было выявлено более чем 35% снижение содержания перекиси в листовой тка ни и повышение ее количества на такую же величину в корневой системе. Получен ные результаты указывают на развитие окислительного стресса в корнях растений та бака.
4. Перекисное окисление липидов в листьях и корнях растений табака при низких положительных температурах.
Одной из причин повреждения растений при гипотермии является нарушение структуры клеточных мембран, а основным процессом деградации мембранных ли пидов является их перекисное окисление (Владимиров, 1999), которое вызывается ин тенсивной генерацией АФК. В связи с этим, следующим этапом нашей работы было исследование процессов ПОЛ в листьях и корнях растений табака при закаливании, которые сопровождаются накоплением первичных продуктов ПОЛ – диеновых конъ югатов (ДК) и одного из конечных продуктов ПОЛ – малонового диальдегида (МДА).
А Б 6, 2, моль/г сыр. массы моль/г сыр. массы 2, Содержание МДА, Содержание ДК, 4, 1, 1, 2, 0, 22oC 8oC, 6 сут. 22оС 8оС, 6 сут.
Рис. 5. Изменение содержания ДК (А) и МДА (Б) в листьях () и корнях () растений табака при низких положительных температурах.
В результате закаливания растений табака происходили существенные измене ния в количестве ДК и МДА, содержание которых изменялось разнонаправлено в надземных и подземных органах (Рис. 5). В листьях наблюдалось снижение содержа ния ДК и МДА, что указывает на торможение ПОЛ и способность листьев адаптиро ваться к пониженной температуре. В корневой системе происходило двукратное уве личение уровня ДК и МДА, что позволяет предположить развитие значительных по вреждений клеточных мембран и свидетельствует о повышенной уязвимости корне вой системы к действию окислительного стресса, индуцированного низкими положи тельными температурами.
Учитывая, что увеличение интенсивности ПОЛ отражает начальные этапы по вреждения клеточных мембран, для характеристики их функционального состояния также был использован метод определения выхода электролитов из тканей растений.
Полученные результаты (Рис. 6) свидетельствуют о различном влиянии низкотемпе ратурной экспозиции на холодостойкость листьев и корней табака: если в листьях за время закаливания наблюдалось сохранение барьерных свойств клеточных мембран, то в Выход электролитов, % корнях наблюдалось резкое возрастание выхода электролитов, свидетельствующее о серьезных повреждениях мембранной системы клеток.
Таким образом, холодовая экспозиция (8С, 6 сут.), в корневой системе наряду с уси 22oC 8oC, 6 сут. лением скорости генерации супероксидного ра Рис. 6. Изменение выхода элек- дикала и накоплением Н2О2 (Рис. 4) индуциро тролитов из листьев () и кор вала повышение интенсивности ПОЛ (Рис. 5). В ней () растений табака при низких положительных темпе то же время в листьях происходило значитель ратурах.
ное снижение скорости образования суперок сидного радикала, так же снижались содержание Н2О2 и интенсивность ПОЛ. Более высокая интенсивность процессов ПОЛ в корнях растений приводила к повреждению клеточных мембран и утрате ими барьерных свойств (Рис. 6), тогда как листья доста точно успешно проходили процессы закаливания, приводящие к снижению интен сивности окислительных процессов и сохранению целостности клеточных мембран, что в конечном итоге обеспечивало им формирование устойчивости к низким темпе ратурам.
5. Изменение активности антиоксидантных ферментов в листьях и корнях рас тений табака при низких положительных температурах.
Как известно, в детоксикации АФК участвуют антиоксидантные ферменты, важ нейшими из которых являются супероксиддисмутаза, каталаза, аскорбат-пероксидаза, и пероксидаза гваякола. Эти ферменты играют существенную роль в снижении ин тенсивности окислительных процессов, вызванных гипотермией (Мерзляк,1999;
Лу каткин, 2002;
Zhou, Zhao, 2004;
Радюк и др., 2009).
Значительная разница в активности СОД в органах растений табака была выяв лена уже при оптимальной температуре выращивания (22°С) (Рис. 7А). При этой тем пературе в листьях растений активность фермента была почти в 2 раза больше (22, ед. активности/г сыр. массы), чем в подземных органах растений (12,9 ед. активно сти/г сыр. массы). В процессе закаливания активность СОД (Рис. 7А) в листьях воз растала достаточно существенно (~ на 40%), а в корневой системе низкая исходная активность СОД после выдерживания растений при температуре 8°С в течение 6 су ток снижалась в 6 раз.
ед. активности/г сыр. массы моль разлож. H 2O 2/г сыр.
Активность каталазы, А Б Активность СОД, массы мин 20 0 22oC 8oC, 6 сут.
22oC 8oC, 6 сут.
Рис. 7. Изменение активности СОД (А) и каталазы (Б) в листьях () и корнях () растений табака при низких положительных температурах.
В детоксикации активных форм кислорода, образующихся при окислительном стрессе, участвует еще один важный антиоксидантный фермент – каталаза, разла гающая перекись водорода.
Из рисунка 7Б видно, что активность каталазы, как и активность СОД, при оп тимальной для роста температуре была выше в листьях растений, чем в корневой сис теме. Закаливание приводило почти к 20% росту активности каталазы в листьях и бо лее чем двукратному снижению активности этого фермента в корнях (Рис. 7Б).
Исходный уровень активности пероксидазы гваякола, которая также способству ет быстрой утилизации Н2О2, при 22°С был значительно выше в корнях растений по сравнению с листовой тканью (Рис. 8А). Активность этой пероксидазы в корнях таба ка в результате воздействия низкими положительными температурами снижалась почти на 20%, а в листьях – возрастала более чем на 40% (Рис. 8А), повторяя тем са мым тенденцию в изменении активности ферментов, рассмотренных выше.
80 А Б моль гваякола/г сыр.
моль аскорбата/г сыр.
Активность гваякол Активность аскорбат пероксидазы, пероксидазы, массы мин массы мин 0 22oC 8oC, 6 сут.
22оС 8оC, 6 сут.
Рис. 8. Изменение активности пероксидазы гваякола (А) и аскорбат-пероксидазы (Б) в листьях () и корнях () растений табака при низких положительных тем пературах.
Помимо пероксидазы гваякола, при охлаждении большое значение имеет анти оксидантный фермент аскорбат-пероксидаза, которая является основным ферментом, утилизирующим Н2О2 в хлоропластах. Активность этого фермента в листьях при 22°С превышала его активность в корнях (Рис. 8Б). После охлаждения (8С, 6 сут.) отмечалось повышение активности аскорбат-пероксидазы в листьях практически вдвое, и снижение активности фермента в корневой системе более чем на 30%.
Таким образом, в листьях закаленных растений существенно повышалась актив ность СОД, каталазы и пероксидаз (Рис. 7 и 8), что могло приводить к снижению со держания АФК (Рис. 4) и интенсивности ПОЛ (Рис. 5). В то же время в корневой сис теме растений табака происходило снижение активности всех исследованных антиок сидантных ферментов, что сопровождалось увеличением скорости генерации супер оксидного радикала и содержания Н2О2 (Рис. 4). Накопление АФК приводило к по вышению интенсивности ПОЛ (Рис. 5), что могло служить причиной пониженной по сравнению с листьями холодостойкости корней.
6. Изменение интенсивности фотосинтеза и темнового дыхания растений табака при низких положительных температурах.
Фотосинтез является поставщиком ассимилятов, которые необходимы как для жизнедеятельности растений при оптимальной температуре вегетации, так и для адаптации растений к гипотермии. В связи с этим, мы провели исследование СО2 газообмена как показателя интенсивности фотосинтеза и дыхания у теплолюбивых растений табака в условиях действия закаливающих температур.
Интенсивности фотосинтеза и дыхания во время закаливания снижались, но в разной степени (Табл. 2): скорость видимого фотосинтеза снижалась меньше, чем скорость темнового дыхания.
Таблица 2. Изменение СО2-газообмена растений табака при низких положительных температурах.
Контрольные растения Закаленные растения Параметры СО2-газообмена (измерения при 22°С) (измерения при 8°С) Видимый фотосинтез, 8,20±1,2 3,78±0, мг СО2/г сух. массы в ч Темновое дыхание, 4,10±0,7 1,57±0, мг СО2/г сух. массы в ч Отношение видимый фотосин- 2,0±0,1 2,40±0, тез/темновое дыхание Это приводило к 20% увеличению отношения фотосинтез/дыхание, что рассмат ривается как положительное свойство, которое дает возможность более экономно расходовать усваиваемый углерод в условиях низкотемпературного стресса и служит количественной мерой способности растений к закаливанию (Klimov, Trunova, 1999).
Изменения СО2-газообмена такого рода служат предпосылкой накопления бльшего числа продуктов фотосинтеза, обеспечивающих комплекс адаптационных перестроек метаболизма, позволяющих растениям выживать при низких температурах (Klimov et al., 1999). Поэтому было необходимо исследовать изменения содержания сахаров в разных органах растений при закаливании.
7. Изменение содержания сахаров в листьях и корнях растений табака при низких положительных температурах.
Одной из особенностей закаленных растений является накопление большого ко личества в них сахаров, которые являются основным источником энергии и предше ственниками при синтезе веществ с защитным эффектом, происходящим в период за каливания при низких положительных температурах. Обеспечение сахарами всех ор ганов растения является важнейшим условием для успешной адаптации целого расте ния к гипотермии (Трунова, 2007).
Исследования показали (Рис. 9), что в ре Содержание сахаров, мг/г сыр. массы зультате закаливания в листьях растений таба 10 ка количество растворимых сахаров увеличи валось более чем на 20%, что является сущест венным для теплолюбивых растений, в то вре мя как в корневой системе их содержание поч 0 ти не изменялось, вследствие чего их количе 22oC 8oC, 6 сут.
ство, по-видимому, оказалось недостаточным Рис. 9. Изменение содержания рас для адаптации корневой системы при низких творимых сахаров в листьях () и корнях () растений табака при низ- положительных температурах.
ких положительных температурах.
8. Загрузка флоэмы при низких положительных температурах.
Обнаруженные нами различия по содер Содержание сахаров, жанию сахаров в разных органах растений та г/г сыр. массы бака при закаливании могут быть связаны с изменениями процессов оттока ассимилятов из листьев в корни. Поскольку табак как предста витель семейства пасленовых имеет преиму 22oC 8oC, 6 сут. щественно апопластный тип загрузки флоэмы Рис. 10. Изменение содержания (Гамалей, 1990), то данные о содержании саха сахаров ( – сахароза, – глюко за, – фруктоза) в апопласте ли- ров в апопласте листьев этих растений в норме стьев растений табака при низких положительных температурах. и при закаливающих температурах способны дать ответ на вопрос об интенсивности загрузки флоэмы при закаливании.
До закаливания в апопласте листьев растений табака преобладали глюкоза и са хароза, тогда как содержание фруктозы было незначительно (Рис. 10). После закали вания наблюдалось снижение содержания всех исследуемых форм сахаров, при этом содержание глюкозы уменьшалось на 30%, фруктозы – более чем на 20%, а сахарозы – в 3,5 раза.
Можно предположить, что столь существенное снижение содержания в апопла сте основной транспортной формы сахаров – сахарозы приводило к существенному, хотя и не полному, ингибированию загрузки флоэмы, а, следовательно, и к торможе нию оттока ассимилятов из листьев в корни, что может являться одной из причин по вышения содержания сахаров в листьях и неспособности корневой системы табака к их накоплению при низких положительных температурах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Адаптация растений к низким температурам является сложным, интегральным процессом, протекающим на всех уровнях структурной организации организма и за трагивающим практически все функции растения (Klimov et al., 1999;
Титов и др., 2006;
Трунова, 2007;
Margesin, 2007). На сегодняшний день возможности закаливания теплолюбивых растений к низким температурам изучены недостаточно полно. В ли тературе практически отсутствуют данные о причинах разной устойчивости листьев и корней теплолюбивых растений к гипотермии. Поэтому основное внимание в данной работе было уделено исследованию процессов низкотемпературного закаливания ти пичного представителя теплолюбивых растений – табака (Nicotiana tabacum L.) в свя зи с холодоустойчивостью его органов.
Установлено, что во время холодовой экспозиции (8С, 6 сут.) в листьях и кор нях табака происходили разнонаправленные изменения физиологических процессов, обеспечивающие повышение холодоустойчивости листьев и неспособность корневой системы к низкотемпературному закаливанию (Рис. 11).
Листья Корни Содержание липидов Повышение Содержание ПНЖК устойчивости к гипотермии ИН Генерация АФК ПОЛ Активность АО ферментов Фотосинтез Снижение Дыхание устойчивости к гипотермии Фотосинтез/дыхание = Содержание сахаров Загрузка флоэмы Рис. 11. Схема изменений физиологических процессов в растениях табака при низких по ложительных температурах.
Увеличение содержания ПНЖК в мембранных липидах листьев обеспечивало сохранение текучести мембран в период охлаждения, что должно стабилизировать работу электрон-транспортных цепей, и могло являться причиной снижения генера ции активных форм кислорода и, как следствие, интенсивности перекисного окисле ния липидов. С другой стороны, поддержание жидкостных свойств мембран листьев закаленных растений позволяло сохранить клеточный гомеостаз и, тем самым, обес печить активность антиоксидантных ферментов в условиях низких температур, что также предотвращало избыточное накопление АФК.
Уменьшение содержания ПНЖК в корневой системе при закаливании табака со провождалось снижением активности всех исследованных антиоксидантных фермен тов, накоплением АФК и повышением интенсивности ПОЛ, что приводило к тому, что корни растений табака после шестисуточной холодовой экспозиции при 8С об ладали меньшей по сравнению с листьями устойчивостью к окислительному стрессу, развивающемуся при гипотермии.
Увеличение содержания ПНЖК в мембранных липидах листьев, происходящее в основном за счет накопления линоленовой кислоты (Таблица 1), которая в значитель ном количестве содержится в мембранах хлоропластов, позволяло закаленным расте ниям поддерживать фотосинтез, хотя его интенсивность снижалась более чем в два раза по сравнению с контрольными растениями. За время закаливания интенсивность дыхания снижалась в бльшей мере чем фотосинтеза, что приводило к росту отноше ния фотосинтез/дыхание и обеспечивало увеличение содержания сахаров в листьях. В то же время в корневой системе содержание сахаров существенно не изменялось, вследствие чего их количество оказывалось недостаточным для успешного прохож дения процесса закаливания. Обнаруженные различия по содержанию сахаров в раз ных органах растений табака в результате закаливания, по-видимому, можно объяс нить ингибированием загрузки флоэмы, что приводит к торможению оттока ассими лятов из листьев в корни.
В ходе проведенной работы показана возможность значительного повышения холодоустойчивости надземной части растений табака и неспособность корневой сис темы табака к низкотемпературной адаптации, что является лимитирующим факто ром, определяющим в целом низкий потенциал устойчивости теплолюбивых расте ний к гипотермии. Такие особенности теплолюбивых растений определяются, по видимому, тем, что стратегия низкотемпературной адаптации этих растений направ лена на формирование повышенной холодоустойчивости надземной части, в то время как корневая система в местах их исконного произрастания практически не подверга ется повреждающему действию низких температур.
ВЫВОДЫ 1. Листья табака реагировали на холодовое закаливание увеличением содержания липидов и доли ПНЖК в их составе, в то время как в корнях происходило сниже ние содержания липидов и входящих в их состав ненасыщенных ЖК.
2. Закаливание растений табака приводило к снижению уровня АФК и интенсивно сти ПОЛ в листьях одновременно с возрастанием обоих этих показателей в кор нях, что свидетельствует о меньшей устойчивости корневой системы к окисли тельному стрессу.
3. Листья после закаливания отличались от корней повышенной активностью СОД, каталазы и пероксидаз, что противодействовало накоплению АФК и способство вало снижению интенсивности ПОЛ в листьях.
4. Снижение скорости фотосинтеза в меньшей степени, чем скорости дыхания в ре зультате закаливания обеспечивало увеличение отношения фотосинтез/дыхание, что является предпосылкой к накоплению продуктов фотосинтеза и повышению устойчивости растений к действию низких температур.
5. Снижение содержания сахаров в апопласте листьев растений табака при закалива нии вызывало ингибирование загрузки флоэмы, что может являться причиной не способности корневой системы табака к накоплению сахаров при низких положи тельных температурах.
6. Листья теплолюбивых растений табака способны значительно повышать устойчи вость к низким температурам. Неспособность корневой системы к низкотемпера турному закаливанию определяет в целом низкую устойчивость теплолюбивых растений табака к гипотермии.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1. Антипина О.В., Попов В.Н., Пчелкин В.П., Цыдендамбаев В.Д., Трунова Т.И.
(2008) Холодостойкость теплолюбивых растений табака в связи с липидным мета болизмом. Тез. докл. межд. науч. конф. “Физико-химические основы структурно функциональной организации растений”, Екатеринбург, с. 52-53.
2. Popov V., Antipina O., Trunova T. (2008) Oxidative stress in the tobacco plants at hy pothermia. Hort. Veg. Growing, 27, 121-127.
3. Попов В.Н., Антипина О.В. (2009) Исследование низкотемпературной адаптации растений табака. Мат. симп. “Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования”, Москва, с. 216-220.
4. Попов В.Н., Антипина О.В. (2009) Особенности низкотемпературной адаптации теплолюбивых растений. Мат. Межд. научно-практ. конф. “Интенсификация и оптимизация продукционного процесса сельскохозяйственных растений”, Орел, с.
128-132.
5. Антипина О.В., Попов В.Н. (2009) Влияние процессов перекисного окисления липидов на закаливание теплолюбивых растений табака к гипотермии. Тез. докл.
межд. научн. конф. “Физико-химические механизмы адаптации растений к ан тропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера”, Апатиты, с. 33-34.
6. Антипина О.В., Попов В.Н. (2010) Увеличение интенсивности ПОЛ в корневой системе табака снижает устойчивость растений к гипотермии. Тез.докл.14 Межд.
Пущинская конф. молодых ученых “Биология – наука ХХI века”, Пущино, с. 309 310.
7. Попов В.Н., Антипина О.В. (2010) Интенсивность окислительного стресса в ли стьях и корнях растений табака при закаливании. Мат. научн. конф. "Вторые чтения памяти профессора О.А. Зауралова", Саранск, с.66-69.
8. Попов В.Н., Антипина О.В. (2010) Роль супероксиддисмутазы в устойчивости растений табака к гипотермии. Мат. IX Межд. научно-метод. конф. "Интродук ция нетрадиционных растений", Мичуринск, Т. II. с. 156-160.
9. Антипина О.В. (2010) Роль листьев и корней в формировании устойчивости к ги потермии растений табака. Тез. докл. Всеросс. симп. “ Растение и стресс”, Моск ва, с. 38-39.
10. Попов В.Н., Антипина О.В., Трунова Т.И. (2010) Перекисное окисление липидов при низкотемпературной адаптации листьев и корней теплолюбивых растений та бака. Физиология растений, 57, 153-156.